CN102123727B

CN102123727B - 用于治疗β-淀粉样变的化合物

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Publication number: CN102123727B
Application number: CN200980131375.9A
Authority: CN
Inventors: 马库斯·曼德勒; 克里斯琴·吉弗斯; 弗兰克·马特纳; 安德烈亚·多利希卡; 奥莱克桑德尔·奥塔瓦
Original assignee: Affiris AG
Current assignee: Affiris AG
Priority date: 2008-06-12
Filing date: 2009-06-12
Publication date: 2015-06-10
Anticipated expiration: 2029-06-12
Also published as: WO2009149486A3; WO2009149486A2; AT506819A1; JP2011522841A; EP2310034B1; AT509105B1; ES2461492T3; US20130230545A1; DK2310034T3; RU2553345C2; HRP20140586T1; US20110097351A1; AU2009257169A1; RS53236B; PL2310034T3; HK1152470A1; AT509106A1; AU2009257169B2; AT509106B1; AT509105A1

Abstract

本发明涉及模拟表位在治疗包括阿尔茨海默氏病的与β-淀粉样蛋白形成和/或聚集(β-淀粉样变)有关的疾病中的用途，由此所述模拟表位能够在体内诱导针对Aβ1-40/42，AβpE3-40/42，Aβ3-40/42和Aβ11-40/42的抗体形成。

Description

用于治疗β-淀粉样变的化合物

本发明涉及模拟表位用于预防，治疗和诊断与β-淀粉样蛋白形成和/或聚集(β-淀粉样变)有关的疾病的用途。

各种变性性疾病的特征在于特定蛋白质的异常聚合和累积。这些所谓的蛋白病(proteopathy)包括神经学病症诸如阿尔茨海默氏病，帕金森氏病和亨廷顿氏病以及不同的系统包括淀粉样变。本发明涉及在术语“β-淀粉样变”之下概括的β-淀粉样蛋白蛋白质有关的蛋白病的预防，治疗和诊断。β-淀粉样变的最突出形式是阿尔茨海默氏病(AD)。其它例子包括但不限于具有Lewy小体的痴呆和唐氏综合征中的痴呆。

AD的特征在于细胞外淀粉状蛋白斑的异常累积一与广泛的星形细胞增多和微观神经胶质增多(microgliosis)以及神经元营养不良(dystrophicneurons)和神经元损失密切相关。这些淀粉状蛋白斑主要由淀粉样蛋白-β(Aβ)肽Aβ40和Aβ42组成，其衍生自在神经系统中的多种细胞类型上表达的淀粉样蛋白前体蛋白(APP)。Aβ肽被认为是直接涉及AD的发病和进展。

APP在正常情况中通过两个切割步骤来加工，形成当前已知形式的Aβx-40/42/43。第一次切割由所谓的β-位点APP切割酶1和2(BACE1和BACE2)实施；第二个蛋白水解步骤由γ-分泌酶复合物实施(见综述De Strooper et al.JCell Sci 113(2000)：1857-1870)。

BACE酶识别假定Aβ肽的N端部分中的两个位点：BACE与APP的第一相互作用导致序列DAEFR(Aβ中位置1)处的切割和Aβ1-X形成。或者，BACE也能在Aβ内位置11处切割，产生片段11-X。如此，BACE介导的APP加工创建多种不同Aβ种类，主要成分为全长Aβ1-40/42。γ-分泌酶活性导致3种主要片段生成：Aβ1-40/42/43。一旦这些肽生成，它们就被氨肽酶进一步加工，导致它们后续的逐步降解。这些进一步的步骤分别导致其它形式像例如Aβ3-40/42形成。在人中，平均60-85％的淀粉状蛋白斑材料由N端截短的和常常修饰的Aβ40/42衍生物形成。N端截短的Aβ种类的相对量关于Aβ水平，突变和BACE活性是多变的。

最丰富的截短形式的Aβ是：Aβ3-40/42和Aβ11-40/42。这两种肽都含有N端谷氨酸残基，它常常被酶促修饰成焦谷氨酸，分别导致Aβ3(pE)-40/42和Aβ11(pE)-40/42形成。因为Aβ3(pE)和11(pE)肽的氨基末端被内部内酰胺所封闭，所以它受到保护免于焦谷氨酸特异性氨肽酶以外的氨肽酶的蛋白水解作用且能如此在组织中保持稳定。

N端截短的修饰的淀粉样蛋白的最突出形式是由肽3(pE)-40/42形成的，认为占到所有截短形式的多达50％。这意味着这种同等型(isoform)占AD脑中所有淀粉样蛋白肽的25-40％。截短的Aβ肽的另一种突出形式是Aβ11-40/42：Naslund等人和Huse等人能证明在AD患者的人脑中以及在AD的亚临床(infra-clinical)患者中能检测到显著水平的这些截短种类。另外，这些肽经历分子内脱水并形成稳定(pE)形式，后果与关于3(pE)-40/42所述相似。

先前显示了截短的和修饰的肽在神经组织中比全长Aβ要更稳定。另外，N端截短形式的Aβ比未修饰的Aβ肽更能生成淀粉样蛋白，如此提高斑形成的速率，而且还在应用于培养的神经元时以及在体内实验中显示神经毒性活性。截短形式的Aβ早就能在AD早期阶段中Aβ的弥漫性聚集中检测到，而且可能涉及早期斑形成，在体内起各种子的作用。

有令人信服的证据表明N端截短的Aβ种类的存在与散发性和家族性阿尔茨海默氏病以及唐氏综合征患者中神经变性的早期发作和严重性升高有关。这些肽的聚集效应与升高的稳定性一起使得它们成为AD发生中一个潜在的危险因素。对患有家族性AD或唐氏综合征的亚临床患者的分析清楚地显示了在疾病的最早阶段(也称作“种子”阶段)期间能检测到Aβ3(pE)-42。此时，检测不到神经学症状或只能检测到次要的神经学病症，尽管携带Aβ3(pE)-42肽种类的斑开始累积。如此，来自此类患者的数据暗示截短的Aβ种类的早期形成与疾病发作以及进展之间的联系。

根据这些发现，降低AD患者中这些肽种类的量以改变疾病进展及降低毒性和伴随的认知衰退似乎是重要的。一种最佳的AD疫苗应当如此在不干扰APP信号传导的生理功能(特别是sAPPα的功能)的情况中引发如下的免疫应答，其能够靶向AD患者的脑中存在的最突出形式的Aβ肽。

确实，在AD的动物模型中，使用针对全长Aβ的主动和被动免疫接种策略的免疫治疗性处理导致Aβ斑缩小/减少，而且对疾病进展具有有益影响。在AD的小鼠模型中进行的被动免疫接种实验清楚地显示了特异性针对Aβ40/42的N和C末端的抗体能够降低脑中的斑负荷，而且还改善处理动物的认知功能，如根据行为分析所判断的。通过在小鼠中使用不同办法来诱导针对Aβ40/42的免疫应答，在主动免疫接种实验中得到了类似的观察结果。所有这些办法使用全长Aβ40/42或含有Aβ天然序列的片段，而且大多降低转基因小鼠模型中的淀粉样蛋白负荷。重要的是，这些动物还显示出改善的认知功能。惊人的是，Lemere等人(Am J Pathol 165(2004)：283-297)能在非人灵长类动物中重现这些结果，其显示斑沉积及相关病理响应全长Aβ的主动免疫接种而清楚地减轻。然而，由于严重的神经炎症副作用，包括自身反应性T细胞的脑浸润，使用全长Aβ42作为抗原在AD患者中进行的第一次IIa期临床免疫接种试验不得不停止。不过，调查在用AN-1792处理的患者中的临床效果的研究揭示，发生了针对Aβ42的抗体应答但没有遭受脑膜脑炎的患者在认识测试中表现比不响应的患者要好，指示免疫疗法会是AD的非常有用治疗办法。

最重要的是，最近自分析接受过AN1792免疫接种的患者尸检案例获得的结果显示了全长Aβ种类自脑清除，但是N端截短形式的Aβ得到维持。这强调靶向全长Aβ以及N端截短和修饰形式的这种分子的新疫苗发明的必要性。

