CN102180971B - 重组β淀粉样肽B细胞表位多肽嵌合抗原、其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了重组β淀粉样肽B细胞表位多肽嵌合抗原、其制备方法和应用。所述重组多肽嵌合抗原，其为包括5～6个串联的β淀粉样肽B细胞表位多肽抗原Aβ1～15，或由上述多肽抗原构成的二聚体。所述的重组多肽嵌合抗原还包括辅助性T细胞表位PADRE，或还进一步包括毒素片段载体分子。本发明人工合成这些靶向β淀粉样肽B细胞表位多肽嵌合抗原的基因，并通过原核表达系统获得表达，经纯化后的重组多肽嵌合抗原蛋白可作为亚单位疫苗用于免疫预防和治疗阿尔茨海默病。

Description

重组β淀粉样肽B细胞表位多肽嵌合抗原、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物制药和基因工程技术领域，具体涉及重组β淀粉样肽B细胞表位多肽嵌合抗原、其制备方法和应用。 

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种以认知功能障碍和记忆减退为主要临床特征的神经退行性疾病，是老年痴呆的主要形式。最新统计显示全世界大约有2700万人受到AD的影响，而我国的AD患者高达1000万，并且每年以30万的速度增长，给社会和家庭造成了沉重的经济负担。目前临床上治疗AD的药物主要有乙酰胆碱酯酶抑制剂和NMDA(N-甲基-D-天冬酰胺)拮抗剂等，但是这些药物只能减轻患者的症状，却不能有效治疗AD。 

淀粉样蛋白级联假说(Amyloid cascade hypothesis)被认为是AD的致病机制。淀粉样肽(β-amyloid，Aβ)由淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)经β-分泌酶和γ-分泌酶剪切加工后生成，裂解为具有40、42或43个氨基酸的淀粉样肽(Aβ)分子，具有自我聚合的能力，因而能够在细胞外聚集成寡聚体，导致纤维化进而形成淀粉样沉积。而阿尔茨海默病就是由于患者大脑内堆积了过多的Aβ，产生了神经毒性，直接导致了神经元功能的障碍及减退，或进而导致tau蛋白的过度磷酸化而产生神经纤维缠结，间接导致神经元功能的减退。目前人们普遍认为，过多的Aβ是诱发AD发病机制的核心，是AD形成和发展的关键；所以，以淀粉样肽(Aβ)为靶标，研制疫苗阻断或清除Aβ堆积，是预防和治疗阿尔茨海默病(AD)的一种有效策略。 

1999年，Schenk等首次报道了利用人纤维化的Aβ42多肽联合弗氏佐剂免疫AD转基因小鼠(Tg2576)(参见Schenk D，et al.，Nature，1999，400：173-7)。此后，Elan和Wyeth采用Aβ42进行了临床试验，但在II a期临床试验中，6％的受试者出现了急性脑膜炎，从而导致实验终止(参见Orgogozo JM，et al.，Neurology，2003，61：46-54)。大多数人认为，出现脑膜炎的原因是产生了Th1型细胞免疫反应(参见Cribbs DH，et al.，Int Immunol，2003，15：505-14)。尽管如此，那些治疗后产生针对Aβ的抗体的患者相比未接受治疗的患者，认知能力下降的速度明显减缓(参见Hock C，et al.Neuron，2003，38：547-54)。因此，只要避免免疫治疗后的有害副作用，以Aβ为靶标的主动免疫方法治疗阿尔茨海默病还是十分有希望的。经过分析得知，Aβ1～42当中存在一个B细胞表位(第1～15位)及两个T细胞表位(第17～21和29～42位)。这个重要发现使人们研究AD主动免疫时更倾向于使用单独B细胞表位，并去除有害的T细胞表位，让疫苗达到促进抗体生成的目的，且从根本上避免之前临床试验所产生的Th1型细胞不良反应。基于以上研究结果，结合AN-1792疫苗在病人体内应用失败的原因，爱尔兰的Elan和美国的 惠氏公司合作开发了一种新疫苗ACC-001，目前该疫苗正进行II期临床试验。ACC-001以白喉毒素突变体(CRM197)为载体蛋白，体外偶联Aβ多肽序列N端，以QS21作为佐剂。同时，Novartis公司制备的CAD106疫苗(Aβ多肽序列N端连接Qb颗粒)，Affiris公司制备的Affitope疫苗(用一段短多肽模拟天然Aβ序列的一部分作为抗原成分)，以及Merck公司制备的V950(Aβ多肽序列N端连接ISCOMATRIX)也正在进行I或II期临床试验。最近，基于Aβ表位的阿尔茨海默病DNA和重组病毒载体疫苗也得到了研究。除此之外，也可设计重组的免疫原作疫苗来治疗阿尔茨海默病；如Moretto等报道了重组Aβ多肽蛋白疫苗，利用大肠杆菌表达包含Aβ的重组蛋白Trx-4/8Aβ(1～15)，获得的重组蛋白经纯化后免疫小鼠，产生了良好的免疫反应，可作为候选疫苗，但该重组蛋白抗原含有Trx蛋白不能够应用于人类，需要进一步优化改选(参见Moretto N，et al.，JBiological Chemistry，2007，282：11436-45)。 

目前研究的各种疫苗都有其缺点，如难以合成大量高度纯化的多肽表位疫苗，DNA疫苗产生抗体水平相对较低等。好的AD疫苗应该能引起高的体液免疫反应，同时不产生自身T细胞反应。因此AD疫苗的研究策略是诱导机体产生高的体液免疫反应，清除大脑内的淀粉样斑块，改善病人认知能力，同时不产生自身T细胞反应。由于Aβ属于小分子多肽，免疫原性较低，Aβ单独作为免疫原时难以达到预期的效果。因此，需要考虑偶联或融合辅助性T淋巴(HTL，Helper T lympocyte)细胞表位或含有丰富的T淋巴细胞表位的载体分子来达到提高抗原免疫原性的作用。辅助性T淋巴细胞表位在免疫反应诱导机体产生体液和细胞免疫反应中起着重要作用。因此，HTL表位可能在疫苗及其诱导的免疫反应起着关键角色，是疫苗抗原的重要组成部分。对于免疫原性弱或无T细胞表位的免疫原来说，必须加入HTL才能诱导或激发体内产生针对免疫原的抗体或细胞免疫反应。PADRE(Pan-DR helper T cell epitopes，AKAVAAWTLKAAA)是一个强的通用型HTL表位，研究表明偶联或嵌合入抗原的T细胞表位确实能够免疫调节和增强抗原的免疫反应。一些免疫原具有很强的免疫反应，含有丰富的T淋巴细胞表位，如白喉毒素或破伤风毒素等，不仅本身可能诱导机体产生针对自身的强免疫反应，而且同时其T淋巴细胞表位具有通用性，可通过其含有的HTL介导(同时也作为载体分子)增强偶联或嵌合的抗原免疫反应。因此，B细胞表位，辅助T细胞表位，各种免疫佐剂，免疫途径的配合使用等也能够提高了疫苗的免疫效果。这些策略除了在制备多肽疫苗上的应用外，既可用于制备融合或嵌合蛋白等亚单位疫苗上，也可应用于制备AD的DNA疫苗。其目的是，针对Aβ的疫苗能够诱导高水平的Aβ抗体，清除大脑内的淀粉样斑块，改善认知能力，同时也能够避免治疗后有害的T细胞免疫副作用，因此以Aβ为靶标的重组多肽嵌合抗原疫苗在阿尔茨海默病(AD)的预防和治疗中具有非常大的潜力和应用前景。 

