CN102123728B

CN102123728B - 用于治疗淀粉样变的化合物

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Publication number: CN102123728B
Application number: CN200980131376.3A
Authority: CN
Inventors: 马库斯·曼德勒; 拉德米拉·桑蒂克; 哈拉尔德·韦宁格; 伊迪思·科皮尼茨
Original assignee: Affiris AG
Current assignee: Affiris AG
Priority date: 2008-06-12
Filing date: 2009-06-12
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2029-06-12
Also published as: AT509611A1; AT506820B1; AU2009257168B2; CA2723967A1; RU2011100125A; CN102123728A; US8409581B2; WO2009149485A3; JP2015110588A; IL209894A; EP2310033B1; MX2010013657A; AU2009257168A1; RU2491953C2; JP2011522840A; AT506820A1; AT509611B1; JP2014139227A; BRPI0915136A2; IL209894A0

Abstract

本发明涉及模拟表位在治疗β‑淀粉样变包括但不限于阿尔茨海默氏病中的用途，由此所述模拟表位能够在体内在不干扰APP信号传导的生理功能的情况中诱导针对非截短的Aβ1‑40/42，及N端截短形式AβpE3‑40/42，Aβ3‑40/42，Aβ11‑40/42，AβpE11‑40/42和Aβ14‑40/42的抗体形成。

Description

用于治疗淀粉样变的化合物

本发明涉及与β-淀粉样蛋白形成和/或聚集(β-淀粉样变)有关的疾病的预防，治疗和诊断。更具体地说，本发明提供引发针对β-淀粉样蛋白和N端截短型和/或翻译后修饰型β-淀粉样蛋白片段的免疫应答的新模拟表位和识别所述模拟表位和Aβ肽的新抗体，供与β-淀粉样蛋白形成和/或聚集有关的疾的预防，治疗和诊断中使用。

各种变性性疾病的特征在于特定蛋白质的异常聚合和累积，所谓的蛋白病(proteopathy)。本发明涉及与术语β-淀粉样变下总结的β-淀粉样蛋白蛋白质有关的蛋白病的预防，治疗和诊断。β-淀粉样变的最突出形式是阿尔茨海默氏病(AD)。其它例子包括但不限于具有Lewy小体的痴呆和唐氏综合征中的痴呆。

AD是人中最常见形式的痴呆。迄今没有有效的治疗方法来终止人患者中的渐进性神经变性及相关认知衰退。AD的特征在于细胞外淀粉状蛋白斑的异常累积-与广泛的星形细胞增多和微观神经胶质增多(microgliosis)以及神经元营养不良(dystrophicneurons)和神经元损失密切相关。这些淀粉状蛋白斑主要由淀粉样蛋白-β(Aβ；其衍生自APP(gi：112927))肽Aβ40和Aβ42组成，其衍生自在神经系统中的多种细胞类型上表达的淀粉样蛋白前体蛋白(APP)。Aβ肽被认为是直接涉及AD的发病和进展。因此，在AD患者中降低脑中的Aβ负荷预测减缓或停止疾病进展且还能终止认知衰退。

APP在正常情况中通过两个切割步骤来加工，形成当前已知形式的Aβx-40/42/43。第一次切割由所谓的β-位点APP切割酶1和2(BACE1和BACE2)实施；第二个蛋白水解步骤由γ-分泌酶复合物实施。

BACE酶识别假定Aβ肽的N端部分中的两个位点，而且BACE的蛋白水解活性导致Aβ1-X和11-X分别形成。如此，BACE介导的APP加工创建多种不同Aβ种类，主要成分为全长Aβ1-40/42。γ-分泌酶活性导致3种主要片段生成：Aβ1-40/42/43。一旦这些肽生成，它们就被氨肽酶进一步加工，导致它们后续的逐步降解。这些进一步的步骤分别导致其它形式像例如Aβ3-40/42形成。

APP加工中涉及的第三个蛋白水解酶家族是所谓的α-分泌酶家族(ADAM(′一种解联蛋白和金属蛋白酶′)家族)。α-分泌酶切割淀粉样蛋白前体蛋白(APP)(在其跨膜区中进行，介于Aβ肽序列的aa16和aa17之间)且排除Aβ肽形成。如此，α-分泌酶切割是非淀粉样蛋白生成性APP加工的至关重要步骤。具体而言，α-分泌酶切割导致称作sAPPα的分泌形式释放。sAPPα被认为是足以介导APP的大多数生理功能且可充当信号传导分子。有证据提示脱落的胞外域在培养的成纤维细胞的生长中发挥作用。发现sAPP对于培养的原代神经元是神经保护性的，阻止由葡萄糖剥夺引起的细胞内Ca2+水平升高且提高谷氨酸盐的兴奋性中毒阈值，以及介导轴突和树突生长。

在人中，平均60-85％的淀粉状蛋白斑材料由N端截短的和常常修饰的Aβ40/42衍生物形成。N端截短的Aβ种类的相对量关于Aβ水平，突变和BACE活性是多变的。最丰富的截短形式的Aβ是：Aβ3-40/42和Aβ11-40/42，认为占到所有截短形式的多达50％。这意味着这些同等型(isoform)占AD脑中所有淀粉样蛋白肽的25-40％。这两种肽都含有N端谷氨酸残基，它常常被酶促修饰成焦谷氨酸，分别导致Aβ3(pE)-40/42和Aβ11(pE)-40/42形成。因为Aβ3(pE)和11(pE)肽的氨基末端被内部内酰胺所封闭，所以它受到保护免于焦谷氨酸特异性氨肽酶以外的氨肽酶的蛋白水解作用且能如此在组织中保持稳定。在AD患者中能检测到别的自β-淀粉样蛋白位置2，3，4，5，6，7，8，9，或10起始的N端截短的淀粉样蛋白变体。这些形式常常受到翻译后修饰，例如甲基化。

先前显示了截短的和修饰的肽在神经组织中比全长Aβ要更稳定。另外，N端截短形式的Aβ比未修饰的Aβ肽更能生成淀粉样蛋白，如此提高斑形成的速率，而且还在应用于培养的神经元时以及在体内实验中显示神经毒性活性。截短形式的Aβ早就能在AD早期阶段中Aβ的弥漫性聚集中检测到，而且可能涉及早期斑形成，在体内起各种子的作用。由于这些效果，有人提出Aβx-40/42肽可启动和/或促进斑形成，或许通过起成核中心的作用，作为相对较少生成淀粉样蛋白但明显更丰富的全长Aβ肽的后续沉积的种子。另外，有令人信服的证据表明N端截短的Aβ种类的存在与散发性和家族性阿尔茨海默氏病以及唐氏综合征患者中神经变性的早期发作和严重性升高有关。来自此类患者的数据暗示截短的Aβ种类的早期形成与疾病发作以及进展之间的联系。总之，这些发现预测在体外和在AD脑中证明存在的Aβ肽N端异质性可能促进Aβ沉积成斑。如此，促成在Aβ的N端结构域内切割APP的蛋白水解事件在AD及相关病症的发病机制中可能是相当大的意义。

根据这些发现，降低AD患者中这些肽种类的量以改变疾病进展及降低毒性和伴随的认知衰退似乎是重要的。一种最佳的AD疫苗应当如此在不干扰APP信号传导的生理功能(特别是sAPPα的功能)的情况中引发如下的免疫应答，其能够靶向AD患者的脑中存在的最突出形式的Aβ肽，Aβ1-40/42，Aβ3-40/42以及Aβ3(p)E-40/42和Aβ11-40/42以及Aβ11(p)E-40/42。

在AD的动物模型中，使用针对全长Aβ的主动和被动免疫接种策略的免疫治疗性处理导致Aβ斑缩小/减少，而且对疾病进展具有有益影响。所有在小鼠模型中测试的主动免疫接种办法使用全长Aβ40/42或含有Aβ天然序列的片段。

然而，由于严重的神经炎症副作用，包括自身反应性T细胞的脑浸润(Nicoll，J.A.et al.2003 Nat Med 9：448-452；Bayer，A.J.，et al.2005 Neurology64：94-101)，使用全长Aβ42作为抗原在AD患者中进行的第一次IIa期临床免疫接种试验不得不停止。不过，调查在用AN-1792处理的患者中的临床效果的研究揭示，发生了针对Aβ42的抗体应答但没有遭受脑膜脑炎的患者在认识测试中表现比不响应的患者要好，指示免疫疗法会是AD的有用治疗办法。