在人中诱导针对Aβ40/42肽的免疫应答会干预AD患者中的认知衰退，但是安全的阿尔茨海默氏病疫苗必须避免自身反应性T细胞形成。使用天然Aβ40/42肽或其片段的免疫接种遭受在患者中诱导自身免疫性疾病的内在风险，因为免疫应答不能专一地靶向Aβ。

本发明的一个目的是提供可用于治疗和/或预防β-淀粉样变包括阿尔茨海默氏病的化合物和药物。这些化合物应当在给个体施用时不显示诱导自身免疫性疾病的风险或显示显著降低的诱导自身免疫性疾病的风险。依照本发明的另一个目的，所述化合物可以在个体体内诱导形成针对截短和/或稳定形式的Aβ(它们通常是淀粉样蛋白沉积物的主要成分)的抗体。

因此，本发明涉及至少一种包含下述氨基酸序列的化合物在生产用于预防和/或治疗β-淀粉样变的药物中的用途，

X₁RX₂DX₃(X₄)_n(X₅)_m(X₆)_o (式I)，

其中

X₁为异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)，

X₂为色氨酸(W)或酪氨酸(Y)，

X₃为苏氨酸(T)，缬氨酸(V)，丙氨酸(A)，甲硫氨酸(M)，谷氨酰胺(Q)或甘氨酸(G)，

X₄为脯氨酸(P)，丙氨酸(A)，酪氨酸(Y)，丝氨酸(S)，半胱氨酸(C)或甘氨酸(G)，

X₅为脯氨酸(P)，亮氨酸(L)，甘氨酸(G)或半胱氨酸(C)，

X₆为半胱氨酸(C)，

n，m和o独立地为0或1，

所述化合物具有结合对包含氨基酸序列EFRHDSGY和/或pEFRHDSGY的淀粉样蛋白β肽(Aβ)表位特异性的抗体的能力。

令人惊讶地发现包含式I氨基酸序列的化合物能够在体内诱导针对截短Aβ形式AβpE3-40/42和Aβ3-40/42的抗体形成。所形成的抗体能够结合所述Aβ片段，导致Aβ斑崩解。

式I和II和本文中公开的所有其它肽分子模拟天然存在Aβ肽和变体Aβ1-40/42，AβpE3-40/42，Aβ3-40/42和Aβ11-40/42，使得包含本文中公开的氨基酸序列的化合物能够诱导相应抗体形成。

本文中呈现的发明指如下的抗原，其不包含天然Aβ肽的序列且模拟通过诸如WO 2004/062556中记载的模拟表位检测不到的新表位的结构。此类基于模拟表位的AD疫苗因此会诱导与本文所述病理Aβ分子广泛起反应但不与亲本结构像APP起反应的抗体应答。另外，模拟表位不含有潜在的T细胞自身表位，而且避免诱导有害的自身反应性T细胞。

如本文中使用的，“β-淀粉样变(amyloidoses)”指以特定蛋白质的异常聚合和累积(所谓的蛋白病)为特征的多种变性性疾病。本发明涉及与术语β-淀粉样变下总结的β-淀粉样蛋白蛋白质有关的蛋白病的预防，治疗和诊断。β-淀粉样变的最突出形式是阿尔茨海默氏病(AD)。其它例子包括但不限于具有Lewy小体的痴呆和唐氏综合征中的痴呆。进一步的例子是Lewy小体痴呆，肌炎，散发性包含体肌炎，具有淀粉样变的遗传性脑出血(荷兰型)，大脑淀粉样蛋白血管病，Aβ相关血管炎。

依照本发明的一个特别优选的实施方案，“β-淀粉样变”为阿尔茨海默氏病。

依照本发明的一个优选实施方案，所述化合物包含具有选自下组的氨基酸序列的肽：IRWDTP(C)，VRWDVYP(C)，IRYDAPL(C)，IRYDMAG(C)，IRWDTSL(C)，IRWDQP(C)，IRWDG(C)和IRWDGG(C)。

本发明的特别优选的化合物包含上文鉴定的氨基酸序列或由其组成，由此所述肽的C末端可以包含或不包含半胱氨酸残基(通过使用括号所指示的)，使得得到的化合物可以例如偶联至载体分子。然而，当然也有可能将半胱氨酸残基连接至所述肽的N末端。

依照本发明的一个特别优选的实施方案，所述氨基酸序列为IRWDTP(C)，VRWDVYP(C)，IRYDAPL(C)或IRYDMAG(C)。

本发明的另一个方面涉及至少一种包含下述氨基酸序列的化合物在生产用于预防和/或治疗β-淀粉样变的药物中的用途：

EX₁WHX₂X₃(X₄)_n(X₅)_m (式II)，

其中

X₁为缬氨酸(V)，精氨酸(R)或亮氨酸(L)，

X₂为精氨酸(R)或谷氨酸(E)，

X₃为丙氨酸(A)，组氨酸(H)，赖氨酸(K)，亮氨酸(L)，酪氨酸(Y)或甘氨酸(G)，

X₄为脯氨酸(P)，组氨酸(H)，苯丙氨酸(F)，谷氨酰胺(Q)或半胱氨酸(C)

X₅为半胱氨酸(C)，

n和m独立地为0或1，

所述化合物具有结合对包含氨基酸序列EVHHQKL的淀粉样蛋白β肽(Aβ)表位特异性的抗体的能力。

施用包含式II氨基酸序列的化合物引起针对截短Aβ形式Aβ11-40/42的免疫应答。

依照本发明的一个优选实施方案，所述化合物包含具有选自下组的氨基酸序列的肽：EVWHRHQ(C)，ERWHEKH(C)，EVWHRLQ(C)，ELWHRYP(C)，ELWHRAF(C)，ELWHRA(C)，EVWHRG(C)，EVWHRH(C)和ERWHEK(C)，优选EVWHRHQ(C)，ERWHEKH(C)，EVWHRLQ(C)，ELWHRYP(C)和ELWHRAF(C)。

本发明的另一个方面涉及至少一种包含选自下组的氨基酸序列的化合物在生产用于预防和/或治疗β-淀粉样变的药物中的用途：QDFRHY(C)，SEFKHG(C)，TSFRHG(C)，TSVFRH(C)，TPFRHT(C)，SQFRHY(C)，LMFRHN(C)，SAFRHH(C)，LPFRHG(C)，SHFRHG(C)，ILFRHG(C)，QFKHDL(C)，NWFPHP(C)，EEFKYS(C)，NELRHST(C)，GEMRHQP(C)，DTYFPRS(C)，VELRHSR(C)，YSMRHDA(C)，AANYFPR(C)，SPNQFRH(C)，SSSFFPR(C)，EDWFFWH(C)，SAGSFRH(C)，QVMRHHA(C)，SEFSHSS(C)，QPNLFYH(C)，ELFKHHL(C)，TLHEFRH(C)，ATFRHSP(C)，APMYFPH(C)，TYFSHSL(C)，HEPLFSH(C)，SLMRHSS(C)，EFLRHTL(C)，ATPLFRH(C)，QELKRYY(C)，THTDFRH(C)，LHIPFRH(C)，NELFKHF(C)，SQYFPRP(C)，DEHPFRH(C)，MLPFRHG(C)，SAMRHSL(C)，TPLMFWH(C)，LQFKHST(C)，ATFRHST(C)，TGLMFKH(C)，AEFSHWH(C)，QSEFKHW(C)，AEFMHSV(C)，ADHDFRH(C)，DGLLFKH(C)，IGFRHDS(C)，SNSEFRR(C)，SELRHST(C)，THMEFRR(C)，EELRHSV(C)，QLFKHSP(C)，YEFRHAQ(C)，SNFRHSV(C)，APIQFRH(C)，AYFPHTS(C)，NSSELRH(C)，TEFRHKA(C)，TSTEMWH(C)，SQSYFKH(C)，(C)SEFKH，SEFKH(C)，(C)HEFRH和HEFRH(C)。

每一种化合物均能够在体内诱导针对Aβ1-40/42，AβpE3-40/42和Aβ3-40/42的抗体形成。因此，这些化合物特别适合于治疗和/或预防β-淀粉样变，诸如AD，因为施用一种化合物导致能够识别三种主要Aβ形式即Aβ1-40/42，AβpE3-40/42和Aβ3-40/42的抗体形成。