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供重组β淀粉样肽B细胞表位多肽嵌合 抗原、其制备方法，以及该抗原作为亚单位疫苗在阿尔茨海默病(AD)的预防和治疗药物中的应用。 

为实现上述目的，本发明首先提供的重组AβB细胞表位多肽嵌合抗原，其包括5～6个串联的β淀粉样肽B细胞表位多肽抗原Aβ1～15(即其第1～15位氨基酸，DAEFRHDSGYEVHHQ，简称Aβ15)，其优选的氨基酸序列如SEQ ID No.18所示。 

优选地，本发明提供的重组AβB细胞表位多肽嵌合抗原为二聚体形式。这种二聚体形式的重组多肽嵌合抗原具有强的构象表位和弱的序列表位，是一种全新的重组抗原，具有独特的结构特性，因此该亚单位疫苗对于AD有新的免疫治疗效果和特征。 

在本发明的另一个实施方案中，重组AβB细胞表位多肽嵌合抗原还包括辅助性T细胞表位PADRE，其优选的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示。 

在本发明的又一实施方案中，重组AβB细胞表位多肽嵌合抗原还进一步包括毒素片段载体分子。 

其中，所述的毒素片段载体分子连接于所述多肽抗原Aβ1～15的C端或N端。 

优选地，所述的毒素片段载体分子选自A型肉毒毒素或破伤风毒素的受体结合区或它们的片段。 

优选地，所述的毒素片段载体分子选自氨基酸序列如SEQ ID No.20～23(分别为THc、THc-C、AHc和AHc-C的氨基酸序列)所示的毒素片段载体分子。 

本发明还提供制备上述重组Aβ15多肽嵌合抗原的方法，包括先人工合成编码所述重组多肽嵌合抗原的基因，再将该基因与原核表达载体连接，通过原核表达系统获得可溶性重组多肽嵌合抗原蛋白的表达并将其纯化。 

本发明还提供编码上述重组Aβ15多肽嵌合抗原的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1～2和SEQ ID No.25～30任一所示。 

本发明还提供含有所述基因的载体。 

本发明还提供所述的重组多肽嵌合抗原在防治和治疗阿尔茨海默病药物中的应用，优选作为亚单位疫苗用于防治和治疗阿尔茨海默病。 

本发明方法具有如下优点： 

本发明人工合成编码所述重组多肽嵌合抗原的基因，通过原核表达系统获得了可溶性表达并且纯化后作为重组多肽嵌合抗原的亚单位疫苗，低剂量免疫小鼠后均能产生很好的免疫反应。其中6Aβ15-T重组抗原的抗Aβ抗体高于6Aβ15和人工合成的多肽Aβ免疫组，也高于Trx-4Aβ42抗原免疫产生的抗体水平，表明其具有良好的应用能力。然后，6Aβ15-T和毒素片段载体分子(如A型肉毒毒素或破伤风毒素受体结合区Hc，AHc基因序列见专利：ZL200710089588.2和序列表中SEQ ID No.4，THc为本发明人工合成的基因，见序列表中SEQ ID No.3)融合为不同的重组分子如6Aβ15-T-AHc/THc，和AHc/THc-6Aβ15-T等，其通过原核表达系统获得了可溶性表达并且纯化后作为重组多肽嵌合抗原疫苗，免疫小鼠后产生了良好的免疫反应，其抗Aβ抗体高于6Aβ15-T抗原免疫组，表明这些载体分子介导免疫调节并提高了抗Aβ的抗体，并且无针对Aβ的T细 胞免疫反应，其免疫反应为Th2型，具有更好的应用能力。更为重要的是，以上这些重组多肽嵌合抗原免疫转基因APP-AD模型小鼠同样也能够诱导产生高滴度的抗Aβ抗体，并且该免疫原没有引起针对Aβ的T细胞增殖反应，其主要抗体亚型为IgG1型，说明引起的免疫完全偏向于Th2型免疫反应。另外，这些免疫血清抗体体外能够与不同形式的Aβ结合情况不同，而与寡聚体结合更强烈。目前，许多研究表明Aβ寡聚体才是导致阿尔茨海默病的主要原因(Klein WL，et al.Trends in neurosciences，2001，24(4)：219-224)，观察疫苗免疫后血清与不同状态Aβ结合状况能够在一定程度上反映疫苗的治疗效果，基于这一免疫特性提示本发明的重组多肽嵌合蛋白抗原疫苗能够产生与Aβ可溶性寡聚体具有高亲和力的抗体。另外，通过免疫组化证实该重组多肽嵌合抗原免疫后转基因模型小鼠脑组织切片中Aβ淀粉样斑块得到了明显的减少。行为学指标观察结果表明，免疫组的(水迷宫)学习记忆能力都得到了明显的改善和提高。以上这些结果表明重组多肽疫苗具有独特的结构和免疫反应特性，有望作为阿尔茨海默病的免疫预防和治疗的新型疫苗候选，具有良好的应用前景和研究价值。 

本发明制备的重组多肽嵌合抗原疫苗具有良好的免疫原性，其可避免大量化学合成多肽的昂贵费用，且细菌表达蛋白工艺相对成熟，是AD疫苗的一种理想选择。本发明采用毒素片段(含有通用型T细胞表位)作载体分子提高AD疫苗针对Aβ的免疫反应是新发展方向。以上这些疫苗及策略扩展了AD研究和应用的潜力，为疫苗的研发提出了许多新的思路，对寻找合适的针对AD病的疫苗具有重要的意义。 

