CN115925987A - 基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽及其应用 - Google Patents

基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于β‑淀粉样蛋白修饰的抗原多肽及其应用；该抗原多肽包括：A、B、C三个组分；其中，所述A组分的成分a为β‑淀粉样蛋白单体氨基酸片段或若干氨基酸片段组合；B组分的成分b为能够与β‑淀粉样蛋白单体或寡聚体结合的小分子化合物；C组分的成分c为偶联载体蛋白。本发明所涉及的修饰抗原肽一方面靶向性针对β‑淀粉样蛋白的片层区，阻断异常折叠的β‑淀粉样蛋白形成毒性寡聚体，另一方面由此抗原免疫生成的抗体能够特异性的识别小分子化合物结合的β‑淀粉样蛋白寡聚体和多聚体——靶向免疫复合物，从而对其进行有效清除，最终从防止β‑淀粉样蛋白单体聚集和清除β‑淀粉样蛋白聚集体多个维度，预防和减缓AD的β‑淀粉样蛋白病理异常，对AD产生预防和治疗的作用。

Description

基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽及其应用
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽及其应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，又称老年痴呆，是一种起病隐匿病程漫长的神经退行性疾病，主要临床特征为由突触及神经元缺失引起的认知和记忆功能减退。有数据统计表明，60至80岁老人老年痴呆的发病率约为4％，而80岁以上老人发病率则高至20％～40％。据世界卫生组织的最新报道，全世界已超过5000万痴呆症患者，并预计到2050年这个数字将超过1.5亿。AD造成的治疗护理等费用到2030年预计增至2万亿美元，给患者的家庭和社会造成了极大的经济负担和压力。目前，已上市治疗AD的几种药物只能在一定程度上缓解症状而不能达到根治的效果，针对中国正逐渐步入老龄化社会的现状，中国阿尔茨海默病的研究和治疗水平亟需得到提高。
AD发病机制的主流假说是淀粉样蛋白级联假说，该假说认为AD患者脑内淀粉样前体蛋白(APP)水解而产生过量β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)是产生神经毒性的主要原因；Aβ还可以引起Tau蛋白过度磷酸化产生神经纤维缠结，最终导致了突触的损伤和神经元的丢失。因此，以Aβ作为治疗靶标的方法成为当前抗AD药物和疫苗研发中的热点。
AD的免疫疗法，主要分为针对Aβ和tau的免疫疗法。由于Aβ各种变体和聚集体(Aβ40，Aβ42，Aβ35，Aβ寡聚体，Aβ前纤维低聚体，Aβ纤维，Aβ斑块沉积) 是机体自身的物质，所以将单纯内源性Aβ多肽或蛋白作为抗原，会引起机体自身免疫反应，容易引发CD4 T细胞的亚群Th1细胞反应，从而导致炎症等不良反应。此外，将Aβ作为抗原免疫机体，还会引起脑微出血的不良反应，这可能是由于产生的免疫反应过度清除Aβ所致。
从1999年首次将人纤维化的Aβ42多肽用于免疫AD转基因小鼠并取得了一定的效果后，众多的I期临床研究亦取得初步性良好反应，但随后的临床II期实验出现了自身毒性T细胞免疫反应导致的脑膜炎，并且后续以选择靶向Aβ42肽的B淋巴细胞表位Aβ1-15的主动免疫疫苗进入临床研究阶段仍旧可以出现副作用，并最终导致实验终止。
目前，在研的其它AD疫苗也都未能达到改善认知能力的治疗效果，可能原因是这些疫苗免疫后产生的抗体不能有效阻断Aβ的异常折叠形成对突触功能和神经元有较大毒性的寡聚体，从而无法使认知能力得到改善。因此，无论主动免疫治疗还是被动免疫治疗或预防AD都应该要求诱导产生的高水平抗体能够特异性阻断Aβ异常折叠形成毒性Aβ寡聚体，降低脑内的Aβ寡聚体水平，保护神经突触功能和认识能力，从而能产生有效的免疫预防作用。
发明内容
为了克服背景技术中的不足，本发明提供了基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽以及抗原多肽在预防和治疗阿尔茨海默病中的应用；该抗原多肽不仅能够诱导机体产生抗体，防止Aβ单体聚集，而且可以与小分子化合物配合清除Aβ聚集体，从而预防和减缓阿尔茨海默病的Aβ病理异常，实现阿尔茨海默病的预防和治疗。
具体技术方案如下：
本发明提供了基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽，该抗原多肽包括：A、B、C三个通过连接键或连接基团进行任意顺序连接的组分；
其中，A组分由m个成分a组合而成，B组分由n个成分b组合而成，C组分由 k个成分c组合而成；所述成分a为β-淀粉样蛋白单体氨基酸片段或若干氨基酸片段组合；成分b为能够与β-淀粉样蛋白单体或寡聚体结合的小分子化合物；成分c为偶联载体蛋白；m≥1，n≥1，k≥0。
进一步地，当k≠0时，A、B、C的连接形式为：A-B-C，C-B-A，A-C-B，C-A-B， B-A-C，B-C-A中的一种；当k＝0时，A、B的连接形式为A-B，B-A，A-B-A或B-A-B。
更进一步地，所述A、B、C的连接形式为：C-A-B，且m＝1，n＝1，k＝1；其中， A组分的C端羧基与B组分的羟基通过酯键连接；A组分的N端连接有巯基，C组分表面的氨基连接有马来酰亚胺基团，A组分通过N端巯基与C组分的马来酰胺基团连接。
进一步地，所述成分a中的β-淀粉样蛋白单体氨基酸片段为连续片段且位于β-淀粉样蛋白单体第14～29位之间，片段中的氨基酸数量为3～7；所述氨基酸片段组合为 N个相同或不同β-淀粉样蛋白单体氨基酸片段的任意顺序连接，N≥2。
上文所述的β-淀粉样蛋白单体的氨基酸全序列为：DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA；其中，第14～29位的氨基酸序列为HQKLVFFAED VGSNKG。
更进一步地，所述β-淀粉样蛋白单体氨基酸片段为HQK、KLV、FFA、AED、NKG、NKGKLV、HQKAED、CFFA、CAED、CNKG、CKLVFFA、CLVFFAE中的一种。
