MX2010013657A - Compuestos para tratar la amiloidosis. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona al uso de mimotopos en el tratamiento de ß-amiloidosis que incluye pero no se limita a la enfermedad de Alzheimer, donde los mimotopos son capaces de inducir la formación in vivo de anticuerpos dirigidos a Aß 1-40/41 no truncado, y formas AßpE3-40/42, truncadas N-terminalmente, Aß3-40/42, Aß11-40/42 y AßpE11-40/42 y Aß14-40/42 sin interferir con funciones fisiológicas de señalización de APP.

Description

COMPUESTOS PARA TRATAR LA AMILOIDOSIS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a la prevención, tratamiento y diagnosis de enfermedades asociadas con la formación y/o agregación de beta-amiloides (beta-amiloidosis) . Más particularmente, la presente invención proporciona nuevos mimotopos que producen una respuesta inmunológica dirigida contra fragmentos beta-amiloides modificados post-translacionalmente y/o truncados N-terminalmente y nuevos anticuerpos que reconocen los mimotopos y péptidos ?ß para uso en la prevención, tratamiento y diagnosis de enfermedades asociadas con la formación y/o agregación de beta-amiloides.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Varias enfermedades degenerativas se caracterizan por la polimerización aberrante y acumulación de proteínas específicas así llamadas proteopatías . La presente invención se relaciona a la prevención, tratamiento y diagnosis de proteopatías asociadas con proteínas beta-amiloides resumidas bajo el término beta-amiloidosis . La forma más prominente de las beta-amiloidosis es la enfermedad de Alzheimer (AD por sus siglas en inglés) . Otros ejemplos incluyen pero no se limitan a demencia con cuerpos de Lewy y demencia en síndrome de Down.

Ref. 216367 La AD es la forma más común de demencia en humanos. Hasta ahora no hay tratamiento efectivo disponible para detener la neurodegeneración progresiva y declinación cognitiva asociada en pacientes humanos. La AD es caracterizada por la acumulación anormal de placas amiloides extracelulares - cercanamente asociado con astrocitosis extensiva y microgliosis así como también neuronas distróficas y pérdida neuronal . Estas placas amiloides principalmente consisten de la amiloide-beta (?ß; derivado de péptidos APP (gi: 112927) ?ß40 y ?ß42 derivado de la proteína precursora amiloide (APP por sus siglas en inglés) , la cual es expresada en varios tipos celulares en el sistema nervioso. Los péptidos ?ß son considerados para estar implicados directamente en la patogénesis y progresión de AD. Consecuentemente, la reducción de carga en el cerebro es predicha para hacer lenta o detener la progresión de enfermedad y puede también detener la declinación cognitiva en pacientes con AD.

La APP es normalmente procesada por dos etapas de escisión para formar las formas actualmente conocidas de Abeta x-40/42/43. La primera escisión es realizada por las así llamadas enzimas 1 y 2 de escisión del sitio beta APP (BACE1 y BACE2 por sus siglas en inglés) ; la segunda etapa proteolítica es realizada por el complejo de gamma-secretasa.

Las enzimas BACE reconocen dos sitios en la porción N-terminal del pép ido ?ß de presunción y la actividad proteolítica de BACE lleva a la formación de Abeta 1-X y 11-X respectivamente. Este procesamiento APP mediado por BACE crea una variedad de diferentes especies de ?ß con longitud completa de Abeta 1-40/42 como contribuyente principal.

La actividad de la gamma-secretasa lleva a la producción de 3 fragmentos principales: ?ß 1-40/42/43. Una vez que estos péptidos son producidos son además procesados por amino-peptidasas lo cual resulta en su subsecuente degradación en forma de etapa. Estas etapas adicionales llevan a la formación de otras formas como por ejemplo ?ß3-40/42 respectivamente.

La tercera familia de enzimas proteolíticas implicas en el procesamiento APP es la así llamada familia alfa-secretasa (ADAM (una " desintegrina y metaloproteasa" ) famiia) . Las alfa secretasas escinden una proteína precursora amiloide (APP) en su región transmembranal (entre aal6 y aal7 de la secuencia de péptidos ?ß) y excluye la formación de péptidos ?ß . De esta forma la escisión de alfa secretasa es la etapa crucial para procesamiento de APP no amiloidogénica . Específicamente, la escisión de alfa secretasas resulta en la liberación de una forma secretada llamada sAPPalfa. La sAPPalfa es considerada para ser suficiente para mediar la mayoría de las funciones fisiológicas de APP y puede servir como una molécula de señalización. La evidencia sugiere que el ectodominio cubierto juega un papel en el crecimiento de fibroblastos en cultivo. La sPP es encontrada para ser neuroprotectora para neuronas primarias en cultivo, evitando elevaciones en niveles de Ca2+ intracelular provocados por la deprivación de glucosa e incremento del umbral excitotóxico de glutamato, así como también mediar el crecimiento axonal y dendrítico.

En humanos en promedio se forma 60-85% de material de placa amiloide por los derivados ?ß40/42 los cuales son truncados N-terminalmente y modificados frecuentemente. Las cantidades relativas de especies ?ß truncadas N-terminalmente son variables con respecto a los niveles de ?ß, mutaciones y activación BACE . Las formas truncadas más abundantes de ?ß son: ?ß3-40/42 y ?ß11-40/42 aunque para constituir hasta 50% de todas las formas truncadas. Esto significa que estas isoformas constituyen 25-40% de todos los péptidos amiloides en cerebros AD. Ambos péptidos contienen un residuo glutamato N-terminal, el cual es frecuentemente modificado enzimáticamente a piro-glutamato, lo cual resulta en la formación de ?ß3 (pE) -40/42 y ?ß?? (pE) -40/42 , respectivamente. Ya que la terminación amino de los péptidos Abeta 3 (pE) y 11 (pE) es bloqueada por la lactama interna, es protegida de la acción proteolítica de aminopeptidasas diferentes a las piroglutamato específicas y puede de esta forma permanecer estable en tejidos. Variantes truncados N-terminalmente adicionales amiloides cateados que inician en la posición 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 0 ó 10 de beta amiloide pueden ser detectados en los pacientes AD. Estas formas son frecuentemente modificadas post translacionalmente, por ejemplo por metilación.

Se ha mostrado previamente que los péptidos truncados y modificados son más estables en tejido neural que ?ß de longitud completa. Adicionalmente, las formas truncadas N-terminalmente de ?ß son más péptidos ?ß amiloidogénicos que no modificados, de esta forma incrementando la proporción de formación de placa, y también muestran actividad neurotóxica cuando se aplica, a neuronas en cultivo así como también en experimentos in vivo. Las formas truncadas de ?ß pueden ser fácilmente detectadas en agregaciones difusas de ?ß en etapas tempranas de AD y pueden estar implicadas en formación temprana de placas, que actúan como semillas individuales in vivo. Debido a estos efectos se sugiere que los péptidos ?ß x-40/42 pueden iniciar y/o acelerar la formación de placa, quizás por actuar como centros de nucleacion que siembran la deposición subsecuente de péptidos ?ß de longitud completa relativamente menos amiloidogénico pero aparentemente más abundante. Adicionalmente, hay una evidencia apremiante que la ocurrencia de especies ?ß truncadas N-terminalmente está correlacionada con severidad incrementada e inicio temprano de neurodegeneración en enfermedad de Alzheimer esporádica y familiar así como también en pacientes con síndrome de Down. Los datos a partir de los pacientes están implicando un enlace entre la formación temprana de especies ?ß truncadas e inicio de enfermedad, así como también en progresión. En resumen, los descubrimientos predicen que la heterogeneidad N- terminal de péptidos ?ß, demostrada para ocurrir tanto en cerebro in vitro y en AD, puede acelerar la deposición de ?ß en placas. De esta forma, los eventos proteolíticos que contribuyen a la escisión de APP dentro del dominio N-terminal de ?ß puede ser de significancia considerable en la patogénesis de AD y trastornos relacionados.

A la luz de estos descubrimientos parece ser importante disminuir la cantidad de estas especies de péptido en pacientes con AD para modificar la progresión de la enfermedad y reducir la toxicidad y acompañar la declinación cognitiva. Una vacuna AD óptima debe de esta forma producir una respuesta inmunológica la cual es capaz de objetivar las formas más prominentes de péptidos ?ß presentes en el cerebro de pacientes con AD, ?ß1-40/42, ?ß3 -40/42 así como también ?ß3 (p) E-40/42 y ?ß?1-40/42 así como también ?ß?? (p) E-40/42 sin interferir con las funciones fisiológicas de señalización de APP, notablemente las funciones de sAPPalfa.

El tratamiento inmunoterapéutico el cual usa estrategias de inmunización activa y pasiva para objetivar ?ß de longitud completa, lleva la reducción de las placas ?ß y tiene impacto benéfico en la progresión de la enfermedad en modelos animales de AD. Todos los procedimientos de vacunación activa probados en modelos de ratón usan ?ß40/42 de longitud completa o fragmentos que contienen la secuencia nativa de ?ß .