依照本发明的一个优选实施方案，所述化合物包含具有选自下组的氨基酸序列的肽或由其组成：QDFRHY(C)，SEFKHG(C)，TSFRHG(C)，TSVFRH(C)，TPFRHT(C)，SQFRHY(C)，LMFRHN(C)，SAFRHH(C)，LPFRHG(C)，SHFRHG(C)，ILFRHG(C)，QFKHDL(C)，NWFPHP(C)，EEFKYS(C)，SPNQFRH(C)，TLHEFRH(C)，THTDFRH(C)，DEHPFRH(C)，QSEFKHW(C)，ADHDFRH(C)，DGLLFKH(C)，EELRHSV(C)，TEFRHKA(C)，(C)SEFKH，SEFKH(C)，(C)HEFRH和HEFRH(C)优选SEFKHG(C)，TSVFRH(C)，SQFRHY(C)，LMFRHN(C)，ILFRHG(C)，SPNQFRH(C)，ELFKHHL(C)，TLHEFRH(C)，THTDFRH(C)，DEHPFRH(C)，QSEFKHW(C)，ADHDFRH(C)，YEFRHAQ(C)，TEFRHKA(C)。

本文中公开的氨基酸序列被认为是包含氨基酸序列EFRHDSGY，pEFRHDSGY或EVHHQKL的Aβ表位的模拟表位。依照本发明，术语“模拟表位(mimotope)”指具有拓扑学与它所模拟的表位等同的构象的分子。模拟表位结合抗体免疫特异性结合期望抗原的相同抗原结合区。模拟表位会在宿主中引发免疫学应答，其能与它所模拟的抗原起反应。模拟表位还可在涉及表位和结合所述表位的抗体的体外抑制测定法(例如ELISA抑制测定法)中起它所模拟的表位的竞争物的作用。然而，本发明的模拟表位可不必在体外抑制测定法中阻止或竞争它所模拟的表位的结合，尽管它能够在给哺乳动物施用时诱导特异性免疫应答。包含此类模拟表位(还有上文列出的那些)的本发明化合物具有避免形成自身反应性T细胞的优点，因为化合物的肽具有与天然存在淀粉样蛋白β肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列。

如本文中使用的，术语“表位”指抗原受到特定抗体分子识别的免疫原性区。一般而言，抗原会拥有一个或多个表位，每一个均能够结合识别该特定表位的抗体。

本发明的模拟表位可以通过本领域公知的化学合成方法来合成生成，或是作为分离的肽或作为另一肽或多肽的一部分。或者，肽模拟表位可以在生成肽模拟表位的微生物中生成，然后分离并(如果想要的话)进一步纯化。肽模拟表位可以在微生物诸如细菌，酵母或真菌中，在真核细胞诸如哺乳动物或昆虫细胞中，或在重组病毒载体诸如腺病毒，痘病毒，疱疹病毒，Simliki森林病毒，杆状病毒，噬菌体，辛德毕斯病毒或仙台病毒中生成。用于生成肽模拟表位的合适细菌包括大肠杆菌(E.coli)，枯草杆菌(B.subtilis)或能够表达肽诸如肽模拟表位的任何其它细菌。用于表达肽模拟表位的合适酵母类型包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，假丝酵母属(Candida)，巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)或能够表达肽的任何其它酵母。相应的方法是本领域公知的。用于分离和纯化重组生成的肽的方法也是本领域公知的，而且包括例如凝胶过滤，亲和层析，离子交换层析等。

为了便于分离肽模拟表位，可生成融合多肽，其中肽模拟表位翻译融合(共价连接)至能够通过亲和层析来分离的异源多肽。典型的异源多肽为His标签(例如His6；6个组氨酸残基)，GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶)等。融合多肽不见便于纯化模拟表位，而且还能防止模拟表位多肽在纯化期间被降解。如果想要在纯化后除去异源多肽，那么融合多肽可在肽模拟表位与异源多肽之间的接合处包含切割位点。切割位点由受到该位点处的氨基酸序列特异性的酶(例如蛋白酶)切割的氨基酸序列组成。

本发明的模拟表位还可在它们的N和/或C端处或附近修饰，使得在所述位置处结合半胱氨酸残基。在一个优选的实施方案中，末端位置(位于肽的N和C端)的半胱氨酸残基用于经二硫键来环化肽。半胱氨酸还可用于结合将别的分子(例如载体)结合至所述肽/化合物。

本发明的模拟表位还可用于各种测定法和试剂盒，特别是免疫学测定法和试剂盒。因此，特别优选的是，模拟表位可以是另一肽或多肽的一部分，特别是在免疫学测定法中用作报告物的酶。此类报告酶包括例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

依照本发明的模拟表位优选是它们的氨基酸序列不同于Aβ或Aβ片段的氨基酸序列的抗原性多肽。在这个方面，本发明的模拟表位可不仅包含一种或多种天然存在氨基酸残基的氨基酸替代，而且还可包含一种或多种非天然氨基酸(即不是来自20种“经典的”氨基酸)的氨基酸替代或者它们可以完全由此类非天然氨基酸装配而成。此外，本发明诱导针对及结合Aβ1-40/42，AβpE3-40/42，Aβ3-40/42和Aβ11-40/42抗体的抗原可以由D-氨基酸或L-氨基酸或DL-氨基酸的组合装配而成，而且任选，它们可以通过进一步修饰，环闭合或衍生化而进行了改变。合适的抗体诱导性抗原可以自商品化肽文库提供。优选的是，这些肽为至少7个氨基酸，且优选的长度可以长达16，优选长达14或20个氨基酸(例如5至16个氨基酸残基)。依照本发明，然而，也可很好地采用更长的肽作为抗体诱导性抗原。另外，本发明的模拟表位也可以是多肽的一部分，并因此在它们的N和/或C端包含至少一个别的氨基酸残基。

为了制备本发明的模拟表位(即本文中公开的抗体诱导性抗原)，当然，噬菌体文库，肽文库也是合适的，例如通过组合化学的手段生成的或通过用于最多变的结构的高通量筛选技术的手段获得的(Display：A LaboratoryManual，Carlos F.Barbas等编；Willats WG，Phage display：practicalities andprospects.Plant Mol.Biol.2002 Dec.；50(6)：837-54)。

另外，依照本发明，也可采用基于核酸的抗Aβ1-40/42，AβpE3-40/42，Aβ3-40/42和Aβ11-40/42抗体诱导性抗原(“适体”)，而且这些也可以用最多变的(寡核苷酸)文库(例如具有2-180个核酸残基)(例如Burgstaller et al.，Curr.Opin.Drug Discov.Dev.5(5)(2002)，690-700；Famulok et al.，Acc.Chem.Res.33(2000)，591-599；Mayer et al.，PNAS 98(2001)，4961-4965；等)找到。在基于核酸的抗体诱导性抗原中，核酸主链可例如通过天然磷酸二酯化合物或也通过硫代磷酸酯或组合或化学变异(例如像PNA)来提供，其中依照本发明可主要采用U，T，A，C，G，H和mC作为碱基。可依照本发明使用的核苷酸的2’-残基优选为H，OH，F，Cl，NH₂，O-甲基，O-乙基，O-丙基或O-丁基，其中核酸还可别不同的修饰，即例如用保护基团修饰，就像它们通常在寡核苷酸合成中被采用的。如此，基于适体的抗体诱导性抗原也是本发明范围内的优选抗体诱导性抗原。

依照本发明的一个优选实施方案，化合物偶联至药学可接受载体，优选KLH(匙孔血蓝蛋白)，破伤风类毒素，清蛋白结合蛋白，牛血清清蛋白，树状聚物(MAP；Biol.Chem.358：581)，肽接头(或侧翼区)以及Singh et al.，Nat.Biotech.17(1999)，1075-1081(特别是该文件表1中的那些)，和O′Hagan etal.，Nature Reviews，Drug Discovery 2(9)(2003)，727-735(特别是其中记载的内源免疫强化性化合物和投递系统)中记载的佐剂物质，或其混合物。此语境中的偶联化学(例如经由异双功能化合物，诸如GMBS，当然还有其它的，如“Bioconjugate Techniques”，Greg T.Hermanson中记载的)可选自本领域技术人员已知的反应。此外，疫苗组合物可以与佐剂，优选低溶解度的铝组合物，特别是氢氧化铝一起配制。当然，也可以使用像MF59磷酸铝，磷酸钙，细胞因子(例如IL-2，IL-12，GM-CSF)，皂苷(例如QS21)，MDP衍生物，CpG寡聚物，LPS，MPL，聚磷腈，乳状液(例如弗氏，SAF)，脂质体，病毒体，ISCOM，蜗形物(cochleates)，PLG微粒，Poloxamer颗粒，病毒样颗粒，热不稳定肠毒素(LT)，霍乱毒素(CT)，突变体毒素(例如LTK63和LTR72)，微粒和/或聚合脂质体这些佐剂。