进一步地，所述小分子化合物为姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素、高牛磺酸、3-磺基丙酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、巴西木素、棉纤维素、橄榄苦苷苷元、槲皮素、白藜芦醇、迷迭香酸、6-姜烯酚、丹参酮、维生素A、维生素B12、维生素D2、维生素D3、维生素K3中的一种。
更进一步地，所述小分子化合物为姜黄素，姜黄素衍生物，高牛磺酸，高牛磺酸衍生物中的一种。
进一步地，所述姜黄素衍生物为去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素中的一种；所述高牛磺酸衍生物为3-磺基丙酸。
进一步地，所述偶联载体蛋白为血蓝蛋白、牛血清白蛋白和卵白蛋白中的一种。
更进一步地，所述抗原多肽的化学结构式如下式(1)～式(14)所示：
Figure BDA0003829608200000031
Figure BDA0003829608200000041
Figure BDA0003829608200000051
其中，KLH表示血蓝蛋白。
本发明还提供了上述抗原多肽(以C-A-B的连接形式为例，且m＝1，n＝1，k＝1) 的合成方法，包括以下步骤：
(1)A组分的C端羧基与B组分的羟基通过酯化反应进行连接，同时通过半胱氨酸或巯基丙酸分子在A组分的N端引入巯基，得到化合物I；
(2)采用琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(SMCC)对C组分表面的氨基进行修饰，引入马来酰亚胺基团，得到化合物II；
(3)化合物I的N端巯基与化合物II的马来酰亚胺基团通过迈克尔加成反应进行连接，最终得到抗原多肽。
本发明还提供了所述基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽在制备用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。
本发明还提供了所述基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽在制备阿尔茨海默病疫苗中的应用。
进一步地，所述疫苗还包括佐剂；所述佐剂为弗氏佐剂。
本发明还提供了所述基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽在制备用于清除Aβ寡聚体或多聚体的产品中的应用。
本发明还提供了所述基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽在制备用于提高阿尔茨海默病患者学习记忆能力的产品中的应用。
本发明还提供了所述基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽在制备用于减少阿尔茨海默病患者脑内Aβ寡聚体和/或可溶性Aβ含量的产品中的应用。
本发明还提供了所述的基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽在制备用于检测Aβ寡聚体或多聚体的产品中的应用。
本发明还提供了所述的基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽在制备用于阿尔茨海默病早期风险评估筛查、疾病诊断或辅助诊断的产品中的应用。
本发明还提供了一种阿尔茨海默病疫苗，包括基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽和佐剂，所述抗原多肽如上所述。
进一步地，所述佐剂为弗氏佐剂。
本发明还提供了一种阿尔茨海默病靶向免疫复合物，包括疫苗，所述疫苗包括基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽和佐剂，所述抗原多肽如上所述。
所述阿尔茨海默病靶向免疫复合物还包括小分子化合物，所述小分子化合物为姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素、高牛磺酸、3-磺基丙酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、巴西木素、棉纤维素、橄榄苦苷苷元、槲皮素、白藜芦醇、迷迭香酸、 6-姜烯酚、丹参酮、维生素A、维生素B12、维生素D2、维生素D3、维生素K3中的一种。
上述小分子化合物作为注射或口服药物的形式进行给药，与疫苗进行配合使用。
为了清除β淀粉样蛋白，又避免引起自身免疫性反应，本发明设计了一种疫苗，该疫苗将β淀粉样蛋白寡聚体和姜黄素(Curcumin)、高牛磺酸(homotaurine)等与β淀粉样蛋白寡聚体有较高亲和力的小分子化合物形成的复合物修饰肽作为抗原用于机体免疫，使得免疫系统清除复合物的同时清除了毒性β淀粉样蛋白寡聚体，同时不会引起自身免疫反应。
在AD高风险人群注射该疫苗后，机体获得针对β淀粉样蛋白寡聚体和姜黄素等小分子化合物形成的复合物的记忆细胞；通过AD疾病进程或个体化医疗研究，给AD 易致病人群服用一定剂量和一定疗程的姜黄素等与β淀粉样蛋白寡聚体有较高亲和力的小分子化合物。由于这些化合物是外源性服用的，所以由这种主动免疫疗法可以通过不服用化合物终止，也可以通过服用少量化合物降低免疫反应强度，从而避免由主动免疫疗法引发的脑微出血。
传统疫苗主要针对病毒或细菌等外源生物体的蛋白，识别的抗原决定簇主要是单一外源性蛋白或重组多肽，传染病学中较前沿的是将糖链作为半抗原，和载体蛋白结合成完整抗原，并免疫细胞。而本发明抗原多肽是一个3-7个氨基酸与小分子化合物连接成的半抗原，这种小分子修饰抗原方法也为今后免疫学基础研究和包括神经退行性疾病在内的多种疾病的免疫预防和临床治疗提供了全新的策略。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过小分子化合物与β淀粉样蛋白序列片段结合对其进行修饰，作为新的抗原肽，并在此基础上偶联载体蛋白增加其抗原性，与传统的单纯基于β淀粉样蛋白序列的抗原设计不同，本发明所涉及的修饰抗原肽一方面靶向性针对β淀粉样蛋白，阻断异常折叠的β淀粉样蛋白形成毒性寡聚体，另一方面由此抗原免疫生成的抗体能够特异性的识别小分子化合物结合的β淀粉样蛋白寡聚体和多聚体——靶向免疫复合物，从而对其进行有效清除，最终从防止β淀粉样蛋白单体聚集和清除β淀粉样蛋白聚集体多个维度，预防和减缓AD的β淀粉样蛋白病理异常，对AD产生预防和治疗的作用。
