JP2001508758A - グループｂナイセリア・メニンギチジス外膜（ｍｂ３）タンパク質の酵母からの発現およびワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は一般に、外膜タンパク質髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質、とりわけＭＢ３、およびその融合タンパク質を得る方法に関する。とりわけ、本発明は、外膜タンパク質髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質を酵母中で発現させる方法に関する。本発明はまた、上記タンパク質の高レベル発現法であって、タンパク質の発現速度が、該タンパク質をコードする遺伝子の５'領域のヌクレオチド配列を置換し、該配列が酵母のコドン使用頻度に対して最適化することによって促進されている方法に関する。本発明はまた、薬理学的に許容しうる担体とともにグループＡ髄膜炎菌多糖（ＧＡＭＰ）抗原、グループＢ髄膜炎菌多糖（ＧＢＭＰ）抗原、およびグループＣ髄膜炎菌多糖（ＧＣＭＰ）抗原を含むワクチンにも関する。本発明はまた、上記ワクチンを免疫応答を誘発するのに充分な量にて哺乳動物に投与することを特徴とする、哺乳動物において免疫応答を誘発する方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 グループＢナイセリア・メニンギチジス外膜（ＭＢ３）タンパク質の酵母からの 発現およびワクチン 発明の背景発明の技術分野 本発明は、遺伝子組換え、タンパク質発現、およびワクチンの分野に属する。 本発明は、ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria meningitidis）からの外膜 グループＢポーリンタンパク質の組換え酵母宿主中での発現方法に関する。本発 明はまた、薬理学的に許容しうる担体とともにグループＡ髄膜炎菌多糖（ＧＡＭ Ｐ）抗原、グループＢ髄膜炎菌多糖（ＧＢＭＰ）抗原およびグループＣ髄膜炎菌 多糖（ＧＣＭＰ）抗原を含んでなるワクチンにも関する。本発明はまた、上記ワ クチンを免疫応答を誘発するのに充分な量で哺乳動物に投与することを含む、哺 乳動物において免疫応答を誘発する方法にも関する。発明の背景に関する説明 髄膜炎菌による髄膜炎は依然として世界的な問題であり、地方病および流行病 の両形態で起こっている（ペルトラ(Peltola,H.)、Rev.Infect.Dis.５：７１〜 ９１（１９８３）；ゴットシュリッヒ（Gotschlich,E.C.）、「髄膜炎菌による 髄膜炎（Meningococcal Meningitis）」、Bacterial Vaccines）ゲルマニエ（Ge rmanier,E.）編、アカデミック、ニューヨーク（１９８４）、ｐｐ.２３７〜２ ５５）。流行病は世界中いたるところで起こっており、１００,０００人の人口 当たり５００人という高率の発病率が報告されている。抗生物質による処置をし ないと死亡率は極めて高く（８５％）、抗生物質で処置をしたとしても死亡率は 約１０％である。さらに、抗生物質療法により治癒した患者は重篤で恒久的な神 経障害を蒙ることがある。これら事実は、ナイセリア・メニンギチジスのスルフ ァジアジン耐性菌の出現とあいまって市販ワクチンの迅速な開発を促進した(ペ ルトラ、Rev.Infect.Dis.５：７１〜８１(１９８３))。 ナイセリア・メニンギチジスはグラム陰性菌であり、血清学的にグループＡ、 Ｂ、２９ｅ、Ｗ１３５、Ｘ、ＹおよびＺに分類されている（ゴットシュリッヒ、 「髄膜炎菌による髄膜炎」、Bacterial Vaccines、ゲルマニエ編、アカデミック 、ニューヨーク（１９８４）、ｐｐ.２３７〜２５５）。他のグループであるＨ 、ＩおよびＫが中国で（ディン（Ding,S.−Q.）ら、J．Biol.Stand.９：３０７ 〜３１５（１９８１））、グループＬがカナダで（アシュトン（Ashton,F.E.） ら、J．Clin.Microbiol.17：７２２〜７２７（１９８３））単離された。このグ ループ分けは菌の莢膜多糖に基づいている。グループＡの多糖は２ーアセトアミ ド−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノシルリン酸の部分的にＯ−アセチル化され た（１→６）結合したホモポリマーであり、グループＢ多糖およびグループＣ多 糖の両者はシアル酸のホモポリマーであることが確立されている（ルイ（Lui,T. −Y.）ら、J.Biol.Chem.２４６：２８４９〜２８５８（１９７１））。 髄膜炎菌による髄膜炎の症例の約９０％はナイセリア・メニンギチジスグルー プＡ、ＢおよびＣによるものである。グループＡおよびグループＣの髄膜炎菌に よる髄膜炎の予防の成功は、２価多糖ワクチンを用いて達成された（ゴットシュ リッヒら、J．Exp.Med.１２９：１３６７〜１３８４（１９６９）；アルテンシ ュタイン（Artenstein,M.S.）ら、N.Engl.J.Med.２８２：４１７〜４２０（１９ ７０））；このワクチンは市販の製品化され、過去１０年の間に世界の多くの地 域で主だった髄膜炎の流行病を予防および阻止するのに首尾よく用いられてきた 。しかしながら、このワクチンを増強する必要性が存在している。というのは、 髄膜炎菌による髄膜炎の症例の有意部分はグループＡおよびグループＣ以外のグ ループによるものだからである。グループＢは特に疫学的に重要であるが、グル ープＹおよびグループＷ１３５もまた重要である（カドス（Cadoz,M.）