DE69533961T2

DE69533961T2 - Trägerprotein mit adjuvant aktivität, diese enthaltende immunogene komplexe, ihre herstellung, nukleotidsequenz und impfstoff

Info

Publication number: DE69533961T2
Application number: DE69533961T
Authority: DE
Inventors: Hans Binz; Thierry Baussant; Jean-François HAEUW; Thien Nguyen Ngoc
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 1994-11-07
Filing date: 1995-11-07
Publication date: 2006-01-05
Anticipated expiration: 2015-11-08
Also published as: US7408044B2; FR2726472A1; WO1996014415A1; DK0791063T3; US6780420B1; DE69533961D1; EP0791063B1; ATE287954T1; FR2726472B1; NZ296561A; AU4119996A; ZA959416B; US20060034870A1; CA2204510A1; JPH10508595A; EP0791063A1; ES2236718T3; PT791063E; US6197929B1; AU714423B2

Description

Die Erfindung betrifft Adjuvantien, die dazu bestimmt sind, mit einem Molekül assoziiert zu werden, um dessen Aktivität zu verbessern, insbesondere um die Intensität der Immunantwort zu erhöhen. Sie betrifft gleichfalls Komplexe, die ein solches Adjuvans, welches mit einem aktiven Molekül assoziiert ist, enthalten.
Das aktive Molekül kann insbesondere ein Protein, ein Peptid, ein Polysaccharid, ein Oligosaccharid oder eine Nukleinsäure, DNA oder RNA sein.
Die Entwicklung von perfekt definierten und von ausgeprägten Nebenwirkungen freien Impfstoffen erfordert den Einsatz von Impf-Antigenen mit niedriger Molekülmasse, wie von Peptiden oder Oligosacchariden. Diese Antigene von niedriger Masse, aber auch bestimmte Antigene von höherer Molekülmasse, wie die Polysaccharide der Bakterienwand, können allein keine dauerhafte und intensive Immunantwort induzieren. Es ist unabdingbar, diese Antigene auf chemischen Wege oder durch Gentechnologie mit Trägerproteinen zu verknüpfen.
Die gegenwärtig eingesetzten Trägerproteine gehören zu zwei Arten:

– die Tetanus- und Diphtherie-Anatoxine: der zu häufige Einsatz dieser Trägerproteine birgt das Risiko in sich, einer intensiven Antwort gegen das Hapten entgegenzuwirken, und birgt das Risiko in sich, dass Immuntoxikologie-Probleme aufgeworfen werden;
– ein Membranproteinextrakt aus Neisseria meningitidis (OMPC) wird aus einem durch Lipide und LPS verunreinigten Membranprotein gebildet.

Das Patent EP-267 204 schlägt die Verwendung eines Trägermoleküls vor, welches dazu bestimmt ist, mit einem Immunogen gekoppelt zu werden, und welches in einem Membranprotein aus E. coli oder Salmonella besteht.
Das Dokument Lawrence et al. (Journal of General Microbiology, 137, 8, 1911–1921, 1992) beschreibt die partiellen Nukleotidsequenzen des Genorts, welcher das äußere Membranprotein vom Typ A (OmpA) von verschiedenen Enterobakterien-Spezies, darunter Klebsiella pneumoniae, kodiert, um zu ermöglichen, die phylogenetischen Beziehungen zwischen diesen Spezies zu ermitteln.
Die Anmelderin hat gezeigt, dass ein aus der äußeren Membran von Klebsiella pneumoniae extrahiertes Protein es erlaubt, die Immunantwort auf ein Antigen oder ein Hapten beträchtlich zu verbessern, wenn dieses zu der gleichen Zeit wie jenes an einen Wirt verabreicht wird. Spezieller kann ein OmpA-Protein, das Protein P40 von K. pneumoniae, als Adjuvans in immunogenen Komplexen, wo es mit einem immunogenen Element assoziiert ist, eingesetzt werden.
Die aus einer Kopplung von Peptiden mit P40 hervorgehenden chemischen Konjugate liefern gute Ergebnisse und eine Auswertung der Immunantwort zeigt Antikörper-Antworten gegen diese Peptide, die stärker sind als jene, die bei Verwendung der Referenz-Trägerproteine KLH oder TT beobachtet werden.
Gleichwohl werden die Peptidantigene bevorzugt auf den C-terminalen Abschnitt der Sequenz, den am stärksten immunogenen Teil des Moleküls, aufgepfropft (Puohiniemi, R., et al., 1990, Infect. Immu. 58, 1691–1696. Dies kann ein ernsthaftes Problem für die Fusionsproteine, die die vollständige Sequenz von P40 enthalten, aufwerfen. So wird die Verwendung eines Fragments der Sequenz, das die Adjuvansaktivität unterstützt, die Immunogenität des Trägerproteins und die mit dieser Immunogenität verbundenen Risiken besser minimieren.
Aus diesem Grund hat die Erfindung einen immunogenen Komplex des Typs, welcher ein immunogenes Element umfasst, welches mit einem Adjuvans, welches die Intensität der Immunantwort erhöht, assoziiert ist, zum Gegenstand, welcher dadurch gekennzeichnet ist, dass das immunogene Element ein Antigen oder ein Hapten ist und dass das Adjuvans wenigstens einen Teil des Proteins P40 von Klebsielle pneumoniae umfasst, wobei der Teil aus der Sequenz zwischen den Aminosäuren 1 bis 179, 108 bis 179 oder 127 bis 179 eingeschlossen der Sequenz SEQ ID Nr. 2 besteht.
Die Erfindung beschreibt insbesondere ein Adjuvans, das aus einem Protein oder Peptid gebildet wird, das die Sequenz von P40, welche im Wesentlichen frei von den immunogenen Abschnitten ist, aufweist.
Diese Fragmente von P40 des erfindungsgemäßen Adjuvans sind insbesondere:

– die Sequenz von P40, der der C-terminale periplasmatische immunogene Abschnitt fehlt,
– eine Sequenz, welche die 3. und 4. außerhalb der Membran befindliche Schleife, welche eine innerhalb der Membran liegende Sequenz flankieren, enthält,
– eine Sequenz, welche eine unveränderliche, außerhalb der Membran befindliche Schleife und die angrenzende innerhalb der Membran liegende Sequenz enthält.