附图说明
图1为实施例3中A3(图A),A7(图B),A9(图C),7P(图D),8P(图E)在15 days免疫且免疫5次后血清抗体滴度与β淀粉样蛋白(Aβ)和Curcumin的特异性检测结果；
其中，A3/A7/A9/7P/8P(after)分别表示15days免疫且5次后血清抗体检测抗原A3/A7/A9/7P/8P；A3/A7/A9/7P/8P(before)表示每次实验的阴性组，也就是未免疫组。 Aβ(after)表示用15days免疫且免疫5次后血清抗体检测Aβ42。Curcumin表示用1 5days免疫且免疫5次后血清抗体检测curcumin；ELISA实验包被的A3/A7/A9/7P/8P/ Aβ42/Curcumin的浓度为6.5μM(100μL)；A3/A7血清抗体的稀释倍数为10,50,250,1 250,6250,31250；A9/7P/8P的稀释倍数为100,1000,10000,100000；HRP标记的抗鼠二抗稀释倍数为1:5000；酶标仪检测的波长为450nm。
图2为实施例3中A3(图A),A7(图B),A9(图C),7P(图D),8P(图E)在55days 免疫且免疫3次后的第7days检测血清抗体含量的结果；
其中，A3/A7/A9/7P/8P(after)分别表示55days免疫且3次后血清抗体检测抗原A3/A7/A9/7P/8P；A3/A7/A9/7P/8P(before)表示每次实验的阴性组，也就是未免疫组； Aβ(after)表示用55days免疫且免疫3次后血清抗体检测Aβ42；Curcumin表示用55days 免疫且免疫3次后血清抗体检测curcumin。ELISA实验包被的 A3/A7/A9/7P/8P/Aβ42/Curcumin的浓度为6.5μM(100μL)；A3/A7/A9/7P/8P的稀释倍数为100,1000,10000,100000；HRP标记的抗鼠二抗稀释倍数为1:5000；酶标仪检测的波长为450nm。
图3为实施例3中A3,A7,A9混合免疫(即：免疫后混合血清抗体)(图A(15days 免疫)和图B(55days免疫))以及7P、8P混合免疫(图C(15days免疫)和图D(55days 免疫))检测Aβ-Curcumin孵育物与抗体的识别情况；
其中，Incubation Aβ:Cur 1:1表示免疫后阳性血清检测Aβ与Curcumin摩尔浓度比为1：1的Aβ与Curcumin复合物；Negative serum表示用同比例稀释同窝未免疫阴性血清检测Aβ与Curcumin摩尔浓度比为1：1的Aβ与Curcumin复合物；ELISA实验包被的IncubationAβ:Cur 1:1的浓度为6.5μM(100μL)；A3/A7/A9 15days、A3/A7/A9 55days、7P/8P 55days阴阳性血清抗体的稀释倍数为100,1000,10000,100000；7P/8P 15days阴阳性血清抗体的稀释倍数为10，100,1000,10000；HRP标记的抗鼠二抗稀释倍数为1:5000；酶标仪检测的波长为450nm。
图4为实施例4中7P血清IgG(1:50,图A)，7P血清IgG(1:100,图B)，4G8(1： 1000,图B)对体内Aβ和姜黄素结合物染色分析镜下观察结果图。
其中，A表示采用免疫组化实验，以1:50倍稀释的7P血清IgG为一抗，分别检测腹腔注射7天300mg/ml姜黄素(DMSO溶，with Curcumin)和腹腔注射7天同体积DMSO(withoutCurcumin)的4个月龄5xFAD雌鼠大脑切片。B表示分别用4G8 (1:1000),7P血清IgG(1:100)检测腹腔注射7天300mg/ml姜黄素的4个月龄5xFAD 雌鼠大脑切片结果。每个免疫组化结果分别在显微镜下10×，20×，40×下观察并记录。
图5为实施例5中采用免疫组织化学试验检测7P免疫5×FAD小鼠并灌胃姜黄素后脑中Aβ寡聚体的变化结果；
其中，A表示，采用免疫组化实验，以A11(特异性抗Aβ寡聚体形式抗体,1:1000) 和4G8(抗Aβ17-24片段抗体，1:1000)为一抗，检测免疫(50ug/20ul)并灌胃姜黄素 300mg/kg5XFAD小鼠(5XFAD mice/Alz813 immunization/Curcumin)、灌胃姜黄素 300mg/kg 5XFAD小鼠(5XFAD mice/Curcumin)、未处理5XFAD小鼠(5XAFD mice control)海马体中Aβ沉积的镜下观察结果；B表示，采用免疫组化实验，以A11(特异性抗Aβ寡聚体形式抗体,1:1000)和4G8(抗Aβ17-24片段抗体,1:1000)为一抗，检测免疫(50ug/20ul)并灌胃姜黄素300mg/kg5XFAD小鼠(5XFAD mice/Alz813 immunization/Curcumin)、灌胃姜黄素300mg/kg 5XFAD小鼠(5XFAD mice/Curcumin)、未处理5XFAD小鼠(5XAFD mice control)皮质中Aβ沉积的镜下观察结果。C表示，采用免疫组化实验，以A11(特异性抗Aβ寡聚体形式抗体,1:1000)和4G8(抗Aβ 17-24片段抗体,1:1000)为一抗，检测免疫(50ug/20ul)并灌胃姜黄素300mg/kg5XFAD 小鼠(5XFAD mice/Alz813 immunization/Curcumin)、灌胃姜黄素5XFAD小鼠300mg/kg (5XFAD mice/Curcumin)、未处理5XFAD小鼠(5XAFD mice control)小脑中Aβ沉积的镜下观察结果；D为A、B、C实验A11检测海马体、皮质和小脑中Aβ含量统计结果；E为A、B、C实验4G8检测海马体、皮质和小脑中Aβ斑块含量统计结果。
图6为实施例6中采用水迷宫实验检测7P免疫5×FAD小鼠并灌胃姜黄素后小鼠认知功能的检测结果；