本发明的化合物优选经选自下组的接头结合至载体或佐剂：NHS-聚(氧化乙烯)(PEO)(例如NHS-PEO₄-马来酰亚胺)。

包含本发明化合物(模拟表位)和药学可接受载体的疫苗可通过任何合适的应用模式(例如i.d.，i.v，i.p.，i.m.，鼻内，口服，皮下，等)及在任何合适的投递装置中施用(O’Hagan et al.，Nature Reviews，Drug Discovery 2(9)，(2003)，727-735)。本发明的化合物优选为静脉内，皮下，皮内或肌肉内施用而配制(参见例如“Handbook of Pharmaceutical ManufacturingFormulations”，Sarfaraz Niazi，CRC Press Inc，2004)。

依照本发明的药物(疫苗)以0.1ng至10mg，优选10ng至1mg，特别是100ng至100μg，或者例如100fmol至10μmol，优选10pmol至1μmol，特别是100pmol至100nmol的量含有依照本发明的化合物。典型地，疫苗还可含有辅助物质，例如缓冲剂、稳定剂等。

本发明的另一个方面涉及上文限定的化合物用于治疗和/或改善突触核蛋白病(synucleopathy)症状的用途。

令人惊讶地发现本发明的化合物还能用于治疗和改善与突触核蛋白病有关的症状。

淀粉样变和突触核蛋白病分别与β-淀粉样蛋白和α-突触核蛋白的大脑累积有关。一些患者显示这两种疾病的临床和病理特征，提出了致病途径交叠的可能性。这些患者还归类为患有一种新鉴定的综合征，其描述为具有Lewy小体的痴呆或具有痴呆的帕金森氏病(DLB/PDD)。在一种最近的转基因动物DLB/PDD模型中，显示了α-突触核蛋白和淀粉样蛋白前体蛋白(hAPP)二者在小鼠中的过表达导致认知和运动改变的发生，其伴有胆碱能神经元的损失和突触囊泡的减少，广泛淀粉状蛋白斑的形成，和haSYN免疫反应性神经元内纤丝包含。所有这些特征也见于DLB/PDD综合征。最近描述了这两种分子潜在地能够在体外相互作用及形成杂合寡聚物。还显示了APP过表达能加剧α-突触核蛋白过表达的一些病理效应。相反，α-突触核蛋白能够增强淀粉样蛋白β肽的分泌和毒性，及因此还能提高β-淀粉样蛋白的效应，支持神经变性过程中致病途径交叠的想法。

在这两种蛋白病中，肽寡聚物的渐进累积被鉴定为导致对于突触核蛋白病或淀粉样变任一而言典型的各种改变的中枢毒性事件之一。尽管有这种机制相似性，假设α-突触核蛋白和Aβ对脑的完整性和功能具有不同的，以及趋同的致病效果。认为突触核蛋白比认知功能更严重地影响运动功能，而淀粉样蛋白β肽被描述为具有相反的影响。造成这种差异的原因目前尚不清楚，也没有对这两种分子的相互依赖和影响的清楚描述。

本发明中呈现的治疗办法描述了一种靶向Aβ的免疫疗法，它会导致主要在细胞内的淀粉样蛋白的清除。因此认为它会减轻淀粉样蛋白相关改变，范围从斑沉积至神经元死亡以及至记忆问题和认知衰退。然而，突触核蛋白的亚细胞定位指示这些细胞内蛋白质主要在突触处有活性，尤其局限于突触囊泡。有趣的是，作为突触核蛋白病的统一病理标志，突触核蛋白累积也主要在细胞内可检测到。另外，认为突触核蛋白病的根本致病机制可归于神经元内变化，范围从线粒体功能障碍，异常折叠的遍在蛋白化或磷酸化蛋白质的累积以及突触核蛋白的累积。这些改变因此导致突触功能的变化，突触失效，和多巴胺能神经元损失和突触核蛋白病的经典临床征候。相反，Aβ主要在神经元外可检测到，而且淀粉状蛋白斑以及纤丝，初原纤维和β-淀粉样蛋白寡聚物在细胞外或大脑内应用时能发挥神经毒性功能。如此，主要影响导致下文描述的典型症状的细胞内过程，主要靶向细胞外淀粉样蛋白的办法会减轻突触核蛋白病像PD的症状对于专家而言是一项令人惊讶的发现。甚至更加令人惊讶的是，当前认为这两种分子的交叠效果是由应主要存在于细胞内的两种蛋白质的直接相互作用引起的。依照本发明，术语“突触核蛋白病(synucleinopathy)”包括以病理性突触核蛋白聚集为特征的所有神经变性性病症。数种神经变性性病症，包括帕金森氏病(PD)，Lewy小体病(LBD)，弥漫性Lewy小体病(DLBD)，具有Lewy小体的痴呆(DLB)，具有痴呆的帕金森综合征(PDD)，多系统萎缩(MSA)和具有脑铁累积的神经变性I型(NBIA I型)共同分组为突触核蛋白病。

如本文中使用的，“突触核蛋白病的症状”指那些影响患有所述疾病的患者的运动和非运动行为的突触核蛋白病(特别是帕金森氏病)症状。“运动症状”包括静止性震颤，运动徐缓，强直，体位不稳，弯腰体位，张力障碍，疲劳，细微运动灵巧性和运动协调受损，整体运动协调受损，运动缺乏(摆臂缩小)，静坐不能，言语问题，诸如由肌肉控制缺失引起的嗓音柔和或言语模糊，面部表情丧失，或“掩蔽”，写字过小，吞咽困难，性功能障碍，流涎等。“非运动”症状包括疼痛，痴呆或意识错乱，睡眠扰动，便秘，皮肤问题，抑郁，恐惧或焦虑，记忆困难和思考缓慢，泌尿问题，疲劳和疼痛，能量损失，强迫行为，痛性痉挛等。