Man definiert als unveränderliche, außerhalb der Membran befindliche Schleifen die Sequenzen von P40, die zu den Sequenzen der Schleifen, die zwischen verschiedenen Enterobakterien-Spezies konserviert sind, homolog sind. Die Sequenzen der während der Evolution nicht konservierten, außerhalb der Membran befindlichen Schleifen werden als variable Schleifen bezeichnet. Die Lokalisierung der außerhalb der Membran befindlichen Schleifen erfolgt nach dem Modell von VOGEL und JAHNIG (1986, J. Mol. Biol., 190: 191–199), betreffend OmpA von E. coli.
Die Wahl der Fragmente und insbesondere die dritte Sequenz (Aminosäuren 127 bis 179 eingeschlossen) gründet auf der Hypothese, gemäß welcher die unveränderlichen, außerhalb der Membran befindlichen Schleifen (die zwischen den OmpA der verschiedenen Enterobakterien konserviert sind) Sequenzen enthalten, die durch immunkompetente Zellen erkannt werden, wobei diese Letzteren Rezeptoren aufweisen können, die diese Sequenzen erkennen.
Die spezifische Erkennung dieser Sequenzen durch Antigenpräsentierende Zellen wird erlauben, Antigene zielgerichtet in Richtung dieser Zellen zu dirigieren und so eine Adjuvans-Wirkung zu induzieren.
Aus diesem Grund besteht einer der Gegenstände der Erfindung in einem Adjuvans-Erzeugnis, welches aus der Sequenz zwischen den Aminosäuren 1 bis 179 eingeschlossen des Proteins P40 von K. pneumoniae oder einer Sequenz, welche wenigstens 80% Homologie und vorzugsweise wenigstens 90% Homologie zu der Sequenz zwischen den Aminosäuren mit den Nummern 1 und 179 eingeschlossen der Sequenz des Proteins P40 von K. pneumoniae mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist, besteht.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist ein Adjuvans, welches aus der Sequenz zwischen den Aminosäuren 108 bis 179 eingeschlossen des Proteins P40 von K. pneumoniae oder einer Sequenz, welche wenigstens 80% Homologie und vorzugsweise wenigstens 90% Homologie zu der Sequenz zwischen den Aminosäuren mit den Nummern 108 und 179 eingeschlossen des Proteins P40 von K. pneumoniae mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist, besteht.
Gemäß einem anderen Aspekt hat die Erfindung ein Adjuvans zum Gegenstand, welches aus der Sequenz zwischen den Aminosäuren 127 bis 179 eingeschlossen des Proteins P40 von K. pneumoniae oder einer Sequenz, welche wenigstens 80% Homologie und vorzugsweise wenigstens 90% Homologie zu der Sequenz zwischen den Aminosäuren mit den Nummern 127 und 179 eingeschlossen des Proteins P40 von K. pneumoniae mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist, besteht.
Die Sequenzen ID Nr. 2, ID Nr. 4, ID Nr. 6 und ID Nr. 8 entsprechen Adjuvantien gemäß der Erfindung. Dieses Adjuvans-Protein und diese Adjuvans-Peptide können insbesondere ausgehend von Mem branen von Bakterien der Gattung Klebsiella pneumoniae hergestellt werden. Das Verfahren umfasst dann die folgenden Schritte:

a) Ausfällung der Lipopolysaccharide durch Zugabe von Detergens und eines Salzes eines zweiwertigen Kations und Gewinnung des Überstands,
b) Ausfällung der Proteine des Überstands und Resuspendierung des Bodensatzes,
c) Chromatographie der Suspension mittels eines Anionenaustauschers und Gewinnung der Fraktionen, welche das Adjuvans-Erzeugnis enthalten,
d) Chromatographie mittels eines Kationenaustauschers und Gewinnung der Fraktion, welche das Adjuvans-Erzeugnis enthält,
e) Aufkonzentrierung der am Ende von Schritt d) erhaltenen Fraktion, um ein Adjuvans-Erzeugnis in Form von Protein oder Peptid, welches im Wesentlichen frei von Lipopolysacchariden ist, zu gewinnen.