ら、Vacc ine ３：３４０〜３４２（１９８５））。グループＢの多糖をワクチンに含ませ ることは特別の問題であった（下記参照）；しかしながら、グループＡ、Ｃ、Ｗ １３５およびＹを含む４価のワクチンはヒトにおいて安全で免疫原性であること が証明され（カドスら、Vaccine ３：３４０〜３４２（１９８５））、現在用い られている髄膜炎菌による髄膜炎のワクチンである（ジェニン グス（Jennings,H.J.）、「ワクチン候補としての莢膜多糖（Capsular Polysacc harides as Vaccine Candidates）」、Current Topics in Microbiol.and Immun ol.、ジャン（Jann,D.）およびジャン（Jann,B.）編、スプリンガー−フェアラ ーク、ベルリン（１９９０）Vol.１５０：９７〜１２７）。 他のグラム陰性細菌と全く同様にナイセリア種の外膜は半透過性膜であり、こ れら細菌のペリプラズム空間を出入りして小分子量の物質の自由な流入および流 出をさせるが、大きなサイズの分子はその出入りを遅らせる（ヒースリー（Heas ley,F.A.）ら、「ナイセリア・ゴノロエエ外膜透過性バリヤの再構成および特徴 付け（Reconstitution and characterization of the Neisseria gonorrhoeae o uter membrane permeability barrier）」、Genetics and Immunology of Neiss eria gonorrhoeae、ダニエルスン（Danielsson）およびノーマーク（Normark） 編、University of Umea、Umea、１２〜１５頁（１９８０）；ダグラス（Dougla s,J.T.）ら、ＦＥＭＳ Microbiol.Lett.１２：３０５〜３０９（１９８１））。 このことが行われる機構の一つは、包括的にポーリン（porins）と呼ばれている タンパク質がこれら膜中に含まれていることである。これらタンパク質は３つの 同一のポリペプチド鎖からなり（ジョーンズ（Jones,R．B.）ら、Infect．Immun .３０：７７３〜７８０（１９８０）；マックデード（McDade,Jr.）およびジョ ンストン（Johnston）、J.Bacteriol.１４１：１１８３〜１１９１（１９８０） ）、その天然の３量体コンホメーションにて、細菌の外膜やそれが組み込まれた 他の膜中で水分の充填された（water filled）電位差に依存するチャンネルを形 成する（リンチ（Lynch,E.C.）ら、Biophys.J.４１：６２（１９８３）；リンチ ら、Biophys.J.４５：１０４〜１０７（１９８４）；ヤング（Young,J.D.E.）ら 、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ ８０：３８３１〜３８３５（１９８３）；マウロ （Mauro,A.）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ ８５：１０７１〜１０７５（１９ ８８）；ヤングら、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ ８３：１５０〜１５４（１９８ ６））。これらタンパク質は外膜中に比較的多く存在するため、これらタンパク 質抗原は また疫学的目的のためにナイセリア・ゴノロエエおよびナイセリア・メニンギチ ジスの両者を幾つかの血清型に細分類するのに用いられている（フラッシュ（Fr asch,C.E.）ら、Rev.Infect.Dis.７：５０４〜５１０（１９８５）；クナップ（ Knapp,J.S.）ら、「ナイセリア・ゴノロエエの栄養型／血清型分類の疫学的およ び臨床的応用の概観(Overview of epidermiological and clinical application s of auxotype/serevar classification of Neisseria gonorrhoeae)」、The Pat hogenic Neisseriae、スクールニク（Schoolnik,G.K.）編、American Society f or Microbiology、ワシントン、６〜１２頁（１９８５））。今日、淋菌および 髄膜炎菌の両者からのこれらタンパク質の多くは精製されており（ヘッケルズ（ Heckels,J.E.）、J.Gen.Microbiol.９９：３３３〜３４１（１９７７）；ジェー ムズおよびヘッケルズ、J．Immunol.Meth.４２：２２３〜２２８（１９８１）； ジュッド（Judd,R.C.）、Anal.Biochem.１７３：３０７〜３１６（１９８８）； ブレイク（Blake）およびゴットシュリッヒ、Infect.Immun.３６：２７７〜２８ ３（１９８２）；ウエッツラー（Wetzler,L.M.）ら、J.Exp.Med.１６８：１８８ ３〜１８９７（１９８８））、クローニングされ配列決定されている（ゴットシ ュリッヒら、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ ８４：８１３５〜８１３９（１９８７ ）；マッギネス（McGuinness,Ｂ.）ら、J.Exp.Med.１７１：１８７１〜１８８２ （１９９０）；カーボネッティ（Carbonetti）およびスパーリング（Sparling） 、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ ８４：９０８４〜９０８８（１９８７）；フィー バーズ（Feavers,I.M.）