最重要的是，最近自分析接受过AN1792免疫接种的患者尸检案例获得的结果显示了全长Aβ种类自脑清除，但是N端截短形式的Aβ得到维持(Nicoll，J.A.，et al.2006 JNeuropathol Exp Neurol 65：1040-1048)。这强调靶向全长Aβ以及N端截短和修饰形式的这种分子的新疫苗发明的必要性。

在人中诱导针对Aβ40/42肽的免疫应答会干预AD患者中的认知衰退，但是安全的阿尔茨海默氏病疫苗必须避免自身反应性T细胞形成。使用天然Aβ40/42肽或其片段的免疫接种遭受在患者中诱导自身免疫性疾病的内在风险，因为免疫应答不能专一地靶向Aβ。

本发明的一个目的是提供可用于治疗和/或预防阿尔茨海默氏病的化合物和药物。这些化合物应当在给个体施用时不显示诱导自身免疫性疾病的风险或显示显著降低的诱导自身免疫性疾病的风险。依照本发明的另一个目的，所述化合物能够在体内在个体中诱导针对截短和/或稳定形式的Aβ(它们通常是淀粉样蛋白沉积物的主要成分)的抗体形成。

因此，本发明涉及至少一种包含下述氨基酸序列的化合物在生产用于预防和/或治疗阿尔茨海默氏病的药物中的用途，

(X₁)_mHX₂X₃X₄X₅FX₆(X₇)_n (式II)，

其中

X₁为丝氨酸(S)，苏氨酸(T)或半胱氨酸(C)，

X₂为谷氨酰胺(Q)，苏氨酸(T)或甲硫氨酸(M)，

X₃为赖氨酸(K)或精氨酸(R)，

X₄为亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，

X₅为色氨酸(W)，酪氨酸(Y)，苯丙氨酸(F)或异亮氨酸(I)，

X₆为天冬酰胺(N)，谷氨酸(E)，丙氨酸(A)或半胱氨酸(C)，

X₇为半胱氨酸(C)，

n和m独立地为0或1，

所述化合物具有结合对包含氨基酸序列HQKLVF和/或HQKLVFFAED的淀粉样蛋白β肽(Aβ)表位特异性的抗体的能力。

本文中呈现的发明指如下的抗原，其不包含天然Aβ肽的序列但模拟通过诸如WO2004/062556中记载的模拟表位检测不到的Aβ新表位的结构。此类基于模拟表位的AD疫苗因此诱导与上文所述病理Aβ分子广泛起反应但不与亲本结构起反应的抗体应答。重要的是，通过这些模拟表位诱导的免疫应答不与全长APP和分泌型APPα(sAPPα)相互作用，而且如此免疫接种保留这两种分子的正常生理功能。另外，模拟表位不含有潜在的T细胞自身表位，而且避免诱导有害的自身反应性T细胞。

令人惊讶地发现包含式I氨基酸序列的化合物能够在体内诱导分别针对未截短Aβ形式Aβ1-40/42，和N端截短形式像Aβ3-40/42，Aβ(pE)3-40/42，未修饰的Aβ11-40/42，经修饰的Aβp(E)11-40/42和Aβ14-40/42，还有针对别的自Aβ位置2，4，5，6，7，8，9，或10起始的N端截短的和翻译后修饰的淀粉样蛋白变体的抗体形成。重要的是，这些模拟表位不诱导与自APP切除后sAPPα中存在的新表位的交叉反应性，而且如此不干扰正常sAPPα信号传导。

通过免疫接种本发明的分子(模拟表位)而形成的抗体能够结合上文所列Aβ片段，导致Aβ斑崩解。

式I和II和本文中公开的所有其它肽分子模拟天然存在Aβ肽和变体Aβ1-40/42，AβpE3-40/42，Aβ3-40/42和Aβ11-40/42，AβpE11-40/42和Aβ14-40/42，使得包含本文中公开的氨基酸序列的化合物能够诱导相应抗体形成。别的自Aβ位置2，4，5，6，7，8，9，或10起始的N端截短的和翻译后修饰的淀粉样蛋白变体也可通过此类抗体来检测。

如本文中使用的，“β-淀粉样变(amyloidoses)”指以特定蛋白质的异常聚合和累积(所谓的蛋白病)为特征的多种变性性疾病。本发明涉及在术语“β-淀粉样变”之下概括的β-淀粉样蛋白蛋白质有关的蛋白病的预防，治疗和诊断。β-淀粉样变的最突出形式是阿尔茨海默氏病(AD)。其它例子包括但不限于具有Lewy小体的痴呆和唐氏综合征中的痴呆。进一步的例子是Lewy小体痴呆，肌炎，散发性包含体肌炎，具有淀粉样变的遗传性脑出血(荷兰型)，大脑淀粉样蛋白血管病，Aβ相关血管炎。

施用包含式II氨基酸序列的化合物引起针对与包含式I氨基酸序列的化合物相同的未截短和截短和翻译后修饰形式的Aβ的免疫应答。

依照本发明的一个优选实施方案，所述化合物包含具有选自下组的氨基酸序列的肽：SHTRLYF(C)，HMRLFFN(C)，SHQRLWF(C)，HQKMIFA(C)，HMRMYFE(C)，THQRLWF(C)和HQKMIF(C)，优选选自下组：SHTRLYF(C)，HMRLFFN(C)，HQKMIFA(C)，HMRMYFE(C)，THQRLWF(C)(都能够在体内诱导针对Aβ肽的抗体形成)。

依照本发明的另一个优选实施方案，所述至少一种化合物包含具有氨基酸序列SHTRLYF(C)，SGEYVFH(C)，SGQLKFP(C)，SGQIWFR(C)，SGEIHFN(C)，HMRLFFN(C)，GELWFP(C)，HQKMIFA(C)，GEIWFEG(C)，GEIYFER(C)，THQRLWF(C)，GEIRFGS(C)，GEIKFDH(C)或GEIQFGA(C)，特别是HQKMIFA(C)的肽。

本发明的另一个方面涉及至少一种包含下述氨基酸序列的化合物在生产用于预防和/或治疗阿尔茨海默氏病的药物中的用途，

(X₁)_mGX₂X₃X₄FX₅X₆(X₇)_n (式I)，

其中

X₁为丝氨酸(S)，丙氨酸(A)或半胱氨酸(c)，

X₂为丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，谷氨酸(E)，天冬氨酸(D)，谷氨酰胺(Q)或甲硫氨酸(M)，

X₃为异亮氨酸(I)，酪氨酸(Y)，甲硫氨酸(M)或亮氨酸(L)，

X₄为亮氨酸(L)，精氨酸(R)，谷氨酰胺(Q)，色氨酸(W)，缬氨酸(V)，组氨酸(H)，酪氨酸(Y)，异亮氨酸(I)，赖氨酸(K)，甲硫氨酸(M)或苯丙氨酸(F)，

X₅为丙氨酸(A)，苯丙氨酸(F)，组氨酸(H)，天冬酰胺(N)，精氨酸(R)，谷氨酸(E)，异亮氨酸(I)，谷氨酰胺(Q)，天冬氨酸(D)，脯氨酸(P)或色氨酸(W)，甘氨酸(G)，

X₆为任何氨基酸残基，

X₇为半胱氨酸(C)，

m和n独立地为0或1，

依照本发明的一个优选实施方案，所述化合物包含具有选自下组的氨基酸序列的肽：SGEYVFH(C)，SGQLKFP(C)，SGQIWFR(C)，SGEIHFN(C)，GQIWFIS(C)，GQIIFQS(C)，GQIRFDH(C)，GEMWFAL(C)，GELQFPP(C)，GELWFP(C)，GEMQFFI(C)，GELYFRA(C)，GEIRFAL(C)，GMIVFPH(C)，GEIWFEG(C)，GDLKFPL(C)，GQILFPV(C)，GELFFPK(C)，GQIMFPR(C)，GSLFFWP(C)，GEILFGM(C)，GQLKFPF(C)，GTIFFRD(C)，GQIKFAQ(C)，GTLIFHH(C)，GEIRFGS(C)，GQIQFPL(C)，GEIKFDH(C)，GEIQFGA(C)，GELFFEK(C)，GEIRFEL(C)，GEIYFER(C)，SGEIYFER(C)，AGEIYFER(C)和(C)GEIYFER。