其中，A为1-4days平台隐藏期，未处理同窝对照C57小鼠(Littermates(WT))、Alz813(50ug/kg)免疫并灌胃50mg/kg姜黄素5XFAD小鼠(Alz813/Curcumin)、Alz813(50ug/kg)免疫5XFAD(Alz813)小鼠、灌胃50mg/kg姜黄素5XFAD小鼠(Curcumin)、未处理对照5XFAD小鼠(Control(5XFAD))水迷宫逃避潜伏期的统计结果；B为5days 去掉平台后，未处理同窝对照C57小鼠(Littermates(WT))、Alz813(50ug/kg)免疫并灌胃50mg/kg姜黄素5XFAD小鼠(Alz813/Curcumin)、Alz813(50ug/kg)免疫5XFAD (Alz813)小鼠、灌胃50mg/kg姜黄素5XFAD小鼠(Curcumin)、未处理对照5XFAD 小鼠(Control(5XFAD))穿越原安全平台的次数统计结果；C为第5days去掉安全平台后未处理同窝对照C57小鼠(Littermates(WT))、Alz813(50ug/kg)免疫并灌胃 50mg/kg姜黄素5XFAD小鼠(Alz813/Curcumin)、Alz813(50ug/kg)免疫5XFAD (Alz813)小鼠、灌胃50mg/kg姜黄素5XFAD小鼠(Curcumin)、未处理对照5XFAD 小鼠(Control(5XFAD))游泳轨迹图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
下列实施例案例中涉及材料的来源如下：4-6w龄雌性Babl/c小鼠,4w龄5×FAD 转基因小鼠购自江苏省常州卡文斯实验动物有限公司；购买后的小鼠饲养于贵州医科大学动物实验中心SPF级代养室内，温度维持在(25±1)℃，每天给予12h的光照和 SPF级饲料和水。弗氏完全佐剂(F5881)和弗氏不完全佐剂(F5506)购自Sigma，A β42(ab120301)购自Abcam，姜黄素(SC0299)、TMB显色液(P0209)和TMB 终止液(P0215)购自Beyotime，血蓝蛋白(KLH)、Tween20(T8220)、柠檬酸修复液(C1032)、封闭专用羊血清(SL038)、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(P1200-1)购自Solarbio，羊抗鼠二抗(M21001)购自Abmart，Dapi染色液(0100-20)购自 SouthernBiotech，4G8(SIG-39220)抗体购自Biolegend，A11(AHB0052)购自ThermoFisher，DAB(ZLI-9018)购自OriGene，MelonTMGel IgG Spin Purification Kit(45206)购自ThermoFisher，WB显色液(WBKLS0100)购自Millipore。
实施例1以姜黄素(Cur)作为小分子化合物的抗原多肽
以姜黄素(Cur)作为成分b所述的小分子化合物，血蓝蛋白(KLH)作为成分c 所述的偶联载体蛋白，与成分a所述的β-淀粉样蛋白单体氨基酸片段(简称多肽序列) 进行自由组合连接，合成抗原多肽(m＝1，n＝1，k＝1)。
具体组合形式如表1所示(KLH为血蓝蛋白)。
表1以姜黄素(Cur)作为小分子化合物的抗原多肽化学结构式
Figure BDA0003829608200000101
以KLH-CKLV-Cur为例，合成步骤为：
(I)多肽序列的C端羧基与姜黄素的羟基通过酯化反应进行连接，同时通过半胱氨酸分子在多肽序列的N端引入巯基，得到CKLV-Cur；
(II)采用琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(SMCC)对血蓝蛋白表面的氨基进行修饰，引入马来酰亚胺基团；
(III)CKLV-Cur中半胱氨酸的N端巯基与KLH(SMCC)的马来酰亚胺基团通过迈克尔加成反应进行连接，最终得到抗原肽KLH-CKLV-Cur。
具体合成方法为：
(1)将20mg SMCC溶于2mL DMF；
(2)将0.8mL KLH加入到25mL圆底烧瓶中，补加PBS缓冲液(pH 7.2)使蛋白终浓度为15mg/mL；
(3)将溶解好的SMCC溶液缓慢滴加到120mg KLH蛋白体系中，室温搅拌反应1h；
(4)用PBS溶液(PH 7.4)于4℃下透析6h，除去游离SMCC；
(5)将2.5mg合成得到的KLH(SMCC)溶液转移到5mL离心管中；
(6)将460mg合成的CKLV多肽溶于甲醇与368mg姜黄素加热反应4h，析出产物CKLV-Cur；
(7)3.0mg CKLV-Cur用0.6mL PBS溶液(pH 7.2)溶解；
(8)将CKLV-Cur溶液滴加到KLH(SMCC)中，室温下用垂直混匀器混匀反应 4小时。
实施例2以高牛磺酸作为小分子化合物的抗原多肽
以高牛磺酸(Hom)作为小分子化合物，血蓝蛋白(KLH)作为偶联载体蛋白，与β-淀粉样蛋白单体的部分氨基酸序列(简称多肽序列)进行自由组合连接，合成抗原多肽。
具体组合形式如表2所示。
表2以高牛磺酸作为小分子化合物的抗原多肽化学结构式
Figure BDA0003829608200000111
Figure BDA0003829608200000121
以KLH-CKLV-Hom为例，合成步骤为：
(I)多肽序列的C端羧基与高牛磺酸的羟基通过酯化反应进行连接，同时通过半胱氨酸分子在多肽序列的N端引入巯基，得到CKLV-Hom；
(II)采用琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(SMCC)对血蓝蛋白表面的氨基进行修饰，引入马来酰亚胺基团，得到KLH(SMCC)；
(III)CKLV-Hom的半胱氨酸N端巯基与KLH(SMCC)的马来酰亚胺基团通过迈克尔加成反应进行连接，最终得到抗原肽KLH-CKLV-Hom。
具体合成方法为：
(1)将20mg SMCC溶于2mL DMF；
(2)将0.8mL KLH加入到25mL圆底烧瓶中，补加PBS缓冲液(pH 7.2)使蛋白终浓度为15mg/mL；
(3)将溶解好的SMCC溶液缓慢滴加到120mg KLH蛋白体系中，室温搅拌反应1h；
(4)用PBS溶液(PH 7.4)于4℃下透析6h，除去游离SMCC；
(5)将2.5mg合成得到的KLH(SMCC)溶液转移到5mL离心管中；
(6)将460mg合成的CKLV多肽溶于甲醇与139mg高牛磺酸加热反应4h，析出产物CKLV-Hom；
(7)3.0mg CKLV-Hom用0.6mL PBS溶液(pH 7.2)溶解；
(8)将CKLV-Hom溶液滴加到KLH(SMCC)中，室温下用垂直混匀器混匀反应4小时。
实施例3
一、实验目的