Zwischen die Schritte b) und c) bzw. die Schritte c) und d) können vorteilhafterweise Dialyseschritte zwischengeschaltet werden.
Die Erfindung hat gleichfalls die immunogenen Komplexe, die ausgehend von den verschiedenen Adjuvantien erhalten werden können, zum Gegenstand.
Das Adjuvans kann mit dem immunogenen Element durch chemische Kopplung assoziiert werden.
Diese kovalente Kopplung des peptidischen Haptens mit dem Adjuvans kann auf eine in diesem Fachgebiet wohlbekannte Weise ausgeführt werden. Zu diesem Zweck geeignete Reagenzien umfassen insbesondere die Ester von N-Succinimid, die Carbodiimide, EEDQ (N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin) und ähnliche Reagenzien.
Man kann das fragliche Fragment des Proteins P40 und das immunogene Element gleichfalls durch Gentechnologie fusionieren.
Das aus dem Fragment des Proteins 40 und dem immunogenen Element erhaltene Fusionsprotein kann gleichfalls durch Gentechnologie mit einem Protein fusioniert werden, das ein Rezeptor für ein Serumprotein, insbesondere für humanes Serumalbumin, ist.
Das immunogene Element, ein Antigen oder Hapten, kann insbesondere von einem Virus stammen; man kann die Proteine des RSV (Respiratory-Syncytial-Virus) oder deren Fragmente, beispielsweise das Protein G des RSV, oder das Hepatitis B-Antigen aufführen.
In dem Falle des Proteins G des RSV kann man das gesamte Protein oder dessen Fragmente, die gegebenenfalls durch Punktmutation oder Deletion modifiziert worden sind, einsetzen.
Die Anmelderin hat gezeigt, dass die Verabreichung eines an ein Fragment des Proteins P40 gekoppelten Haptens gemäß der Erfindung eine substantielle Erhöhung der Immunantwort mit sich bringen wird, wobei die Risiken von Reaktionen gegen das Adjuvans selbst begrenzt werden.
Ein Verfahren zur Erhöhung der Immunogenität eines Antigens oder eines Haptens, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man das Antigen oder Hapten mit einem Adjuvans, das die Gesamtheit oder einen Teil der Sequenz des Proteins P40 von Klebsiella pneumoniae umfasst, in Form eines Komplexes assoziiert, wie zuvor definiert, bildet ebenfalls einen Teil der Erfindung.
Die Erfindung hat folglich gleichfalls einen Impfstoff zum Gegenstand, welcher dadurch gekennzeichnet ist, dass er ein immunogenes Element enthält, welches mit einem Fragment des Proteins P40 assoziiert ist, welches durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden kann.
Sie umfasst gleichfalls pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen zwischen einem Adjuvans und einem immunogenen Element gebildeten Komplex, wie zuvor definiert, und pharmazeutisch an nehmbare Trägersubstanzen, die für dessen Verabreichung auf parenteralem und/oder oralem Wege angepasst sind, enthalten.
Die folgenden Beispiele sind dazu bestimmt, die Erfindung zu veranschaulichen, ohne deren Umfang in irgendeiner Weise zu beschränken.
In diesen Beispielen wird Bezug genommen auf die folgenden Figuren:
1: Klonierungsstrategie durch Genamplifizierung von P40.
2: Klonierung von P40 in pVABBG2ΔC.
3: Auswahl der verschiedenen Fragmente von P40
4: Klonierung von ΔP40G2ΔC in pVABB.
5: Anti-Peptid-G1ΔC-Antikörperantwort nach Immunisierungen mit verschiedenen Konzentrationen von P40ext-G1ΔC.
6: Anti-Peptid-G1ΔC-Antikörperantwort, die mit verschiedenen Immunisierungsschemata erhalten wurde.
Beispiel 1: Isolierung und Reinigung des Proteins P40.
Material und Methoden
Die Biomasse von Klebsiella pneumoniae (Stamm 1–145, 40 g trockene Zellen) wird mit Hilfe von reiner Essigsäure auf pH 2,5 eingestellt.
Nach Zugabe von ½ Volumen einer 6% Cetrimid, 60% Ethanol, 1,5 M CaCl₂ enthaltenden Lösung, deren pH mit Essigsäure auf pH 2,5 eingestellt ist, wird die Mischung 16 h bei Umgebungstemperatur bewegt.
Nach 20-minütiger Zentrifugation bei 15000 g bei 4°C werden die Proteine des Überstands mit Ethanol ausgefällt. Es werden zwei aufeinanderfolgende Ausfällungen mit zwischengeschalteter Zentrifugation (10 min, 10000 g, 4°C) ausgeführt: von 20 bis 50%, dann 50 bis 80%.
Die nach der zweiten Ausfällung erhaltenen Bodensätze werden in einer 1%-igen Lösung von Zwittergent 3–14 resuspendiert.
Nach vierstündiger Bewegung bei Umgebungstemperatur wird der pH mit Hilfe von 1 N NaOH auf 6,5 eingestellt.
Eine Zentrifugation der Mischung während 20 min bei 10000 g bei 4°C erlaubt es, eine an Membranproteinen angereicherte Fraktion (MP-Fraktion) zu erhalten.
Die Proteine der MP-Fraktion werden gegen einen 20 mM Tris/HCl-Puffer, pH 8,0, 0,1% Zwittergent 3–14 dialysiert. Das Dialysat wird auf eine mit dem oben beschriebenen Puffer äquilibrierte Säule aufgeladen, welche einen Träger vom Typ starker Anionenaustauscher enthält (Säule mit ∅ = 50 mm × H = 250 mm, Gel Biorad Macroprep High Q). Das Protein P40 wird bei einer NaCl-Konzentration von 50 mM in dem Äquilibrierungspuffer eluiert.
Die das P40 enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und gegen einen 20 mM Citratpuffer, pH 3,0, 0,1% Zwittergent 3–14 dialysiert. Das Dialysat wird auf eine mit dem 20 mM Citratpuffer, pH 3,0, 0,1% Zwittergent 3–14 äquilibrierte Säule aufgeladen, welche einen Träger vom Typ starker Kationenaustauscher enthält (Abmessungen der Säule: ∅ = 25 mm × H = 160 mm, Gel Biorad Macroprep High S). Das Protein P40 wird bei einer NaCl-Konzentration von 0,7 M eluiert. Die das P40 enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und durch Ultrafiltration mit Hilfe eines Minitan Millipore-Tangentialfluss-Filtrationssystems, welches mit Membranplatten, die einen Ausschlussschwellenwert von 10 kDa aufweisen, verwendet wird, aufkonzentriert.
Ergebnisse
Die nach jedem Chromatographieschritt erhaltenen Fraktionen werden durch SDS-PAGE analysiert, um jene zu vereinigen, die das Protein P40 enthalten.
Die Mengen von Proteinen werden durch die Lowry-Methode gemessen (Tabelle 1).
Tabelle 1: Rekapitulationstabelle der Mengen von Protein und LPS der bei den verschiedenen Schritten des Verfahrens zur Reinigung des Proteins P40 erhaltenen Fraktionen (n.b. = nicht bestimmt).
Die Reinheit und die Homogenität des Proteins P40 werden anhand von SDS-PAGE abgeschätzt.
Nach dem Kationenaustauschchromatographieschritt ist das Protein P40 frei von der in der MP-Fraktion vorhandenen Hauptverunreinigung (dem Protein, welches eine apparente Molekülmasse von 18 kDa aufweist) und weist einen Reinheitsgrad über 95% auf. Andererseits erlaubt dieser Reinigungsschritt die Entfernung der Lipopolysaccharide. Diesen Reinigungsschritt gibt es in dem zuvor präsentierten Reinigungsverfahren nicht.
Das elektrophoretische Profil des P40 enthüllt mehrere Banden. Diese Banden werden nach Immunoblot durch monoklonale anti-P40-Antikörper, die aus der Maus erhalten werden, erkannt. Die obere Hauptbande entspricht dem denaturierten Protein (durch Behandlung bei 100°C, 15 min, in Gegenwart von SDS), und die untere, geringfügigere Bande dem Protein in seiner nativen Form.
P40 ist tatsächlich ein sogenanntes Wärme-modifizierbares („heat-modifiable") Protein und diese Eigenschaft wurde mit Hilfe einer Erwärmungskinetik bei 100°C in Gegenwart von SDS verifiziert. Ohne Erwärmung weist das Protein in seiner nativen Form eine β-Faltblattstruktur auf, die mehr SDS bindet und folglich weiter in Richtung der Anode wandert als die denaturierte Form (vollständige Denaturierung nach 5 min bei 100°C), welche eine α-Helix-Struktur aufweist (KELLER, K. B., 1978, J. Bacteriol., 134, 1181–1183).
Die Verunreinigung durch die Lipopolysaccharide (LPS) wird anhand einer quantitativen Bestimmung von β-Hydroxymyristinsäure, der Marker-Fettsäure der LPS von Klebsiella pneumoniae, durch Gasphasenchromatographie abgeschätzt (Tabelle 1).
Diese Methode kann lediglich dazu verwendet werden, den Gehalt an LPS der aus den verschiedenen Reinigungsschritten stammenden Proben näherungsweise abzuschätzen.
Da die in der P40-Fraktion nach der Kationenaustauschchromatographie vorhandene Menge von β-Hydroxymyristinsäure unter dem Quantifizierungsschwellenwert der quantitativen Bestimmung liegt, kann man abschätzen, dass die restliche LPS-Menge unter 1% liegt.
Beispiel 2: Klonierung und Expression des Proteins P40
72% der Sequenz des OmpA-Gens von Klebsiella pneumoniae sind von LAWRENCE et al., 1991, J. Gen. Microbiol., 137: 1911–1921) veröffentlicht worden.