附图说明

图1为纯化的重组多肽嵌合抗原SDS-PAGE结果。泳道1～8分别为6Aβ15、6Aβ15-T、6Aβ15-T-AHc-C、AHc-5Aβ15-T、6Aβ15-T-THc、THc-5Aβ15-T、6Aβ15-T-THc-C和Trx-4Aβ42，泳道M为低分子量蛋白Marker，分子量范围从上往下依次为：116、66、45、35、25、18和14.4KD。 

图2为重组多肽嵌合抗原6Aβ15-T分子量测定(图2A)和肽谱分析(图2B)结果。 

图3为重组多肽嵌合抗原Western blot鉴定结果。泳道1～8分别为6Aβ15、6Aβ15-T、6Aβ15-T-AHc-C、AHc-5Aβ15-T、6Aβ15-T-THc-C、6Aβ15-T-THc、THc-5Aβ15-T和Trx-4Aβ42，泳道M为预染分子量蛋白Marker，分子量范围从上往下依次为：170、130、95、72、55、43、34和26。 

图4为重组多肽嵌合抗原与人工合成的多肽抗原免疫小鼠后的抗体滴度及亚型的比较结果。 

图5为含毒素片段载体分子的重组多肽嵌合抗原免疫小鼠后的抗体滴度及亚型分析。其中A为AHc和AHc-C作为载体分子介导的重组多肽嵌合抗原；B为THc和THc-C作为载体分子介导的重组多肽嵌合抗原。 

图6为特异性刺激的T淋巴细胞产生的细胞因子分析。其中，A为细胞因子IL-4水平；B为细胞因子IFN-γ水平。Aβ、T和PBS是指分别用Aβ42、PADRE和PBS(无 抗原刺激)特异性刺激的T淋巴细胞产生的细胞因子水平。 

图7为重组多肽嵌合抗原免疫APP转基因AD模型小鼠后的各阶段的抗体水平。 

图8为重组多肽嵌合抗原免疫APP转基因AD模型小鼠后血清中的抗体滴度及亚型分析。 

图9为各免疫血清与不同状态Aβ结合的斑点杂交结果图。 

图10为各组小鼠在Morris水迷宫的学习和记忆能力结果。 

图11重组多肽嵌合抗原疫苗减少了13个月龄APP模型小鼠脑内淀粉样斑块含量的脑组织切片免疫组化染色图。 

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。DNA基因均由上海生物工程技术服务有限公司(上海)合成；所用引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。 

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 

实施例16Aβ15，6Aβ15-T和THc基因的获得 

根据密码子简并性人工合成了编码AβB细胞表位多肽抗原(第1～15位氨基酸，DAEFRHDSGYEVHHQ，简称为Aβ15)6个拷贝串联重复的6Aβ15基因(见序列表中SEQ ID No.1)，直接合成克隆于pMD18-T(TaKaRa)T载体中命名为pMD18-6Aβ15，编码6Aβ15(氨基酸序列见序列表中SEQ ID No.18)，各个Aβ15间用KL或GS柔性肽连接，起始于第9个核苷酸(ATG)，一直到CAG(倒数第7个核苷酸)。其中DAEFRHDSGYEVHHQ为Aβ15，KL(AAGCTT)为引入的酶切位点，为下步在Aβ15的N端引入载体分子提供位点，GS为柔性肽。 

然后人工合成了6Aβ15直接与通用型DR辅助性T细胞表位PADRE(AKAVAAWTLKAAA，Pan-DR helper T cell epitopes，PADRE)融合的重组多肽嵌合抗原6Aβ15-T基因(见序列表中SEQ ID No.2)，直接克隆于pMD18-T中命名为pMD18-6Aβ15-T，编码6Aβ15-T(氨基酸序列见序列表中SEQ ID No.19)，起始于第9个核苷酸(ATG)，一直到最后一个为GCA。其中AKAVAAWTLKAAA为泛DR辅助性T细胞表位PADRE序列。 

同时也合成了编码4个Aβ42拷贝串联重复的4Aβ42基因(见序列表中SEQ IDNo.5)，直接合成克隆于T载体pMD18-T中命名为pMD18-4Aβ42，编码4个Aβ42串联重复的4Aβ42(氨基酸序列见序列表中SEQ ID No.24)。另外，也人工合成了编码破伤风毒素受体结合区Hc(THc)基因(见序列表中SEQ ID No.3)，直接克隆于pMD18-T中命名为pMD18-THc，编码THc(长度1299个核苷酸，编码氨基酸433个，884～1315aa，氨基酸序列见序列表中SEQ ID No.20)；起始于第9个核苷酸(ATG)，一直到GAC(倒数 第7个核苷酸)。 

以上基因设计采用大肠杆菌常用的密码子，同时兼顾真核细胞常用的密码子，并保证所编码的氨基酸残基序列不变。对于串联重复的Aβ15基因采用不同密码子使之不完全一样，减少重复序列并提高基因的表达翻译水平。而对于THc基因，根据破伤风毒素受体结合区Hc的基因序列和氨基酸残基序列(中国流行株CMCC64008)优化THc基因，使A和T含量由72.4％降低至52％。 

实施例2原核表达载体的构建及重组多肽抗原在大肠杆菌中的表达与纯化 

一、重组原核表达载体的构建 

用EcoR I和Xho I及EcoR I和Not I分别双酶切实施例1获得的质粒pMD18-6Aβ15和pMD18-6Aβ15-T，用DNA回收试剂盒分别回收长度约320和350bp的目的片段，与经相同酶双酶切的原核表达载体pTIG-Trx(见专利：ZL2007100895882)连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序，获得序列及插入位置均正确的重组原核表达载体，分别命名为pTIG-Trx-6Aβ15和pTIG-Trx-6Aβ15-T。 

将6Aβ15-T和毒素片段载体分子(如A型肉毒毒素或破伤风毒素受体结合区Hc)融合为不同的重组分子作重组多肽抗原。首先，以本实验室保存的质粒pGEM-AHc(见专利：ZL200710089588.2)为模板，在引物F1-AHcN(见序列表中SEQ ID No.6)：和引物R1-AHcX(见序列表中SEQ ID No.7)的引导下，PCR扩增AHc基因序列(见序列表中SEQID No.4；其编码AHc的412个氨基酸，即885～1296aa，AHc氨基酸序列见序列表中SEQID No.22)，PCR反应体系为50μl，其中pfu Taq 0.5μl，10×buffer(plus Mg²⁺)5μl，dNTP(各25mM)4μl，引物各0.5μl，补水足50μl，PCR反应条件为95℃3min，94℃50s，62℃50s，72℃120s，共25个循环，72℃10min，并在序列两端分别添加Not I和Xho I识别位点，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA回收试剂盒回收长度约1300bp的目的片段并对其进行纯化，将回收片段用Not I和Xho I进行双酶切后与经相同酶双酶切的之前构建的载体pTIG-Trx-6 Aβ15-T连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序，测序结果表明得到了序列及插入位置均正确的6Aβ15-T与AHc融合的重组原核表达载体，命名为pTIG-Trx-6Aβ15-T-AHc(6Aβ15-T-AHc基因的核苷酸序列，见序列表中SEQ ID No.25)。 