本发明的特别优选的化合物包含上文鉴定的氨基酸序列或由其组成，由此所述肽的C末端可以包含或不包含半胱氨酸残基(通过使用括号所指示的)，使得得到的化合物可以例如偶联至载体分子。然而，当然也有可能将半胱氨酸残基连接至所述肽的N末端。

依照本发明的一个特别优选的实施方案，所述氨基酸序列选自下组：GELWFP(C)，GEIWFEG(C)，GEIYFER(C)，GEILFGM(C)，GEIKFDH(C)，GEIQFGA(C)(都是竞争性肽)和GEIKFDH(C)，GEIRFGS(C)，SGQLKFP(C)，SGQIWFR(C)，SGEIHFN(C)，GELWFP(C)，GEIWFEG(C)，GEIYFER(C)，GEIQFGA(C)，SGEYVFH(C)(都能够在体内诱导针对上文所列Aβ肽的抗体形成)。

本发明的另一个方面涉及至少一种包含选自下组的氨基酸序列的肽在生产用于预防和/或治疗阿尔茨海默氏病的药物中的用途：AIPLFVM(C)，KLPLFVM(C)，QLPLFVL(C)和NDAKIVF(C)。

本发明的每一种化合物均能够在体内诱导针对自Aβ40/42衍生的肽(分别包括Aβ1-40/42，及N端截短形式像Aβ3-40/42，Aβ(pE)3-40/42，未修饰的Aβ11-40/42，修饰的Aβp(E)11-40/42和Aβ14-40/42)的抗体形成。既然本发明的化合物是通过针对Aβ氨基酸残基14至19的抗体分离的，那么本发明的化合物能够诱导能结合自Aβ肽氨基酸位置2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或14起始的Aβ肽截短物的抗体形成。因此，这些化合物特别适合于治疗和/或预防AD，因为施用至少一种所述化合物导致能够识别主要Aβ形式，例如Aβ1-40/42，AβpE3-40/42和Aβ3-40/42的抗体形成。这些模拟表位也不能诱导与自APP切除后sAPPα中存在的新表位的交叉反应性，如此不干扰正常sAPPα信号传导。

本发明的化合物，特别是本发明的肽可以通过酰化和/或乙酰化反应在它们的N端进一步修饰。例如，一种特别优选的化合物包含氨基酸序列AC-GEIYFER(C)。

依照本发明，术语“模拟表位(mimotope)”指具有拓扑学与它所模拟的表位等同的构象的分子。模拟表位结合抗体免疫特异性结合期望抗原的相同抗原结合区。模拟表位会在宿主中引发免疫学应答，其能与它所模拟的抗原起反应。模拟表位还可在涉及表位和结合所述表位的抗体的体外抑制测定法(例如ELISA抑制测定法)中起它所模拟的表位的竞争物的作用。然而，本发明的模拟表位可不必在体外抑制测定法中阻止或竞争它所模拟的表位的结合，尽管它能够在给哺乳动物施用时诱导特异性免疫应答。

如本文中使用的，术语“表位”指抗原受到特定抗体分子识别的免疫原性区。一般而言，抗原会拥有一个或多个表位，每一个均能够结合识别该特定表位的抗体。

本发明的模拟表位可以通过本领域公知的化学合成方法来合成生成，或是作为分离的肽或作为另一肽或多肽的一部分。或者，肽模拟表位可以在生成肽模拟表位的微生物中生成，然后分离并(如果想要的话)进一步纯化。肽模拟表位可以在微生物诸如细菌，酵母或真菌中，在真核细胞诸如哺乳动物或昆虫细胞中，或在重组病毒载体诸如腺病毒，痘病毒，疱疹病毒，Simliki森林病毒，杆状病毒，噬菌体，辛德毕斯病毒或仙台病毒中生成。用于生成肽模拟表位的合适细菌包括大肠杆菌(E.coli)，枯草杆菌(B.subtilis)或能够表达肽诸如肽模拟表位的任何其它细菌。用于表达肽模拟表位的合适酵母类型包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，假丝酵母属(Candida)，巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)或能够表达肽的任何其它酵母。相应的方法是本领域公知的。用于分离和纯化重组生成的肽的方法也是本领域公知的，而且包括例如凝胶过滤，亲和层析，离子交换层析等。

为了便于分离肽模拟表位，可生成融合多肽，其中肽模拟表位翻译融合(共价连接)至能够通过亲和层析来分离的异源多肽。典型的异源多肽为His标签(例如His6；6个组氨酸残基)，GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶)等。融合多肽不见便于纯化模拟表位，而且还能防止模拟表位多肽在纯化期间被降解。如果想要在纯化后除去异源多肽，那么融合多肽可在肽模拟表位与异源多肽之间的接合处包含切割位点。切割位点由受到该位点处的氨基酸序列特异性的酶(例如蛋白酶)切割的氨基酸序列组成。

本发明的模拟表位还可在它们的N和/或C端处或附近修饰，使得在所述位置处结合半胱氨酸残基。在一个优选的实施方案中，末端位置(位于肽的N和C端)的半胱氨酸残基用于经二硫键来环化肽。

本发明的模拟表位还可用于各种测定法和试剂盒，特别是免疫学测定法和试剂盒。因此，特别优选的是，模拟表位可以是另一肽或多肽的一部分，特别是在免疫学测定法中用作报告物的酶。此类报告酶包括例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

依照本发明的模拟表位优选是它们的氨基酸序列不同于Aβ或Aβ片段的氨基酸序列的抗原性多肽。在这个方面，本发明的模拟表位可不仅包含一种或多种天然存在氨基酸残基的氨基酸替代，而且还可包含一种或多种非天然氨基酸(即不是来自20种“经典的”氨基酸)的氨基酸替代或者它们可以完全由此类非天然氨基酸装配而成。此外，本发明诱导针对及结合Aβ1-40/42，AβpE3-40/42，Aβ3-40/42，Aβ11-40/42，AβpE11-40/42和Aβ14-40/42(及Aβ自氨基酸位置2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12和13开始的其它N端截短形式)抗体的抗原可以由D-氨基酸或L-氨基酸或DL-氨基酸的组合装配而成，而且任选，它们可以通过进一步修饰，环闭合或衍生化而进行了改变。合适的抗体诱导性抗原可以自商品化肽文库提供。优选的是，这些肽为至少7个氨基酸，且优选的长度可以长达16，优选长达14或20个氨基酸(例如5至16个氨基酸残基)。依照本发明，然而，也可很好地采用更长的肽作为抗体诱导性抗原。另外，本发明的模拟表位也可以是多肽的一部分，并因此在它们的N和/或C端包含至少一个别的氨基酸残基。

为了制备本发明的模拟表位(即本文中公开的抗体诱导性抗原)，当然，噬菌体文库，肽文库也是合适的，例如通过组合化学的手段生成的或通过用于最多变的结构的高通量筛选技术的手段获得的(Display：A LaboratoryManual，Carlos F.Barbas等编；WillatsWG，Phage display：practicalities andprospects.Plant Mol.Biol.2002 Dec.；50(6)：837-54)。

另外，依照本发明，也可采用基于核酸的抗Aβ1-40/42，AβpE3-40/42，Aβ3-40/42，Aβ11-40/42，AβpE11-40/42和Aβ14-40/42抗体诱导性抗原(“适体(aptamer)”)，而且这些也可以用最多变的(寡核苷酸)文库(例如具有2-180个核酸残基)(例如Burgstaller et al.，Curr.Opin.Drug Discov.Dev.5(5)(2002)，690-700；Famulok et al.，Acc.Chem.Res.33(2000)，591-599；Mayer et al.，PNAS 98(2001)，4961-4965；等)找到。在基于核酸的抗体诱导性抗原中，核酸主链可例如通过天然磷酸二酯化合物或也通过硫代磷酸酯或组合或化学变异(例如像PNA)来提供，其中依照本发明可主要采用U，T，A，C，G，H和mC作为碱基。可依照本发明使用的核苷酸的2’-残基优选为H，OH，F，Cl，NH₂，O-甲基，O-乙基，O-丙基或O-丁基，其中核酸还可别不同的修饰，即例如用保护基团修饰，就像它们通常在寡核苷酸合成中被采用的。如此，基于适体的抗体诱导性抗原也是本发明范围内的优选抗体诱导性抗原。