Die Eigentümlichkeit unserer Arbeiten liegt in der Bestimmung der Gesamtheit der Sequenz, nämlich von jener, die den 83 N-terminalen Aminosäuren und den 11 C-terminalen Aminosäuren (bei einer Gesamtzahl von 335 Aminosäuren) entspricht. Material und Methode Bakterienstämme

– E. coli:	RV 308: Stamm ATCC 31608 (Maurer, R., et al., 1980, J. Mol. Biol., 139, 147–161)
– K. pneumoniae:	IP 145: Stamm C. I. B. P. F.-Erfindungspatent, eingereicht am 19. Januar 1981.

Vektoren

– pRIT 28 (Hultman, T., et al., 1988, Nucleosides Nucleotides, 7: 629–638): Klonierungs- und Sequenzierungsvektor, welcher das Ampicillinresistenzgen, die Replikationsstartpunkte von E. coli und des Phagen F1 sowie einen Abschnitt des lac-Z-Gens von E. coli (p-Galactosidase) aufweist.
– pVABB: Genfusions-Expressionsvektor

Lösungen
– Genamplifizierung

Lysepuffer: 25 mM Taps, pH 9,3 2 mM MgC 1₂

Amplifizierungspuffer: 25 mM Taps, pH 9,3
2 mM MgC 1₂
0,1% Tween 20
200 mM dNTP
– Reinigung der Proteine
Synthese der Oligonukleotide
Die Nukleotidprimer wurden ausgehend von dem Abschnitt der veröffentlichten Sequenz von OMPA von Klebsiella pneumoniae (Lawrence, J. G., et al., 1991, J. Gen. Microbiol., 137: 1911–1921), ausgehend von der Consensus-Sequenz, die aus dem Alignment der Sequenzen von 5 OMPA von Enterobakterien (E. coli, S. typhimurium, S. marcescens, S. dysenteriae, E. aeroginosae) hervorgeht, sowie ausgehend von durch manuelle Sequenzierung erhaltenen Sequenzen von Peptiden bestimmt.
Die Oligonukleotide wurden gemäß der chemischen Phosphoramidit-Methode an dem „Gene Assembler Plus"-Apparat von Pharmacia synthetisiert.
Genamplifizierung des Gens P40 durch PCR
Die DNA von OMPA von Klebsiella pneumoniae wurde auf die folgende Weise amplifiziert.
Eine Kolonie von Klebsiella pneumoniae wird in 10 μl Lysepuffer durch Erwärmen auf 95°C während 5 min lysiert.
1 μl dieser Lösung dient als DNA-Quelle für die Amplifizierungsreaktionen.
Diese werden in 100 μl Amplifizierungspuffer mit 5 pmol von jedem Primer und einer Einheit Taq-Polymerase-Enzym (Perkin Elmer Cetus) ausgeführt. Jeder Zyklus umfasst einen Denaturierungsschritt von 30 s bei 95°C, gefolgt von einer Hybridisierung des Primers mit der DNA und einer Verlängerung von einer Minute bei 72°C. Auf diese Weise werden 30 Zyklen mit Hilfe eines „Gen Amp PCR" 9000-Thermocyclers von Perkin Elmer Cetus ausgeführt.
Die folgenden PCRs werden ausgehend von zuvor amplifizierten DNA-Fragmenten ausgeführt.
Die amplifizierten DNA-Fragmente werden dann verdaut und mit dem Vektor pRIT 28 verknüpft.
Sequenzierung
Die so klonierten Fragmente werden an einem automatischen 373 DNA Sequencer-Sequenziergerät von Applied Biosystems sequenziert. Die Sequenzierungsreaktionen erfolgen mit Hilfe des Kits „dye Terminator" gemäß den Empfehlungen des Lieferanten (Applied Biosystems) entweder an der nach der Genamplifizierung erhaltenen oder aus einer Maxipräp hervorgehenden doppelsträngigen DNA oder an der einzelsträngigen DNA, die von denaturierten PCR-Fragmenten stammt (Hultman, T., et al. 1989, Nucleic Acids Rev. 17: 4937–4946).
Expression des Proteins
Das vollständige P40-Gen wird in den Expressionsvektor pVABB kloniert. Dieser Vektor erlaubt, einen „BB"-Affinitätsschwanz an P40 anzufügen, wobei B der Abschnitt des Streptokokken-Proteins G ist, der Serumalbumin bindet (Nygren, P. A., et al., 1988, J. Mol. Recognit. 1, 69–74).
Die E. coli-Stämme RV308, die durch den Vektor pVABBP40 transformiert worden sind, werden eine Nacht bei 37°C unter Bewegung in 100 ml TSB, ergänzt mit Hefeextrakt, mit Ampicillin (200 μg/ml), mit Tetracyclin (8 μg/ml) und mit Tryptophan (100 μg/ml), kultiviert. Am folgenden Tag wird eine Kultur mit OD = 1 bei einer Wellenlänge von 580 nm in TSB + Hefeextrakte + ampi + tetra hergestellt.
Nach 10 min Kultivierung wird die Expression des Proteins durch Zugabe von IAA in einer Konzentration von (25 μg/ml) zu dem Medium induziert. Die Kultur wird bei 4°C bei 2460 g während 10 min zentrifugiert.
Der Bodensatz wird in 20 ml TST 1 × pH 7,4 aufgenommen und die Lösung wird dann bei 4°C bei 23000 g 30 min zentrifugiert.
Der Überstand wird über HSA Sepharose geleitet, was es erlaubt, die sogenannten löslichen Proteine zu isolieren. Der Bodensatz wird mit Waschpuffer gewaschen, dann bei 23000 g bei 4°C 30 min zentrifugiert. Der die Einschlusskörper enthaltende Bodensatz wird dann in 900 μl einer Denaturierungslösung + 100 μl 10 mM Dithiothreitol wieder aufgenommen und 2 h bei 37°C inkubiert.