依照本发明的一个优选实施方案，突触核蛋白病选自下组：帕金森氏病，具有Lewy小体的痴呆，多系统萎缩和具有脑铁累积的神经变性。特别优选帕金森氏病。

本发明的另一个方面涉及具有选自下组的氨基酸序列或由其组成的肽：IRWDTP(C)，VRWDVYP(C)，IRYDAPL(C)，IRYDMAG(C)，IRWDTSL(C)，IRWDQP(C)，IRWDG(C)，IRWDGG(C)，EVWHRHQ(C)，ERWHEKH(C)，EVWHRLQ(C)，ELWHRYP(C)，ELWHRAF(C)，ELWHRA(C)，EVWHRG(C)，EVWHRH(C)，ERWHEK(C)，QDFRHY(C)，SEFKHG(C)，TSFRHG(C)，TSVFRH(C)，TPFRHT(C)，SQFRHY(C)，LMFRHN(C)，SAFRHH(C)，LPFRHG(C)，SHFRHG(C)，ILFRHG(C)，QFKHDL(C)，NWFPHP(C)，EEFKYS(C)，NELRHST(C)，GEMRHQP(C)，DTYFPRS(C)，VELRHSR(C)，YSMRHDA(C)，AANYFPR(C)，SPNQFRH(C)，SSSFFPR(C)，EDWFFWH(C)，SAGSFRH(C)，QVMRHHA(C)，SEFSHSS(C)，QPNLFYH(C)，ELFKHHL(C)，TLHEFRH(C)，ATFRHSP(C)，APMYFPH(C)，TYFSHSL(C)，HEPLFSH(C)，SLMRHSS(C)，EFLRHTL(C)，ATPLFRH(C)，QELKRYY(C)，THTDFRH(C)，LHIPFRH(C)，NELFKHF(C)，SQYFPRP(C)，DEHPFRH(C)，MLPFRHG(C)，SAMRHSL(C)，TPLMFWH(C)，LQFKHST(C)，ATFRHST(C)，TGLMFKH(C)，AEFSHWH(C)，QSEFKHW(C)，AEFMHSV(C)，ADHDFRH(C)，DGLLFKH(C)，IGFRHDS(C)，SNSEFRR(C)，SELRHST(C)，THMEFRR(C)，EELRHSV(C)，QLFKHSP(C)，YEFRHAQ(C)，SNFRHSV(C)，APIQFRH(C)，AYFPHTS(C)，NSSELRH(C)，TEFRHKA(C)，TSTEMWH(C)，SQSYFKH(C)，(C)SEFKH，SEFKH(C)，(C)HEFRH和HEFRH(C)。如使用括号所指示的，本发明的肽可以包含或不包含C或N末端处的半胱氨酸残基。因此，本发明还涵盖下面的氨基酸序列：IRWDTP，VRWDVYP，IRYDAPL，IRYDMAG，IRWDTSL，IRWDQP，IRWDG，IRWDGG，EVWHRHQ，ERWHEKH，EVWHRLQ，ELWHRYP，ELWHRAF，ELWHRA，EVWHRG，EVWHRH，ERWHEK，QDFRHY，SEFKHG，TSFRHG，TSVFRH，TPFRHT，SQFRHY，LMFRHN，SAFRHH，LPFRHG，SHFRHG，ILFRHG，QFKHDL，NWFPHP，EEFKYS，NELRHST，GEMRHQP，DTYFPRS，VELRHSR，YSMRHDA，AANYFPR，SPNQFRH，SSSFFPR，EDWFFWH，SAGSFRH，QVMRHHA，SEFSHSS，QPNLFYH，ELFKHHL，TLHEFRH，ATFRHSP，APMYFPH，TYFSHSL，HEPLFSH，SLMRHSS，EFLRHTL，ATPLFRH，QELKRYY，THTDFRH，LHIPFRH，NELFKHF，SQYFPRP，DEHPFRH，MLPFRHG，SAMRHSL，TPLMFWH，LQFKHST，ATFRHST，TGLMFKH，AEFSHWH，QSEFKHW，AEFMHSV，ADHDFRH，DGLLFKH，IGFRHDS，SNSEFRR，SELRHST，THMEFRR，EELRHSV，QLFKHSP，YEFRHAQ，SNFRHSV，APIQFRH，AYFPHTS，NSSELRH，TEFRHKA，TSTEMWH，SQSYFKH，(C)SEFKH，SEFKH，HEFRH和HEFRH。

依照一个优选的实施方案，所述肽偶联至药学可接受载体，优选KLH(匙孔血蓝蛋白)。

本发明的又一个方面涉及包含至少一种依照本发明的肽的药物配制剂，优选疫苗。所述药物配制剂可用于治疗患有β-淀粉样变包括阿尔茨海默氏病的个体或预防在个体中形成Aβ斑以阻止β-淀粉样变包括阿尔茨海默氏病的形成。

本发明在下面的附图和实施例中进一步例示，然而，不限于此。

图1显示单克隆抗体MV-001对特定肽和重组蛋白的结合；

图2显示单克隆抗体MV-003对特定肽和重组蛋白的结合；

图3显示单克隆抗体MV-004对特定肽和重组蛋白的结合；

图4显示用β-淀粉样蛋白和N端截短的和/或翻译后修饰的β-淀粉样蛋白片段的模拟表位进行的典型结合测定法；

图5显示用β-淀粉样蛋白和N端截短的和/或翻译后修饰的β-淀粉样蛋白片段的模拟表位进行的典型抑制测定法；

图6显示通过模拟表位免疫接种(注射的肽/无关的肽)引发的免疫应答的体内表征的例子；

图7显示通过针对淀粉样蛋白β片段的模拟表位免疫接种引发的免疫应答的体内表征的例子；

图8显示通过针对全长Aβ40/42的模拟表位免疫接种引发的免疫应答的体内表征的例子

图9显示被淀粉状蛋白斑占据的面积。以一个月间隔通过s.c接种给Tg2576注射6次以氢氧化铝(ALUM)作为佐剂的模拟表位疫苗。对照小鼠只接受PBS-ALUM。被淀粉状蛋白斑占据的面积显示为对照组的百分比。Gr1...对照组；Gr2...接受p4381；Gr3...接受p4390；Gr4...接受p4715。

图10显示被淀粉状蛋白斑占据的面积。以一个月间隔通过s.c接种给Tg2576注射6次以氢氧化铝(ALUM)作为佐剂的AFFITOPE疫苗。对照小鼠只接受PBS-ALUM。被淀粉状蛋白斑占据的面积显示为对照组的百分比。Gr1...对照组；Gr2...接受p4395。

实施例

方法

用于依照下面的实施例的模拟表位鉴定的抗体检测自人Aβ衍生的氨基酸序列但不结合全长人APP。所检测的序列包括EFRHDS(＝Aβ初始表位aa3-8)，p(E)FRHDS(＝经修饰的Aβ初始表位aa3-8)，EVHHQK(＝Aβ初始表位aa11-16)。抗体可以是单克隆或多克隆抗体制备物或其任何抗体部分或衍生物，唯一的先决条件在于抗体分子特异性识别至少一种上文所述(自人Aβ衍生的)表位，但不结合全长人APP。

用此类单克隆抗体和肽文库鉴定并进一步表征模拟表位。

实施例1：生成单克隆抗体，以特异性检测β-淀粉样蛋白和N端截短的和/或翻译后修饰的β-淀粉样蛋白片段

实施例1a：单克隆抗体MV-001的生成

生成了自实验Alz-5的融合物衍生的单克隆抗体。在实验Alz-5中，给C57/B16小鼠重复免疫接种偶联至KLH(匙孔血蓝蛋白)和作为佐剂的Alum(氢氧化铝)的初始Aβ表位DAEFRHDSGYC。通过ELISA(经p1253和p4371肽包被的ELISA板)来检测p4371肽特异性抗体生成型杂交瘤。人Aβ40/42(重组蛋白)用作阳性对照肽：包括识别在ELISA板上固定化的重组蛋白的杂交瘤，因为它们特异性结合肽和全长Aβ二者。P1454(人Aβ33-40)用作阴性对照肽。另外，针对p4373测试杂交瘤。只有没有p4373结合或具有有限p4373结合的杂交瘤用于进一步的抗体开发。

纯化杂交瘤克隆(MV-001(内部名称824；IgG1)并分别分析对p1253，p4371，p4373，p1454和Aβ的特异性检测。MV-001在ELISA中识别注射的表位(p1253)以及特定表位(p4371)和全长Aβ蛋白(重组蛋白；得自Bachem AG，Bubendorf，Switzerland)。然而，它在ELISA中不检测p1454。另外，MV-001抗体基本上不能检测编码Aβ3-10的焦谷氨酸型式的肽p4373(滴度比初始表位低30倍)。

实施例1b：单克隆抗体MV-003的生成

生成了自实验Alz-16的融合物衍生的单克隆抗体。在实验Alz-16中，给BalbC小鼠重复免疫接种偶联至KLH(匙孔血蓝蛋白)和作为佐剂的Alum(氢氧化铝)的表位p(E)FRHDSC(p4373)。通过ELISA(经p4373肽包被的ELISA板)来检测p4373肽特异性抗体生成型杂交瘤。p1253，p1454和Aβ40/42用作阴性对照肽。另外，针对p4371测试杂交瘤。只有没有p4371结合或具有有限p4371结合的杂交瘤用于进一步的抗体开发以保证焦谷氨酸特异性。

纯化杂交瘤克隆(MV-003(内部名称D129；IgG1)并分别分析对p1253，p4371，p4373，p1454和Aβ的特异性检测。MV-003在ELISA中识别注射的表位(p4373)但不能检测p1454，p1253或全长Aβ蛋白(重组蛋白；得自BachemAG，Bubendorf，Switzerland)。另外，MV-003抗体不能检测编码Aβ3-10的正常型式的肽p4371(滴度比初始表位低15倍)。