选取实施例1中的KLH-CFFA-Cur(记为A3)，KLH-CAED-Cur(记为A7)，KLH-CNKG-Cur(记为A9)，KLH-CKLVFFA-Cur(记为7P)，KLH-CLVFFAE-Cur(记为8P)，制成疫苗，获得免疫血清抗体并进行检测。
二、实验方法
1、制作疫苗
具体方法为：将一定浓度的抗原多肽和弗氏佐剂(分为完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA))按照体积比为1:1，用超声破碎仪将弗氏佐剂和抗原多肽溶液充分混匀制成油包水型乳化剂。超声破碎仪的使用条件是：频率为20kHz，电功率为 750watt，超声频率为超声3s，停顿3s，超声次数根据样品的特性和体积超声3次-10 次。这个过程需要防止超声放热可能对多肽的影响。疫苗即用即制备，全程冰上操作。
2、疫苗免疫小鼠(4-6months的雌性Babl/c)实验
1)15days短时程免疫：
(1)用10μg A3(或A7/A9/7P/8P)合成短肽与福氏完全佐剂等量混匀制成油包水的乳化液(20μL)，经足垫多点注射免疫小鼠；
(2)以后每隔3天用同样剂量的A3(或A7/A9/7P/8P)合成短肽与福氏不完全佐剂等量混匀依此法再免疫4次；
(3)第15天取眼内眦静脉血(血清)测效价。
2)55days长时程免疫：
(1)用50μg A3(或A7/A9/7P/8P)合成短肽与福氏完全佐荆等量混匀制成油包水的乳化液(20μL)，经足垫多点注射免疫小鼠；
(2)以后每隔20天用同样剂量的A3(或A7/A9/7P/8P)合成短肽福氏不完全佐剂等量混匀皮下多点注射，共两次；
(3)第55天取眼内眦静脉血(血清)测效价。
眼内眦静脉提取的血液，在室温放置1-3h，或者4℃过夜，在4℃离心机中4000rpm离心15min后，血清分装后，在-80℃冻存。
3、间接ELISA实验
用PBS将抗原多肽或对照(Aβ42，Curcumin)稀释成6.5μM，每孔100μL加入 96孔板中，ELISA封板膜封板，放置在4℃过夜。用Bio-rad immunowash 1575的P3 程序洗板，在纸上拍干后，加入用PBST(0.05％的Tween 20)制备的1％封闭专用山羊血清140μl，放置在37℃温箱，1.5小时。将提取的免疫血清按照10,100,1000,10000, 100000梯度稀释，备用。封闭完成后，用Bio-rad immunowash 1575的P3程序洗板，在纸上拍干，将梯度血清作为血清一抗按照50μL/孔的方式加进孔里，放置37℃温箱， 1.5小时。一抗反应完成后，用Bio-radimmunowash 1575的P4程序洗板，在纸上拍干，每孔加入HRP标记的羊抗鼠二抗100μL，二抗的稀释比为1:5000，放置37℃温箱，1小时。二抗反应完成后，用Bio-rad immunowash 1575的P4程序洗板，在纸上拍干，每孔加入TMB显色液100μL，室温放置20min后，加入100μL的TMB反应终止液。加了反应终止液后，立即在酶标仪上检测OD值。整个过程使用的洗涤液为PBST(0.05％的Tween 20)。
三、实验结果
1、小鼠血清抗体滴度和特异性识别
图1为A3,A7,A9,7P,8P在15days免疫且免疫5次后滴度与Aβ和Curcumin的特异性检测结果；图2为A3,A7,A9,7P,8P在55days免疫且免疫3次后的第7days 检测血清抗体含量的结果。
如图1～2所示，A3,A7,A9,7P,8P合成短肽可以诱导机体产生相应的抗体，短时程免疫(15days)的抗体滴度为1:1000～1:100000，而长时程免疫(55days)的抗体滴度为1:10000-1:100000，说明5个合成多肽加上佐剂(弗氏佐剂)诱导的抗体滴度相对较高。5个多肽产生的抗体滴度无显著性差异。同时，5个多肽的血清抗体只识别合成抗原肽，而不识别单独Aβ或Curcumin。
2、A3,A7,A9和7P，8P混合免疫后检测Aβ-Curcumin孵育物与抗体的识别
为了进一步验证由化学合成方法得到的Aβ复合抗原是否能模拟自然状态下Aβ42异常单体及聚集体与Curcumin的结合，我们用Aβ与Curcumin过夜孵育物检测血清抗体。如图3所示，A3/A7/A9在15days短时程免疫的血清可较弱识别孵育物；7P/8P 在15days短时程免疫血清抗体识别孵育物的滴度为1000～10000。A3/A7/A9在55days 长时程免疫抗体血清检测孵育物滴度为1000:10000，7P/8P在55days长时程免疫抗体血清检测孵育物的滴度为10000-100000。从实验的重复性或稳定性和检测孵育物的血清抗体滴度来看，7P和8P抗原肽免疫效果优于A3/A7/A9。
实施例4
一、实验目的
抗原肽7P血清抗体检测姜黄素与Aβ异常单体及聚集体的体内复合物。
二、实验方法
1.用7P IgG检测4～6个月龄喂食300mg/kg姜黄素7天的5×FAD小鼠；
处理分为：300mg/kg姜黄素腹腔注射的5×FAD小鼠(Positive)组以及相同体积的DMSO腹腔注射的5×FAD小鼠(Control)组，24h注射一次，连续注射7天第7天注射后4h麻醉小鼠，用剪刀和镊子剪开小鼠胸腔，暴露心脏，将1ml注射器针头插进左心室，在心耳剪掉一个切口，随后用装满PBS的10ml针管进行心脏灌注，灌注完成后，打开小鼠颅骨，取出全脑，用解剖刀将全脑分为两个半脑，一个半脑置于-80℃，用于冰冻切片，一个半脑置于4％多聚甲醛，用于石蜡切片。
免疫4weeks Babl/c小鼠实验中，7P免疫Babl/c小鼠得到阳性7P血清，阳性7P 血清用MelonTMGel IgG Spin Purification Kit纯化为7P IgG(7P sera-derived IgG)；未免疫4weeks Babl/c小鼠作为阴性对照血清，阴性对照血清用MelonTMGel IgG SpinPurification Kit纯化为IgG(negative IgG)。用阳性7P血清(7P sera-derived IgG)，negative IgG作为一抗检测Positive mice(with Curcumin)，Control mice(withoutCurcumin)脑中Aβ异常单体及聚集体和姜黄素的复合物，随后用羊抗鼠二抗结合一抗进行检测。
2.血清IgG的纯化：