依照本发明的一个优选实施方案，化合物偶联至药学可接受载体，优选KLH(匙孔血蓝蛋白)，破伤风类毒素，清蛋白结合蛋白，牛血清清蛋白，树状聚物(MAP；Biol.Chem.358：581)，肽接头(或侧翼区)以及Singh et al.，Nat.Biotech.17(1999)，1075-1081(特别是该文件表1中的那些)，和O′Hagan etal.，Nature Reviews，DrugDiscovery 2(9)(2003)，727-735(特别是其中记载的内源免疫强化性化合物和投递系统)中记载的佐剂物质，或其混合物。此语境中的偶联化学(例如经由异双功能化合物，诸如GMBS，当然还有其它的，如“Bioconjugate Techniques”，Greg T.Hermanson中记载的)可选自本领域技术人员已知的反应。此外，疫苗组合物可以与佐剂，优选低溶解度的铝组合物，特别是氢氧化铝一起配制。当然，也可以使用像MF59磷酸铝，磷酸钙，细胞因子(例如IL-2，IL-12，GM-CSF)，皂苷(例如QS21)，MDP衍生物，CpG寡聚物，LPS，MPL，聚磷腈，乳状液(例如弗氏，SAF)，脂质体，病毒体，ISCOM，蜗形物(cochleates)，PLG微粒，Poloxamer颗粒，病毒样颗粒，热不稳定肠毒素(LT)，霍乱毒素(CT)，突变体毒素(例如LTK63和LTR72)，微粒和/或聚合脂质体这些佐剂。

本发明的化合物优选经选自下组的接头结合至载体或佐剂：NHS-聚(氧化乙烯)(PEO)(例如NHS-PEO₄-马来酰亚胺)。

包含本发明化合物(模拟表位)和药学可接受载体的疫苗可通过任何合适的应用模式(例如i.d.，i.v，i.p.，i.m.，鼻内，口服，皮下，等)及在任何合适的投递装置中施用(O’Hagan et al.，Nature Reviews，Drug Discovery 2(9)，(2003)，727-735)。本发明的化合物优选为静脉内，皮下，皮内或肌肉内施用而配制(参见例如“Handbook ofPharmaceutical ManufacturingFormulations”，Sarfaraz Niazi，CRC Press Inc，2004)。

依照本发明的药物(疫苗)以0.1ng至10mg，优选10ng至1mg，特别是100ng至100μg，或者例如100fmol至10μmol，优选10pmol至1μmol，特别是100pmol至100nmol的量含有依照本发明的化合物。典型地，疫苗还可含有辅助物质，例如缓冲剂、稳定剂等。

本发明的另一个方面涉及上文限定的化合物用于治疗和/或改善突触核蛋白病症状的用途。

令人惊讶地发现本发明的化合物还能用于治疗和改善与突触核蛋白病有关的症状。

淀粉样变和突触核蛋白病分别与β-淀粉样蛋白和α-突触核蛋白的大脑累积有关。一些患者显示这两种疾病的临床和病理特征，提出了致病途径交叠的可能性。这些患者还归类为患有一种新鉴定的综合征，其描述为具有Lewy小体的痴呆或具有痴呆的帕金森氏病(DLB/PDD)。在一种最近的转基因动物DLB/PDD模型中，显示了α-突触核蛋白和淀粉样蛋白前体蛋白(hAPP)二者在小鼠中的过表达导致认知和运动改变的发生，其伴有胆碱能神经元的损失和突触囊泡的减少，广泛淀粉状蛋白斑的形成，和haSYN免疫反应性神经元内纤丝内含体。所有这些特征也见于DLB/PDD综合征。最近描述了这两种分子潜在地能够在体外相互作用及形成杂合寡聚物。还显示了APP过表达能加剧α-突触核蛋白过表达的一些病理效应。相反，α-突触核蛋白能够增强淀粉样蛋白β肽的分泌和毒性，及因此还能提高β-淀粉样蛋白的效应，支持神经变性过程中致病途径交叠的想法。

在这两种蛋白病中，肽寡聚物的渐进累积被鉴定为导致对于突触核蛋白病或淀粉样变任一而言典型的各种改变的中枢毒性事件之一。尽管有这种机制相似性，假设α-突触核蛋白和Aβ对脑的完整性和功能具有不同的，以及趋同的致病效果。认为突触核蛋白比认知功能更严重地影响运动功能，而淀粉样蛋白β肽被描述为具有相反的影响。造成这种差异的原因目前尚不清楚，也没有对这两种分子的相互依赖和影响的清楚描述。

本发明中呈现的治疗办法描述了一种靶向Aβ的免疫疗法，它会导致主要在细胞内的淀粉样蛋白的清除。因此认为它会减轻淀粉样蛋白相关改变，范围从斑沉积至神经元死亡以及至记忆问题和认知衰退。然而，突触核蛋白的亚细胞定位指示这些细胞内蛋白质主要在突触处有活性，尤其局限于突触囊泡。有趣的是，作为突触核蛋白病的统一病理标志，突触核蛋白累积也主要在细胞内可检测到。另外，认为突触核蛋白病的根本致病机制可归于神经元内变化，范围从线粒体功能障碍，异常折叠的遍在蛋白化或磷酸化蛋白质的累积以及突触核蛋白的累积。这些改变因此导致突触功能的变化，突触失效，和多巴胺能神经元损失和突触核蛋白病的经典临床征候。相反，Aβ主要在神经元外可检测到，而且淀粉状蛋白斑以及纤丝，初原纤维和β-淀粉样蛋白寡聚物在细胞外或大脑内应用时能发挥神经毒性功能。如此，主要影响导致下文描述的典型症状的细胞内过程，主要靶向细胞外淀粉样蛋白的办法会减轻突触核蛋白病像PD的症状对于专家而言是一项令人惊讶的发现。甚至更加令人惊讶的是，当前认为这两种分子的交叠效果是由应主要存在于细胞内的两种蛋白质的直接相互作用引起的。

依照本发明，术语“突触核蛋白病(synucleinopathy)”包括以病理性突触核蛋白聚集为特征的所有神经变性性病症。数种神经变性性病症，包括帕金森氏病(PD)，Lewy小体病(LBD)，弥漫性Lewy小体病(DLBD)，具有Lewy小体的痴呆(DLB)，具有痴呆的帕金森综合征(PDD)，多系统萎缩(MSA)和具有脑铁累积的神经变性I型(NBIA I型)共同分组为突触核蛋白病。

如本文中使用的，“突触核蛋白病的症状”指那些影响患有所述疾病的患者的运动和非运动行为的突触核蛋白病(特别是帕金森氏病)症状。“运动症状”包括静止性震颤，运动徐缓，强直，体位不稳，弯腰体位，张力障碍，疲劳，细微运动灵巧性和运动协调受损，整体运动协调受损，运动缺乏(摆臂缩小)，静坐不能，言语问题，诸如由肌肉控制缺失引起的嗓音柔和或言语模糊，面部表情丧失，或“掩蔽”，写字过小，吞咽困难，性功能障碍，流涎等。“非运动”症状包括疼痛，痴呆或意识错乱，睡眠扰动，便秘，皮肤问题，抑郁，恐惧或焦虑，记忆困难和思考缓慢，泌尿问题，疲劳和疼痛，能量损失，强迫行为，痛性痉挛等。