ら、Infect.Immun.６０：３６２０〜３６２９（１９９ ２）；ムラカミ（Murakami,K.）ら、Infect.Immun.５７：２３１８〜２３２３（ １９８９）；ウォルフ（Wolff）およびスターン（Stern）、ＦＥＭＳ Microbiol .Lett.８３：１７９〜１８６（１９９１）；ウォード（Ward,M.J.）ら、ＦＥＭ Ｓ Microbiol.Lett.７３：２８３〜２８９（１９９２））。 ポーリンタンパク質は、最初、リポ多糖とともに単離された。その結果、ポー リンタンパク質は「内毒素結合タンパク質」と呼ばれた（ビヨルンソン（Bjorns on）ら、Infect.Immun.５６：１６０２〜１６０７（１９８８））。 野性型ポーリンの研究によれば、完全な集合およびオリゴマー形成はタンパク質 環境中に対応細菌株からのＬＰＳが存在しない限り起こらないことが報告されて いる（ホルゼンブルク（Holzenburg）ら、Biochemistry２８：４１８７〜４１９ ３（１９８９）；セン（Sen）およびニカイドー（Nikaido）、J.Biol.Chem.２６ ６：１１２９５〜１１３００（１９９１））。 髄膜炎菌のポーリンは３つの主要なクラスに細分されており、これらは以前の 命名ではクラス１、２および３として知られていた（フラッシュら、Rev.Infect .Dis.７：５０４〜５１０（１９８５））。調べた各髄膜炎菌にはクラス２ポー リン遺伝子かまたはクラス３ポーリン遺伝子のいずれかの対立遺伝子の一方が含 まれていたが両方は含まれていなかった（フィーバーズら、Infect.Immun.６０ ：３６２０〜３６２９（１９９２）；ムラカミら、Infect.Immun.５７：２３１ ８〜２３２３（１９８９））。クラス１の遺伝子が存在するか存在しないかは場 合によるように思われる。同様に、プローブしたすべての淋菌にはクラス２かま たはクラス３の対立遺伝子のいずれかに類似する一方のみのポーリン遺伝子が含 まれている（ゴットシュリッヒら、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ ８４：８１３５ 〜８１３９（１９８７）；カーボネッティおよびスパーリング、Proc.Natl.Acad .Sci.ＵＳＡ ８４：９０８４〜９０８８（１９８７））。ナイセリア・ゴノロ エエはクラス１の対立遺伝子を全く欠失していると思われる。これまで配列決定 された遺伝子からのデータは、すべてのナイセリア系ポーリンタンパク質は互い に少なくとも７０％の相同性を有し、基本骨格（basic theme）の上に若干の変 異を有することを示唆している（フィーバーズら、Infect.Immun.６０：３６２ ０〜３６２９（１９９２））。これらナイセリア系ポーリンタンパク質間で認め られる変異のほとんどは、これら病原微生物がその天然の宿主であるヒト中に侵 入することによってもたらされた免疫学的圧力によるものであることが示唆され ている。しかしながら、ポーリンタンパク質の配列における変化がいかにしてこ れらタンパク質の機能的活性に影響を及ぼすかについてはほとんどわかっていな い。 脂質二重層の研究において、クラス２の対立遺伝子型の単離淋菌ポーリンは、 イオン選択性および電位差依存性に関してクラス３型の単離淋菌ポーリンと電気 物理学的に若干異なる挙動を示すことが報告されている（リンチら、Biophys.J. ４１：６２（１９８３）；リンチら、Biophys.J.４５：１０４〜１０７（１９８ ４））。さらに、種々のポーリンが完全な生きた細菌からのこれら脂質二重層に 侵入する能力は、ポーリンの型のみならず、それが由来するナイセリア種とも関 係すると思われる（リンチら、Biophys.J.４５：１０４〜１０７（１９８４）） 。これら機能的特性の少なくとも幾つかは、ポーリンのタンパク質配列内の異な る領域と関係すると思われる。これまでにすべての淋菌クラス２様タンパク質内 で同定されたそのような機能的領域の一つは、キモトリプシン開裂部位である。 キモトリプシン消化すると、このクラスのポーリンは電位差に応答する能力を失 い、閉鎖される。淋菌クラス３様ポーリン並びに髄膜炎菌ポーリンは該配列を欠 失しており、それゆえキモトリプシン開裂に供されないが、それにも拘わらず閉 鎖することによって負荷した電位差に応答する（グレコ（Greco,F.）、「淋菌主 要外膜タンパク質による脂質二重層でのチャンネルの形成（The formation of c hannels in Iipid bilayers by gonococcal major outer membrane protein）」 、要旨集、The Rockefeller University、ニューヨーク（１９８１）；グレコら 、Fed.Proc.３９：１８１３（１９８０））。 ナイセリア系ポーリンはこれら生物の外膜に存在する最も豊富なタンパク質の ひとつであり、また感染に際して（幾つかの他の主要な表面抗原と異なり）抗原 シフトを受けないことから、該ポーリンのナイセリア・メニンギチジスおよびナ イセリア・ゴノロエエの両者における普遍的な存在および表面での暴露が、これ ら生物に対するワクチン成分の候補としている。髄膜炎菌疾患から回復している 患者は抗ポーリン抗体を産生しており、ポーリンタンパク質を用いた免疫により 引き起こされる抗体は相同な血清型に対して殺菌性である。さらに、特定の疫学 的設定においては、髄膜炎菌疾患を引き起こすほとんどの株は限られた数の血清 型、とりわけクラス２タンパク質を有する株での血清型２およびクラス３タンパ ク質を有する株での血清型１５に属する。