Sin embargo, la primera prueba de vacunación clínica fase IIA en pacientes con AD usando ?ß42 de longitud completa como antígeno tiene que ser discontinuada debido a los efectos laterales neuroinflamatorios severos que incluyen infiltración de cerebro de células T autorreactivas (Nicoll, J. A. et al. 2003 Nat ed 9:448-452; Bayer, A.J., et al. 2005 Neurology 64:94-101). Sin embargo, los estudios que investigan los efectos clínicos en pacientes tratados con AN-1792 revela que los pacientes quienes desarrollan una respuesta de anticuerpo contra ?ß42 no sufren de meningoencefalicitis realizada mejor en pruebas cognitivas qué pacientes que no responden, indicando que la inmunoterapia puede ser un procedimiento de tratamiento útil en AD.

Más importante, los resultados recientes obtenidos de casos de autopsia que analizan pacientes quienes sufrieron de vacunación AN1792 muestra una claridad de especies de ?ß de longitud completa a partir del cerebro pero una persistencia de formas truncadas N-terminalmente de ?ß (Nicoll, J. A., et al. 2006 J Neuropathol Exp Neurol 65:1040-1048) . Esto acentúa la necesidad de la invención de vacunas novedosas las cuales están objetivando ?ß de longitud completa así como también formas truncadas N- terminalmente y modificadas de esta molécula.

Inducir una respuesta inmunológica contra los péptidos ?ß40/42 en humanos puede interferir con la declinación cognitiva en pacientes AD, pero una vacuna segura contra Alzheimer tiene que ser evitada para la formación de células T auto reactivas. La vacunación usando péptidos ?ß40/42 nativos o fragmentos de los mismos sufre de riesgo intrínseco de inducir la enfermedad inmunológica en pacientes, ya que la respuesta inmunológica no puede ser exclusivamente objetivada a ?ß .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Es un objeto de la presente invención proporcionar compuestos y medicamentos los cuales pueden ser usados para tratar y/o evitar la enfermedad de Alzheimer. Estos compuestos muestran riesgo significativamente reducido o ningún riesgo para inducir las enfermedades autoinmunológicas cuando se administran a un individuo. De acuerdo a otro objeto de la presente invención el compuesto puede ser capaz de inducir la formación in vivo de anticuerpos en un individuo los cuales son dirigidos a formas truncadas y/o estabilizadas de ?ß, los cuales son los componentes principales de depósitos amiloides.

Por lo tanto la presente invención se relaciona al uso de por lo menos un compuesto el cual comprende la secuencia de aminoácidos (X1)mHX2X3X4X5FX6(X7)n (fórmula II) En donde Xi es serina (S) , treonina (T) o cisteína (C) , X2 es glutamina (Q) , treonina (T) o metionina (M) , X3 es lisina (K) o arginina (R) , X4 es leucina (L) , metionina (M) , X5 es triptófano (W) , tirosina (Y) , fenilalanina (F) o isoleucina (I) , X6 es asparagina (N) , ácido glutámico (E) , alanina (A) o cisteína (C) , X7 es cisteína (C) , n y m son, independientemente, 0 ó 1.

El compuesto el cual tiene una capacidad de enlace a un anticuerpo el cual es específico para un epítopo del amiloide-beta-péptido (?ß) el cual comprende la secuencia de aminoácidos HQ LVF y/o HQKLVFFAED .

Para producir un medicamento para evitar y/o tratar la enfermedad de Alzheimer.

La invención presentada en la presente se refiere a antígenos los cuales no contienen secuencias del péptido ?ß nativo sino son sin embargo imitadores de la estructura de neo-epítopos de ?ß no detectable por mimotopos tales como los descritos en la solicitud O 2004/062556. La vacuna AD a base de mimotopo por lo tanto induce las respuestas de anticuerpo que reaccionan exclusivamente con las moléculas ?ß patológicas mencionadas anteriormente pero no con estructurales parentales . En forma importante, la respuesta inmunológica inducida por estos mimotopos no interactúa con APP de longitud completa y APPalfa secretada (sAPPalfa) y de esta forma la vacunación retiene las funciones fisiológicas normales de ambas moléculas. Adicionalmente , los mimotopos no contienen autoepítopos de células T potenciales y evita la inducción de células T auto reactivas dañinas .

Esto resulta sorpresivamente, en que un compuesto el cual comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula I es capaz de inducir la formación in vivo de anticuerpos los cuales se dirigen a la forma ?ß no truncada ?ß1-40/42, y formas truncadas N- terminalmente como ?ß3-40/42, ?ß(??)3-40/42, ?ß11-40/42 no modificadas, ?ß (E) 11-40/41 modificada y ?ß14-40/42, respectivamente, y también a variantes amiloides modificadas post translacionalmente y truncadas N-terminalmente que inician en la posición 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 de ?ß . En forma importante, estos mimotopos no inducen una reactividad cruzada para los neoepítopos presentes en sAPP alfa después de la escisión de APP y de esta forma no interfiere con la señalización de sAPP alfa normal.

Los anticuerpos formados por la vacunación de las moléculas (mimotopos) de la presente invención son capaces de enlazar a los fragmentos ?ß enlistados anteriormente lo cual resulta en la desintegración de placas ?ß .

La Fórmula I y II y todas las otras moléculas peptídicas descritas en la presente imitan los péptidos ?ß que ocurren en forma natural y variantes ?ß1-40/42, ?ß??3 -40/42, ?ß3-40/42, y ?ß??-40/42, ?ß??11-40/42 y ?ß?4-40/42 de tal forma que los compuestos los cuales comprenden las secuencias de aminoácidos descritas en la presente son capaces de inducir la formación de anticuerpos respectivos. Las variantes amiloides modificadas post translacionalmente y truncadas N- terminalmente que inician en la posición 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 de ?ß pueden ser detectadas por los anticuerpos también.

La "beta-amiloidosis" como se usa en la presente, se refiere a varias enfermedades degenerativas las cuales se caracterizan por la polimerización aberrante y acumulación de proteínas específicas así llamadas proteopatías . La presente invención se relaciona a la prevención, tratamiento y diagnosis de proteopatías asociadas con proteínas beta-amiloides resumidas bajo el término beta-amiloidosis. La forma más prominente de beta-amiloidosis es la enfermedad de Alzheimer (AD) . Otros ejemplos incluyen pero no se limitan a demencia con cuerpos de Lewy y demencia en síndrome de Down.

Ejemplos adicionales son demencia de cuerpo de Lewi, miositis, miositis de cuerpos de inclusión esporádica, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis (tipo Dutch) , angiopatía amiloide cerebral, angitis relacionada a Ap .

La administración de un compuesto el cual comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula II provoca una respuesta inmunológica contra las mismas formas modificadas no truncadas y truncadas y post translacionalmente de ?ß como los compuestos los cuales comprenden una secuencia de aminoácidos de la fórmula I.

De acuerdo a una modalidad preferida de la presente invención el compuesto comprende un péptido el cuál tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo el cual consiste de SHTRLYF (C) , HMRLFFN (C) , SHORL F (C) , HQKMIFA (C) , HMRMYFE (C) , THQRLWF (C) Y HQKMIF (C) , preferentemente del grupo el cual consiste de SHTRLYF (C) , HMRLFFN (C) , HQKMIFA (C) , HMRMYFE (C) , THQRLWF (C) (todas las cuales son capaces para inducir in vivo la formación de anticuerpos dirigidos a péptidos Abeta) .

De acuerdo a una modalidad preferida adicional de la presente invención el por lo menos un compuesto comprende un péptido el cual tiene la secuencia de aminoácidos SHTRLYF (C) , SGEYVFH (C) , SGQLKFP (C) , SGQIWFR (C) , SGEIHFN (C) , HMRLFFN (C) , GELWFP (C) , HQKMIFA (C) , GEIWFEG (C) , GEIYFER (C) , THQRLWF (C) , GEIRFGS (C) , GEIKFDH (C) o GEIQFGA (C) , en particular HQKMIFA (C) .

Otro aspecto de la presente invención se relaciona al uso de por lo menos un compuesto el cual comprende la secuencia de aminoácidos (X1)mGX2X3X4FX5Xe(X7)n (Fórmula I) , en donde Xi es serina (S) , alanina (A) o cisteína (C) , X2 es serina (S) , treonina (T) , ácido glutámico (E) , ácido aspártico (D) , glutamina (Q) o metionina (M) , X3 es isoleucina (I) , tirosina (Y) , metionina (M) o leucina (L) , X4 es leucina (L) , arginina (R) , glutamina (Q) , triptófano (W) , valina (V) , histidina (H) , tirosina (Y) , isoleucina (I) , lisina (K) , metionina (M) , o fenilalanina (F) , X5 es alanina (A) , fenilalanina (F) , histidina (H) , asparagina (N) , arginina (R) , ácido glutámico (E) , isoleucina (I) , glutamina (Q) , ácido aspártico (D) , prolina (P) , o triptófano (W) , glicina (G) , X6 es cualquier residuo de aminoácido, X7 es cisteína (C) , n y m son, independientemente, 0 ó 1; el compuesto el cual tiene una capacidad de enlace a un anticuerpo el cual es específico para un epítopo del amiloide-beta-péptido (Abeta) el cual comprende la secuencia de aminoácidos HQKLVF y/o HQKLVFFAED, para producir un medicamento para evitar y/o tratar la enfermedad de Alzheimer.