Die Lösung wird dann 1 Nacht bei Umgebungstemperatur unter Bewegung in 100 ml Renaturierungspuffer inkubiert, dann bei 23000 g bei 4°C 30 min zentrifugiert.
Der Überstand wird über HSR Sepharose geleitet.
In den beiden Fällen werden die gebundenen Proteine mit 0,5 M Essigsäure, pH 2,8, eluiert und in Fraktionen von 1 ml gesammelt.
Die gesammelten Fraktionen werden dann auf einem SDS-PAGE-Elektrophoresegel und durch Immunoblot analysiert.
Ergebnisse
Die Klonierung des Gens erfolgte auf drei Mal gemäß der in der 1 aufgeführten Strategie.
Zunächst haben wir den Abschnitt der veröffentlichten Sequenz mit Ausnahme eines T anstelle eines A an Position 103 bestätigt.
Dann haben wir die 3'-Sequenz des Gens und schließlich jene 5' bestimmt.
Das vollständige Gen wurde durch Fusion der beiden Abschnitte 8/4 und 3/14 erhalten, dann in den Vektor pRIT 28 kloniert. Die Sequenz ist die Sequenz ID Nr. 1.
Das Protein wird in der BBP40-Form exprimiert.
Es wird im Wesentlichen ausgehend von Einschlusskörpern erhalten. Bei einer Kultur von 200 ml reinigt man ungefähr 15 Milligramm Protein.
Das Elektrophoreseprofil zeigt, dass nach Denaturierung erhaltenes BBP40 eine große Reinheit aufweist. Das apparente Molekulargewicht entspricht dem theoretischen berechneten Gewicht, welches 63 kDa beträgt.
Die Charakterisierung mittels Immunoblot zeigt, dass das gereinigte Protein durch ein anti-P40-Kaninchen-Serum gut erkannt wird.
Beispiel 3: Fusionsprotein BBP40G2ΔC, Untergruppe a
Es wurde ein dem N-terminalen Abschnitt, bei welchem das Stop-Codon des Gens deletiert ist, entsprechendes Oligonukleotid synthetisiert.
Der 5'-Abschnitt wurde durch PCR amplifiziert, gereinigt, in den Vektor pRIT 28 kloniert und sequenziert gemäß der in Beispiel 2 beschriebenen Methodik.
Als Zweites wurden die beiden Abschnitte des Gens fusioniert und in den Vektor pVABBG2ΔC kloniert (Figur Nr. 2). G2ΔC repräsentiert die Sequenz eines 101 Aminosäuren enthaltenden Fragments des Proteins G des Respiratory-Syncytial-Virus G (130–230).
Dann werden E. coli-Bakterien des Stamms RV308 mit dem Vektor PVABBG2ΔC transformiert.
Die produzierten Proteine werden gereinigt, wie bereits für BBP40 beschrieben.
Ergebnisse
Das Protein BBP40G2ΔC wird im Wesentlichen ausgehend von Einschlusskörpern erhalten. Man reinigt ungefähr zwölf mg Proteine ausgehend von 200 ml Kulturmedium.
Anhand von Elektrophorese ist das Protein ausreichend rein.
Die apparente Molekülmasse entspricht der berechneten theoretischen Masse, die 75 kDa beträgt.
Beispiel 4: Klonierung und Expression von drei P40-Fragmenten.
Material und Methoden
Die Oligonukleotide
Es wurden drei zu der P40-Sequenz komplementäre Oligonukleotide synthetisiert: 16-17-18 (siehe 3).
Bestimmte Abschnitte des Gens wurden dann mittels PCR ausgehend von der DNA eines Minipräp (Protokoll Applied) von pRIT 28 P40 amplifiziert.
So konnte der Abschnitt des Gens, welcher der Gesamtheit des Transmembrananteils (8/17, als Nr. 8 bezeichnetes Fragment), zwei äußeren Schleifen-zwei Transmembranabschnitten (16/17, als Nr. 16 bezeichnetes Fragment) und 1 äußeren Schleife-zwei Transmembranabschnitten (18/17, als Nr. 18 bezeichnetes Fragment) entspricht, kloniert werden.
Die so amplifizierten DNA-Fragmente werden verdaut, dann isoliert und mit dem Vektor pRIT 28 ligiert und sequenziert (siehe BBP40-Klonierung von P40).
Das Fusionsprotein BBΔP40G2ΔC
Das Gen G2ΔC wird ausgehend von dem Vektor pRIT 28 G2ΔC verdaut, dann mit dem verdauten Vektor pRIT 28 ΔP40 (ΔP40 repräsentiert eines der Fragmente von P40) ligiert.
Dann wird die Gesamtheit ΔP40G2ΔC verdaut und in pVABB kloniert (siehe 4).
Die drei hybriden Proteine werden gemäß dem für BBP40 beschriebenen Protokoll exprimiert.
Ergebnisse
Genau wie BBP40 und BBP40G2ΔC wird BB8G2ΔC im Wesentlichen ausgehend von Einschlusskörpern erhalten. Eine Kultur von 900 ml liefert etwa zehn mg Proteine.
Im Gegensatz dazu finden sich die Proteine BB18G2ΔC und BB16G2ΔC hauptsächlich im Beschallungsschritt in löslicher Form. In den beiden Fällen erhält man ungefähr 10 mg/400 Kultur.
Diese Proteine wurden mittels SDS-PAGE-Elektrophorese charakterisiert. Ihre Molekülmasse entspricht der berechneten theoretischen Masse:

BB8G2ΔC 58,03 kDa

BB16G2ΔC 46,5 kDa

BB18G2ΔC 45,5 kDa
Die drei Hybride werden im Rahmen eines Western-Blot ebenso durch einen polyklonalen anti-G2-Antikörper wie durch einen anti-P40-Antikörper erkannt.
Beispiel 5
1. Wirkungen des Proteins P40 auf Zellen des Immunsystems
1.a. B-Lymphozyten
Man injiziert BALB/c-Mäusen (5 pro Gruppe) an den Tagen 0 und 21 subkutan 30 μg P40, erhalten durch Extraktion der Membran (P40 ext) oder durch genetische Rekombination (P40 rec, d.h. BBP40). Die Immunisierungen erfolgten ohne irgendwelches Adjuvans. 10 Tage nach der letzten Immunisierung wurde die anti-P40ext-Antikörper-Antwort an den individuellen Seren durch die ELISA-Methode ausgewertet. Die Tabelle 2 liefert den Mittelwert der bei 5 Proben erhaltenen Titer. Die Negativkontrollen enthalten keinen anti-P40ext-Antikörper.
Tabelle 2: anti-P40ext-Antikörperantwort
Unter diesen experimentellen Bedingungen ist P40rec ebenso immunogen wie P40ext. Diese beiden Proteine enthalten folglich B-Epitope, die mit den B-Lymphozyten interagieren.
1.b. T-Lymphozyten
Die verzögerte Überempfindlichkeitsreaktion (HSR) auf P40ext wurde durch den Test des unterschiedlichen Anschwellens des Sohlenballens gemessen. BALB/c-Mäuse (5 pro Gruppe) wurden auf subkutanem Wege mit 100 μg P40ext ohne jegliches Adjuvans sensibilisiert. Nach 6 bis 10 Tagen wurden die Mäuse auf subkutanem Wege mit 100 μg P40ext/20 μl in den rechten hinteren Sohlenballen stimuliert, wohingegen der linke hintere Sohlenballen PBS erhielt. 24 h später wurde das Anschwellen des Sohlenballens gemessen. Man beobachtet keine verzögerte Überempfindlichkeit bei der Negativkontrolle (5 nicht-sensibilisierte Mäuse).
Tabelle 3: Durch P40ext induzierte verzögerte Überempfindlichkeitsreaktion, gemessen durch Anschwellen des Sohlenballens (in mm)
Die in der Tabelle 3 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die mit P40ext immunisierten Mäuse hochquantitative verzögerte Überempfindlichkeitsreaktionen im Sohlenballen erzeugen. Die HSR-Reaktion spiegelt die zellvermittelte Immunantwort, welche Th1-Zellen erfordert, wieder. Man kann daraus schließen, dass P40 ext wenigstens ein T-Epitop enthält, welches in der Lage ist, die Th1-Antwort zu begünstigen, ohne MHC-Restriktion.
1.3. Makrophagen
Die Wirkung von P40ext auf Makrophagen wurde anhand von deren Nitrit-Produktion bestimmt. RAW 264,7-Zellen, die Monozyten-Makrophagen aus der Maus sind, wurden 72 h bei 37°C in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von P40ext inkubiert. Die Menge von Nitriten im Überstand der Zellkulturen wurde durch eine kolorimetrische quantitative Bestimmung mit dem Griess-Ilosvay-Reagens gemessen.
Die Nitrit-Produktion spiegelt die Aktivierung der Makrophagen wieder und spielt eine entscheidende Rolle bei der antimikrobiellen Aktivität und Antitumor-Aktivität dieser Zellen. Die erhaltenen Daten zeigen, dass P40ext die Produktion von Nitrit der RAW 264,7-Zellen stimuliert, wodurch gezeigt wird, dass P40ext die Makrophagen aktiviert.
2. P40 ist ein Träger mit Adjuvans-Wirkung für ein Peptid (G1ΔC)
2.1. Vergleich von P40ext mit anderen Trägern
Das eingesetzte Peptid ist G1ΔC, ein Peptid, das ausgehend von dem Protein G des RSV erhalten wird: (G174–187 ΔC) Trudel et al., 1991, J. Virol. 185: 749–757.
Kinetik der Immunantwort gegen G1 ΔC
C57B1/6-Mäuse (5 pro Gruppe) werden mit G1 ΔC in verschiedenen Formen gemäß einem identischen Immunisierungsschema immunisiert. Die durch die verschiedenen Formen von G1 ΔC induzierten Antikörperantworten werden zu den Zeitpunkten: 7, 17, 28, 35, 42 Tage nach dem Beginn des Experiments verglichen.
Die anti-G1 ΔC-Antwort ist signifikant höher und schneller, wenn die Mäuse mit P40/G1 ΔC immunisiert werden, als bei den klassischeren TT/G1 ΔC- und KLH/G1 ΔC + FA-Immunisierungen. Eine einzige Injektion von P40/G1 ΔC erlaubt es, in 7 Tagen einen anti-G1 ΔC-Antikörpertiter von 1000 zu erhalten. Dieser Titer wird mit TT/G1 ΔC + FA in 28 Tagen erhalten. Die maximale Antwort (Titer = 1/380000), welche nach drei Injektionen in 28 Tagen erhalten wird, ist ungefähr 30-mal höher als jene, die mit KLH/G1 ΔC + FA erhalten wird, und 70-mal höher als jene, die mit TT/G1 ΔC erhalten wird. Der anti-G1-Antikörpertiter bleibt bis zum Tag 42 bestehen, ohne schwächer zu werden.
Schlussfolgerung