それゆえ、クラス２および３のタンパ ク質は有力なワクチン候補である。 そのような研究の主要な障害は、近代的な分子技術によってポーリン遺伝子を 容易に操作し、これら変化したポーリンタンパク質の生物物理学的特徴付けを行 うために充分な精製タンパク質を得る能力に関するものであった。初期の頃は、 クローニングしたナイセリアのポーリン遺伝子は大腸菌中で発現させたときに宿 主である大腸菌にとって致死性であると認識されていた（カーボネッティおよび スパーリング、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ ８４：９０８４〜９０８８（１９８ ７）；カーボネッティら、Ｐroc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ ８５：６８４１〜６８ ４５（１９８８）；バーロウ（Barlow,A.K.）ら、Infect.Immun.５５：２７３４ 〜２７４０（１９８７））。それゆえ、これら遺伝子の多くは、全遺伝子の断片 としてクローニングおよび配列決定されるかまたは厳しい発現制御下で低コピー 数のプラスミド中に入れられた（カーボネッティら、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳ Ａ８５：６８４１〜６８４５（１９８８））。これら条件下ではたとえ全ポーリ ン遺伝子が発現されたとしても、さらに精製し特徴付けのために処理することが できるタンパク質はごくわずかしか蓄積しなかった。 この問題に対する他の方針でわずかに成功を勝ち得たものは、ポーリン遺伝子 を低コピー数の厳しく制御された発現プラスミド中にクローニングし、このポー リン遺伝子に修飾を導入し、ついで該修飾された配列をナイセリア中に再導入す るというものであった（カーボネッティら、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ ８５： ６８４１〜６８４５（１９８８））。しかしながら、この方法もまた、ナイセリ ア、とりわけ淋菌中に存在する精巧な制限エンドヌクレアーゼ系による問題を伴 っていた（デービーズ（Davies,J.K.）、Clin.Microbiol.Rev.２：７８〜８２頁 （１９８９））。 ナイセリアのポーリンを含むワクチンが長い間探求されてきたが、すべての血 清型生物およびすべてのヒトに対して完全な適用範囲を有する有効な髄膜炎菌多 糖ワクチンもまた必要である。このような広範囲多糖ワクチンの開発に際して幾 つかの深刻な問題が残っている。第一に、グループＡおよびＣの多糖は成人およ び年長の子供には有効であるが、幼児におけるその有効性はぎりぎりのものでし かないことが確立されている（ゴールドシュナイダー（Goldschneider,I.）ら、 J.Infect.Dis.１２８：７６９〜７７６（１９７３）；ゴットシュリッヒら、「 ヒトにおける細菌多糖への免疫応答（The Immune Responses to Bacterial Poly saccharides in Man）」、Antibodies in Human Diagnosis and Therapy、ヘイ バー（Haber,E.）およびクラウス（Krause,R.M.）編、ラベン、ニューヨーク（ １９７７）、３９１〜４０２頁）。第二に、グループＢの髄膜炎菌多糖はヒトで は不充分にしか免疫原性を示さない（ワイル（Wyle,F.A.）ら、J.Infect.Dis.１ ２６：５１４〜５２１（１９７２））。第三の問題は、多価ワクチンは各成分を 個々に投与した場合に比べて免疫原性が低い傾向があることである（インゼル（ Insel,R.A.）、「ワクチン成分を併用するかまたは同時に投与することによる免 疫原性の変化の可能性（Potential alterations in immunogenicity by combini ng or simultaneously administering vaccine components）」、Annals of the New York Academy of Sciences、Vol.７５４、Combined Vaccines and Simulta neous Administration：Current Issues and Perspectives、ウイリアムズ（Wil liams,J.C.）ら編、ニューヨークアカデミーオブサイエンスィズ、ニューヨーク （１９９３）、３５〜４７頁；クレメンス（Clemens,J.）ら、「ヘモフィルス・ インフルエンザｂ型に対するＰＲＰ−Ｔワクチンと従来の幼児ワクチンとの相互 作用：同時免疫および混合ワクチンの将来の研究のための課程（Interactions b etween ＰＲＰ−Ｔ vaccine against Haemophilus influenzae type b and conv entional infant vaccines：lessons for future studies of simultaneous imm unization and combined vaccines）」、Annals of the New York Academy of S ciences、Vol.７５４、Combined Vaccines and Simultaneous Administration： Current Issues and Perspectives、ウイリアムズら編、ニューヨークアカデミ ーオブサイエンスィズ、ニューヨーク（１９９３）、２５５〜２６６頁；パラジ ソ（Paradiso,P.R.）