De acuerdo a una modalidad preferida de la presente invención el compuesto comprende un péptido el cual tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo el cual consiste de SGEYVFH (C) , SGQLKFP (C) , SGQI FR (C) , SGEIHFN (C) , GQIWFIS (C) , GQIIFQS (C) , GQIRFDH (C) , GEMWFAL (C) , GELQFPP (C) , GELWFP (C) , GEMQFFI (C) , GELYFRA (C) , GEIRFAL (C) , GMIVFPH (C) , GEI FEG (C) , GDL FPL (C) , GQILFPV (C) , GELFFPK (C) , GQI FPR (C) , GSLFF P (C) , GEILFGM (C) , GQLKFPF (C) , GTIFFRD (C) , GQIKFAQ (C) , GTLIFHH (C) , GEIRFGS (C) , GQIQFPL (C) , GEIKFDH (C) , GEIQFGA (C) , GELFFEK (C) , GEIRFEL (C) , GEIYFER (C) , SGEIYFER (C) , AGEIYFER (C) y (C) GEIYFER.

Los compuestos particularmente preferidos de la presente invención comprenden o consisten de las secuencias de aminoácidos identificadas anteriormente, en donde la terminal C del péptido puede o no puede comprender un residuo de cisteína (indicado por el uso de paréntesis) de tal forma que el compuesto obtenido puede ser acoplado, por ejemplo, a una molécula portadora. Sin embargo, es por supuesto posible enlazar a la N-terminal del péptido un residuo de cisteína.

De acuerdo a una modalidad particularmente preferida de la presente invención la secuencia de aminoácidos es seleccionada del grupo el cual consiste de GELWFP (C) , GEIWFEG (C) , GEIYFER (C) , GEILFGM (C) , GEIKFDH (C) , GEIQFGA (C) (todas las cuales son péptido de competición) y GEIKFDH (C) , GEIRFGS (C) , SGQLKFP (C) , SGQIWFR (C) , SGEIHFN (C) , GELWFP (C) , GEIWFEG (C) , GEIYFER (C) , GEIQFGA (C) , SGEYVFH (C) (todas las cuales son capaces de inducir in vivo la formación de anticuerpo dirigidos a péptidos Abeta enlistados anteriormente) .

Otro aspecto de la presente invención se relaciona al uso de por lo menos un compuesto el cual, comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo el cual consiste de AIPLFVM (C) , KLPLFVM (C) , QLPLFVL (C) Y NDAKIVF (C) para producir un medicamento para evitar y/o tratar la enfermedad de Alzheimer.

Cada uno de los compuestos de la presente invención es capaz de inducir la formación in vivo de anticuerpos dirigidos a péptidos derivados de ?ß40/42, incluyendo ?ß?-40/42, y formas truncadas N-terminalmente como ?ß3 -40/42, ?ß (pE) 3-40/42, ?ß11-40/42 no modificado, ?ß (E) 11-40/42 modificado y ?ß14-40/42, respectivamente. Ya que los compuestos de la presente invención son aislados por anticuerpos que están dirigidos a los residuos de aminoácidos 14 a 19 de ?ß, los compuestos de la presente invención son capaces de inducir la formación de anticuerpos que pueden unirse a los truncamientos del péptido ?ß iniciando desde la posición de aminoácidos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 del péptido ?ß. Por lo tanto, estos compuestos son particularmente apropiados para tratar y/o prevenir AD porque la administración de al menos uno de los compuestos resulta en la formación de anticuerpos que son capaces de reconocer las principales formas de ?ß, por ejemplo, ?ß1-40/42, ?ß??3— 40/42 y ?ß3-40/42. Además, estos mimotopos no inducen reactividad cruzada con los neoepítopos presentes en sAPP alfa después de la escisión de APP y, de esta forma, no interfieren con la señalización alfa APP normal.

Los compuestos de la presente invención, en particular los péptidos de la presente invención, pueden además ser modificados en su N-terminal mediante una acilación y/o reacción de acetilación. Por ejemplo, un compuesto particularmente preferido comprende la secuencia aminoacídica AC-GEIYFER (C) .

De acuerdo con la presente invención, el término "mimotopo" hace referencia a una molécula que tiene una conformación que tiene una topología equivalente al epítopo con el cual se mimetiza. El mimotopo se une a la misma región de unión a antígeno que un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente al antígeno deseado. El mimotopo provocará una respuesta inmunológica en un hospedero que es reactivo al antígeno con el cual se mimetiza. El mimotopo también puede fungir como competidor para el epítopo con el cual se miraetiza en ensayos de inhibición ín vitro (por ej . , ensayos de inhibición ELISA) que involucran el epítopo y un anticuerpo que se une a ese epítopo. Sin embargo, un mimotopo de la presente invención, no necesariamente evita o compite con la unión del epítopo con el cual se mimetiza en un ensayo de inhibición in vitro, aunque sea capaz de inducir respuestas inmunológicas específicas cuando se administra a un mamífero.

Como se usa en la presente, el término "epítopo" se refiere a una región inmunogénica de un antígeno el cual es reconocido por una molécula particular de anticuerpo. En general, un antígeno contará con uno o más epítopos, cada uno de los cuales será capaz de unirse a un anticuerpo que reconozca al epítopo particular.

Los mimotopos de la presente invención pueden producrise de forma sintética mediante métodos de síntesis química bien conocidos en la técnica, ya sea como un péptido aislado o como parte de otro péptido o polipéptido. Alternativamente, el mimotopo de péptido puede ser producido en un microorganismo el cual produce el mimotopo de péptido el cual es entonces aislado y si se desea, además purificado. El mimotopo péptido puede ser producido en microorganismo como bacterias, levaduras u hongos, en células eucariotas como una célula de mamífero o un insecto, o en un vector de virus recombinante como los adenovirus, viruela, virus herpes, virus de Simlikii fores, baculovirus, bacteriófago, virus sindbis o virus sendai . Las bacterias adecuadas para producir el mimotopo de péptido incluyen E. coli, B. subtilis o cualquier otra bacteria que es capaz de expresar péptido como el mimotopo de péptido. Los tipos de levadura adecuados para expresar el mimotopo de péptido incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida, Pichia pastoris o cualquier otra levadura capaz de expresar los péptidos . Los métodos correspondientes son bien conocidos en la técnica. También los métodos para aislar y purificar péptidos producidos recombinantemente son bien conocidos en la técnica e incluyen por ejemplo como filtración de gel, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio de iones, etc.

Para facilitar el aislamiento del mimotopo de péptido, un polipéptido de fusión puede ser hecho en donde el mimotopo de péptido es fusionado translacionalmente (enlazado covalentemente) a un polipéptido heterólogo el cual permite el aislamiento por cromatografía de afinidad. Los polipéptidos heterólogos típicos son His-Tag (por ejemplo Hise; 6 residuos de histidina) , GST-Tag (glutationa-S-transferasa) etc. El polipéptido de fusión facilita no solamente la purificación de los mimotopos sino puede también evitar que el polipéptido de mimotopo sea degradado durante la purificación. Si se desea remover el polipéptido heterólogo después de la purificación el polipéptido de fusión puede comprender un sitio de escisión en la unión entre el mimotopo de péptido y el polipéptido heterólogo. El sitio de escisión consiste de una secuencia de aminoácidos que se escinde con una enzima específica para la secuencia de aminoácidos en el sitio (por ejemplo proteasas) .

Los mimotopos de la presente invención pueden también ser modificados en o cerca de su N y/o C -terminal de tal forma que en las posiciones se enlaza un residuo de cisteína al mismo. En una modalidad preferida los residuos de cisteína colocados terminalmente (ubicados en la N y C -terminal del péptido) son usados para ciclizar los péptidos a través del enlace disulfuro.

Los mimotopos de la presente invención pueden también ser usados en varios ensayos y kits, en particular en ensayos inmunológicos y kits. Por lo tanto, es particularmente preferido que el mimotopo pueda ser parte de otro péptido o polipéptido, particularmente una enzima la cual es usada como un reportador en ensayos inmunológicos. Las enzimas reportadoras incluyen por ejemplo fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano.