依照本发明的一个优选实施方案，突触核蛋白病选自下组：帕金森氏病，具有Lewy小体的痴呆，多系统萎缩和具有脑铁累积的神经变性。特别优选帕金森氏病。

本发明的另一个方面涉及具有选自下组的氨基酸序列或由其组成的肽：SHTRLYF(C)，SGEYVFH(C)，SGQLKFP(C)，SGQIWFR(C)，SGEIHFN(C)，GQIWFIS(C)，NDAKIVF(C)，GQIIFQS(C)，GQIRFDH(C)，HMRLFFN(C)，GEMWFAL(C)，GELQFPP(C)，GELWFP(C)，SHQRLWF(C)，HQKMIFA(C)，GEMQFFI(C)，GELYFRA(C)，GEIRFAL(C)，GMIVFPH(C)，GEIWFEG(C)，GEIYFER(C)，AIPLFVM(C)，GDLKFPL(C)，GQILFPV(C)，GELFFPK(C)，GQIMFPR(C)，HMRMYFE(C)，GSLFFWP(C)，GEILFGM(C)，GQLKFPF(C)，KLPLFVM(C)，GTIFFRD(C)，THQRLWF(C)，GQIKFAQ(C)，GTLIFHH(C)，GEIRFGS(C)，GQIQFPL(C)，GEIKFDH(C)，GEIQFGA(C)，QLPLFVL(C)，HQKMIF(C)，GELFFEK(C)，GEIRFEL(C)，AcGEIYFER(C)，SGEIYFER(C)，AGEIYFER(C)和(C)GEIYFER。如使用括号所指示的，本发明的肽可以包含或不包含C或N末端处的半胱氨酸残基。因此，本发明还涵盖下面的氨基酸序列：SHTRLYF，SGEYVFH，SGQLKFP，SGQIWFR，SGEIHFN，GQIWFIS，NDAKIVF，GQIIFQS，GQIRFDH，HMRLFFN，GEMWFAL，GELQFPP，GELWFP，SHQRLWF，HQKMIFA，GEMQFFI，GELYFRA，GEIRFAL，GMIVFPH，GEIWFEG，GEIYFER，AIPLFVM，GDLKFPL，GQILFPV，GELFFPK，GQIMFPR，HMRMYFE，GSLFFWP，GEILFGM，GQLKFPF，KLPLFVM，GTIFFRD，THQRLWF，GQIKFAQ，GTLIFHH，GEIRFGS，GQIQFPL，GEIKFDH，GEIQFGA，QLPLFVL，HQKMIF，GELFFEK，GEIRFEL，SGEIYFER，和AGEIYFER。

依照一个优选的实施方案，所述肽偶联至药学可接受载体，优选KLH(匙孔血蓝蛋白)。

本发明的又一个方面涉及包含至少一种依照本发明的肽的药物配制剂，优选疫苗。所述药物配制剂可用于治疗患有阿尔茨海默氏病的个体或预防在个体中形成Aβ斑以阻止阿尔茨海默氏病的形成。

本发明在下面的附图和实施例中进一步例示，然而，不限于此。

图1显示单克隆抗体MV-002对特定肽和重组蛋白的结合。

图2显示用β-淀粉样蛋白和N端截短型和/或翻译后修饰型β-淀粉样蛋白片段的模拟表位进行的典型结合测定法。

图3显示用β-淀粉样蛋白和N端截短型和/或翻译后修饰型β-淀粉样蛋白片段的模拟表位进行的典型抑制测定法。

图4显示通过模拟表位免疫接种(注射的肽/无关的肽)引发的免疫应答的体内表征的例子。

图5显示通过针对淀粉样蛋白β片段和sAPPα的模拟表位免疫接种引发的免疫应答的体内表征的例子。

图6显示通过针对全长Aβ40/42的模拟表位免疫接种引发的免疫应答的体内表征的例子。

图7显示被淀粉状蛋白斑占据的面积。以一个月间隔通过s.c接种给Tg2576注射6次以氢氧化铝(ALUM)作为佐剂的模拟表位疫苗。对照小鼠只接受PBS-ALUM。被淀粉状蛋白斑占据的面积显示为对照组的百分比。Gr1...对照组；Gr2...接受p4675。

实施例

方法

用于依照本发明的模拟表位鉴定的抗体检测自人Aβ衍生的氨基酸序列但不结合全长人APP。所检测的序列包括EVHHQKLVFFAED(＝Aβ初始表位aa11-24)和p(E)VHHQKLVF(p4374＝在N端具有焦谷氨酸修饰的Aβ初始表位aa11-19)。抗体可以是单克隆或多克隆抗体制备物或其任何抗体部分或衍生物，唯一的先决条件在于抗体分子特异性识别至少一种上文所述(自人Aβ衍生的)表位，但不结合全长人APP。

用此类单克隆抗体和肽文库鉴定并进一步表征模拟表位。

实施例1：生成单克隆抗体，所述抗体特异性检测β-淀粉样蛋白和N端截短型和/或翻译后修饰型β-淀粉样蛋白片段

生成了自实验Alz-9的融合物衍生的单克隆抗体。给C57/B16小鼠重复免疫接种偶联至KLH(匙孔血蓝蛋白)和作为佐剂的Alum(氢氧化铝)的初始Aβ表位HQKLVFC。通过ELISA(经p4377肽包被的ELISA板)来检测p4377肽特异性抗体生成型杂交瘤。人Aβ40/42(重组蛋白)用作阳性对照肽：包括识别在ELISA板上固定化的重组蛋白的杂交瘤，因为它们特异性结合肽和全长Aβ二者。P1454(人Aβ33-40)用作阴性对照肽。另外，针对p4374，p1323和sAPPα测试杂交瘤。只有具有较好p4374和p1323结合且没有sAPPα结合的杂交瘤用于进一步的抗体开发。

纯化杂交瘤克隆MV-002(内部名称A115；IgG2b)并分别分析对p1323，p4374，p4377，p1454，Aβ和sAPPα的特异性检测。MV-002在ELISA中识别表位p1323以及p4377和全长Aβ蛋白(重组蛋白；得自Bachem AG，Bubendorf，Switzerland)。然而，它在ELISA中不检测p1454。另外，MV-002抗体不能检测sAPPα但特异性结合编码Aβ11-19的焦谷氨酸型式的肽p4374。

实施例2：噬菌体展示，体外结合和抑制ELISA

此实施例中使用的噬菌体展示文库为Ph.D.7：New England BioLabsE8102L(线性7聚物文库)。依照制造商的方案(www.neb.com)进行噬菌体展示。

2或3个后续轮次的淘选后，挑取单个噬菌体克隆，在包被了淘选过程所用抗体的板上对噬菌体上清液进行ELISA。对在此ELISA中呈阳性(对靶物的信号强，但对非特异性对照无信号)的噬菌体克隆测序。根据DNA序列，推导肽序列。合成这些肽并在结合和抑制ELISA中表征。另外，将所述筛选中鉴定出的模拟表位的序列信息组合，创建了一些新模拟表位，以便鉴定用于模拟表位免疫接种的共有序列。

1.体外结合测定法(ELISA)

将自噬菌体展示衍生的肽及其变体偶联至BSA并结合至ELISA板(1μM；如各图中指示的)并随后与用于筛选过程的单克隆抗体一起温育以分析所鉴定的肽的结合能力。

2.体外抑制测定法(ELISA)

将不同量的自噬菌体展示衍生的肽(浓度范围5μg至0.03μg；连续稀释)与用于筛选过程的单克隆抗体一起温育。降低后续的抗体对ELISA板上包被的初始表位的结合的肽被认为是在此测定法中是抑制性的。

实施例3：体内测试模拟表位：分析免疫原性和交叉反应性

1.对模拟表位的体内测试

将抑制性以及非抑制性肽偶联至KLH并与适宜的佐剂(氢氧化铝)一起注射入小鼠(野生型C57/B16小鼠；皮下注射入体侧)。以两周间隔给动物免疫接种3-6次并两周一次采集血清。用每一份血清测定对注射的肽以及对无关肽的滴度。另外，分别测定针对重组人Aβ蛋白和针对初始肽的滴度。一般而言，通过针对在ELISA板上固定化的肽(偶联至牛血清清蛋白(BSA))和重组全长蛋白的反应来分析血清。使用抗小鼠IgG特异性抗体来测定滴度。关于详细的结果，分别见图4，5和6。

2.结果

2.1.鉴定针对N端截短型和修饰型Aβ的特异性单克隆抗体(mAB)：

图1描绘自实验Alz-9衍生的单克隆抗体MV-002(内部名称A115；IgG2b)的表征，证明了对全长Aβ和在位置E11和H14处截短和在位置E11至pE11处修饰的Aβ片段的特异性。