ら、Pediatrics ９２（６）：８２７〜８３２（１９９３） ）。 グループＡおよびＣのナイセリア・メニンギチジスに対する現在利用できるワ クチンは、たいていの抗原によって生成される免疫とは対照的に幼児での多糖特 異的な免疫応答がＴ細胞非依存性であるため、ヒト幼児において不充分な免疫原 性しか有しない。Ｔ細胞の関与が存在しない場合には、免疫応答は短期間のもの でしかない。さらに重要なことに、免疫記憶が明示されず、それゆえ「ブースタ ー」反応も起こらない。さらに、抗体親和性成熟が起こらない。これら欠点は、 多糖がＴ細胞に特異的に結合できないことによるものである。おそらく、Ｔ細胞 受容体と結合するのに必要な構造的な特性が大部分の多糖には存在しないのであ ろう。免疫応答のＴ細胞非依存性の性質のため、幼児における多糖への抗体応答 はＩｇＭイソタイプの抗体に限られている；非ＩｇＭ抗体の産生に必要なイソタ イプスイッチにはＴ細胞の関与が必要である。より成熟したヒト（２歳以上）で は多糖抗原はＩｇＭと同様にＩｇＧイソタイプの抗体を誘発することができるの でそれほど問題ではない（ヨーント（Yount）ら、J.Exp.Med.１２７：６３３〜 ６４６（１９６８））。 グループＢの髄膜炎菌多糖は、他の多糖に比べてあらゆる年齢のヒトにおいて 免疫原性が低い。この特性を説明するために２つの主要な説明が提案されている （ジェニングス、Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.４１：１５５〜２０８（１９８ ３）；ライフリー（Lifely,M.R.）ら、Vaccine ５：１１〜２６（１９８７）） 。一つは、α（２→８）結合したシアル酸ホモポリマーであるグループＢ髄膜炎 菌多糖がノイラミニダーゼの作用のためにヒト組織で速やかに脱重合されるとい うものである。もう一つは、この構造がヒト免疫系によって「自己」と認識され 、その結果、この構造に特異的な抗体の産生が抑制されることである。証拠の重 要さでは後者の説明に分配がある。なぜなら、グループＣ髄膜炎菌多糖のノイラ ミニダーゼ感受性変異体［α（２→９）結合したシアル酸ホモポリマー］がヒト において免疫原性が大きいことがわかっているからである（グロード（Glode,M. P.）ら、J.Infec.Dis.１３９：５２〜５９（１９７９））。さらに、グループＢ 多糖をその末端の非還元性シアル酸を介してタンパク質担体（破傷風トキソイド ）に結合した（このことにより多糖はノイラミニダーゼに対して安定になる）コ ンジュゲートは、免疫原性が有意に促進されるという結果にはならなかったこと が示されている（ジェニングスおよびルゴウスキー（Lugowski, C.）、J.Immunol．１２７：１０１１〜１０１８（１９８１））。上記観察は、 免疫機構がα（２→８）結合したシアル酸残基に対する特異性を有する抗体の産 生を回避するという理論と一致する。この理論はさらに、ヒトおよび動物組織の 多糖中にα（２→８）結合したシアル酸残基の存在が同定されたことによって確 認された。グループＢ多糖の不充分な免疫原性を克服するための新たなアプロー チは、これを化学的に修飾することである。 ヒト幼児における多糖抗原のＴ細胞非依存性という性質は、多糖をタンパク質 担体にコンジュゲートする（共有結合する）ことにより克服しうる。新生児後期 の髄膜炎の主たる原因である細菌の莢膜多糖はタンパク質担体にコンジュゲート されている；これらにはｂ型ヘモフィルス・インフルエンザ（シュニアソン（Sc hneerson,R.）ら、J.Exp.Med.１５２：３６１〜３７６（１９８０）；アンダー ソン（Anderson,P.W.）、Infect.Immun.３９：２３３〜２３８（１９８３）；マ ールブルグ（Marburg,S.）ら、J.Am.Chem.Soc.１０８：５２８２〜５２８７（１ ９８６））、グループＡ（ジェニングスおよびルゴウスキー、J.Immunol.１２７ ：１０１１〜１０１８（１９８１）；ボベリー（Beuvery,E.C.）ら、Vaccine １ ：３１〜３６（１９８３））、Ｂ（ジェニングスおよびルゴウスキー、J.Immuno l.１２７：１０１１〜１０１８（１９８１））、およびＣ（ジェニングスおよび ルゴウスキー、J.Immunol.１２７：１０１１〜１０１８（１９８１）；ボベリー ら、Infect.Immun.４０：３９〜４５（１９８３））ナイセリア・メニンギチジ ス、および６Ａ型ストレプトコッカス・ニュモニエ（Strep.pneumoniae）（チュ ー（Chu,C.）ら、Infect.Immun.４０：２４５〜２５６（１９８３））が含まれ る。担体タンパク質の選択については、たいていの研究者は破傷風トキソイドか またはジフテリアトキソイドを用いており、これら２つのタンパク質は現在、幼 児ワクチンとして用いられている。このテーマにおける最近の革新は、非毒性で ある変異体由来のジフテリア毒素（ＣＲＭ₁₉₇）（アンダーソン、Infect.Immun. ３９：２３３〜２３８（１９８３））の使用である。このタンパク質の重要性は 、それがホルムアルデヒド処理による無毒化を必要としないのでアミノ基がすべ て誘導体化されずに残り、このことがコンジュ ゲーション過程を非常に簡単にすることである。 他の可能な細菌タンパク質の担体としての使用は、それほど広範囲には探求さ れていない。しかしながら、ナイセリア・メニンギチジスのある種の血清型外膜 タンパク質はタンパク質担体として用いられている（マールブルグら、J.Am.Che m.Soc.１０８：５２８２〜５２８７（１９８６））。 