Die chemische Kopplung des Peptids G1 ΔC an das Protein P40 hat erlaubt, eine ebenso bedeutende anti-G1 ΔC-Antwort zu induzieren wie die Referenzmodelle KLH/G1 ΔC + FA oder TT/G1 ΔC.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass P40ext ein Trägermolekül mit Adjuvans-Wirkung für G1ΔC ist: P40ext ist besser als das Tetanustoxin und ebenso gut wie die Kombination aus KLH + Freund-Adjuvans.
2.1. Isotypenverteilung der anti-Peptid-G1 ΔC-Antikörper
Die Isotypen der während der oben beschriebenen Experimente erhaltenen Seren wurden durch ELISA bestimmt. Die Tabelle 4 gibt den Mittelwert der A450-Werte von 5 individuellen Seren, die in einer Verdünnung von 1/250 getestet wurden, an.
Tabelle 4: Isotypenverteilung der anti-Peptid- G1ΔC-Antikörper
Es wurde gezeigt, dass die Antikörper-Isotyp-Sekretion durch Untergruppen von Th-Zellen, die für ein Antigen spezifisch sind, reguliert wird, die in zwei Untergruppen Th1 und Th2 unterteilt werden können. Die Th1-Klone produzieren IL-2 und IFN-gamma und Lymphotoxine, wohingegen die Th2-Klone IL-4 und IL-5 produzieren. Die Th1- und Th2-Klone induzieren spezifisch die Sekretion von IgG2a + IgG3 bzw. von Ige1 + IgG2b + IgE durch die für ein Antigen spezifischen B-Zellen.
Die in der Tabelle 4 angegebenen Daten zeigen, dass IgG1 und IgG2b die beiden Hauptisotypen der anti-G1ΔC-Antikörper sind, wobei IgG2a gleichfalls repräsentiert ist. Man kann daraus schließen, dass bei den C57B1/6-Mäusen P40-G1ΔC eine Th2-Antwort, die stärker als die Th1-Antwort ist, hervorruft.
2.2. Dosis-Wirkungs-Untersuchung
BALB/c-Mäusen (5 pro Gruppe) wurden subkutan unterschiedliche Konzentrationen von P40ext-G1ΔC an den Tagen 0, 10 und 21 injiziert. Eine Woche nach der letzten Immunisierung werden Blutproben abgenommen und die anti-Peptid-G1ΔC-Antikörperantwort wird an den individuellen Seren durch ELISA abgeschätzt. Es wird der Mittelwert der Titer von 5 Proben gebildet.
Die 5 zeigt das Dosis-Wirkungs-Verhältnis von P40ext-G1ΔC. Eine anti-Peptid-G1ΔC-Antikörperantwort wird mit 1 μg P40ext-G1ΔC erhalten. Die höchsten Antikörpertiter werden mit 10 bis 50 μg P40ext-G1ΔC beobachtet.
2.4. Bestimmung des optimalen Immunisierungsschemas
BALB/c-Mäusen (5 pro Gruppe) wurde subkutan P40ext-G1ΔC (äquivalent zu 10 μg G1 ΔC) an den in der 6 angegebenen Tagen injiziert. Die anti-Peptid-G1ΔC-Antikörperantwort wird an den individuellen Seren durch ELISA bestimmt. Es wurden vier Immunisierungsschemata getestet: eine Injektion, zwei Injektionen an den Tagen 0 und 14 oder an den Tagen 0 und 21 und drei Injektionen an den Tagen 0, 21 und 90. Die stärkste anti-Peptid-anti-G1ΔC-Antikörperantwort wird mit drei Injektionen erhalten.
3. P40ext ist ein wirksames Adjuvans für ein Protein-Antigen (BBG2ΔC)
BALB/c-Mäusen (5 pro Gruppe) wurde subkutan chemisch mit P40ext konjugiertes BBG2ΔC (äquivalent zu 10 μg G2ΔC) an den Tagen 0 und 21 injiziert. Zehn Tage später wird die anti-G2ΔC-Antikörperant wort in den individuellen Seren durch ELISA bestimmt. Die Mittelwerte der Titer von 5 Proben sind in der Tabelle 5 angegeben. Die Negativkontrolle enthält keinen anti-G2ΔC-Antikörper.
Tabelle 5: Adjuvans-Wirkung von P40ext bezüglich eines Protein-Antigens
BBG2ΔC ist schwach immunogen. Die Verwendung von Freund-Adjuvans erhöht den anti-G2ΔC-Antikörpertiter. Wenn BBG2ΔC auf chemischem Wege mit P40ext konjugiert wird, wird die anti-G2ΔC-Antikörperantwort ungefähr 200-fach erhöht. P40ext ist folglich ein gutes Adjuvans für ein Protein-Antigen.
4. Adjuvans-Aktivität der P40-Fragmente
BALB/c-Mäusen (5 pro Gruppe) wurden subkutan am Tag 0 die folgenden rekombinanten Proteine injiziert und diese wurden am Tag 21 mit eben diesen rekombinanten Proteinen stimuliert: das Fusionsprotein BBP40G2ΔC, das Fusionsprotein, welches das P40-Fragment Nr. 8 enthält (BB8G2ΔC), das Fusionsprotein, welches das P40-Fragment Nr. 16 enthält (BB16G2ΔC), und das Fusionsprotein, welches das P40-Fragment Nr. 18 enthält (BB18G2ΔC), (Äquivalent zu 10 μg G2ΔC).
Am Tag 31 werden die anti-G2ΔC-, anti-P40- und anti-BB-Antikörperantworten durch ELISA in den individuellen Seren bestimmt. Es wird der Mittelwert der Titer von 5 individuellen Seren gebildet. Die Negativkontrollen enthalten keinen anti-G2ΔC-Antikörper.
Tabelle 6: Adjuvans-Wirkung der rekombinanten P40-Fragmente
In diesem Experiment wird gezeigt, dass die P40-Fragmente die Eigenschaften des vollständigen Proteins beibehalten. Dies ist besonders spektakulär, wenn man die anti-BB-Antikörperantwort untersucht.