2.2.筛选针对N端截短型和修饰型Aβ的特异性mAB：

2.2.1.噬菌体展示文库Ph.D.7

2.2.1.1.筛选针对p1323的单克降抗体

在此筛选中通过筛选PhD 7噬菌体展示文库鉴定了47种序列。表1总结了所鉴定的肽及其与初始表位相比的结合能力。

表1：结合亲本抗体MV-002的模拟表位

内部肽编号	SEQ ID No.	序列	结合能力
				p4403	1	SHTRLYFC	1
p4404	2	SGEYVFHC	1
				p4413	3	SGQLKFPC	1
p4414	4	SGQIWFRC	1
				p4415	5	SGEIHFNC	1
p4666	6	GQIWFISC	1
				p4667	7	NDAKIVFC	3
p4668	8	GQIIFQSC	2
				p4669	9	GQIRFDHC	3
p4670	10	HMRLFFNC	3
				p4671	11	GEMWFALC	3
p4672	12	GELQFPPC	3

p4673	13	GELWFPC	3
				p4674	14	SHQRLWFC	3
p4675	15	HQKMIFAC	3
				p4676	16	GEMQFFIC	3
p4677	17	GELYFRAC	3
				p4678	18	GEIRFALC	3
p4679	19	GMIVFPHC	3
				p4680	20	GEIWFEGC	3
p4681	21	GEIYFERC	3
				p4682	22	AIPLFVMC	1
p4683	23	GDLKFPLC	3
				p4684	24	GQILFPVC	3
p4685	25	GELFFPKC	3
				p4686	26	GQIMFPRC	3
p4687	27	HMRMYFEC	3
				p4688	28	GSLFFWPC	2
p4689	29	GEILFGMC	3
				p4690	30	GQLKFPFC	3
p4691	31	KLPLFVMC	1
				p4692	32	GTIFFRDC	1
p4693	33	THQRLWFC	3
				p4694	34	GQIKFAQC	3
p4695	35	GTLIFHHC	2
				p4696	36	GEIRFGSC	3
p4697	37	GQIQFPLC	3
				p4698	38	GEIKFDHC	3
p4699	39	GEIQFGAC	3
				p4700	40	QLPLFVLC	1
p4794	41	HQKMIFC	2
				p4795	42	GELFFEKC	2

p4796	43	GEIRFELC	2
				p4804	44	Ac-GEIYFERC	2
p4805	45	SGEIYFERC	1
				p4806	46	AGEIYFERC	1
p4807	47	CGEIYFER	1

对表1的说明：结合能力用下面的结合代码编码：1：X描述亲本AB的稀释因子。Ac-...表示乙酰化AA。

结合代码 OD半最大1：X

0 无结合：0

1 弱结合：＜40000

2 中等结合：40000-320000

3 强结合：＞320000

2.3.体外表征模拟表位，所述表位是在用针对N端截短型和修饰型Aβ的单克隆抗体筛选噬菌体展示文库时鉴定出的：

图2和3显示用于在体外表征模拟表位的结合和抑制测定法的代表性例子。获得的数据分别总结于表1和2。

MV-002模拟表位：在所呈现的47种序列中，11种序列在体外竞争实验中抑制单克隆抗体MV-002的结合。另36种序列被鉴定为在体外竞争实验中不抑制单克隆抗体的结合但仍保留对亲本抗体的结合能力(表2)。重要的是，如图4-6所示，在体外与初始表位竞争对亲本抗体的结合的能力不是在体内引起与特定肽起交叉反应的特异性免疫应答的先决条件。如此，抑制性以及非抑制性肽可用于在体内诱导检测肽的免疫应答(详情见图4-6)，这能导致自脑清除淀粉样蛋白肽。

表2：在本发明中鉴定的，在抑制测定法中给出阳性结果的模拟表位；MV-002模拟表位

内部肽编号	SEQ ID No.	序列	抑制能力
				p4667	7	NDAKIVFC	1
p4670	10	HMRLFFNC	1
				p4673	13	GELWFPC	1
p4674	14	SHQRLWFC	1
				p4675	15	HQKMIFAC	2

p4680	20	GEIWFEGC	2
				p4681	21	GEIYFERC	2
p4689	29	GEILFGMC	1
				p4698	38	GEIKFDHC	2
p4699	39	GEIQFGAC	1
				p4794	41	HQKMIFC	1

对表2的说明：抑制能力用下面的代码编码：

弱抑制意味着降低AB结合需要比初始表位要多的肽；强抑制意味着降低AB结合需要的模拟表位和初始表位的肽量相似。将模拟表位与作为标准的初始肽比较。使用测定法中5ug肽时的OD来计算与初始肽相比的竞争能力。

竞争代码
		0	无抑制(肽的OD高于初始肽4.6倍)
1	比初始表位要弱(肽的OD低于初始肽4.6倍)
		2	强抑制(像初始表位一样；肽的OD低于初始肽的2.3倍)

2.4.体内表征模拟表位，所述表位是在用针对淀粉样蛋白β的单克隆抗体筛选噬菌体展示文库时鉴定出的：

给雌性C57/b16小鼠，每组5-6只小鼠，皮下免疫接种30μg偶联至KLH的肽。给对照组施用初始表位-KLH偶联物。使用明矾作为佐剂(始终每只小鼠1mg)。所施用的肽都能够特异性结合单克隆抗体，尽管一些肽在体外(在体外抑制测定法中)不抑制初始表位对其亲本抗体的结合。以两周间隔用每次免疫接种后单只小鼠的血清实施体外ELISA测定法以测定抗体滴度(分别见图6和7)。作为所有所显示的图中OD最大值/2来计算滴度。将ELISA板的孔用模拟表位-BSA偶联物和无关肽-BSA偶联物(阴性对照)包被。通过亲本抗体与各模拟表位-BSA偶联物的反应来实施阳性对照。用抗小鼠IgG来实施检测。另外，在ELISA板上固定化重组蛋白并相应地使血清反应。图4，5和6显示用于在体内表征模拟表位的测定法的代表性例子。所示结果分别衍生自在体外抑制测定法中有活性的肽，像p4670，p4675，p4680，和p4681及没有抑制能力的肽p4403。

图4显示通过分析针对注射的肽和含有无关序列的无关肽的免疫应答对通过模拟表位免疫接种引发的免疫应答的体内表征的例子。在所显示的例子中，表位p4377和模拟表位p4670，p4675，p4680，p4681和p4403引发针对注射的肽的免疫应答但不能诱导针对无关序列(p1454)的有关非特异性免疫应答。

图5显示对通过针对亲本抗体的各自初始表位(p4377)以及针对自Aβ的截短种类衍生的肽(p1323和p4374)及针对sAPPα的模拟表位免疫接种引发的免疫应答的体内表征的例子。

p4377和模拟表位p4670，p4675，p4680，p4681和p4403引起可检测的针对初始表位p4377的免疫应答。分析针对如p4374展示的修饰形式的交叉反应性，能检测到类似的现象。有趣的是，初始表位和模拟表位疫苗引起针对p4374即修饰形式的初始表位的有关滴度。令人惊讶的是，模拟表位似乎能够诱导但不是必然诱导更有效的针对p1323的免疫应答，指示诱导与初始Aβ片段相比更宽的免疫反应性的潜力。另外，检测不到针对sAPPα的反应性。

图6显示通过针对全长Aβ的模拟表位免疫接种引发的免疫应答的体内表征的例子。令人惊讶的是，通过使用MV-002选择的模拟表位不仅诱导了与用于创建抗体的截短或修饰的短表位的交叉反应，而且诱导了与全长未修饰形式的Aβ的交叉反应性，就像初始序列一样好或甚至比p4377更有效。

有趣的是，竞争性以及非竞争性肽能够诱导相似的与含有初始Aβ序列的肽特异性相互作用的免疫应答。如此，本发明中呈现的模拟表位构成优化的新疫苗候选物来靶向广谱的天然存在形式的Aβ肽，像在AD患者的脑中已经找到的。所述形式分别包括但不限于Aβ1-40/42，和N端截短的形式像Aβ3-40/42，Aβ(pE)3-40/42，未修饰的Aβ11-40/42，修饰的Aβp(E)11-40/42和Aβ14-40/42。重要的是，所呈现的模拟表位也不诱导与自APP切除后sAPPα中存在的新表位的交叉反应性，如此不干扰正常sAPPα信号传导(详情见图5)。

表3：使用的非模拟表位肽

在表4中，描述了通过使用MV-002衍生模拟表位通过针对全长Aβ的模拟表位免疫接种引发的免疫应答的其它例子。表4中列出的所有肽引起针对全长和/或截短和修饰形式的Aβ或其片段的特异性免疫反应。

表4：模拟表位的体内表征：MV-002

内部肽编号	SEQ ID No.	Aβ/截短/修饰形式的检测
			p4403	1	+
p4404	2	+
			p4413	3	+
p4414	4	+
			p4415	5	+
p4670	10	+
			p4673	13	+
p4675	15	+
			p4680	20	+
p4681	21	+
			p4693	33	+
p4696	36	+
			p4698	38	+
p4699	39	+

2.5.体内表征模拟表位在转基因动物中减轻AD样疾病的功效(概念分析的证据)