血清IgG的纯化采用MelonTMGel IgG Spin Purification Kit。血清样本用MeonGel Purification Buffer按照1：10比例稀释。试剂盒在室温下复温15min，将Purification Support颠倒混匀，加入500μL的Purification Support到离心柱，4000rpm离心1min，倒掉废液。加入300μL的Purification Buffer到离心柱里面，4000rpm，瞬离10s，倒掉废液，洗涤过程重复一次。将离心柱的底盖和顶盖盖上后，加入100～500μL的血清稀释液，倒混匀5min。用一个新的离心管4000rpm离心1min收集纯化IgG。
3.免疫组化实验；
取出各组小鼠脑石蜡切片，置于70℃，40min化蜡。二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中脱蜡，各15min。100％乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇各5min。蒸馏水浸洗1次， 5min/次。柠檬酸修复液高压修复5min，PBS浸洗3次，3min/次。加入80μL的3％H2O2，室温避光孵育10min，PBS浸洗3次，3min/次。加入80μl 5％的封闭专用山羊血清(PBS 稀释)，37℃孵育30min。加入50μl一抗(P7 IgG(1：50，1：100)，4G8(1：1000))， 4℃过夜。室温复温30min，PBS浸洗3次，3min/次。加入50μL的山羊抗兔二抗(1： 200稀释)，37℃孵育1h，PBS洗3次，3min/次。加入50μL DAB显色液，PBS洗3 次，3min/次。苏木素染色10s，立即放入双蒸水中，并在流水下返蓝5min。50％乙醇、 75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、100％乙醇，各5min。再将片子放到二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ各15min透明。滴一滴中性树脂，盖上盖玻片，镜下观察并记录。
一抗采用4G8(验证5×AFD作为AD小鼠模型Aβ大量存在)，1:1000稀释。 4G8(Biolegend Cat#800701)为IgG2b蛋白，是一种抗Aβ17-24抗体。4G8的二抗为山羊抗兔抗体，稀释比为1:200。DAB染色后，苏木精用于细胞核染色。最后，使用尼康Ci-E显微镜在4×、10×和40×下观察并记录图像。
三、实验结果：
如图4所示，4G8为Aβ17～24的抗体，4G8对Aβ的免疫组化染色为斑块状，在本试验中，4G8作为阳性对照，验证小鼠为正确的AD小鼠模型。结果显示，7P IgG (1：50)检测withCurcumin和without Curcumin处理5×FAD小鼠实验中，和without Curcumin处理的小鼠相比，with Curcumin小鼠的免疫组化结果为强阳性。而7P IgG (1：100)检测with Curcumin处理的5XFAD小鼠也呈阳性。
总之，7P IgG可以特异性结合姜黄素与小鼠脑内Aβ异常单体及聚集体的复合物——靶向免疫复合物。
实施例5
一、实验目的
建立一个合成短肽免疫后的5×FAD小鼠模型，再喂食姜黄素产生体内姜黄素与 Aβ的靶向免疫复合物，通过抗体的特异性结合达到清除Aβ寡聚体的目的。
二、实验方法
1、5×FAD小鼠疫苗预防和治疗
实验处理分为：对照组(Control)；姜黄素组(Curcumin)；姜黄素免疫组(Alz813immunization/Curcumin)，每组3-5只同窝5×FAD小鼠。
姜黄素组(Curcumin)：在开始实验后15days起，每隔一天喂食姜黄素300mg/kg，共灌胃75天。100days处死小鼠，整个实验共100天，最后采用免疫组织化学实验检测5×FAD中的Aβ寡聚体。
对照组(Control)：不做任何处理。100days处死小鼠，整个实验共100天，最后采用免疫组织化学实验检测5×FAD中的Aβ寡聚体。
姜黄素免疫组(Alz813 immunization/Curcumin)：每3周(间隔20天)用50μg(20uL)Alz813(即：7P，化学结构式详见实施例1)免疫4周龄5×FAD雌性小鼠 5次。第一次免疫后第十五天(15days)开始，每隔一天用姜黄素(300mg/kg)灌胃小鼠75天。最后一次免疫后15天(100days)处死小鼠，整个实验共100天，最后采用免疫组织化学实验检测5×FAD中的Aβ寡聚体。
2、获取小鼠组织
在无菌条件下，用解剖刀打开小鼠胸腔，暴露心脏，将1ml注射器针头插入左心室，在心耳剪掉一个切口，用装满PBS的10mL针管进行心脏灌注，灌注完成后，打开小鼠颅骨，取出全脑，用解剖刀将全脑分为两个半脑，一个半脑置于-80℃，一个半脑置于4％多聚甲醛，用于石蜡切片。
3、免疫组化实验
取出各组小鼠脑石蜡切片，置于70℃，40min化蜡。二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中脱蜡，各15min。100％乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇各5min下行。蒸馏水浸洗1次， 5min/次。柠檬酸修复液高压修复5min，PBS浸洗3次，3min/次。加入80μl的3％H2O2，室温避光孵育10min，PBS浸洗3次，3min/次。加入80μl 5％的封闭专用山羊血清(PBS 稀释)，37℃孵育30min。加入50μl一抗(4G8(1：1000)，A11(1：1000))，4℃过夜。室温复温30min，PBS浸洗3次，3min/次。加入50μl的羊抗鼠或山羊抗兔二抗(1： 200稀释)，37℃孵育1h，PBS洗3次，3min/次。加入50μl DAB显色液，PBS洗3 次，3min/次。苏木素染色10s，立即放入双蒸水中，并在流水下返蓝5min。50％乙醇、 75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、100％乙醇，各5min。将片子放到二甲苯I，二甲苯 II各15min。滴一滴中性树脂，盖上盖玻片，镜下观察并记录。
4、统计学分析