实施例1c：单克隆抗体MV-004的生成

生成了自实验Alz-15的融合物衍生的单克隆抗体。在实验Alz-15中，给BalbC小鼠重复免疫接种偶联至KLH(匙孔血蓝蛋白)和作为佐剂的Alum(氢氧化铝)的表位EVHHQKC(p4372)。通过ELISA(经p4372肽包被的ELISA板)来检测p4372肽特异性抗体生成型杂交瘤。P4376，p4378，p1454和Aβ40/42用作阴性对照肽。只有没有p4376和p4378结合或具有有限p4376和p4378结合的杂交瘤用于进一步的抗体开发以保证针对位置aa11处游离N末端的特异性。

纯化杂交瘤克隆(MV-004(内部名称B204；IgG1)并分别分析对p4372，p4376，p4378，p1454和Aβ的特异性检测。MV-004在ELISA中识别注射的表位(p4372)但不能检测p1454，p4376和p4378以及全长Aβ蛋白(重组蛋白；得自Bachem AG，Bubendorf，Switzerland)。不能检测p4376，p4378证明了对截短的Aβ中位置aa11处游离N末端的特异性。

实施例2：噬菌体展示，体外结合和抑制ELISA

此实施例中使用的噬菌体展示文库为Ph.D.7：New England BioLabsE8102L(线性7聚物文库)。依照制造商的方案(www.neb.com)进行噬菌体展示。

2或3个后续轮次的淘选后，挑取单个噬菌体克隆，在包被了淘选过程所用抗体的板上对噬菌体上清液进行ELISA。对在此ELISA中呈阳性(对靶物的信号强，但对非特异性对照无信号)的噬菌体克隆测序。根据DNA序列，推导肽序列。合成这些肽并在结合和抑制ELISA中表征。另外，将所述筛选中鉴定出的模拟表位的序列信息组合，创建了一些新模拟表位，以便鉴定用于模拟表位免疫接种的共有序列。

1.体外结合测定法(ELISA)

将自噬菌体展示衍生的肽及其变体偶联至BSA并结合至ELISA板(1μM；如各图中指示的)并随后与用于筛选过程的单克隆抗体一起温育以分析所鉴定的肽的结合能力。

2.体外抑制测定法(ELISA)

将不同量的自噬菌体展示衍生的肽(浓度范围10μg至0.08μg；连续稀释)与用于筛选过程的单克隆抗体一起温育。降低后续的抗体对ELISA板上包被的初始表位的结合的肽被认为是在此测定法中是抑制性的。

实施例3：体内测试模拟表位：分析免疫原性和交叉反应性

1.对模拟表位的体内测试

将抑制性以及非抑制性肽偶联至KLH并与适宜的佐剂(氢氧化铝)一起注射入小鼠(野生型C57/B16小鼠；皮下注射入体侧)。以两周间隔给动物免疫接种3-6次并两周一次采集血清。用每一份血清测定对注射的肽以及对无关肽的滴度。另外，分别测定针对重组人Aβ蛋白和针对初始肽的滴度。一般而言，通过针对在ELISA板上固定化的肽(偶联至牛血清清蛋白(BSA))和重组全长蛋白的反应来分析血清。使用抗小鼠IgG特异性抗体来测定滴度。关于详细的结果，分别见图6，7和8。

2.结果

2.1.针对N端截短的和修饰形式的Aβ的特异性单克隆抗体(mAB)的鉴定：

图1描绘自实验Alz-5衍生的单克隆抗体MV-001(内部名称824；IgG1)的表征，证明了对全长Aβ和在位置E3处截短的Aβ的特异性。

图2描绘自实验Alz-16衍生的单克隆抗体MV-003(内部名称D129；IgG1)的表征，证明了对在位置p(E)3处截短和翻译后修饰的Aβ的特异性。

图3描绘自实验Alz-15衍生的单克隆抗体MV-004(内部名称B204；IgG1)的表征，证明了对在位置E11处截短的Aβ的特异性。

2.2.针对N端截短的和修饰形式的Aβ的特异性mAB的筛选：

2.2.1.噬菌体展示文库Ph.D.7

2.2.1.1.针对p4373的单克隆抗体的筛选

在此筛选中通过筛选PhD 7噬菌体展示文库鉴定了8种序列。表1A总结了所鉴定的肽及其与初始表位相比的结合能力。

2.2.1.2.针对p4372的单克隆抗体的筛选

在此筛选中通过筛选PhD 7噬菌体展示文库鉴定了9种序列。表1B总结了所鉴定的肽及其与初始表位相比的结合能力。

2.2.1.3.针对p4371的单克隆抗体的筛选

在此筛选中通过筛选PhD 7和PhD12噬菌体展示文库鉴定了71种序列。

表1C总结了所鉴定的肽及其与初始表位相比的结合能力。

表1A：结合亲本抗体MV-003的模拟表位

内部肽编号	SEQ ID No.	序列	结合能力
				p4395	1	IRWDTPC	2
p4396	2	VRWDVYPC	1
				p4397	3	IRYDAPLC	1
p4399	4	IRYDMAGC	1
				p4728	5	IRWDTSLC	3
p4756	6	IRWDQPC	3
				p4792	7	IRWDGC	1
p4793	8	IRWDGGC	2

对表1A的说明：结合能力用下面的结合代码编码：1：X描述亲本AB的稀释因子。

结合代码		OD半最大1：X
			0	无结合	：0
1	弱结合	：＜16000
			2	中等结合	：16-60000
3	强结合	：＞60000

表1B：结合亲本抗体MV-004的模拟表位

内部肽编号	SEQ ID No.	序列	结合能力
				p4417	9	EVWHRHQC	2
p4418	10	ERWHEKHC	3
				p4419	11	EVWHRLQC	3
p4420	12	ELWHRYPC	2
				p4665	13	ELWHRAFC	2
p4786	14	ELWHRAC	1
				p4788	15	EVWHRGC	1
p4789	16	EVWHRHC	1
				p4790	17	ERWHEKC	1

对表1B的说明：结合能力用下面的结合代码编码：1：X描述亲本AB的稀释因子。

结合代码		OD半最大1：X
			0	无结合	：0
1	弱结合	：＜24000
			2	中等结合	：24-96000
3	强结合	：＞96000

表1C：结合亲本抗体MV-001的模拟表位

内部肽编号	SEQ ID No.	序列	结合能力
				p4380	18	QDFRHYC	2
p4381	19	SEFKHGC	3
				p4382	20	TSFRHGC	2
p4383	21	TSVFRHC	3
				p4384	22	TPFRHTC	2
p4385	23	SQFRHYC	2
				p4386	24	LMFRHNC	3
p4387	25	SAFRHHC	2
				p4388	26	LPFRHGC	2
p4389	27	SHFRHGC	2
				p4390	28	ILFRHGC	3
p4391	29	QFKHDLC	2
				p4392	30	NWFPHPC	1
p4393	31	EEFKYSC	2
				p4701	32	NELRHSTC	3
p4702	33	GEMRHQPC	3
				p4703	34	DTYFPRSC	2
p4704	35	VELRHSRC	2
				p4705	36	YSMRHDAC	2
p4706	37	AANYFPRC	2
				p4707	38	SPNQFRHC	3
p4708	39	SSSFFPRC	2

p4709	40	EDWFFWHC	1
				p4710	41	SAGSFRHC	3
p4711	42	QVMRHHAC	2
				p4712	43	SEFSHSSC	3
p4713	44	QPNLFYHC	1
				p4714	45	ELFKHHLC	3
p4715	46	TLHEFRHC	3
				p4716	47	ATFRHSPC	2
p4717	48	APMYFPHC	2
				p4718	49	TYFSHSLC	2
p4719	50	HEPLFSHC	1
				p4721	51	SLMRHSSC	2
p4722	52	EFLRHTLC	3
				p4723	53	ATPLFRHC	3
p4724	54	QELKRYYC	1
				p4725	55	THTDFRHC	3
p4726	56	LHIPFRHC	3
				p4727	57	NELFKHFC	2
p4729	58	SQYFPRPC	2
				p4730	59	DEHPFRHC	3
p4731	60	MLPFRHGC	2
				p4732	61	SAMRHSLC	2
p4733	62	TPLMFWHC	1
				p4734	63	LQFKHSTC	2
p4735	64	ATFRHSTC	2
				p4736	65	TGLMFKHC	2
p4737	66	AEFSHWHC	2
				p4738	67	QSEFKHWC	3
p4739	68	AEFMHSVC	2
				p4740	69	ADHDFRHC	3

p4741	70	DGLLFKHC	3
				p4742	71	IGFRHDSC	2
p4743	72	SNSEFRRC	3
				p4744	73	SELRHSTC	3
p4745	74	THMEFRRC	3
				p4746	75	EELRHSVC	3
p4747	76	QLFKHSPC	3
				p4748	77	YEFRHAQC	3
p4749	78	SNFRHSVC	3
				p4750	79	APIQFRHC	3
p4751	80	AYFPHTSC	2
				p4752	81	NSSELRHC	3
p4753	82	TEFRHKAC	3
				p4754	83	TSTEMWHC	1
p4755	84	SQSYFKHC	3
				p4800	85	CSEFKH	3
p4801	86	SEFKHC	3
				p4802	87	CHEFRH	3
p4803	88	HEFRHC	3