Los mimotopos de acuerdo a la presente invención preferentemente son polipéptidos antigénicos los cuales en su secuencia de aminoácidos varían de la secuencia de aminoácidos de ?ß o de fragmentos de ?ß . En este aspecto, los mimotopos inventivos pueden no solamente comprender substituciones de aminoácidos de uno o más residuos de aminoácidos que ocurren en forma natural sino también de uno o más de los aminoácidos no naturales (es decir no de 20 aminoácidos "clásicos") o pueden ser completamente ensamblados de los aminoácidos no naturales. Por otra parte, los antigenos inventivos los cuales inducen los anticuerpos dirigidos y enlace a ?ß1-40/42, ?ß??3-40/42, ?ß3-40/42, ?ß??-40/42, ?ß??11-40/42 y ?ß14-40/42 (y otras formas truncadas N-terminalmente de ?ß que inicia de las posiciones de aminoácidos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13) pueden ser ensamblados de D- o L-aminoácidos o de combinaciones de DL-aminoácidos y, opcionalmente, pueden haber sido cambiados por modificaciones adicionales, cierres de anillo o derivatizaciones . Los antigenos que inducen antígenos adecuados pueden ser proporcionados de bibliotecas de péptido comercialmente disponibles. Preferentemente, estos péptidos son por lo menos 7 aminoácidos, y longitudes preferidas puede ser hasta 16, preferentemente hasta 14 ó 20 aminoácidos (por ejemplo 5 a 16 de residuos de aminoácidos) . De acuerdo a la invención, sin embargo, también péptidos más largos pueden ser empleados muy bien como antígenos que inducen anticuerpo. Adicionalmente los mimotopos de la presente invención pueden también ser parte de un polipéptido y consecuentemente que comprenden en su N y/o C-terminal por lo menos un residuo de aminoácido adicional.

Para preparar los mimotopos de la presente invención (es decir los antígenos que inducen anticuerpos descritos en la presente) , por supuesto también las bibliotecas de fagos, bibliotecas de péptido son adecuadas, por ejemplo producidas por medio de química combinatorial u obtenida por medio de técnicas de tamizado de alto rendimiento para las estructuras más variadas (Display: A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas (Editor), et al., Willats WG Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 2002 Dec; 50(6): 837-54).

Adicionalmente, de acuerdo a la invención también antígenos inductores de anticuerpos anti-A i-40/42 , ?ß??3 -40/42, -?ß3-40/42, -?ß11-40/42- ?ß??11-40/42- y ?ß14-40/42-en base a ácidos nucleicos ( "aptámeros" ) pueden ser empleados, y estos, también, pueden ser encontrados con las bibliotecas más variadas (oligonucleótido) (por ejemplo con 2-180 residuos de ' ácidos nucleicos (por ejemplo Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5(5) (2002), 690-700; Famulok et al., Acc . Chem. Res. 33(2000), 591-599 ; Mayer et al., PNAS 98 (2001), 4961-4965, etc) . En antígenos inductores de anticuerpos en base a los ácidos nucleicos, la estructura principal de ácido nucleico puede ser proporcionada por ejemplo por los compuestos fosforo-diéster naturales, o también por fosforotioatos o combinaciones de variaciones químicas (por ejemplo como PNA) , en donde como bases, de acuerdo a la invención principalmente U, T, A, C, G, H y mC pueden ser empleados. Los residuos 2' de los nucleótidos los cuales pueden ser usados de acuerdo a la presente invención preferentemente son H, OH, F, Cl, NH2, O-metilo, O-etilo, 0-propilo, o 0-butilo, en donde los ácidos nucleicos pueden también ser modificados en forma diferente, es decir por ejemplo con grupos protectores, ya que son comúnmente empleados en la síntesis de oligonucleótidos . De esta forma, los antígenos inductores de anticuerpo a base de aptámeros son también antígenos inductores de anticuerpos preferidos dentro del alcance de la presente invención.

De acuerdo a una modalidad preferida de la presente invención el compuesto es acoplado a un portador aceptable farmacéuticamente, preferentemente KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin hemocianina modificada de lapa) , toxoide de tétanos, proteína de enlace de albúmina, albúmina sérica bovina, un dendrímero (MAP; Biol .. Chem. 358: 581), enlazadores de péptido (o regiones de flanqueo) así como también las substancias adyuvantes descritas en Singh et al., Nat. Biotech. 17 (1999), 1075-1081 (en particular aquellas en la Tabla 1 de ese documento), y O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003) , 727-735 (en particular los compuestos de inmunopotenciación endógenos y sistemas de suministro descritos en la misma), o mezclas de los mismos.

El químico de conjugación (por ejemplo, por medio de compuestos heterobifuncionales como' GMBS y por supuesto también otros descritos en "Bioconjugate Techniques" , Greg T. Hermanson) en este contexto puede ser seleccionado de reacciones conocidas para el hombre experto en la técnica. Por otra parte, la composición de vacuna puede ser formulada con un adyuvante, preferentemente una composición de aluminio soluble bajo, en particular hidróxido de aluminio. Por supuesto, también se pueden usar los adyuvantes como fosfato de aluminio MF59, fosfato de calcio, citosinas (por ejemplo, IL-2, IL-12, GM-CSF) , saponinas (por ejemplo, QS21) , derivados MDP, oligosacáridos CpG, LPS, MPL, polifosfozanos , emulsiones (por ej . , emulsión de Freund, SAF) , liposomas, virosomas, iscomas, cocleatos, micropartículas PLG, partículas poloxaméricas , partículas similares a virus, enterotoxinas lábiles al calor (LT) , toxinas de cólera (CT) , toxinas mutantes (por ej . , LTK63 y LTK72) , micropartículas y/o liposomas polimerizados .

El compuesto de la presente invención está unido de preferencia al portador o adyuvante por medio de un enlazador, el cual se selecciona del grupo que consiste en NHS-poli (óxido de etileno) (PEO) (por ej . , NHS PE04-maleimidá) .

Una vacuna que comprende el compuesto de la presente invención (mimotopo) y un portador farmacéuticamente aceptable puede administrarse mediante cualquier modo adecuado de aplicación, por ejemplo, i.d., i.v., i.p., i.m., intranasal, oral y subcutáneamente, entre otros, y mediante cualquier dispositivo de administración (O'Hagan et al., Drug Discovery 2 (9) , (2003) , 727-735) . El compuesto de la presente invención está formulado de preferencia para administración intravenosa, subcutánea, transdérmica o intramuscular (ver por ej . , "Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations " , Sar- faraz Niazi, CRC Press Inc, 2004) .

El medicamento (vacuna) de conformidad con la presente invención contiene el compuesto de la invención en una cantidad de 0.1 ng a 10 mg, preferentemente 10 ng a 1 mg, en particular 100 ng a 100 µg, o, alternativamente, por ej . , 100 fmol a 10 ymol, preferiblemente 10 pmol a 1 pmol, en particular 100 pmol a 100 nmol . Típicamente, la vacuna también puede contener sustancias auxiliares como amortiguadores y estabilizadores.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona con el uso de un compuesto como el que se define arriba para tratar y mejorar los síntomas de sinucleopatía.

Resultó sorprendentemente que los compuestos de la presente invención también pueden ser usados para tratar y mejorar síntomas asociados con sinucleopatías .

La amiloidosis y las sinucleopatías están relacionadas con la acumulación, en el cerebro, de ß-amiloide and a-sinucleina, respectivamente. Algunos pacientes muestran características clínicas y patológicas de ambas enfermedades. Estos pacientes también están clasificados por padecer de un síndrome recientemente identificado descrito como Demencia de cuerpos de Lwey o enfermedad de Parkinson con demencia (DLB/PDD) . En un modelo animal trasgénico reciente para DLB/PDD se ha demostrado que la sobreexpresión tanto de proteína precursora alfa-sinucleina como amiloide (hAPP) , en ratones lleva al desarrollo de alteraciones cognitivas y motoras acompañadas por la pérdida de neuronas colinérgicas y reducción en vesículas sinápticas, formación de placas amiloides extensivas, e inclusiones fibrilares intraneuronales inmunoreactivas haSYN. Todas estas características son también encontradas en el síndrome DLB/PDD. Se ha descrito recientemente que tanto las moléculas son potencialmente capaces de interactúar y formar oligómeros híbridos in vitro. Se ha mostrado también que la sobre expresión de la APP puede exacerbar algunos de los efectos patológicos de sobre expresión de alfa-sinucleina . En contraste, la alfa-sinucleina es capaz de incrementar la secreción y toxicidad de péptidos beta amiloides y puede también de esta forma incrementar los efectos de ß-amiloide que soporta la noción de traslapar trayectorias patogénicas en procesos neurodegenerativos.

En arabas proteopatías la acumulación progresiva de oligómeros de péptidos ha sido identificada como uno de los eventos tóxicos centrales que llevan a las varias alteraciones típicas para ya sea sinucleopatías o amiloidosis. A pesar de esta similitud mecánica, se tiene la hipótesis que alfa-sinucleina y ?ß tienen efectos patogénicos distintos, así como también convergentes en la integridad y función del cerebro. Las sinucleinas son creídas para afectar la función motora más severamente que la función cognitiva, mientras que los péptidos ß amiloides son descritos para tener efectos opuestos. La razón para esta discrepancia es actualmente desconocida pero incluye una descripción clara de las interdependencias y efectos de ambas moléculas .