利用之前构建的pTig-Trx-6Aβ15-T-AHc中预留的SacI位点，将AHc的C端基因进行PCR扩增，去掉pTIG-Trx-6Aβ15-T-AHc中的AHc片段，改换成AHc-C。以质粒pGEM-AHc为模板，在引物F1-AHc-CS(见序列表中SEQ ID No.8)和引物R1-AHcX(见序列表中SEQ ID No.7)的引导下，PCR扩增AHc-C基因序列(编码AHc的209个氨基酸，即1088～1296aa，氨基酸序列见序列表中SEQ ID No.23)，PCR反应体系为50μl，其中pfu Taq 0.5μl，10×buffer(plus Mg²⁺)5μl，dNTP(各25mM)4μl，引物各0.5μl，补水足50μl，PCR反应条件为95℃3min，94℃50s，62℃50s，72℃60s，共25个循环， 72℃10min，并在序列两端分别添加Sac I和Xho I识别位点，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA回收试剂盒回收长度约640bp的目的片段并对其进行纯化，将回收片段用Sac I和Xho I进行双酶切后与经相同酶双酶切的载体pTIG-Trx-6 Aβ15-T-AHc连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序，测序结果表明得到了序列及插入位置均正确的6 Aβ15-T与AHc-C融合的重组原核表达载体，命名为pTIG-Trx-6 Aβ15-T-AHc-C(6Aβ15-T-AHc-C基因的核苷酸序列，见序列表中SEQ ID No.26)。 

另外，将AHc与Aβ1～15的N端融合，构建其原核表达载体。以质粒pGEM-AHc为模板，在引物F1-AHc-E(见序列表中SEQ ID No.9)和引物R-AHc-H2(见序列表中SEQ IDNo.10)的引导下，PCR扩增AHc基因序列(见序列表中SEQ ID No.4；其编码AHc的412个氨基酸，即885～1296aa，氨基酸序列见序列表中SEQ ID No.22)，PCR反应体系为50μl，其中pfu Taq 0.5μl，10×buffer(plus Mg²⁺)5μl，dNTP(各25mM)4μl，引物各0.5μl，补水足50μl，PCR反应条件为95℃3min，94℃50s，62℃50s，72℃120s，共25个循环，72℃10min，并在序列两端分别添加EcoR I和Hind III识别位点，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA回收试剂盒回收长度约1300bp的目的片段并对其进行纯化，将回收片段用EcoR I和Hind III进行双酶切后与经相同酶双酶切的载体pTIG-Trx-6Aβ15-T连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序，测序结果表明得到了序列及插入位置均正确的AHc与5 Aβ15-T(6Aβ15-T经EcoR I和Hind III双酶切后连接后去除了一个拷贝Aβ15)融合的重组原核表达载体，命名为pTIG-Trx-AHc-5 Aβ15-T(AHc-5Aβ15-T基因的核苷酸序列，见序列表中SEQID No.27)。 

进一步将THc全长和其C端基因与6Aβ-T融合后克隆入原核表达载体以制备重组多肽抗原。如，以质粒pMD18-THc(含人工合成的编码破伤风毒素受体结合区Hc基因THc)为模板，在引物F-THC-S(见序列表中SEQ ID No.11)和引物R-THC-X(见序列表中SEQ IDNo.12)的引导下，PCR扩增THc基因序列(见序列表中SEQ ID No.3；其编码THc的432个氨基酸，即884～1315aa，氨基酸序列见序列表中SEQ ID No.20)，PCR反应体系为50μl，其中pfu Taq 0.5μl，10×buffer(plus Mg²⁺)5μl，dNTP(各25mM)4μl，引物各0.5μl，补水足50μl，PCR反应条件为95℃3min，94℃50s，62℃50s，72℃120s，共25个循环，72℃10min，并在序列两端分别添加Sac I和Xho I识别位点，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA回收试剂盒回收长度约1300bp的目的片段并对其进行纯化，将回收片段用Sac I和Xho I进行双酶切后与经相同酶双酶切的载体pTIG-Trx-6Aβ15-T-AHc连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序，测序结果表明得到了序列及插入位置均正确的6Aβ15-T与THc融合的重组原核表达载体，命名为pTIG-Trx-6Aβ15-T-THc(6Aβ15-T-THc基因的核苷酸序列，见序列表中SEQ ID No.28)。相同方法，以质粒pMD18-THc为模板，在引物F-THC-CS(见序列表中SEQ ID No.13)和引物R-THC-X(见序列表中SEQ ID No.12)的引 导下，PCR扩增THc基因C序列(编码THc的219个氨基酸，即1097～1315aa，命名为THc-C，氨基酸序列见序列表中SEQ ID No.21)，经Sac I和Xho I双酶切后与经相同酶双酶切的载体pTIG-Trx-6 Aβ15-T-AHc连接，替换AHc，获得测序结果表明得到了序列及插入位置均正确的6 Aβ15-T与THc-C融合的重组原核表达载体，命名为pTIG-Trx-6 Aβ15-T-THc-C(6Aβ15-T-THc-C基因的核苷酸序列，见序列表中SEQ ID No.29)。 

进一步将THc与Aβ1～15的N端融合，构建其原核表达载体。以质粒pMD18-THc为模板，在引物F-THC-Aβ(见序列表中SEQ ID No.14)和引物R-THC-Aβ(见序列表中SEQ IDNo.15)的引导下，PCR扩增THc基因序列，PCR反应体系为50μl，其中pfu Taq 0.5μl，10×buffer(plus Mg²⁺)5μl，dNTP(各25mM)4μl，引物各0.5μl，补水足50μl，PCR反应条件为95℃3min，94℃50s，62℃50s，72℃120s，共25个循环，72℃10min，并在序列两端分别添加EcoR I和Hind III识别位点，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA回收试剂盒回收长度约1300bp的目的片段并对其进行纯化，将回收片段用EcoR I和Hind III进行双酶切后与经相同酶双酶切的载体pTIG-Trx-6Aβ15-T连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序，测序结果表明得到了序列及插入位置均正确的THc与5 Aβ15-T(6 Aβ15-T经EcoR I和Hind III双酶切后连接后去除了一个拷贝Aβ15)融合的重组原核表达载体，命名为pTIG-Trx-THc-5Aβ15-T(THc-5Aβ15-T基因的核苷酸序列，见序列表中SEQ ID No.30)。 