以上のことから、ナイセリア・メニンギチジスの外膜グループＢポーリンタン パク質を大量に得ることのできる方法に対する有意の必要性が存在することが明 らかであろう。また、ナイセリア・メニンギチジスの３つの主要な血清グループ であるグループＡ、ＢおよびＣに対して完全な適用範囲を有し、幼児およびより 成熟したヒトの両者においてこれら生物に対する免疫を付与しうる多糖ワクチン に対する必要性が存在することも明らかであろう。 発明の要約 本発明の一般的目的は、髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質、とりわけク ラス３ポーリンタンパク質を酵母中で発現させる方法を提供することにある。 本発明の特定の目的は、 （ａ）選択可能なマーカーを有するプラスミド中に （i）成熟ポーリンタンパク質、 （ii）酵母分泌シグナルペプチドに融合した成熟ポーリンタンパク質である融合 タンパク質、 よりなる群から選ばれたタンパク質をコードする遺伝子をクローニングし、その 際、該遺伝子は酵母プロモーターに作動可能に連結しており、 （ｂ）該遺伝子を含む該プラスミドを酵母株中に形質転換し、 （ｃ）形質転換した酵母の選択を可能とする培地中で該酵母を増殖させることに よって形質転換した酵母を選択し、 （ｄ）該形質転換した酵母を増殖させ、ついで （ｅ）該タンパク質の発現を誘発させて該タンパク質を含む酵母を得、 その際、かくして発現された該タンパク質は該酵母中で発現された全タンパク質 の約２％以上を占める ことを特徴とする、外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質またはその融合 タンパク質の酵母中での発現方法を提供することにある。 本発明の他の特定の目的は、かくして発現されたタンパク質が酵母中で発現さ れた全タンパク質の約３〜５％を占める、成熟ポーリンタンパク質またはその融 合タンパク質を発現させる方法を提供することにある。 本発明のさらに他の特定の目的は、タンパク質がナイセリア・メニンギチジス 外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質（ＭＢ３）である、成熟ポーリンタ ンパク質を発現させる方法を提供することにある。 本発明の他の特定の目的は、該酵母プロモーターがＡＯＸ１プロモーターであ る、成熟ポーリンタンパク質またはその融合タンパク質を発現させる方法を提供 することにある。 本発明の他の特定の目的は、該酵母分泌シグナルペプチドが、サッカロミセス ・セレビシエ（S.cerevisiae）α−交配因子（mating−factor）プレプロペプチ ドの分泌シグナルおよびピキア・パストリス（P.pastoris）酸性ホスファターゼ 遺伝子（ＰＨＯ）の分泌シグナルよりなる群から選ばれたものである、外膜髄膜 炎菌グループＢポーリンタンパク質またはその融合タンパク質を酵母中で発現さ せる方法を提供することにある。 本発明のさらに他の特定の目的は、該プラスミドがｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ −Ｓ１、ｐＰＩＣ９およびｐＰＩＣ９Ｋよりなる群から選ばれたものである、上 記ＭＢ３またはその融合タンパク質を酵母中で発現させる方法を提供することに ある。 本発明の他の特定の目的は、上記髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質をコ ードする遺伝子の５'領域の少なくとも一つのコドンが酵母のコドン使用頻度を 最適化するように変化されている、該タンパク質またはその融合タンパク質の発 現方法を提供することにある。 本発明のさらに他の特定の目的は、上記髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク 質をコードする遺伝子の５'領域が、ピキア・パストリスのコドン使用頻度を最 適化するコドンを採用したヌクレオチド配列を含む、該タンパク質またはその融 合タンパク質の発現方法を提供することにある。 本発明の他の特定の目的は、該コドン変化が、（天然配列の位置４〜６におけ るＧＴＴ→ＧＴＣ）、（天然配列の位置７〜９におけるＡＣＣ→ＡＣＴ）、（天 然配列の位置１０〜１２におけるＣＴＧ→ＴＴＧ）、（天然配列の位置１６〜１ ８におけるＧＧＣ→ＧＧＴ）、（天然配列の位置１９〜２１におけるＡＣＣ→Ａ ＣＴ）、（天然配列の位置２２〜２４におけるＡＴＣ→ＡＴＴ）、（天然配列の 位置２５〜２７におけるＡＡＡ→ＡＡＧ）、（天然配列の位置２８〜３０におけ るＧＣＣ→ＧＣＴ）、（天然配列の位置３１〜３３におけるＧＧＣ→ＧＧＴ）、 （天然配列の位置３４〜３６におけるＧＴＡ→ＧＴＴ）、（天然配列の位置３７ 〜３９におけるＧＡＡ→ＧＡＧ）よりなる群から選ばれたものであり、その際、 該位置は該タンパク質をコードする天然のヌクレオチド配列の第一のヌクレオチ ドから数えたものである、上記方法を提供することにある。 本発明の他の特定の目的は、該遺伝子の５'領域が、ピキア・パストリスのコ ドン使用頻度を最適化したコドンを含み、該ヌクレオチド配列が配列番号：２６ である、上記方法を提供することにある。 本発明の他の特定の目的は、該酵母が該タンパク質または融合タンパク質を分 泌する、上記タンパク質の発現方法を提供することにある。 本発明の他の特定の目的は、該分泌タンパク質が発現されるベクターがｐＨＩ Ｌ−Ｓ１、ｐＰＩＣ９およびｐＰＩＣ９Ｋよりなる群から選ばれたものである、 上記タンパク質の発現方法を提供することにある。 