El procedimiento de tratamiento presentado en la invención presente está describiendo una inmunoterapia que objetiva ?ß lo cual lleva a la remoción de amiloide principalmente extracelular . Es de esta forma creído para liberar las alteraciones asociadas a amiloides en el intervalo de deposición de placa a muerte neuronal así como también a problemas de memoria y declinación cognitiva. La localización subcelular de sinucleinas sin embargo indica que estas proteínas intracelulares son principalmente activas en la sinapsis, especialmente confinado a vesículas sinapticas. En forma interesante, también las acumulaciones de sinucleina, las cuales son el sello patológico unificante de sinucleopatías , son principalmente detectables intracelularmente . Adicionalmente , el mecanismo patogénico que subyace a las sinucleopatías es creído para ser atribuible a cambios intraneuronales en el intervalo de disfunción mitocondrial, acumulación de proteínas anormalmente duplicada, ubiquitinado o fosforilado así como la acumulación de alfa sinucleina. Estas alteraciones son consecuentemente resultantes en cambios en funciones sinápticas, falla sináptica, y pérdida de neuronas dopaminérgicas y signos clínicos clásicos de sinucleopatías. En contraste ?ß es principalmente detectable extraneuronalmente y placas amiloides así como también fibrilas, protofibrilas y oligómeros de beta amiloide pueden ejercer funciones neurotóxicas cuando se aplican extracelularmente o intracerebralmente . De esta forma es sorprendente encontrar para un experto que un procedimiento principalmente que objetiva amiloide extracelular puede reducir los síntomas de sinucleopatías como PD, las cuales están afectando principalmente procesos intracelulares que llevan a los síntomas típicos descritos posteriormente. Es incluso más sorprendente ya que es actualmente creído que los efectos de traslape de ambas moléculas son provocadas por interacciones directas de las dos proteínas lo cual puede principalmente ocurrir intracelularmente.

De acuerdo a la presente invención el término "sinucleinopatía" incluye todos los trastornos neurodegenerativos caracterizados por agregaciones de sinucleina patológica. Varios trastornos neurodegenerativos que incluyen la enfermedad de Parkinson (PD por sus siglas en inglés) , enfermedad de cuerpos de Lewi (LBD, por sus siglas en inglés) , enfermedad de cuerpo de Lewy difuso (DLBD por sus siglas en inglés) , demencia con cuerpos de Lewy (DLB por sus siglas en inglés) , parkinsonismo con demencia (PDD por sus siglas en inglés) , atrofia sistemática múltiple ( SA por sus siglas en inglés) y neurodegeneración con acumulación de hierro cerebral tipo I (NBIA tipo I por sus siglas en inglés) son agrupados colectivamente como sinucleinopatías .

Los "síntomas de sinucleopatía" como se usa en la presente, se refiere a aquellos síntomas de las sinucleopatías , en particular la enfermedad de Parkinson, lo cual afecta el comportamiento motor y no motor de un paciente el cual sufre de la enfermedad. "Síntomas motores" incluyen tremor de descansa, Bradiquinesia, rigidez, inestabilidad postural, postura detenida, distonia, fatiga, dexteridad motora fina dañada y coordinación motora, coordinación motora gruesa dañada, insuficiencia de movimiento (movimiento del brazo disminuido) , acatisia, problemas de velocidad, como la suavidad de voz o palabras arrastradas provocado por la carencia de control muscular, pérdida de la expresión facial, o "enmascarado", micrografia, .linchamiento dificultoso, disfunción sexual, babeado, etc. Síntomas "no motores" incluyen dolor, demencia o confusión, perturbaciones del sueño, constipación, problemas de. la piel, depresión, miedo o ansiedad, dificultades de la memoria y pensado lento, problemas urinarios, fatiga y dolor, pérdida de energía, comportamiento compulsivo, calambre, etc.

De acuerdo a una modalidad preferida de la presente invención la sinucleopatía es seleccionada del grupo de enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy, atrofia sistemática múltiple y neurodegeneración con acumulación de hierro cerebral . Particularmente preferido es la enfermedad de Parkinson.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona a un péptido el cual tiene o consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo el cual consiste de SHTRLYF (C) , SGEYVFH (C) , SGQLKFP (C) , SGQIWFR (C) , SGEIHFN (C) , GEMWFAL (C) , GELQFPP (C) , GELWFP (C) , SHQRLWF (C) , HQKMIFA (C), GEMQFFI (C), GELYFRA (C) , GEIRFAL (C) , GMIVFPH (C) , GEI FEG (C) , GEIYFER (C) , AIPLFVM (C) , GDLKFPL (C) , GQILFPV (C) , GELFFPK (C) , GQIMFPR (C) , HMRMYFE (C) , GSLFF P (C) , GEILFGM (C) , GQLKFPF (C) , KLPLFV (C) , GTIFFRD (C) , THQRLWF (C) , GQIKFAQ (C) , GTLIFHH (C) , GEIRFGS (C) , GQIQFPL ®, GEIKFDH (C) , GEIQFGA (C) , QLPLFVL (C) , HQKMIF (C) , GELFFEK (C) , GEIRFEL (C) , AcGEIYFER (C) , SGEIYFER (C) , AGEIYFER (C) y GEIYFER (C) . Como se indica por el uso del paréntesis los péptidos de la presente invención pueden o no pueden comprender el residuo de cisteína en la C-o N- terminal .

Consecuentemente la presente invención comprende también las siguientes secuencias de aminoácidos : SHTRLYF, SGEYVFH , SGQLKFP , SGQIWFR, SGEIHFN, GQIWFIS, NDAKIVF , GQIIFQS , GQIRFDH, HMRLFFN, GENWFAL, GELQFPP, GELWFP , SHQRLWF, HQK IFA, GEMQFFI , GELYFRA, GEIRFAL, GMIVFPH , GEIWFEG, GEIYFER, AIPLFVM, GDLKFPL, GQILFPV, GELFFPK-, GQIMFPR, HMRMYFE , GSLFFWP, GEILFGM, GQLKFPF, KLPLFVM, GTIFFRD, THQRLWF, GQIKFAQ, GTLIFHH, GEIRFGS , GQIQFPL, GEIKFDH, GEIQFGA, QLPLFVL, HQKMIF, GELFFEK, GEIRFEL , SGEIYFER, y AGEIYFR.

De acuerdo a una modalidad preferida el péptido es acoplado a un portador aceptable farmacéuticamente, preferentemente KLH (por sus siglas en inglés de hemocianina modificada de lapa) .

Aún otro aspecto de la presente invención se relaciona a una formulación farmacéutica, preferentemente una vacuna, la cual comprende por lo menos un péptido de acuerdo a la presente invención. La formulación farmacéutica puede ser empleada para tratar individuos que sufren de la enfermedad de Alzheimer o evitan la formación de placas ?ß en un individuo para impedir la formación de la enfermedad de Alzheimer.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La presente invención es además ilustrada por las siguientes figuras y ejemplos, sin embargo sin estar restringido al mismo.

La Figura 1 muestra enlace de anticuerpo monoclonal MV-002 para especificar péptidos y proteínas recombinantes .

La Figura 2 muestra ensayos de enlace típicos con mimotopos para beta-amiloide y fragmentos de beta-amiloide truncados N- terminalmente y/o modificados post-translacionalmente .

La Figura 3 muestra ensayos de inhibición típicos con mimotopos para beta-amiloide y fragmentos beta-amiloide truncados N- terminalmente y/o modificados post translacionalmente .

La Figura 4 muestra ejemplos para caracterizaciones in vivo de la respuesta inmunológica producida por vacunación de mimotopo (péptido inyectado/péptido irrelevante) .

La Figura 5 muestra ejemplos para caracterización in vivo de la respuesta inmunológica producida por vacunación de mimotopo contra fragmentos beta amiloides y sAPP-alfa.

La Figura 6 muestra ejemplos para caracterización in vivo de la respuesta inmunológica producida por vacunación de mimotopos contra ?ß40/42 de longitud completa.

La Figura 7 muestra áreas ocupadas por placas amiloides. Tg2576 son inyectadas 6 veces con vacunas de mimotopo con adyuvante de hidróxido de aluminio (ALUM) por s.c. inoculación en intervalos mensuales. Los ratones de control reciben PBS-ALUM solamente. El área ocupada por las placas amiloides mostrada como porcentaje del grupo de control. Grl .. . grupo de control; Gr2 ... reciben p4675.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN EJEMPLOS Métodos Los anticuerpos usados para la identificación de mimotopos de acuerdo a la presente invención detectan secuencias de aminoácidos derivadas de ?ß humano pero no enlazan a APP humana de longitud completa. Las secuencias detectadas incluyen EVHHQKLVFFAED (=epitopo original aall-24 de ?ß) y p (e ) VHHQKLVF (p4374= epítopo original aall-19 de ?ß con una modificación de piroglutamato en la N-terminal) . El anticuerpo puede ser una preparación de anticuerpo monoclonal o policlonal o cualquier parte de anticuerpo o derivado del mismo, el único prerrequisito es que la molécula de anticuerpo reconoce específicamente por lo menos uno de los epítopos mencionados anteriormente (derivado de ?ß humano) , pero no enlaza a APP humana de longitud completa.