Die anti-P40-Antikörperantwort wird bei einer Verwendung der P40-Fragmente beträchtlich verringert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Adjuvans-Erzeugnis, welches dazu bestimmt ist, die Aktivität eines Moleküls während der Verabreichung an einen Wirt zu erhöhen, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens den aus der Sequenz zwischen den Aminosäuren 1 bis 179, 108 bis 179 oder 127 bis 179 eingeschlossen bestehenden Teil des Proteins P40 von Klebsiella pneumoniae mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2 umfasst.
Adjuvans-Erzeugnis nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Protein umfasst, welches die Sequenz ID Nr. 2 aufweist oder wenigstens 90% Homologie zu dieser Sequenz aufweist.
Adjuvans-Erzeugnis nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es aus der Sequenz zwischen den Aminosäuren 1 bis 179 eingeschlossen des Proteins P40 von K. pneumoniae oder einer Sequenz, welche wenigstens 90% Homologie zu der Sequenz zwischen den Aminosäuren mit den Nummern 1 und 179 eingeschlossen der Sequenz des Proteins P40 von K. pneumoniae aufweist, besteht.
Adjuvans-Erzeugnis nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es aus der Sequenz zwischen den Aminosäuren 108 bis 179 eingeschlossen des Proteins P40 von K. pneumoniae oder einer Sequenz, welche wenigstens 80% Homologie zu der Sequenz zwischen den Aminosäuren mit den Nummern 108 und 179 eingeschlossen des Proteins P40 von K. pneumoniae aufweist, besteht.
Adjuvans-Erzeugnis nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es aus der Sequenz zwischen den Aminosäuren mit den Nummern 127 bis 179 eingeschlossen des Proteins P40 von K. pneumoniae oder einer Sequenz, welche wenigstens 80% Homologie zu der Sequenz zwischen den Aminosäuren mit den Nummern 127 bis 179 eingeschlossen des Proteins P40 von K. pneumoniae aufweist, besteht.
Protein oder Peptid, welches eine der Sequenzen ID Nr. 2, ID Nr. 4, ID Nr. 6 oder ID Nr. 8 aufweist.
Immunogener Komplex des Typs, welcher ein immunogenes Element assoziiert mit einem Adjuvans, welches die Intensität der Immunantwort verstärkt, umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass das immunogene Element ein Antigen oder ein Hapten ist and das Adjuvans ein Erzeugnis nach einem der Ansprüche 1 bis 6 umfasst.
Immunogener Komplex nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das immunogene Element mit dem Adjuvans durch eine kovalente Bindung verbunden ist.
Immunogener Komplex nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass das immunogene Element aus einem Fragment des Proteins G des RSV gebildet wird.
Immunogener Komplex nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das immunogene Element, welches mit dem Adjuvans assoziiert ist, mit einem Protein fusioniert ist, welches ein Rezeptor für ein Serumprotein, insbesondere für das menschliche Serumalbumin ist.
In vitro-Verfahren zur Erhöhung der Immunogenität eines Antigens oder eines Haptens, dadurch gekennzeichnet, dass man das Antigen oder Hapten mit einem Adjuvans nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in Form eines Komplexes nach einem der Ansprüche 7 bis 10 kombiniert.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man das Antigen oder das Haptem mit dem Adjuvans durch chemische Kopplung verbindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen oder Hapten durch Gentechnologie mit dem Adjuvans fusioniert ist.
Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Komplex nach einem der Ansprüche 7 bis 10, welcher durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13 hergestellt werden kann, enthält.
Verfahren zur Herstellung eines Adjuvans-Erzeugnisses, Proteins oder Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 6 ausgehend von Membranen von Bakterien der Gattung Klebsiella pneumoniae, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst: a) Ausfällung der Lipopolysaccharide durch Zugabe von Detergens und eines Salzes eines zweiwertigen Kations und Gewinnung des Überstands, b) Ausfällung der Proteine des Überstands and Resuspendierung des Bodensatzes, c) Chromatographie der Suspension mittels eines Anionenaustauschers und Gewinnung der Fraktionen, welche das Adjuvans-Erzeugnis enthalten, d) Chromatographie mittels eines Kationenaustauschers und Gewinnung der Fraktion, welche das Adjuvans-Erzeugnis enthält, e) Aufkonzentrierung der am Ende von Schritt d) erhaltenen Fraktion, um ein Adjuvans-Erzeugnis in Form von Protein, welches im wesentlichen frei von Lipopolysacchariden ist, zu gewinnen.