通过Image J处理图像，通过GraphPad Prism 9分析数据，并采用One-way AN OVA进行多组间比较。P<0.05被认为具有显著的统计学差异，*P<0.0332**P<0.0021* **P<0.0002****P<0.0001。同组中的小鼠使用平均值±SEM。
三、实验结果
如图5所示，采用免疫组织化学方法分别在各实验组5×FAD小鼠的海马体、皮质和小脑内检测Aβ寡聚体的含量。其中，A11(Invitrogen Cat#AHB0052)为IgG蛋白，是一种特异性Aβ寡聚体抗体(https://www.thermofisher.cn/cn/zh/antibody/product/ Oligomer-A11-Antibody-Polyclonal/AHB0052)；4G8(Biolegend Cat#800701)为IgG2 b蛋白，是一种抗Aβ17-24抗体。一抗为A11和4G8，均为1:1000稀释。
A11和4G8的二抗分别为山羊抗小鼠抗体和山羊抗兔抗体，稀释比为1:200。DAB 染色后，苏木精用于细胞核染色。结果表明，与姜黄素组和对照组相比，姜黄素免疫组的海马显著减少Aβ寡聚体，但额叶皮质和小脑无显著差异。
实施例6
一、实验目的
建立一个合成短肽免疫后的5×FAD小鼠模型，再喂食姜黄素后检测5xFAD小鼠的认知功能是否改善。
二、试验方法
1、5×FAD小鼠疫苗预防和治疗
实验分为5个组：Littermates(WT)；Alz813/Curcumin；Alz813；Curcumin；Control(5 ×FAD)。每组共3-12只小鼠。
5XFAD小鼠是在C57小鼠遗传背景下，转入3个人源APP突变基因 (Swedish(L670N,M671L)，Florida I716V，London V717I)和2个PS1突变基因 (M146L，L286V),最终导致大量的Aβ堆积在C57小鼠脑中，并命名为5xFAD小鼠，作为AD小鼠模型被广泛用于研究。研究表明，和C57小鼠相比，5XFAD小鼠在 5-6个月具有认知功能障碍。
Alz813/Curcumin：每3周(间隔20天)用50μg(20uL)Alz813免疫4周龄5 ×FAD雌性小鼠6次。第一次免疫后第十五天(15days)开始，每天用姜黄素(50mg/kg) 灌胃小鼠99天。最后一次免疫后7天(113days)开始水迷宫实验，水迷宫实验一共7 天，整个实验共120天。
Alz813：每3周(间隔20天)用50μg(20uL)Alz813免疫同窝4周龄5×FAD 雌性小鼠6次。最后一次免疫后7天(113days)开始水迷宫实验，水迷宫实验一共7 天，整个实验共120天。
Curcumin：在开始实验后15days起，每天给同窝4周龄5xFAD小鼠喂食姜黄素50mg/kg，共灌胃99天。灌胃结束后(113days)开始水迷宫实验，水迷宫实验一共7 天，整个实验共120天。
Control(5×FAD)：同窝4周龄5xFAD小鼠，期间不做任何处理，113days开始水迷宫实验，水迷宫实验一共7天，整个实验共120天。
Littermates(WT)：4周龄C57小鼠，期间不做任何处理，113days开始水迷宫实验，水迷宫实验一共7天，整个实验共120天。
2、水迷宫实验：将水池分为1、2、3、4四个象限，逃生安全平台置于1象限的中间位置，在水池周围放置不同的图标帮助小鼠定位。实验持续6天，0day为可视性平台期，水面设置为低于逃生平台顶端以下1cm，将小鼠放进水池熟悉环境；1～4days 为平台隐藏期，水面设置为高于逃生平台顶端以上1cm，选取4个点作为小鼠的投放点，每天每只小鼠分别在4个投放点进入水池，每次给予小鼠60时间寻找并记忆隐藏的逃生平台，小鼠到达平台后，给予小鼠15s记忆平台及周围环境位置，小鼠每次投放的间隔时间大于30min。5days，撤去安全平台，选择平台对侧象限作为投放点，记录小鼠穿越原安全平台的次数。整个实验采用Smart v3.0软件记录。
3、统计学分析：通过Smart v3.0处理并导出数据，通过GraphPad Prism 9分析数据，并采用One-way ANOVA进行多组间比较。P<0.05被认为具有显著的统计学差异， *P<0.0332**P<0.0021***P<0.0002****P<0.0001。同组中的小鼠使用平均值±SEM。
二、实验结果
结果如图6A所示，1day,每个组找到逃生安全平台的时间基本一致，随着训练时间的增加，Littermates(WT)和Alz813/Curcumin找到逃生平台的时间越来越短， Curcumin找到平台的时间也有缩短，但没有Littermates(WT)和Alz813/Curcumin组明显，最后是Alz813和Control(5×FAD空白组)，其中，Control组找到平台的时间最长，提示学习记忆能力损害。6days，和Alz813、Curcumin、Control(5×FAD)相比，Littermates (WT)和Alz813/Curcumin组找到穿越平台的次数更多，接近WT组小鼠。与Alz813组与Curcumin组相比，Alz813/Curcumin具有显著性差异，图C为每组小鼠穿越平台的轨迹图。上述结果说明，Alz813免疫并喂食姜黄素后，认知与记忆能力得到显著改善，并和正常小鼠趋近一致，喂食姜黄素对5×FAD的认知功能也有一定的改善作用，但作用不及复合免疫组。
Figure IDA0003829608260000011
Figure IDA0003829608260000021

Claims (22)

1.基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽，其特征在于，包括：A、B、C三个通过连接键或连接基团进行任意顺序连接的组分；
其中，A组分由m个成分a组合而成，B组分由n个成分b组合而成，C组分由k个成分c组合而成；所述成分a为β-淀粉样蛋白单体氨基酸片段或若干氨基酸片段组合；成分b为能够与β-淀粉样蛋白单体或寡聚体结合的小分子化合物；成分c为偶联载体蛋白；m≥1，n≥1，k≥0。
2.如权利要求1所述的基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽，其特征在于，当k≠0时，A、B、C的连接形式为：A-B-C，C-B-A，A-C-B，C-A-B，B-A-C，B-C-A中的一种；当k＝0时，A、B的连接形式为A-B，B-A，A-B-A或B-A-B。