Los mimotopos son identificados y además caracterizado con los anticuerpos monoclonales y bibliotecas de péptido.

Ejemplo 1 : Generación de anticuerpos monoclonales para detectar específicamente beta-amiloide y fragmentos beta-amiloides truncados N-terminalmente y/o modificados post-translacionalmen e Un anticuerpo monoclonal derivado de la fusión del experimento Alz-9 es generado: los ratones C57/B16 son inmunizados repetidamente con epítopo ?ß original HQKLVFC acoplado a KLH (hemocianina modificada de lapa y Alum (hidróxido de aluminio) como adyuvante. El péptido específico p4377, hibridomas de producción de anticuerpo son detectados por ELISA (placas ELISA recubiertas con péptido p4377) . ?ß40/42 humano (proteína recombinante) es usado como un péptido de control positivo: los hibridomas que reconocen la proteína recombinante inmovilizada en placas ELISA son incluidas ya que son enlazadas tanto a péptido y ?ß de longitud completa específicamente. Se usa pl454 (?ß 33-40 humano) como péptido de control negativo. Adicionalmente los hibridomas con buen enlace p4374, y pl323 y una carencia de enlace sAPP-alfa son usados para desarrollo de anticuerpo adicional.

El clon de hibridoma Mv-002 (nombre interno A115; IgG2b) es purificado y analizado para detección específica de pl323, p4374, p4377, pl454, ?ß y sAPP-alfa respectivamente. Mv-002 reconoce los epítopos pl323 así como también p4377 y proteína ?ß de longitud completa (proteína recombinante: obtenido de Bachem AG, Bubendorf, Suiza) en ELISA. Sin embargo no detecta pl454 en ELISA. Adicionalmente, los anticuerpos MV-002 fallan para detectar sAPP-alfa pero enlazado específicamente al péptido p4374 que codifica la versión de piroglutamato de ?ß11-19.

Ejemplo 2: Exhibición de fagos, ELISA de enlace e inhibición in vitro Las bibliotecas de exhibición de fago usadas en este ejemplo son: Ph. D. 7: New England BioLabs E8102L (biblioteca 7mer lineal) . La exhibición de fagos es hecha de acuerdo al protocolo del fabricante (www. neb. com) .

Después de 2 ó 3 vueltas subsecuentes de apelmazado, los clones de fagos sencillos son tomados y los sobrenadantes de fagos son sometidos a ELISA en placas recubiertas con el anticuerpo que es usado para el procedimiento de apelmazado. Los clones de fagos que son positivos en este ELISA (señal fuerte para el objetivo, pero no señal para control no específico) son secuenciados . A partir de las secuencias de ADN, las secuencias de péptidos son deducidas. Estos péptidos son sintetizados y caracterizados en ELISA de enlace e inhibición. Adicionalmente, algunos mimotopos novedosos son creados por combinar la información de secuencia a partir de los mimotopos identificados en el tamiz para soportar la identificación de una secuencia de consenso para una vacunación de mimotopo. 1. Ensayo de enlace in vitro (ELISA) Los péptidos derivados de exhibición de fagos así como también variantes de los mismos son acoplados a BSA y enlazado a las placas de ELISA (1 µ?; como se indica en las figuras respectivas) y se incuba subsecuentemente con el anticuerpo monoclonal que es usado para el procedimiento de tamizado para analizar la capacidad de enlace de péptidos identificados . 2. Ensayo de inhibición in vitro (ELISA) Diferentes cantidades de péptidos (concentraciones en el intervalo de 5 µ5 a 0.03 ig ; diluciones en serie), derivado de exhibición de fagos son incubados con el anticuerpo monoclonal que es usado para el procedimiento de tamizado. Los péptidos que disminuyen enlace subsecuente del anticuerpo al epítopo original recubierto en placas ELISA son considerados como que se inhiben en este ensayo.

Ejemplo 3: Prueba in vivo de mimotopos ; Análisis de inmunogenicidad y reactividad cruzada 1. Prueba in vivo de mimotopos Péptidos de inhibición así como también de no inhibición son acoplados a KLH e inyectados en ratones (ratones C57/B16 del tipo silvestre; inyección subcutánea en el flanco) junto con un adyuvante apropiado (hidróxido de aluminio) . Los animales son vacunados 3-6 veces en intervalos bisemanalmente y el suero es tomado bisemanalmente también. Se determinan los títulos a péptidos inyectados, así como también para un péptido irrelevante con cada suero. Adicionalmente , los títulos contra la proteína ?ß humana recombinante, y contra los péptidos originales son determinados respectivamente. En general los sueros son analizados por reacción contra los péptidos acoplados a albúmina sérica bovina (BSA por sus siglas en inglés) y las proteínas de longitud completa recombinante las cuales son inmovilizadas en placas ELISA. Los títulos son determinados usando anticuerpos específicos IgG anti ratón. Para los resultados detallados ver las figuras 4, 5 y 6 respectivamente . 2. Resultados 2.1 Identificación de anticuerpos monoclonales (mAB) específicos dirigidos contra formas de ?ß truncadas N térmicamente y modificadas La Figura 1 representa la caracterización del anticuerpo monoclonal MV-002 (nombre interno A115; IgG2b) derivado de Alz-9 experimental que demuestra especificidad para ?ß longitud completa y fragmentos ?ß truncadas en la posición Ell y H14 y modificados en la posición Ell a pEll. 2.2. Tamizado con mAB específicos dirigidos contra formas de ?ß truncadas N- terminalmente y modificadas 2.2.1 Biblioteca de exhibición de fagos Ph. D. 7 2.2.1.1. Tamizado con anticuerpo monoclonal dirigido contra p!323 47 secuencias son identificadas por bibliotecas de exhibición de fagos PhD7 de tamizado en este tamiz: La Tabla 1 resume los péptidos identificados y su capacidad de enlace como se compara al epítopo original.

Tabla 1. Mimotopos que enlazan al anTicuerpo parental MV-002 Número de SEQ ID No. secuencia péptido interno p4403 1 SHTRLYFC 1 p4404 2 SGEYVFHC 1 p4413 3 SGQLKFPC 1 p4414 4 SGQIWFRC 1 p4415 5 SGEIHFNC 1 p4666 6 GQIWFISC 1 p4667 7 NDAKIVFC 3 p4668 8 GQIIFQSC 2 p4669 9 GQIRFDHC 3 P4670 10 HMRLFFNC 3 P4671 11 GEMWFALC 3 p4672 12 GELQFPPC 3 p4673 13 GEL FPC 3 p4674 14 SHQRLWFC 3 p4676 16 GEMQFFIC 3 p4677 17 GELYFRAC 3 P4678 18 GEIRFALC 3 p4679 19 GMIVFPHC 3 p4680 20 GEIWFEGC 3 Número de SEQ ID No. secuencia péptido interno p4681 21 GEIYFERC 3 p4682 22 AIPLFVMC 1 p4683 23 GDLKFPLC 3 p4684 24 GQILFPVC 3 p4685 25 GELFFPKC 3 p4686 26 GQIMFPRC 3 p4687 27 HMRMYFEC 3 p4688 28 GSLFFWPC 2 p4689 29 GEILFGMC 3 p4690 30 GQLKFPFC 3 p4691 31 KLPLFVMC 1 p4692 32 GTIFFRDC 1 p4693 33 THQRLWFC 3 p4694 34 GQIKFAQC 3 p4695 35 GTLIFHHC 2 p4696 36 GEIRFGSC 3 p4697 37 ¦ GQIQFPLC 3 p4698 38 GEIKFDHC 3 p4699 39 GEIQFGAC 3 p4700 40 QLPLFVLC 1 p4794 41 HQKMIFC 2 p4795 42 GELFFEKC 2 Número de SEQ ID No. secuencia péptido interno p4804 44 AcGEIYFERC 2 p4805 45 SGEIYFERC 1 . p4805 46 AGEIYFERC 1 p4807 47 CGEIYFER 1 Leyenda a la Tabla 1 : la capacidad de enl codificada por el siguiente código de enlace: 1:X describe el factor de dilución del AB parental . Ac-.. indica AA acetilada .

Código de OD max media competición 1:X 0 Sin enlace : 0 1 Enlace débil : <4000 2 Enlace media :4000- 32000 3 Enlace fuerte : >320000 2.3. Caracterización in v tro de mimotopos identificados en bibliotecas de exhibición de fagos de tamización con anticuerpo monoclonales contra formas de ?ß truncadas N- terminalmente y modificadas Las Figuras 2 y 3 muestran ejemplos representativos para ensayos de enlace e inhibición usados para caracterizar mimotopos in vitro. Los datos obtenidos son resumidos en las Tablas 1 y 2 respectivamente .