最后，构建了一个表达4Aβ42抗原的载体，利用Trx基因中存在的BamH I(GGATCC)位点(Trx基因存在于pTIG-Trx表达载体中，见专利：ZL200710089588.2)，将其N端与Trx融合，获得了可表达重组融合蛋白的表达载体。具体构建过程如下：以质粒pMD18-4Aβ42(含人工合成的编码4个拷贝Aβ42基因)为模板，在引物F-Aβ42(见序列表中SEQ IDNo.16)和引物R-Aβ42(见序列表中SEQ ID No.17)的引导下，PCR扩增4Aβ42基因序列(见序列表中SEQ ID No.5)，PCR反应体系为50μl，其中pfu Taq 0.5μl，10×buffer(plus Mg²⁺)5μl，dNTP(各25mM)4μl，引物各0.5μl，补水足50μl，PCR反应条件为95℃3min，94℃50s，62℃50s，72℃60s，共25个循环，72℃10min，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA回收试剂盒回收长度约500bp的目的片段并对其进行纯化，将回收片段用BamHI和Xho I进行双酶切后与经相同酶双酶切的载体pTIG-Trx连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序，测序结果表明得到了序列及插入位置均正确的4Aβ42与Trx融合的重组原核表达载体，命名为pTIG-Trx-4Aβ42。 

二、重组多肽抗原在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化 

1.重组多肽抗原在大肠杆菌中的表达及表达产物的SDS-PAGE检测 

将步骤一构建的9个重组原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(TIANGEN公司)，筛选阳性重组子，以转化有pTIG-Trx空载体的重组菌为阴性对照，然后按1∶100的比例将阳性重组菌接种至含100mg/mL氨苄青霉素的500mL的LB液体培养基中，在37℃、250rpm下进行大量培养，培养至对数生长期(OD₆₀₀约为0.4～0.6)时加入化 学诱导剂IPTG至终浓度为0.2mmol/L，在16℃下继续诱导培养12小时。培养结束后，离心收集菌体，重悬于20mM磷酸钠缓冲液中(pH 8.0)，超声打碎细胞，离心收集上清进行12％SDS-PAGE检测，结果表明，经诱导表达的重组蛋白都获得了表达并能够以可溶性方式存在，而未诱导的菌株和诱导的空载体对照未出现该目的蛋白带，说明所表达的蛋白可能就是目的蛋白即重组多肽抗原。 

2.表达产物的纯化及鉴定 

步骤1所表达的重组多肽嵌合抗原的C端含有六个组氨酸标签，因此用Ni-NTA亲和层析柱(购自法玛西亚公司)并参照说明书对可溶性表达产物进行纯化，得到洗脱纯化蛋白，然后对经纯化的蛋白进行12％SDS-PAGE检测，检测结果表明得到了纯化的目的蛋白。图1所示是其中8种目的蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图。除Trx-4Aβ42蛋白是Aβ42与Trx融合表达外，其他蛋白是与Trx同时表达，但分为二个阅读框。另外，可进一步对第一步纯化产物进行Q/SP阴/阳离子交换柱纯化，以获得更高的纯化产物，可达到95％以上。其中获得6Aβ15和6Aβ15-T为二聚体形式，分子量分别为24和28KD(其中单体分子量分别为12和14KD)，其中对6Aβ15-T进行了分子量测定和肽谱分析，进一步确定其为二聚体，并且是符合设计的6Aβ15-T，如图2。图2A显示为6Aβ15-T的分子量，经强力处理后大部分为单体即14KD，仍然有部分为分子量为28KD的二聚体。图2B显示为6Aβ15-T的肽谱分析，有符合设计的多肽成份，表明为6Aβ15-T多肽嵌合抗原。另外，具有二聚体结构特征的重组蛋白6Aβ15和6Aβ15-T具有良好的稳定性。 

3.表达产物的Western blot和ELISA鉴定 

以鼠源抗Aβ40单克隆抗体(Monoclonal Anti-β-Amyloid，BAM-10，购自sigma)为一抗，以辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG(购自Sigma公司)为二抗，对纯化的重组多肽抗原蛋白进行Western blot分析，结果显示表达目的蛋白与鼠抗Aβ抗体特异性结合，大小位置与电泳位置一致，表明诱导表达或经纯化的重组蛋白即为目的蛋白(图3)。同时，通过ELISA确定了该抗体也能够与这些重组多肽抗原蛋白结合，而与空载体诱导表达产物不结合，进一步表明我们表达和纯化的多肽抗原含Aβ42或Aβ42的B细胞表位抗原Aβ15。另外，用抗载体分子AHc或THc的多克隆抗体进一步鉴定6Aβ15-T-AHc-C，AHc-5Aβ15-T，6Aβ15-T-THc，6Aβ15-T-THc-C和THc-5Aβ15-T多肽嵌合抗原蛋白，也表明这些重组多肽嵌合抗原含载体分子，进一步确定获得了符合设计的含各自相应载体的重组嵌合多肽抗原。 

实施例3重组多肽嵌合抗原6Aβ15-T诱导普通小鼠产生高水平抗Aβ抗体 

以实施例2中表达并经纯化的重组蛋白6Aβ15和6Aβ15-T作为免疫原即亚单位疫苗免疫小鼠，以检测其免疫原性，并且与人工合成的溶于PBS的Aβ15(氨基酸序列为DAEFRHDSGYEVHHQ，纯度90％以上，为上海生工生物工程技术服务有限公司合成)和Aβ42(氨基酸序列为DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAED VGSNKGAIIGLMVGGVVIA，纯度90％以上，为上海生工生物工程技术服务有限公司合成)多肽抗原进行比较。具体方法为：将Balb/c小(8周龄，雌性，SPF级，购自军事医学科学院实验动物中心)随机分为5组，每组8只，重组多肽抗原免疫组免疫5μg重组蛋白，人工合成的多肽组免疫100μg，而对照组免疫不含重组蛋白的PBS，共免疫四次。免疫前，将抗原稀释于终浓度为20％(V/V)铝佐剂(Alhydrogel，Sigma)。每只100μl进行肌肉注射免疫，加强免疫时，间隔2周，剂量和方法同上。每次免疫前，以及最后一次免疫后第2周，小鼠尾部采血，分离血清，用ELISA去(用酶联免疫板包被Aβ42或Aβ15抗原，浓度为2μg/mL，用分离的免疫小鼠血清为一抗，以HRP标记羊抗鼠IgG(购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.)为二抗测定血清抗体。终末稀释ELISA去测定免疫动物血清中的特异性抗体滴度。以空对照组小鼠血清为阴性对照(即N)，重组多肽抗原免疫组的OD492值(即P值)达到0.2以上，并且P/N≥2.1为阳性。每组的平均抗体滴度以每组单个血清样品抗体滴度以几何平均数(GMT±SD)表示。 