对表1C的说明：结合能力用下面的结合代码编码：1：X描述亲本AB的稀释因子。

结合代码		OD半最大1：X
			0	无结合	：0
1	弱结合	：＜4000
			2	中等结合	：4000-20000
3	强结合	：＞20000

2.3.体外表征模拟表位，所述表位是在用针对N端截短的和修饰形式的Aβ的单克隆抗体筛选噬菌体展示文库时鉴定出的：

图4和5显示用于在体外表征模拟表位的结合和抑制测定法的代表性例子。获得的数据分别总结于表1和2。

MV-003模拟表位：在所呈现的8种序列中，6种序列在体外竞争实验中抑制p(E)3-7Aβ特异性单克隆抗体的结合。另2种序列被鉴定为在体外竞争实验中不抑制单克隆抗体的结合但仍保留对亲本抗体的结合能力(表2A)。

MV-004模拟表位：所有所呈现的9种序列在体外竞争实验中都抑制特异性结合在位置E11处截短的Aβ的游离N末端的单克隆抗体的结合(表2B)。

MV-001模拟表位：在所呈现的71种序列中，27种序列在体外竞争实验中抑制特异性针对在位置E3处截短的Aβ的单克隆抗体的结合。另44种序列被鉴定为在体外竞争实验中不抑制单克隆抗体的结合但仍保留对亲本抗体的结合能力(表2C)。

表2：在本发明中鉴定的，在抑制测定法中给出阳性结果的模拟表位

表2A：MV-003模拟表位

内部肽编号	SEQ ID No.	序列	抑制能力
				p4395	1	IRWDTPC	1
p4397	3	IRYDAPLC	1
				p4728	5	IRWDTSLC	2
p4756	6	IRWDQPC	1
				p4792	7	IRWDGC	1
p4793	8	IRWDGGC	1

对表2A的说明：抑制能力用下面的代码编码：

弱抑制意味着降低AB结合需要比初始表位要多的肽；强抑制意味着降低AB结合需要的模拟表位和初始表位的肽量相似。将模拟表位与作为标准的初始肽比较。使用测定法中10ug肽时的OD来计算与初始肽相比的竞争能力。

竞争代码
		0	无抑制(10ug肽的OD高于初始肽12倍)
1	比初始表位要弱(10ug肽的OD低于初始肽12倍)
		2	强抑制(像初始表位一样；10ug肽的OD低于初始肽的5倍)

表2B：MV-004模拟表位

内部肽编号	SEQ ID No.	序列	抑制能力
				p4417	9	EVWHRHQC	1
p4418	10	ERWHEKHC	2

p4419	11	EVWHRLQC	2
				p4420	12	ELWHRYPC	1
p4665	13	ELWHRAFC	2
				p4786	14	ELWHRAC	1
p4788	15	EVWHRGC	1
				p4789	16	EVWHRHC	1
p4790	17	ERWHEKC	2

对表2B的说明：抑制能力用下面的代码编码：

竞争代码
		0	无抑制(10ug肽的OD高于初始肽5倍)
1	比初始表位要弱(10ug肽的OD低于初始肽5倍)
		2	强抑制(像初始表位一样；10ug肽的OD低于初始肽的2倍)

表2C：MV-001模拟表位

内部肽编号	SEQ ID No.	序列	抑制能力
				p4380	18	QDFRHYC	1
p4381	19	SEFKHGC	1
				p4382	20	TSFRHGC	1
p4383	21	TSVFRHC	1
				p4384	22	TPFRHTC	1
p4385	23	SQFRHYC	1
				p4386	24	LMFRHNC	1
p4387	25	SAFRHHC	1
				p4388	26	LPFRHGC	1
p4389	27	SHFRHGC	1
				p4390	28	ILFRHGC	1
p4391	29	QFKHDLC	1
				p4392	30	NWFPHPC	1

p4393	31	EEFKYSC	1
				p4707	38	SPNQFRHC	1
p4715	46	TLHEFRHC	2
				p4725	55	THTDFRHC	1
p4730	59	DEHPFRHC	1
				p4738	67	QSEFKHWC	1
p4740	69	ADHDFRHC	1
				p4741	70	DGLLFKHC	1
p4746	75	EELRHSVC	1
				p4753	82	TEFRHKAC	2
p4800	85	CSEFKH	2
				p4801	86	SEFKHC	1
p4802	87	CHEFRH	2
				p4803	88	HEFRHC	2

对表2C的说明：抑制能力用下面的代码编码：

竞争代码
		0	无抑制(10ug肽的OD高于初始肽3倍)
1	比初始表位要弱(10ug肽的OD低于初始肽3倍)
		2	强抑制(像初始表位一样；10ug肽的OD低于初始肽的2倍)

表3：非模拟表位肽

2.4.体内表征模拟表位，所述表位是在用针对N端截短的和修饰形式的Aβ的单克隆抗体筛选噬菌体展示文库时鉴定出的：

给雌性C57/b16小鼠，每组5-6只小鼠，皮下免疫接种30μg偶联至KLH的肽。给对照组施用初始表位-KLH偶联物。使用明矾作为佐剂(始终每只小鼠1mg)。所施用的肽都能够特异性结合单克隆抗体，尽管一些肽在体外(在体外抑制测定法中)不抑制初始表位对其亲本抗体的结合。以两周间隔用每次免疫接种后单只小鼠的血清实施体外ELISA测定法以测定抗体滴度(分别见图6和7)。将ELISA板的孔用模拟表位-BSA偶联物和无关肽-BSA偶联物(阴性对照)包被。通过亲本抗体与各模拟表位-BSA偶联物的反应来实施阳性对照。用抗小鼠IgG来实施检测。另外，在ELISA板上固定化重组蛋白并相应地使血清反应。图6至8显示用于在体内表征模拟表位的测定法的代表性例子。

图6显示通过分析针对注射的肽和含有无关序列的无关肽的免疫应答对通过模拟表位免疫接种引发的免疫应答的体内表征的例子。在所显示的所有三个例子中，初始表位和模拟表位引发针对注射的肽的免疫应答但不能诱导针对无关序列(p1454)的有关免疫应答。

作为MV-003模拟表位的例子，初始表位p4373和模拟表位p4395，p4396，p4397，和p4399描绘于图6A。所有疫苗都引起相似的针对它们各自模拟表位的免疫应答。用初始表位p4373疫苗处理的动物或用模拟表位p4395，p4396，p4397或p4399疫苗处理的动物都没有引起针对无关肽p1454的有关滴度(比注射的肽低11倍-25倍)。

作为MV-004模拟表位的例子，初始表位p4372和模拟表位p4417，p4418，p4419，和p4420描绘于图6B。所有疫苗都引起相似的针对它们各自模拟表位的免疫应答。用初始表位p4372疫苗处理的动物或用模拟表位p4417，p4418，p4419，和p4420疫苗处理的动物都没有引起针对无关肽p1454的有关滴度(比注射的肽低20-80倍)。

作为MV-001模拟表位的例子，初始表位p4371和模拟表位p4381，p4382，和p4390描绘于图6C。所有疫苗都引起相似的针对它们各自模拟表位的免疫应答。用初始表位p4371疫苗处理的动物或用模拟表位p4381，p4382，和p4390疫苗处理的动物都没有引起针对无关肽p1454的有关滴度(比注射的肽低＞10倍)。