使用Tg2576AD小鼠来研究模拟表位疫苗的临床前功效。这种转基因系在仓鼠朊病毒蛋白质(PrP)启动子控制下表达在aa位置670/671处携带瑞典双重突变的人APP，这导致蛋白质的过表达。它是当前AD研究中最广泛采用的模型之一。Tg2576模型再现AD病理的各种标志，包括疾病特异性淀粉状蛋白斑沉积和星形细胞增多。正如迄今可得的所有其它AD模型系统，它不反映AD的所有主要神经病理特征。

为了评估用模拟表位处理是否能够预防大脑Aβ累积，以一个月间隔给Tg2576小鼠s.c注射6次吸附至ALUM(佐剂：氢氧化铝)的肽-KLH偶联物或单独的吸附至ALUM的PBS(称作PBS或对照)。直至最后一次免疫接种后8周，处死动物，收获它们的脑并分析它们的Aβ载荷(AD样病理)。在深度麻醉下处死小鼠。随后，分离脑，在4％PFA中固定并通过梯度乙醇系列来脱水，接着在二甲苯中温育及石蜡包埋。使用显微切片机将每一个石蜡包埋的脑以7μM切片并将切片安装在载玻片上。

作为测定Tg2576动物中AD样病理的一种方法，我们分析经处理动物的脑中被淀粉样蛋白沉积物占据的相对面积。使用自动化面积识别程序来实施这种分析。为了鉴定斑，将切片用单克隆抗体(mAb)3A5(对Aβ40/42特异性的)染色。将经模拟表位处理的动物与对照动物比较。在13.5-14月龄时处死所有动物。为了这种分析，选择覆盖皮质和海马的3片载玻片/动物，用mAb3A5染色并随后使用Mirax-system(Zeiss)记录。为了计算被淀粉状蛋白斑占据的面积，我们分析多至4片切片/载玻片并在检查结果图片后排除携带组织假象和异常染色强度的切片。

对于MV002的模拟表位，我们使用一种例示性候选物实施了面积分析。使用肽-KLH偶联物疫苗进行重复免疫接种后实施分析。对照组显示出平均占据0.35％，比较而言，经模拟表位处理的动物分别为0.24％。这对应于模拟表位处理后第2组中31％的降低。

如此，这组数据清楚地指示模拟表位疫苗处理对转基因动物中AD样病理的有益效果。

Claims

1.选自下述氨基酸序列的肽在生产用于预防和/或治疗包括阿尔茨海默氏病的β-淀粉样变的药物中的用途：

SHTRLYF，HMRLFFN，SHQRLWF，HQKMIFA，HMRMYFE，THQRLWF，HQKMIF，SHTRLYFC，HMRLFFNC，SHQRLWFC，HQKMIFAC，HMRMYFEC，THQRLWFC，HQKMIFC，SGEYVFH，SGQLKFP，SGQIWFR，SGEIHFN，GQIWFIS，GQIIFQS，GQIRFDH，GEMWFAL，GELQFPP，GQILFPV，GELFFPK，GQIMFPR，GSLFFWP，GEILFGM，GQLKFPF，GTIFFRD，GQIKFAQ，GTLIFHH，GEIRFGS，GQIQFPL，GEIKFDH，GEIQFGA，GELFFEK，GEIRFEL，SGEIYFER，AGEIYFER，SGEYVFHC，SGQLKFPC，SGQIWFRC，SGEIYFERC，AIPLFVM，KLPLFVM，QLPLFVL，NDAKIVF，AIPLFVMC，KLPLFVMC，QLPLFVLC，NDAKIVFC，NDAKIVF，GELWFP，SHQRLWF，GEMQFFI，GELYFRA，GEIRFAL，GMIVFPH，GEIWFEG，GEIYFER，AIPLFVM，GDLKFPL，GQILFPV，GELFFPK，GQIMFPR，HMRMYFE，KLPLFVM，GTIFFRD，QLPLFVL，GELFFEK，GEIRFEL，AcGEIYFER，GEIYFER，SGEIHFNC，GQIWFISC，NDAKIVFC，GQIIFQSC，GQIRFDHC，HMRLFFNC，GEMWFALC，GELQFPPC，GELWFPC，SHQRLWFC，GEMQFFIC，GELYFRAC，GEIRFALC，GMIVFPHC，GEIWFEGC，GEIYFERC，AIPLFVMC，GDLKFPLC，GQILFPVC，GELFFPKC，GQIMFPRC，HMRMYFEC，GSLFFWPC，GEILFGMC，GQLKFPFC，KLPLFVMC，GTIFFRDC，GQIKFAQC，GTLIFHHC，GEIRFGSC，GQIQFPLC，GEIKFDHC，GEIQFGAC，QLPLFVLC，GELFFEKC，GEIRFELC，AcGEIYFERC，SGEIYFERC，AGEIYFERC和CGEIYFER，

所述肽具有与抗体结合的能力，所述抗体特异于包含氨基酸序列HQKLVF和/或HQKLVFFAED的淀粉样蛋白β肽表位。

2.选自下述氨基酸序列的肽在生产用于预防和/或治疗包括阿尔茨海默氏病的β-淀粉样变的药物中的用途：

SHTRLYFC，HMRLFFNC，SHQRLWFC，HQKMIFAC，HMRMYFEC，THQRLWFC和HQKMIFC，

3.选自下述氨基酸序列的肽生产用于预防和/或治疗β-淀粉样变包括阿尔茨海默氏病的药物中的用途：

SGEYVFH，SGQLKFP，SGQIWFR，SGEIHFN，GQIWFIS，GQIIFQS，GQIRFDH，GEMWFAL，GELQFPP，GELWFP，GEMQFFI，GELYFRA，GEIRFAL，GMIVFPH，GEIWFEG，GQILFPV，GELFFPK，GQIMFPR，GSLFFWP，GEILFGM，GQLKFPF，GTIFFRD，GQIKFAQ，GTLIFHH，GEIRFGS，GQIQFPL，GEIKFDH，GEIQFGA，GELFFEK，GEIRFEL，GEIYFER，SGEIYFER，AGEIYFER和GEIYFER，

4.选自下述氨基酸序列的肽在生产用于预防和/或治疗β-淀粉样变包括阿尔茨海默氏病的药物中的用途：

SGEYVFHC，SGQLKFPC，SGQIWFRC，SGEIHFNC，GQIWFISC，GQIIFQSC，GQIRFDHC，GEMWFALC，GELQFPPC，GELWFPC，GEMQFFIC，GELYFRAC，GEIRFALC，GMIVFPHC，GEIWFEGC，GQILFPVC，GELFFPKC，GQIMFPRC，GSLFFWPC，GEILFGMC，GQLKFPFC，GTIFFRDC，GQIKFAQC，GTLIFHHC，GEIRFGSC，GQIQFPLC，GEIKFDHC，GEIQFGAC，GELFFEKC，GEIRFELC，GEIYFERC，SGEIYFERC，AGEIYFERC和CGEIYFER，

5.选自下组的氨基酸序列的肽在生产用于预防和/或治疗β-淀粉样变包括阿尔茨海默氏病的药物中的用途：AIPLFVM，KLPLFVM，QLPLFVL和NDAKIVF，

6.选自下组的氨基酸序列的肽在生产用于预防和/或治疗β-淀粉样变包括阿尔茨海默氏病的药物中的用途：AIPLFVMC，KLPLFVMC，QLPLFVLC和NDAKIVFC，