ELISA检测结果表明，随着免疫次数的增加，抗体滴度也得到相应提高，而对照组血清与免疫前相比始终为阴性，低于100，最后一次免疫后抗体滴度如图4；上述检测结果表明，重组多肽抗原6Aβ15-T免疫效果最好，抗体水平明显高于6Aβ15和多肽Aβ15(P＜0.01，差异极显著)，表明T细胞表位对于产生抗体水平至关重要，正如多肽Aβ42高于多肽Aβ15组，另外6Aβ15-T免疫组没有产生IgG2a抗体，表明其免疫应答完全为Th2，这与其免疫后没有产生明显的针对Aβ42刺激的淋巴细胞增殖是一致的。但，6Aβ15重给多肽抗原产生的抗体水平也高于多肽Aβ15，并且它也是二聚体结构，因此提示它有潜力作为候选疫苗和免疫原。 

淋巴细胞的增殖能力是细胞免疫应答的一个重要指标，用MTS法测定淋巴细胞的增殖能力，方法为：最后一次免疫后第4周取脾细胞，制备浓度为10⁶个/mL的脾细胞悬液，在体外用抗原多肽Aβ42或T细胞表位(AKAVAAWTLKAAA，PADRE)多肽，浓度为10μg/mL，进行刺激，4天后用MTS法检测T细胞增殖能力。淋巴细胞增殖能力的MTS法测定结果表明，6Aβ15-T免疫组小鼠体内诱导产生了特异的针对T细胞表位多肽的T细胞免疫反应，但是没有产生针对Aβ42刺激的淋巴细胞增殖的T细胞免疫反应，而多肽Aβ42免疫组则产生了针对多肽Aβ42的T细胞免疫反应。 

进一步结果证实，0.2和1μg重组蛋白6Aβ15-T也能够诱导小鼠产生良好的抗Aβ抗体，但10μg Aβ多肽则不能够诱导小鼠产生良好的抗Aβ抗体。并且以上产生的免疫反应用Aβ42或Aβ15抗原检测时，均得到类似的结果。因此，上述实验结果表明，重组多肽抗原6Aβ15-T可作为阿尔茨海默病(AD)候选疫苗，低剂量就能够诱导小鼠产生高水平抗Aβ抗体，并且免疫应答反应为Th2型。 

另外，实验结果表明，重组多肽嵌合抗原5Aβ15-T也可诱导普通小鼠产生高水平抗Aβ抗体。 

实施例4载体分子增强了6Aβ15-T的免疫原性，诱导产生更高水平的抗Aβ抗体 

以实施例2中表达并经纯化的重组蛋白6Aβ15-T-AHc-C，AHc-5Aβ15-T，6Aβ-T-THc，6Aβ15-T-THc-C和THc-5Aβ15-T作为免疫原即亚单位疫苗免疫小鼠，以检测其免疫原性，并且与6Aβ15-T和Trx-4Aβ42免疫原进行比较。具体方法为：将Balb/c小(8周龄，雌性，SPF级，购自军事医学科学院实验动物中心)随机分为8组，每组8只，重组多肽抗原免疫组免疫5μg重组蛋白，而对照组免疫不含重组蛋白的PBS，共免疫四次。免疫前，将抗原稀释于终浓度为20％(V/V)铝佐剂(Alhydrogel，Sigma)。每只100μl进行肌肉注射免疫，加强免疫时，间隔2周，剂量和方法同上。ELISA法测定免疫动物血清中的特异性抗体滴度和淋巴细胞的增殖能力方法同上。 

ELISA检测结果表明，随着免疫次数的增加，抗体滴度也得到相应提高，而对照组血清与免疫前相比始终为阴性，低于100，最后一次免疫后抗体滴度如图5。检测结果表明，含有载体分子(如AHc、AHc-C、THc和THc-C)重组多肽抗原均产生了高滴度的抗Aβ抗体，抗体水平也高于6Aβ15-T(P＜0.05，差异显著)，抗体亚型也主要为IgG1，没有产生IgG2a抗体，表明其免疫应答主要为Th2，这与其免疫后没有产生明显的针对Aβ42刺激的淋巴细胞增殖是一致的，此结果表明载体分子提高了6Aβ15-T抗原对Aβ的特异性抗体水平，并且没有改变其免疫反应类型。然后对培养基上清中的细胞因子进行了分析(图6A，B)。结果表明没有产生针对Aβ42的细胞因子(IL-4和IFN-γ)，而产生了针对PADRE(简称T)的细胞因子，并且IL-4的水平高于IFN-γ的水平，这暗示免疫应答为Th2，与多肽抗原蛋白免疫特性和抗体亚型的分析是一致。另外，低剂量的Trx-4Aβ42抗原也能够产生良好的抗体反应，相当于100μg的多肽Aβ42免疫组，但比6Aβ15-T抗原产生的抗体水平略低，更显著地低于含有载体分子的抗原组(6Aβ15-T-AHc-C，AHc-5Aβ15-T，6Aβ15-T-THc，6Aβ15-T-THc-C和THc-5Aβ15-T)(P＜0.05)。以上结果表明免疫组Trx-4Aβ42免疫原可以诱导产生免疫反应，但与含T或载体分子重组免疫原相比，产生的抗体反应低，并且含有Trx分子的融合蛋白可能更不适合作为人类疫苗药物，因此后者具有更明显的优势，是我们重点研究的对象。 

因此，上述实验结果表明含载体分子的重组多肽抗原也可作为阿尔茨海默病(AD)候选疫苗，低剂量就能够诱导小鼠产生高水平抗Aβ抗体，并且免疫应答反应为Th2型。 

在上面实验基础上，也检测了各免疫原对载体分子抗原的免疫反应，结果表明含有载体分子的重组多肽嵌合抗原免疫后也产生了针对载体分子的抗体反应，并且能够产生对A型肉毒毒素或破伤风毒素的保护作用，证实了A型肉毒毒素或破伤风毒素的C片段作为载体分子诱导了免疫反应，并且也调节介导和增强了其融合多肽抗原分子的免疫反应。因此，本发明的设计并获得的重组多肽嵌合抗原不仅仅可用于制备阿尔茨海默病(AD)候选疫苗，而且能够产生对A型肉毒毒素或破伤风毒素的保护作用，表明其可作二价疫苗。 