3.如权利要求2所述的基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽，其特征在于，所述A、B、C的连接形式为：C-A-B，且m＝1，n＝1，k＝1；其中，A组分的C端羧基与B组分的羟基通过酯键连接；A组分的N端连接有巯基，C组分表面的氨基连接有马来酰亚胺基团，A组分通过N端巯基与C组分的马来酰胺基团连接。
4.如权利要求1所述的基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽，其特征在于，所述成分a中的β-淀粉样蛋白单体氨基酸片段为连续片段且位于β-淀粉样蛋白单体第14～29位之间，片段中的氨基酸数量为3～7；所述氨基酸片段组合为N个相同或不同β-淀粉样蛋白单体氨基酸片段的任意顺序连接，N≥2。
5.如权利要求1所述的基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽，其特征在于，所述β-淀粉样蛋白单体氨基酸片段为HQK、KLV、FFA、AED、NKG、NKGKLV、HQKAED、CFFA、CAED、CNKG、CKLVFFA、CLVFFAE中的一种。
6.如权利要求1所述的基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽，其特征在于，所述小分子化合物为姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素、高牛磺酸、3-磺基丙酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、巴西木素、棉纤维素、橄榄苦苷苷元、槲皮素、白藜芦醇、迷迭香酸、6-姜烯酚、丹参酮、维生素A、维生素B12、维生素D2、维生素D3、维生素K3中的一种。
7.如权利要求1所述的基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽，其特征在于，所述小分子化合物为姜黄素，姜黄素衍生物，高牛磺酸，高牛磺酸衍生物中的一种。
8.如权利要求7所述的基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽，其特征在于，所述姜黄素衍生物为去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素中的一种；所述高牛磺酸衍生物为3-磺基丙酸。
9.如权利要求1所述的基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽，其特征在于，所述偶联载体蛋白为血蓝蛋白、牛血清白蛋白和卵白蛋白中的一种。
10.如权利要求1所述的基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽，其特征在于，所述抗原多肽的化学结构式如下式(1)～式(14)所示：
Figure FDA0003829608190000021
Figure FDA0003829608190000031
Figure FDA0003829608190000041
其中，KLH表示血蓝蛋白。
11.如权利要求1～10任一项所述的基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽在制备用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。
12.如权利要求1～10任一项所述的基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽在制备阿尔茨海默病疫苗中的应用。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述疫苗还包括佐剂；所述佐剂为弗氏佐剂。
14.如权利要求1～10任一项所述的基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽在制备用于清除Aβ寡聚体或多聚体的产品中的应用。
15.如权利要求1～10任一项所述的基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽在制备用于提高阿尔茨海默病患者学习记忆能力的产品中的应用。
16.如权利要求1～10任一项所述的基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽在制备用于检测Aβ寡聚体或多聚体的产品中的应用。
17.如权利要求1～10任一项所述的基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽在制备用于阿尔茨海默病早期风险评估筛查、疾病诊断或辅助诊断的产品中的应用。
18.如权利要求1～10任一项所述的在制备用于减少阿尔茨海默病患者脑内Aβ寡聚体和/或可溶性Aβ含量的产品中的应用。
19.一种阿尔茨海默病疫苗，其特征在于，包括基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽和佐剂，所述抗原多肽如权利要求1～10任一项所述。
20.如权利要求19所述的阿尔茨海默病疫苗，其特征在于，所述佐剂为弗氏佐剂。
21.一种阿尔茨海默病靶向免疫复合物，包括疫苗，其特征在于，所述疫苗包括基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽和佐剂，所述抗原多肽如权利要求1～10任一项所述。
22.如权利要求21所述的阿尔茨海默病靶向免疫复合物，其特征在于，还包括小分子化合物，所述小分子化合物为姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素、高牛磺酸、3-磺基丙酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、巴西木素、棉纤维素、橄榄苦苷苷元、槲皮素、白藜芦醇、迷迭香酸、6-姜烯酚、丹参酮、维生素A、维生素B12、维生素D2、维生素D3、维生素K3中的一种。
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