Los mimotopos MV-002: A partir de 47 secuencias presentadas 11 secuencias inhiben el enlace en experimentos de competición in vitro de anticuerpo monoclonal MV-002. Las 36 secuencias adicionales son identificadas que no inhiben el enlace de anticuerpo monoclonal en experimentos de competición in vitro pero todavía retienen capacidad de enlace al anticuerpo parental (Tabla 2) . En forma importante, como se describe en las figuras 4-6, la capacidad para competir con el epítopo original para enlace al anticuerpo parental in vitro no es prerrequisito para montar respuestas inmunológicas específicas de reacción cruzada con péptidos específicos in vivo. De esta forma los péptidos de inhibición así como también de no inhibición pueden ser usados para inducir respuestas inmunológicas que detectan péptidos in vivo (para detalles ver: figuras 4-6) lo cual puede llevar a la claridad de péptidos amiloides a partir del cerebro.

Tabla 2. Mimotopos identificados en esta invención los cuales dan resultados positivos en ensayos de inhibición; mimotopos MV-002 Número de SEQ ID No. secuencia Capacidad de péptido interna inhibición p4667 7 NDAKIVFC 1 p4670 10 HMRLFFNC 1 Número de SEQ ID No. secuencia Capacidad de péptido interna inhibición p4674 14 SHQRLWFC 1 p4675 15 HQKMIFAC 2 p4680 20 GEIWFEGC 2 p4681 21 GEIYFERC 2 p4689 29 GEILFGMC 1 p4698 38 GEIKFDHC 2 p4699 39 GEIQFGAC 1 p4794 41 HQKMIFC 1 Leyenda para la Tabla 2 : la capacidad de inhibición es codificada por el siguiente código: la inhibición débil significa que más péptido es requerido para disminuir el enlace AB que con el epítopo original; la inhibición fuerte significa cantidades de péptidos similares son requeridas para mimotopo y epítopo original para disminuir el enlace AB. Los mimotopos son comparados al péptido original como estándar. OD en 5 ug de péptido usado en el ensayo es usado para calcular la capacidad de competición comparada con el péptido original.

Código de competición 0 Sin inhibición (OD de péptido arriba 4, 6 veces del péptido original) 1 Más débil que el epítopo original (OD de péptido abajo 4,6 veces de péptido original) 2 Fuerte inhibición (como epítopo original; OD de péptido abajo 2,3 veces de péptido original) 2.4 La caracterización in vivo de mimo opos identificados en bibliotecas de exhibición de fagos de tamización con un anticuerpo monoclonal dirigidos contra amiloide beta: Los ratones C57/bl6 hembra, 5-6 ratones por grupo, son inmunizados subcutáneamente con 30 g de péptido acoplado a KLH. Los grupos de control son conjugados epítopo-KLH originales administrados respectivamente. En cuanto se usa el alum adyuvante (siempre 1 mg por ratón) . Los péptidos administrados son todos capaces de enlazar a los anticuerpos monoclonales específicamente aunque algunos de los péptidos no inhiben el enlace del epítopo original a su anticuerpo parental in vitro (en un ensayo de inhibición in vitro) . El ensayo ELISA in vitro para determinar el título de anticuerpo es realizado con sueros de ratones individuales después de cada vacunación en un intervalo de dos semanas (ver la Figura 6 y 7 respectivamente) . Los títulos son calculados como OD max/2 en todas las figuras mostradas. Los pozos de la placa ELISA son recubiertos con conjugado de mimotopo-BSA y un conjugado de péptido-BSA irrelevante (control negativo) . El control positivo es realizado por reacción del anticuerpo parental con el conjugado de mimotopo-BSA respectivo. La detección es realizada con IgG antiratón. Adicionalmente, las proteínas recombinantes son inmovilizadas en placas ELISA y sueros reaccionados por consiguiente. Las Figuras 4, 5 y 6 muestran ejemplos representativos para ensayos usados para caracterizar mimotopos in vivo. Los resultados representados son derivados de péptidos activos en ensayos de inhibición in vitro como p4670, p4675, p4680, y p4681 y un péptido sin capacidad de inhibición, p4403 respectivamente.

La Figura 4 muestra los ejemplos para caracterizaciones in vivo de la respuesta inmunológica producida por vacunación de mimotopo por analizar la respuesta inmunológica contra el péptido inyectado y un péptido irrelevante, el cual contiene una secuencia no relacionada. En los ejemplos mostrados, el epítopo p4377 y los mimotopos p4670, p4675, p4680, p4681 y p4403 producen respuestas inmunológicas contra los péptidos inyectados pero fallan para inducir una respuesta inmunológica no específica relevante contra una secuencia no relacionada (pl454) .

La Figura 5 muestra ejemplos para caracterizaciones in vivo de la respuesta inmunológica producida por vacunación de mimotopo contra el epítopo original respectivo del anticuerpo parental (p4377) así como también contra los péptidos derivados de especies truncadas de ?ß (pl323 y p4374) y contra sAPP alfa.

El p4377 y los mimotopos p4670, p4675, p4680, p4681 p4403 montan respuestas inmunológicas detectables contra el epítopo original p4377. Un fenómeno similar puede ser detectado analizando reactividad cruzada contra la forma modificada como se exhibe por p4374. En forma interesante, el epítopo original y las vacunas de mimotopo montan títulos relevantes contra p4374 la forma modificada del epítopo montado. Sorpresivamente, los mimotopos parecen ser capaces de inducir pero no inducen necesariamente una respuesta más eficiente contra pl323 que indica un potencial para inducir una reactividad inmunológica más amplia como se compara con el fragmento ?ß original. Adicionalmente, ninguna reactividad es detectable contra sAPP alfa.

La Figura 6 muestra ejemplos para caracterizaciones in vivo de la respuesta inmunológica producida por vacunación de mimotopos contra ?ß de longitud completa. Sorpresivamente, los mimotopos seleccionados por usar MV-002 induce una reacción cruzada no solamente con los epítopos cortos truncados o modificados usados para crear los anticuerpos pero también reactividad cruzada inducida para formas de ?ß de longitud completa, no modificadas tan bueno como la secuencia original o incluso más eficientemente que p4377.

En forma interesante péptidos de competición así como de no competición son capaces de inducir las respuestas intnunológicas similares que interactúan específicamente con péptidos que contienen secuencias ?ß originales. De esta forma los mimotopos presentados en esta invención constituyen candidatos de vacuna optimizados, novedosos para objetivar un espectro amplio de formas que ocurren en forma natural de los péptidos ?ß como han sido encontrados en el cerebro de pacientes AD. Las formas incluyen pero no se limitan a ?ß?-40/42, y formas truncadas N-terminalmente como ?ß3-40/42, ?ß (pE) 3-40/42, ?ß?1-40/42 no modificado, ?ß? () 11-40/42 y ?ß14-40/42 respectivamente. En forma importante, los mimotopos presentados también no inducen una reactividad cruzada a los neoepítopos presentes en sAPP alfa después de la escisión a partir de APP y de esta forma no interferir con señalización de sAPP alfa normal (ver la Figura 5 para detalles) .

Tabla 3 : Péptidos no mimotopos usados No . de SEQ ID Secuencia péptido No. interno pl253 48 DAEFRHDSGYC pl323 49 CHQKLVFFAED p4374 50 P (E) VHHQKLVFC P4.377 51 EVHHQLVFC pl454 52 CGLMVGGW No . de SEQ ID Secuencia péptido No. interno ?ß1-40 53 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV; derivado de APP humana (gi: 112927) ?ß1-42 54 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIÍGLMVGGWI A; derivado de APP humana (gi: 112927) alfasAPP 55 Alfa secretada induce producto de escisión derivado de APP humana (gi: 112927) En la tabla 4 ejemplos adicionales de la respuesta inmunológica producida por la vacunación de mimotopos contra ?ß de longitud completa por usar mimotopos derivados de Mv-002 son descritos. Todos los péptidos enlistados en la Tabla 4 montan reacciones inmunológicas específicas contra formas de ?ß de longitud completa y/o truncada y modificadas o fragmentos del mismo.

Tabla 4. Caracterización in vivo de mimo opos: MV-002 Numero de péptido SEQ ID No. Detección de formas interno ?ß/1runcadas/modificadas p4403 1 + p4404 2 + p4413 3 + p4414 4 + Numero de péptido SEQ ID No. Detección de formas interno ?ß/truncadas/modificadas p4415 5 + p4670 10 + p4673 13 + p4675 15 + p4680 20 + p4681 21 + p4693 33 + p4696 36 + p4698 38 + p4699 39 + 2.5 Caracterización in vivo de mimotopos para la eficacia para reducir enfermedad como AD en animales transgénicos (prueba de análisis de concepto) Se usa el modelo de ratón Tg2576 AD para estudiar la eficacia preclínica de las vacunas de mimotopos . Esta línea transgénica está expresando APP humana que porta la doble mutación sueca en la posición aa 670/671 bajo el control de un promotor de proteína de priones de hámster (PrP) el cual resulta en sobre expresión de la proteína. Es actualmente uno de los modelos empleados más ampliamente en la investigación de AD. El modelo Tg2576 recapitula varios sellos de patología de AD que incluyen deposición de placa amiloide específica a enfermedad y astrocitosis . Como todos los otros sistemas de modelo AD disponibles a la fecha, no reflejan todas las características neuropatológicas cardinales de AD.