本発明の他の特定の目的は、本発明に従って得られた不溶性の細胞内外膜髄膜 炎菌グループＢポーリンタンパク質またはその融合タンパク質の精製方法であっ て、 （ａ）該タンパク質を発現した上記酵母を溶解して該タンパク質を不溶性の膜結 合画分として放出し、 （ｂ）工程（ａ）で得た不溶性物質を緩衝液で洗浄して、混入する酵母細胞タン パク質を除去し、 （ｃ）工程（ｂ）で得た該不溶性画分を変性剤の水溶液中に懸濁および溶解し、 （ｄ）工程（ｃ）で得た該溶液を界面活性剤で希釈し、ついで （ｅ）該タンパク質をゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーにより精製 する ことを特徴とする方法を提供することにある。 本発明の他の特定の目的は、本発明に従って得られた外膜髄膜炎菌グループＢ ポーリンタンパク質またはその融合タンパク質の精製方法であって、 （ａ）該タンパク質を発現した上記酵母培養液を遠心分離にかけて該タンパク質 を可溶性の分泌物質として単離し、 （ｂ）工程（ａ）で得た該可溶性の分泌物質から、混入する酵母培養不純物を約 ２０％のエタノールで沈殿させることにより除去し、その際、該可溶性の分泌物 質は可溶性画分に残留し、 （ｃ）工程（ｂ）の該可溶性画分から該分泌物質を約80％のエタノールで沈殿さ せ、 （ｄ）工程（ｃ）で得た該沈殿物質を緩衝液で洗浄して、混入する酵母の分泌タ ンパク質を除去し、 （ｅ）工程（ｄ）で得た該沈殿物質を界面活性剤の水溶液中に懸濁および溶解し 、ついで （ｆ）該タンパク質をイオン交換クロマトグラフィーにより精製する ことを特徴とする方法を提供することにある。 本発明の他の特定の目的は、 （ａ）成熟ポーリンタンパク質 （ｂ）酵母分泌シグナルペプチドに融合した成熟ポーリンタンパク質である融合 タンパク質 よりなる群から選ばれたタンパク質をコードする遺伝子を含む酵母宿主細胞であ って、該遺伝子が酵母プロモーターに作動可能に連結しているものを提供するこ とにある。 本発明の他の特定の目的は、血清グループＢのナイセリア・メニンギチジス成 熟外膜クラス３タンパク質（ＭＢ３）を発現しうる上記酵母宿主細胞を提供する ことにある。 本発明のさらに他の特定の目的は、該酵母プロモーターがＡＯＸ１プロモータ ーである上記酵母宿主細胞を提供することにある。 本発明の他の目的は、薬理学的に許容しうる担体とともにグループＡ髄膜炎菌 多糖（ＧＡＭＰ）抗原、グループＢ髄膜炎菌多糖（ＧＢＭＰ）抗原、およびグル ープＣ髄膜炎菌多糖（ＧＣＭＰ）抗原を含むワクチンを提供することにある。 本発明のさらに他の特定の目的は、哺乳動物に免疫応答を引き起こすのに充分 な量の上記ワクチンを哺乳動物に投与することを特徴とする、哺乳動物において 免疫応答を引き起こす方法を提供することにある。 本発明の他の目的および利点は以下の記載から明らかとなるであろう。 図面の簡単な説明 図１：ＰｏｒＢ遺伝子の配列決定戦略を示す模式図。実施例１に記載するＰＣ Ｒ産物（材料および方法の部門）を発現プラスミドｐＥＴ−１７ｂのＢａｍＨＩ −ＸｈｏＩ部位中にライゲートした。最初の二本鎖プライマ一伸長配列決定を、 ｐＥＴ−１７ｂプラスミド内のＢａｍＨＩ部位のすぐ上流およびＸｈｏＩ部位の すぐ下流のオリゴヌクレオチド配列を用いて行った。別の配列データを、エキソ ヌクレアーゼIII／ヤエナリヌクレアーゼ反応を用いて該遺伝子の３'末端に多数 の欠失を生成させることにより得た。再ライゲーションおよび大腸菌中への形質 転換後、挿入物のサイズに従って幾つかのクローンを選択し、引き続き配列決定 した。この配列決定は、Ｂｐｕ１１０２１部位のすぐ下流のオリゴヌクレオチド プライマーを用い、常に該遺伝子の３'末端から行った。 図２：ＰＣＲ反応の生成物を示すゲル電気泳動（ＴＡＥ緩衝液を用い、１％ア ガロース中で電気泳動）。 図３Ａおよび３Ｂ、図３Ａ：挿入物を有しない対照のｐＥＴ−１７ｂプラスミ ドを有する大腸菌、および材料および方法の部門に記載する得られたＰＣＲ産物 からの挿入物を含有するｐＥＴ−１７ｂプラスミドを有する大腸菌クローンの全 細胞溶解液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。両方の培養液とも、６００ｎｍにおける吸 光度が０.６になるまで増殖させ、ＩＰＴＧを加え、３７℃で２時間インキュベ ートした。各培養液を各１.５ｍｌ取り、遠心分離し、細菌ペレットを１００μ ｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ調製緩衝液中に可溶化した。レーンＡは対照の試料１０μ ｌで得られたタンパク質プロフィールを示し、レーンＢ（５μｌ）およびＣ（１ ０μｌ）はＰｏｒＢタンパク質を発現する大腸菌宿主のタンパク質プロフィール を示す。図３Ｂ：ＩＰＴＧで２時間誘発した後の挿入物を有しない対照のｐＥＴ −１７ｂプラスミドを有する大腸菌の全細胞溶解液のウエスタンブロット分析、 レーンＡ、２０μｌおよびｐｏｒＢ−ｐＥＴ−１７ｂプラスミドを含有する対応 大腸菌クローン、レーンＢ、５μｌ；レーンＣ、１０μｌ；およびレーンＤ、２ ０μｌ。モノクローナル抗体４Ｄ１１を一次抗体として用い、記載のようにして ウエスタンブロットを展開した。ＢＲＬからの前以て染色した低分子量標準を各 場合に用いた。 図４：発現プラスミドｐＥＴ−１７ｂ中にクローニングした成熟ＰｏｒＢ遺伝 子のヌクレオチド配列および翻訳したアミノ酸配列。以前に刊行されている血清 型１５ＰｏｒＢとは異なる２つのヌクレオチドに下線を引いてある。 