7.依照权利要求1-6任一项的用途，其特征在于所述肽偶联至药学可接受载体。

8.依照权利要求7的用途，其中所述药学可接受载体为匙孔虫戚血蓝蛋白。

9.依照权利要求1-6任一项的用途，其特征在于所述肽为静脉内，皮下，皮内或肌肉内施用而配制。

10.依照权利要求7的用途，其特征在于所述肽为静脉内，皮下，皮内或肌肉内施用而配制。

11.依照权利要求8的用途，其特征在于所述肽为静脉内，皮下，皮内或肌肉内施用而配制。

12.依照权利要求1-6任一项的用途，其特征在于所述肽与佐剂一起配制。

13.依照权利要求7的用途，其特征在于所述肽与佐剂一起配制。

14.依照权利要求8的用途，其特征在于所述肽与佐剂一起配制。

15.依照权利要求9的用途，其特征在于所述肽与佐剂一起配制。

16.依照权利要求10的用途，其特征在于所述肽与佐剂一起配制。

17.依照权利要求11的用途，其特征在于所述肽与佐剂一起配制。

18.依照权利要求12的用途，其中所述佐剂为氢氧化铝。

19.依照权利要求13的用途，其中所述佐剂为氢氧化铝。

20.依照权利要求14的用途，其中所述佐剂为氢氧化铝。

21.依照权利要求15的用途，其中所述佐剂为氢氧化铝。

22.依照权利要求16的用途，其中所述佐剂为氢氧化铝。

23.依照权利要求17的用途，其中所述佐剂为氢氧化铝。

24.依照权利要求1-6任一项的用途，其特征在于所述肽以0.1ng至10mg的量包含在药物中。

25.依照权利要求7的用途，其特征在于所述肽以0.1ng至10mg的量包含在药物中。

26.依照权利要求8的用途，其特征在于所述肽以0.1ng至10mg的量包含在药物中。

27.依照权利要求9的用途，其特征在于所述肽以0.1ng至10mg的量包含在药物中。

28.依照权利要求10的用途，其特征在于所述肽以0.1ng至10mg的量包含在药物中。

29.依照权利要求11的用途，其特征在于所述肽以0.1ng至10mg的量包含在药物中。

30.依照权利要求12的用途，其特征在于所述肽以0.1ng至10mg的量包含在药物中。

31.依照权利要求13的用途，其特征在于所述肽以0.1ng至10mg的量包含在药物中。

32.依照权利要求14的用途，其特征在于所述肽以0.1ng至10mg的量包含在药物中。

33.依照权利要求15的用途，其特征在于所述肽以0.1ng至10mg的量包含在药物中。

34.依照权利要求16的用途，其特征在于所述肽以0.1ng至10mg的量包含在药物中。

35.依照权利要求17的用途，其特征在于所述肽以0.1ng至10mg的量包含在药物中。

36.依照权利要求18的用途，其特征在于所述肽以0.1ng至10mg的量包含在药物中。

37.依照权利要求19的用途，其特征在于所述肽以0.1ng至10mg的量包含在药物中。

38.依照权利要求20的用途，其特征在于所述肽以0.1ng至10mg的量包含在药物中。

39.依照权利要求21的用途，其特征在于所述肽以0.1ng至10mg的量包含在药物中。

40.依照权利要求22的用途，其特征在于所述肽以0.1ng至10mg的量包含在药物中。

41.依照权利要求23的用途，其特征在于所述肽以0.1ng至10mg的量包含在药物中。

42.依照权利要求1-6任一项的用途，其中所述肽以10ng至1mg的量包含在药物中。

43.依照权利要求7的用途，其中所述肽以10ng至1mg的量包含在药物中。

44.依照权利要求8的用途，其中所述肽以10ng至1mg的量包含在药物中。

45.依照权利要求9的用途，其中所述肽以10ng至1mg的量包含在药物中。

46.依照权利要求10的用途，其中所述肽以10ng至1mg的量包含在药物中。

47.依照权利要求11的用途，其中所述肽以10ng至1mg的量包含在药物中。

48.依照权利要求12的用途，其中所述肽以10ng至1mg的量包含在药物中。

49.依照权利要求13的用途，其中所述肽以10ng至1mg的量包含在药物中。

50.依照权利要求14的用途，其中所述肽以10ng至1mg的量包含在药物中。

51.依照权利要求15的用途，其中所述肽以10ng至1mg的量包含在药物中。

52.依照权利要求16的用途，其中所述肽以10ng至1mg的量包含在药物中。

53.依照权利要求17的用途，其中所述肽以10ng至1mg的量包含在药物中。

54.依照权利要求18的用途，其中所述肽以10ng至1mg的量包含在药物中。

55.依照权利要求19的用途，其中所述肽以10ng至1mg的量包含在药物中。

56.依照权利要求20的用途，其中所述肽以10ng至1mg的量包含在药物中。

57.依照权利要求21的用途，其中所述肽以10ng至1mg的量包含在药物中。

58.依照权利要求22的用途，其中所述肽以10ng至1mg的量包含在药物中。

59.依照权利要求23的用途，其中所述肽以10ng至1mg的量包含在药物中。

60.依照权利要求1-6任一项的用途，其中所述肽以100ng至10μg的量包含在药物中。

61.依照权利要求7的用途，其中所述肽以100ng至10μg的量包含在药物中。

62.依照权利要求8的用途，其中所述肽以100ng至10μg的量包含在药物中。

63.依照权利要求9的用途，其中所述肽以100ng至10μg的量包含在药物中。

64.依照权利要求10的用途，其中所述肽以100ng至10μg的量包含在药物中。

65.依照权利要求11的用途，其中所述肽以100ng至10μg的量包含在药物中。

66.依照权利要求12的用途，其中所述肽以100ng至10μg的量包含在药物中。

67.依照权利要求13的用途，其中所述肽以100ng至10μg的量包含在药物中。

68.依照权利要求14的用途，其中所述肽以100ng至10μg的量包含在药物中。

69.依照权利要求15的用途，其中所述肽以100ng至10μg的量包含在药物中。

70.依照权利要求16的用途，其中所述肽以100ng至10μg的量包含在药物中。

71.依照权利要求17的用途，其中所述肽以100ng至10μg的量包含在药物中。

72.依照权利要求18的用途，其中所述肽以100ng至10μg的量包含在药物中。

73.依照权利要求19的用途，其中所述肽以100ng至10μg的量包含在药物中。

74.依照权利要求20的用途，其中所述肽以100ng至10μg的量包含在药物中。

75.依照权利要求21的用途，其中所述肽以100ng至10μg的量包含在药物中。

76.依照权利要求22的用途，其中所述肽以100ng至10μg的量包含在药物中。

77.依照权利要求23的用途，其中所述肽以100ng至10μg的量包含在药物中。

78.选自下组的氨基酸序列的肽：SHTRLYF，SGEYVFH，SGQLKFP，SGQIWFR，SGEIHFN，GQIWFIS，NDAKIVF，GQIIFQS，GQIRFDH，HMRLFFN，GEMWFAL，GELQFPP，GELWFP，SHQRLWF，HQKMIFA，GEMQFFI，GELYFRA，GEIRFAL，GMIVFPH，GEIWFEG，GEIYFER，AIPLFVM，GDLKFPL，GQILFPV，GELFFPK，GQIMFPR，HMRMYFE，GSLFFWP，GEILFGM，GQLKFPF，KLPLFVM，GTIFFRD，THQRLWF，GQIKFAQ，GTLIFHH，GEIRFGS，GQIQFPL，GEIKFDH，GEIQFGA，QLPLFVL，HQKMIF，GELFFEK，GEIRFEL，AcGEIYFER，SGEIYFER，AGEIYFER和GEIYFER，

79.选自下组的氨基酸序列的肽：SHTRLYFC，SGEYVFHC，SGQLKFPC，SGQIWFRC，SGEIHFNC，GQIWFISC，NDAKIVFC，GQIIFQSC，GQIRFDHC，HMRLFFNC，GEMWFALC，GELQFPPC，GELWFPC，SHQRLWFC，HQKMIFAC，GEMQFFIC，GELYFRAC，GEIRFALC，GMIVFPHC，GEIWFEGC，GEIYFERC，AIPLFVMC，GDLKFPLC，GQILFPVC，GELFFPKC，GQIMFPRC，HMRMYFEC，GSLFFWPC，GEILFGMC，GQLKFPFC，KLPLFVMC，GTIFFRDC，THQRLWFC，GQIKFAQC，GTLIFHHC，GEIRFGSC，GQIQFPLC，GEIKFDHC，GEIQFGAC，QLPLFVLC，HQKMIFC，GELFFEKC，GEIRFELC，AcGEIYFERC，SGEIYFERC，AGEIYFERC和CGEIYFER，

80.依照权利要求78或79的肽，其特征在于该肽偶联至药学可接受载体。

81.依照权利要求80的肽，其中所述药学可接受载体为匙孔虫戚血蓝蛋白。

82.包含至少一种依照权利要求78-81任一项的肽的用于治疗阿尔茨海默氏病或用于治疗和/或改善突触核蛋白病的症状的药物配制剂。

83.依照权利要求82的药物配制剂，其中所述突触核蛋白病选自下组：帕金森氏病，具有Lewy小体的痴呆，多系统萎缩和具有脑铁累积的神经变性。

84.依照权利要求82或83的药物配制剂，其为疫苗。