Para evaluar si el tratamiento con mimotopos es capaz de evitar la acumulación de ?ß cerebral, los ratones Tg2576 son inyectados s.c. 6 veces en intervalos mensuales con conjugados de péptido-KLH adsorbidos a ALUM (adyuvante: hidróxido de aluminio) o PBS adsorbido a ALUM (referido como PBS o control) solo. Hasta ocho semanas después de la última inmunización, los animales son sacrificados, sus cerebros son cosechados y analizados para carga de ?ß (patología como AD) . Los ratones son sacrificados bajo anestesia profunda. Subsecuentemente, el cerebro es aislado, fijado en 4% de PFA y deshidratado por series de etanol graduado seguido por incubación en xileno y embebido en parafina. Cada cerebro embebido en parafina es seccionado en 7 µ? usando un microtomo de corte y las secciones son montadas en portaobjetos de vidrio.

Como un método para ensayar la patología similar a AD en animales Tg2576, se analiza en la presente el área relativa ocupada por depósitos amiloides en el cerebro de animales tratados. Este análisis es realizado usando un programa de reconocimiento de área automatizada. Para identificar las placas, se tiñen las secciones con el anticuerpo monoclonal (mAb) 3A5 (específico para ?ß40/42) . Los animales tratados con mimotopos son comparados a animales de control. Todos los animales han sido sacrificados en una edad de 13, 5-14 meses. Para este análisis 3 cortes/animal que cubren la corteza y el hipocampo son seleccionados, teñidos con mAb 3A5 y documentados subsecuentemente usando el sistema Mirax (Zeiss) . Para el cálculo del área ocupada por las placas amiloides, se analiza hasta cuatro secciones individuales por portaobjetos y secciones que portan artefactos de tejido e intensidades de tinción aberrante han sido excluidas después de la inspección de las fotos resultantes.

Para los mimotopos de Mv002 se realizan en la presente análisis de área usando un candidato de ejemplo. El análisis es realizado después de la vacunación repetida usando vacunas de conjugado de péptido-KLH. El grupo de control muestra una ocupación promedio de 0.35% como se compara a 0.24% para los animales tratados con mimotopo respectivamente. Esto corresponde a una reducción después del tratamiento de mimotopos de 31% en el grupo 2.

De esta forma, este grupo de datos indica claramente un efecto benéfico del tratamiento de vacuna de mimotopos sobre patología como AD en animales transgénicos .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la, invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. El uso de por lo menos un compuesto el cual comprende la secuencia de aminoácidos: (X1)mH 2X3X4X5FX6(X7)n (fórmula II) en donde ?? es serina (S) , treonina (T) o cisteína (C) , X2 es glutamina (Q) , treonina (T) o metionina (M) , X3 es lisina (K) o arginina ®, X4 es leucina (L) , metionina (M) , X5 es triptófano ( ) , tirosina (Y) , fenilalanina (F) o isoleucina (I) , X6 es asparagina (N) , ácido glutámico (E) , alanina (A) o cisteína (C) , X7 es cisteína (C) , n y m son, independientemente, 0 ó 1. el compuesto tiene una capacidad de enlace a un anticuerpo el cual es específico para un epítopo del amiloide-beta-péptido (?ß) el cual comprende la secuencia de aminoácidos HQKLVF y/o HQKLVFFAED. para producir un medicamento para evitar y/o tratar beta-amiloidosis incluyendo la enfermedad de Alzheimer

2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el compuesto comprende un péptido el cual tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo el cual consiste de SHTRLYF (C) , HMRLFFN (C) , SHQRLWF (C) , HQKMIFA (C) , HMRMYFE (C) , THQRLWF (C) Y HQKMIF (C) .

3. El uso de por lo menos un compuesto el cual comprende la secuencia de aminoácidos (X1)mGX2X3X4FX5Xs(X7)n (Fórmula I), en donde Xi es serina (S) , alanina (A) o cisteína (C) , X2 es serina (S) , treonina (T) , ácido glutámico (E) , ácido aspártico (D) , glutamina (Q) o metionina (M) , X3 es isoleucina (I) , tirosina (Y) , metionina (M) o leucina (L) , X4 es leucina (L) , arginina (R) , glutamina (Q) , triptófano (W) , valina (V) , histidina (H) , tirosina (Y) , isoleucina (I) , lisina (K) , metionina (M) , o fenilalanina (F) , X5 es alanina (A) , fenilalanina (F) , histidina (H) , asparagina (N) , arginina (R) , ácido glutámico (E) , isoleucina (I) , glutamina (Q) , ácido aspártico (D) , prolina (P) , o triptófano ( ) , glicina (G) , X6 es cualquier residuo de aminoácido, X7 es cisteína (C) , n y m son, independientemente, 0 ó 1, el compuesto el cual tiene una capacidad de enlace a un anticuerpo el cual es específico para un epítopo del amiloide-beta-péptido (?ß) el cual comprende la secuencia de aminoácidos HQKLVF y/o HQKLVFFAED. para producir un medicamento para evitar y/o tratar la ß-amiloidosis incluyendo la enfermedad de Alzheimer.

4. El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde el compuesto comprende un péptido el cual tiene una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo el cual consiste de SGEYVFH (C) , SGQLKFP (C) , SGQIWFR (C) , SGEIHFN (C) , GQIWFIS (C) , GQIIFQS (C) , GQIRFDH (C) , GEMWFAL (C) , GELQFPP (C) , GELWFP (C) , GEMQFFI (C) , GELYFRA (C) , GEIRFAL (C) , GMIVFPH (C) , GEIWFEG (C) , GDLKFPV (C) , GELFFPK (C) , GQI FPR (C) , GSLFFWP (C) , GEILFGM (C) , GQLKFPF (C) , GTIFFRD (C) , GQIKFAQ (C) , GTLIFHH (C) , GEIRFGS (C) , GQIQFPL (C) , GEIKFDH (C) , GEIQFGA (C) , GELFFEK (C) , GEIRFEL (C) , GEIYFER (C) , SGEIYFER (C) , AGEIYFER (C) y (C) GEIYFER.

5. El uso de por lo menos un compuesto el cual comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo el cual consiste de AIPLFV (c) , KLPLFVM (c) , QLPLFVL (C) y NDAKIVF (C) para producir un medicamento para evitar y/o tratar la ß-amiloidosis incluyendo la enfermedad de Alzheimer .

6. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el compuesto es un polipéptido el cual comprende 4 a 20 residuos de aminoácidos.

7. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el compuesto es acoplado a un portador aceptable farmacéuticamente, preferentemente KLH (hemocianina modificada de lapa) .

8. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el compuesto es formulado para administración intravenosa, subcutánea, intradérmica, o intramuscular.

9. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el compuesto es formulado con un adyuvante, preferentemente hidróxido de aluminio.

10. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el compuesto está contenido en el medicamento en una cantidad de 0.1 ng a 10 mg, preferentemente 10 ng a 1 mg, en particular 100 ng a 10 µg.

11. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para tratar y/o mejorar los síntomas de sinucleopatía .

12. El uso de conformidad con la reivindicación 11, en donde la sinucleopatía es seleccionada del grupo de enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy, atrofia sistemática múltiple y neurodegeneración con acumulación de hierro cerebral.

13. El péptido caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo el cual consiste de SHTRLYF (C) , SGEYVFH (C) , SGQLKF(C), SGQIWFR(C) , SGEIHF (C) , GQI FIS (C) , NDAKIVF (C) , GQIIFQS (C) , GQIRFDH (C) , HMRLFFN(C) , GEN FAL (C) , GELQFPP (C) , GELWFP(C) , SHQRLWF (C) , HQKMIFA (C) , GEMQFFI (C) , GELYFRA (C) , GEIRFAL (C) , GMIVFPH (C) , GEIWFEG (C) , GEIYFER (C) , AIPLFVM(C) , GDLKFPL (C) , GQILFPV(C) , GELFFPK (C) , GQIMFPR (C) , HMRMYFE (C) , GSLFFWP (C) , GEILFGM (C) , GQLKFPF (C) , KLPLFVM (C) , GTIFFRD (C) , THQRLWF (C) , GQIKFAQ (C) , GTLIFHH (C) , GEIRFGS (C) , GQIQFPL (C) , GEIKFDH (C) , GEIQFGA (C) , QLPLFVL (C) , HQK IF(C), GELFFEK (C) , GEIRFEL (C) , AcGEIYFER (C) , SGEIYFER (C) , AGEIYFR y GEYFER(C) .

14 El péptido de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque es acoplado a un portador aceptable farmacéuticamente preferentemente KLH (hemocianina modificada de lapa) .

15. Una formulación farmacéutica, preferentemente una vacuna, caracterizada porque comprende por lo menos un péptido de conformidad con la reivindicación 11 ó 12.