图7显示对通过针对亲本抗体的各个初始表位以及针对自Aβ的其它截短形式衍生的肽的模拟表位免疫接种引发的免疫应答的体内表征的例子。

作为MV-003模拟表位的例子，初始表位p4373和模拟表位p4395，p4396，p4397，和p4399描绘于图7A。3/4的所示模拟表位疫苗引起可检测的针对初始表位p4373的免疫应答。分析针对如p4371展示的未修饰形式的交叉反应性，能检测到类似的现象。初始表位p4373疫苗和2/4的模拟表位疫苗引起针对p4371的有关滴度。令人惊讶的是，通过特异性结合p4373的MV-003选择的模拟表位也诱导与未修饰形式的初始表位起交叉反应的免疫反应。

作为MV-004模拟表位的例子，初始表位p4372和模拟表位p4417，p4418，p4419，和p4420描绘于图7B。3/4的所示模拟表位疫苗引起可检测的针对初始表位p4372的免疫应答。

作为MV-001模拟表位的例子，初始表位p4371和模拟表位p4381，p4382，和p4390描绘于图7C。所有所示模拟表位疫苗都引起可检测的针对初始表位p4371的免疫应答。分析针对如p4373展示的焦谷氨酸修饰形式的交叉反应性，能检测到与关于MV-003衍生模拟表位所述类似的现象。初始表位p4371疫苗和所有模拟表位疫苗都引起针对p4373的有关滴度。令人惊讶的是，通过特异性结合p4371的MV-001选择的模拟表位诱导比初始表位诱导的免疫反应或亲本抗体要好的与未修饰形式的初始表位起交叉反应的免疫反应。如此，这些模拟表位可令人惊讶地诱导但不是必然诱导比亲本抗体要宽泛的免疫反应而且可用于更宽泛地靶向多种形式的Aβ。

图8显示通过针对全长Aβ的模拟表位免疫接种引发的免疫应答的体内表征的例子。令人惊讶的是，通过使用MV-001和MV-003选择的模拟表位不仅诱导了与用于创建抗体的截短或修饰的短表位的交叉反应，而且诱导了与全长未修饰形式的Aβ的交叉反应性，就像初始序列一样好或甚至比p4371/p4373更有效。对于MV-002初始表位以及对于所鉴定的模拟表位，检测不到此类交叉反应性，证明了抗体的特异性转移至未修饰Aβ11-40/42的游离N末端。如此，本发明中呈现的模拟表位构成优化的疫苗候选物来靶向广谱的天然存在形式的Aβ肽，像在AD患者的脑中已经找到的那些。所述形式分别包括但不限于Aβ1-40/42，和N端截短的形式像Aβ3-40/42，Aβ(pE)3-40/42和未修饰的Aβ11-40/42。

在表4和5中，描述了通过使用MV-001和MV-003衍生模拟表位通过针对全长Aβ的模拟表位免疫接种引发的免疫应答的其它例子。

表4：模拟表位的体内表征：MV-001

内部肽编号	SEQ ID No.	Aβ/截短/修饰形式的检测
			p4381	19	+
p4383	21	+
			p4385	23	+
p4386	24	+
			p4390	28	+
p4707	38	+
			p4714	45	+
p4715	46	+
			p4725	55	+
p4730	59	+
			p4738	67	+
p4740	69	+
			p4748	77	+
p4753	82	+

表4中列出的所有肽引起针对全长和/或截短和修饰形式的Aβ或其片段的特异性免疫反应。

表5：模拟表位的体内表征：MV-003

内部肽编号	SEQ ID No.	Aβ/截短/修饰形式的检测
			p4395	1	+
p4396	2	+
			p4397	3	+

p4399

4

+

表5中列出的所有肽引起针对全长和/或截短和修饰形式的Aβ或其片段的特异性免疫反应。

2.5.模拟表位在转基因动物中减轻AD样疾病的体内表征

使用Tg2576AD小鼠来研究模拟表位疫苗的临床前功效。这种转基因系在仓鼠朊病毒蛋白质(PrP)启动子控制下表达在aa位置670/671处携带瑞典双重突变的人APP，这导致蛋白质的过表达。它是当前AD研究中最广泛采用的模型之一。Tg2576模型再现AD病理的各种标志，包括疾病特异性淀粉状蛋白斑沉积和星形细胞增多。正如迄今可得的所有其它AD模型系统，它不反映AD的所有主要神经病理特征。

为了评估用模拟表位处理是否能够预防大脑Aβ累积，以一个月间隔给Tg2576小鼠s.c注射6次吸附至ALUM(佐剂：氢氧化铝)的肽-KLH偶联物或单独的吸附至ALUM的PBS(称作PBS或对照)。直至最后一次免疫接种后8周，处死动物，收获它们的脑并分析它们的Aβ载荷(AD样病理)。在深度麻醉下处死小鼠。随后，分离脑，在4％PFA中固定并通过梯度乙醇系列来脱水，接着在二甲苯中温育及石蜡包埋。使用显微切片机将每一个石蜡包埋的脑以7μM切片并将切片安装在载玻片上。

作为测定Tg2576动物中AD样病理的一种方法，我们分析经处理动物的脑中被淀粉样蛋白沉积物占据的相对面积。使用自动化面积识别程序来实施这种分析。为了鉴定斑，将切片用单克隆抗体(mAb)3A5(对Aβ40/42特异性的)染色。将经模拟表位处理的动物与对照动物比较。在13.5-14月龄时处死所有动物。为了这种分析，选择覆盖皮质和海马的3片载玻片/动物，用mAb3A5染色并随后使用Mirax-system(Zeiss)记录。为了计算被淀粉状蛋白斑占据的面积，我们分析多至4片切片/载玻片并在检查结果图片后排除携带组织假象和异常染色强度的切片。

对于自MV001衍生的模拟表位，使用三种例示候选物实施了面积分析。使用肽-KLH偶联物疫苗进行重复免疫接种后实施分析。对照组显示出平均占据0.35％，比较而言，经模拟表位处理的动物分别为0.11％，0.14％和0.22％。这对应于模拟表位处理后第2组中67％的降低，第3组中60％的降低和第4组中36％的降低(见图9)。

对MV003衍生模拟表位组能检测到类似的图片。这里描绘了p4395的例子。正如关于MV001衍生模拟表位描述的，实施了肽偶联物免疫接种后被淀粉状蛋白斑占据的面积分析。对照组显示出平均占据0.35％，比较而言，经模拟表位处理的动物分别为0.21％。这对应于模拟表位处理后第2组中38％的降低(见图10)。

如此，这组数据清楚地指示模拟表位疫苗处理对转基因动物中AD样病理的有益效果。

Claims

1.肽化合物在生产用于预防和/或治疗阿尔茨海默氏病的药物中的用途，所述肽化合物选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NOs:1-4,9-12,19-20和28，并且所述肽化合物为静脉内，皮下，皮内或肌肉内施用而配制。

2.依照权利要求1的用途，其特征在于所述肽化合物偶联至药学可接受载体。

3.依照权利要求2的用途，所述药学可接受载体是匙孔虫戚血蓝蛋白。

4.依照权利要求1-3任一项的用途，其特征在于所述肽化合物与佐剂一起配制。

5.依照权利要求4的用途，所述佐剂是氢氧化铝。

6.依照权利要求1的用途，其特征在于所述肽化合物以0.1ng至10mg的量包含在药物中。

7.依照权利要求1的用途，其特征在于所述肽化合物以从10ng至1mg的量包含在所述药物中。

8.依照权利要求1的用途，其特征在于所述肽化合物以从100ng至10μg的量包含在所述药物中。

9.选自下组的氨基酸序列所示的肽：SEQ ID NOs:1-4,9-12,19-20和28。

10.肽化合物，其特征在于选自下组的氨基酸序列所示的肽：SEQ ID NOs:1-4,9-12,19-20和28偶联至药学可接受载体。

11.依照权利要求10的肽化合物，所述药学可接受载体是匙孔虫戚血蓝蛋白。

12.药物配制剂，其包含至少一种依照权利要求9的肽。

13.药物配制剂，其包含至少一种依照权利要求10或11的肽化合物。