实施例5重组多肽嵌合抗原亚单位疫苗免疫APP转基因AD模型小鼠后，诱导产生高水平的抗Aβ抗体 

以上实验结果表明，设计和制备重组多肽嵌合抗原亚单位疫苗在普通小鼠上诱导产生了良好的免疫原性，并且其免疫血清能够与不同形式Aβ42结合，呈现特异性高结合Aβ寡聚体，因此这些抗原疫苗当应用于AD模型小鼠时，可能能够诱导产生抗Aβ42抗体并且特异性地结合和清除Aβ42，从而改善AD症状。故，本实验研究并证实这些重组多肽抗原亚单位疫苗在APP转基因AD模型小鼠上的免疫原性和免疫效果，从而进一步确定和比较它们的药效学结果。具体方案如下，AD模型小鼠为PDAPP^V717V，高水平表达APP751的转基因小鼠，作为AD模型，购自中国医学科学院实验动物研究所北京华阜康生物科技股份有限公司；重组多肽抗原亚单位疫苗与之前的制备和配制方法相同；转基因小鼠(12周龄，雌雄性，SPF级)随机分为4组，每组6～8只，5μg重组多肽抗原6Aβ15-T，6Aβ15-T-AHc-C和6Aβ15-T-THc-C分别混合于PBS中，免疫前，将抗原稀释于终浓度为20％(V/V)铝佐剂(Alhydrogel，Sigma)，总体积100μl/只，阴性对照组为不含重组蛋白的PBS，共免疫五次，前四次间隔3周，最后一次间隔8周，每只100μl进行肌肉注射免疫，加强免疫时，剂量和方法同上。ELISA去测定免疫动物血清中的特异性抗体滴度的方法同上。另外，设置一组非转基因模型小鼠(转基因模型小鼠的母本C57/BL6)，用于评价行为学实验的阳性对照。 

ELISA检测结果表明，随着免疫次数的增加，抗体水平也得到相应提高，如图7(注：免疫后各个阶段抗体水平以ELISA表示(OD492值))，而阴性对照组血清与免疫前相比始终为阴性，最后一次免疫后抗体滴度如图8(注：最后一次加强免疫后3周各免疫组的抗体水平)；上述检测结果表明，这三种重组多肽嵌合抗原疫苗免疫后诱导产生了高滴度的特异性抗体水平(P＜0.01，差异极显著，与阴性对照组相比)，均达到12800以上，抗体亚型也主要为IgG1，表明其免疫应答主要为Th2，这与先前在普通小鼠的结果是一致的，并且载体分子也一定程度上提高了6Aβ15-T抗原对Aβ的特异性抗体水平，但无明显统计学差异，表明它们都可作为AD的候选疫苗。另外，最后一次加强免疫后，其各个免疫组的抗体水平可维持6个月不下降。同时，也检测了各含有载体分子的重组多肽抗原免疫后产生了针对载体分子的抗体反应，提示载体分子可能在免疫反应应答中发挥了重要的免疫调节和辅助作用。 

总之，研究结果表明，低剂量重组多肽嵌合抗原免疫后就能够诱导APP转基因AD模型小鼠产生高水平抗Aβ抗体，并且免疫应答反应为Th2型。下一步对其行为学能力和脑组织中Aβ含量的变化进行评价，进一步证实该重组多肽嵌合疫苗的药效学效果。 

实施例6重组多肽嵌合抗原诱导产生的血清抗体与不同形式Aβ42的特异性结合分析 

Aβ寡聚体是Aβ从单体聚合成斑块过程中的一种中间形式，其无论在体内还是在体外均能产生较强的细胞毒性。目前，许多研究表明Aβ寡聚体才是导致阿尔茨海默病的主要原因，观察疫苗免疫后血清与不同状态Aβ结合状况能够在一定程度上反映疫苗的治疗效果。 

目的是使用斑点杂交方法测定血清中的抗体主要是与何种形式的Aβ42结合。斑点 杂交简单步骤为：①先将合成的多肽Aβ42重悬到PBS中，终浓度为500μg/ml，分为7组，分别在37℃温箱中孵育0min，10min，12h，24h，36h，3d，6d；用TBS(20mM Tris-Hcl，PH7.5，0.8％NaCl)处理NC膜以备用。②将准备好的7组Aβ42滴加在处理后的NC膜上，每组20μl；并滴加相同浓度的BSA为对照。③使用5％脱脂奶粉封闭过夜。④将各组小鼠免疫后血清作为一抗，稀释度为1∶100，37℃温箱中反应1h。⑤使用PBS-T清洗5次，每次5min。⑥用1∶1000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的酶标IgG作为二抗，37℃温箱中反应0.5h。⑦使用PBS-T清洗5次，每次5min。⑧使用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒显色。首先我们通过电镜观察的结果表明多肽Aβ42放置后，在37℃条件下时，随着孵育时间的增加，会发生形态变化。从最初的单体状态逐渐聚集为寡聚体直至最终形成纤维状结构。电镜结果表明，新鲜的多肽主要以单体形式存在(0分钟)，孵育时间为10min时，除了单体外，多肽产生了明显的寡聚体。随着孵育时间的增加，寡聚体逐渐增多(12～36小时内)，3天后则聚集逐渐形成纤维状，6天为成熟纤维。 

对普通小鼠的免疫血清抗体和AD模型小鼠的免疫血清抗体与不同状态Aβ进行Dot-blot，如图9，各免疫血清与不同状态Aβ结合的斑点杂交结果图(注：从上往下依次为6Aβ15-T免疫普通小鼠的免疫血清，免疫AD模型小鼠的免疫血清，6Aβ15-T-THc-C和6Aβ15-T-AHc-C免疫AD模型小鼠的免疫血清，6Aβ15-T-THc免疫普通小鼠的免疫血清，Aβ多肽免疫普通小鼠的免疫血清，商业化抗体以及阴性对照组血清)。结果表明，各免疫组小鼠血清均是与12～36h样品的斑点反应最明显，0min和6d样品的斑点最弱，并且抗体滴度高的免疫组反应相对比较明显，滴度低的反应较弱。传统合成的Aβ多肽免疫小鼠的免疫血清不仅反应极弱，而且与各种形式的Aβ结合无差异，与商业化抗体反应一致。阴性对照组血清和免疫前血清则不与各种形式的Aβ不结合，而且免疫血清也不与BSA结合，表明这种结合是特异性的。由实验结果可证明，重组多肽嵌全抗原免疫小鼠产生的抗体主要是与Aβ寡聚体结合，跟单体和纤维状Aβ结合程度弱，与传统合成的Aβ多肽产生的抗体及商业化抗体反应不相同。基于这一免疫特性，提示本发明的重组多肽嵌合抗原可能拥有强的寡聚体构象表位和弱的序列表位，用作疫苗能够产生与Aβ可溶性寡聚体具有高亲和力的抗体，提示其免疫反应特性可能有良好的免疫治疗效果。因此，开发的AD疫苗使其能产生与Aβ可溶性寡聚体具有高亲和力的抗体并将寡聚体清除，可能拥有很重要的意义。 

实施例7重组多肽嵌合抗原亚单位疫苗免疫APP转基因AD模型小鼠后的学习记忆能力观察 

对重组多肽嵌合抗原亚单位疫苗免疫的APP转基因AD模型小鼠于最后一次加强免疫后6个月(即13个月龄)进行行为学改变的观察，采用Morris水迷宫方法。实验可分为隐藏平台获得实验和空间搜索实验两步。隐藏平台获得实验用于测量动物在水迷宫中的学习和记忆能力，实验历时3天。以非转基因C57BL/6小鼠为阳性对照(正常小鼠)，未免疫或PBS免疫的转基因模型小鼠为阴性对照(AD模型小鼠)。其评价方法为：对每 只小鼠分别从四个象限入水点放入，记录动物寻找并爬上平台所需时间即逃避潜伏期，计算每天各组4次逃避潜伏期的平均值。Morris水迷宫中的潜伏期是采用重复测量的数据取平均值评价。空间搜索实验用于测量动物对平台空间位置准确记忆，即记忆保持能力。隐藏平台获得实验后第4天撤除平台，将动物从任一入水点放人水中，评价动物在目标象限和其他各象限的游泳时间和穿越原平台位置次数等指标。如图10，各组小鼠在Morris水迷宫的学习和记忆能力结果(注：隐藏平台获得实验训练时间为三天，然后第四天进行空间搜索实验)表明，随着时间延长，除阴性对照(AD模型小鼠)外，其他各组动物的潜伏期时间相继缩短；到第三天时有明显的差异，第四天时还具有一定的记忆能力，其潜伏期低于第一天的时间。但是阴性对照(AD模型小鼠)组一直无明显变化，表明其无学习和记忆能力。因此，总体上我们的实验结果表明，重组多肽嵌合抗原亚单位疫苗免疫后，APP转基因AD模型小鼠的学习记忆能力得到了明显的改善，提示疫苗达到了免疫预防AD病症的效果。 

实施例8免疫组化分析重组多肽嵌合抗原亚单位疫苗免疫APP转基因AD模型小鼠后脑组织中Aβ含量的变化 

在完成以上AD模型动物行为学指标的观察后，然后对重组多肽嵌合抗原亚单位疫苗免疫的APP转基因AD模型小鼠于最后一次加强免疫后6个月(即13个月龄)进行病理组织切片及免疫组织化学染色。检测方法：开颅取脑后固定、脱水等过程后，进行冠状冷冻切片。切片PBS冲洗，经过溶于PBST进行过氧化反应，封闭处理后，加入鼠源抗Aβ单克隆抗体(6E10，购自sigma)摇匀、孵育过夜。然后，在室温下加入羊抗鼠IgG二抗摇匀、孵育，室温摇匀、孵育，显色。最后，经过常规粘片、干燥、脱水、透明、封片，光学显微镜下观察并拍摄。如图11，其中图11A示6Aβ15-T疫苗免疫后模型小鼠脑组织切片，图11B示6Aβ15-T-AHc-C疫苗免疫后模型小鼠脑组织切片，图11C示6Aβ15-T-THc-C疫苗免疫后模型小鼠脑组织切片，图11D示佐剂阴性对照(无抗原)免疫后模型小鼠脑组织，图11E示模型小鼠脑组织和图11F示母本C57BL/6小鼠脑组织；图11中结果表明，阳性对照(APP转基因AD模型小鼠或未进行重组多肽嵌合抗原亚单位疫苗免疫的APP转基因AD模型小鼠)脑组织(图D和E)中有明显的淀粉样斑块存在，而重组多肽嵌合抗原亚单位疫苗免疫的APP转基因AD模型小鼠脑组织(图A-C)中的淀粉样斑块则明显相对少和小或无，并且阴性对照组(非转基因AD模型小鼠即母本C57BL/6小鼠)脑组织(图11F)中无淀粉样斑块存在。因此，以上实验结果说明，重组多肽嵌合抗原亚单位疫苗免疫后APP转基因AD模型小鼠脑组织中的淀粉样斑块或Aβ含量明显减少，提示疫苗免疫后抗体能够清除/中和小鼠脑组织中的淀粉样斑块或Aβ含量；这个结果与行为学指标结果一起表明，疫苗免疫后达到了减少APP模型小鼠脑内淀粉样斑块和改善学习记忆能力，有望作为阿尔茨海默病的免疫预防和治疗的新型疫苗候选，具有良好的应用前景和研究价值。 

总之，我们设计和表达的重组多肽嵌合疫苗具有独特的结构和免疫反应特性，免疫后转基因AD模型小鼠后的学习记忆能力(水迷宫)都得到了明显的改善和提高，更 为重要的是，该免疫原没有引起针对Aβ42的T细胞增殖反应，其主要抗体亚型为IgG1型，说明引起的主要是Th2型免疫反应，因此以上这些结果表明有望作为阿尔茨海默病的免疫预防和治疗的新型疫苗候选，具有良好的应用前景和研究价值。 

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。 

Claims (8)

1.重组AβB细胞表位多肽嵌合抗原，其为：

6个串联的β淀粉样肽B细胞表位多肽抗原Aβ1～15，为二聚体结构；

所述多肽抗原Aβ1～15的氨基酸序列为DAEFRHDSGYEVHHQ。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原，其特征在于，所述6个串联的β淀粉样肽B细胞表位多肽抗原Aβ1～15的氨基酸序列如SEQ ID No.18所示。

3.根据权利要求1所述的嵌合抗原，其特征在于，还包括辅助性T细胞表位PADRE。

4.权利要求1～3任意一项所述的嵌合抗原的制备方法，包括先人工合成编码所述重组多肽嵌合抗原的基因，再将该基因与原核表达载体连接，通过原核表达系统获得可溶性重组多肽的表达并将该重组多肽嵌合抗原蛋白纯化。

5.编码权利要求1～3任意一项所述的嵌合抗原的基因。

6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.1～2任一所示。

7.含有权利要求6所述的基因的载体。

8.权利要求1～3任意一项所述的嵌合抗原在制备阿尔茨海默病疫苗中的应用。

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