図５：２８０ｎｍにおける吸光度およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりモニター した、髄膜炎菌株８７６５から単離した野性型クラス３タンパク質およびｒ３ｐ ＥＴ−１７ｂプラスミドを有するＢＬ２１（ＤＥ３）−ΔｏｍｐＡ大腸菌株によ って産生された組換えクラス３タンパク質の両者のセファクリルＳ−３００カラ ム溶出プロフィールを示すグラフ。カラムのボイド容積は矢印で示してある。Ｓ ＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される髄膜炎菌ポーリンを含有するフラクションお よび組換えポーリンを含有するフラクションを横棒で示してある。 図６：６つのヒト免疫血清において相同野性型ＰｏｒＢが反応性抗体に競合す る能力を示す抑制ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフ。算術平均抑制を太線 で示す。 図７：６つのヒト免疫血清において精製組換えＰｏｒＢタンパク質が反応性抗 体に競合する能力を示す抑制ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフ。算術平均 抑制を太線で示す。 図８：野性型および組換えＰｏｒＢタンパク質を用いて得られたこれら２つの 平均抑制の比較を示すグラフ。 図９Ａおよび図９Ｂ：発現プラスミドｐＥＴ−１７ｂ中にクローニングした成 熟クラスIIポーリン遺伝子のヌクレオチド配列および翻訳したアミノ酸配列。 図１０Ａおよび図１０Ｂ：発現プラスミドｐＥＴ−１７ｂ中にクローニングし た融合クラスIIポーリン遺伝子のヌクレオチド配列および翻訳したアミノ酸配列 。 図１１（パネルＡおよびＢ）：パネルＡはｐＥＴ−１７ｂプラスミドの制限地 図を示す。パネルＢはｐＥＴ−１７ｂのＢｇｌII部位とＸｈｏＩ部位との間のヌ クレオチド配列を示す。このプラスミドによって提供される配列は通常の印字で 示すが、ＰＣＲ産物から挿入した配列は太い印字で示す。このプラスミドに由来 するアミノ酸は通常の印字で示すが、該挿入物からのアミノ酸は太い印字で示す 。矢印は、図４の配列と一致する配列が開始する場所およびそれが終止する場所 を画定する。 図１２：クローンｐｎｖ３２２（使用した発現ベクターはｐＨＩＬ−Ｄ２であ る）のＭＢ３の発現レベルを示すグラフ。ＭＢ３の発現レベルは、ｍｇ不溶性Ｍ Ｂ３／ｇ細胞ペレット／単位時間として示す。 図１３Ａ：コドンの好み（preference）の最適化を行う前のｐＮＶ１５（ｐＥ Ｔ２４ａ中のＭＢ３）のＤＮＡ配列および翻訳したアミノ酸配列。 図１３Ｂ：Ｍｅｎ.Ｃｌａｓｓ３ｏｐｔ.（酵母のコドンの好みに最適化したＭ Ｂ３）のＤＮＡ配列および翻訳したアミノ酸配列。 図１４Ａおよび図１４Ｂ：サイズ排除カラムからのＭＢ３の溶出を示すグラフ 。細胞内形態で発現したＭＢ３を、変性／復元プロトコール、ついでゲル濾過お よびイオン交換クロマトグラフィーを行って精製した。得られた精製タンパク質 は、サイズ排除クロマトグラフィーにより、大腸菌中で過剰発現した組換えクラ ス３タンパク質と類似した溶出プロフィールを示し、ともに天然の野生型対応物 と同じ溶出プロフィールを与える。このことは、ＭＢ３が再生およびオリゴマー 化して完全な天然のコンフォメーションを達成することを示している。１４（Ａ ）：ＭＢ３の溶出プロフィール；１４（Ｂ）：大腸菌封入体から発現し再生した クラス３タンパク質の溶出プロフィール。 図１５：ＨＰＬＣ（ヒューレットパッカードモデル１０９０）に連結したスー パーローズ（Superose）１２（ファルマシア）上での精製ＭＢ３のサイズ排除ク ロマトグラフィーを示すグラフ。ＭＢ３と天然の野生型対応物との比較並びに分 子量標準（矢印で示す）を用いた検量に基づき、溶出プロフィールは三量体の集 合（trimeric assembly）を示す。分子量マーカーは、１＝チログロブリン（６ ７０,０００）；２＝ガンマグロブリン（１５８,０００）；３＝ミオグロブリン （１７,０００）である。 図１６Ａ、図１６Ｂおよび図１６Ｃ：クローンｐｎｖ３２２のＤＮＡ配列。こ のクローンは、インビトロジェンの発現ベクターであるｐＨＩＬ−Ｄ２のＥｃｏ ＲＩ部位に挿入したＭＢ３遺伝子を有する。それゆえ、ＭＢ３はＡＯＸ１プロモ ーターのすぐ下流に挿入されている。この構築により細胞内発現が可能となる。 ベクター配列は大文字で示してあり、一方、ＭＢ３配列は小文字で示してある。 図１７Ａ、図１７Ｂおよび図１７Ｃ：クローンｐｎｖ３１８のＤＮＡ配列。こ のクローンは、インビトロジェンの発現ベクターであるｐＨＩＬ−Ｓ１のＸｈｏ Ｉ−ＢａｍＨＩ部位に挿入したＭＢ３遺伝子を有する。それゆえ、ＭＢ３はＰＨ ＯＩリーダーペプチドのすぐ下流に発現タンパク質の分泌のための分泌シグナル オープンリーディングフレームとインフレームで挿入されている。ベクター配列 は大文字で示してあり、一方、ＭＢ３配列は小文字で示してある。 図１８Ａ、図１８Ｂおよび図１８Ｃ：クローンｐｎｖ３４２のＤＮＡ配列。こ のクローンは、インビトロジェンの発現ベクターであるｐＰＩＣ−９のＥｃｏＲ Ｉ−ＡｖｒII部位に挿入したＭＢ３遺伝子を有する。それゆえ、ＭＢ３は発現タ ンパク質の分泌のためのα−因子プレプロペプチドの分泌シグナルのすぐ下流に 挿入されている。ベクター配列は大文字で示してあり、一方、ＭＢ３配列は小文 字で示してある。 図１９Ａ、図１９Ｂおよび図１９Ｃ：クローンｐｎｖ３５０のＤＮＡ配列。こ のクローンは、インビトロジェンの発現ベクターであるｐＰＩＣ−９ＫのＥｃｏ ＲＩ−ＡｖｒII部位に挿入したＭＢ３遺伝子を有する。それゆえ、ＭＢ３は発現 タンパク質の分泌のためのα−因子プレプロペプチドの分泌シグナルのすぐ下流 に挿入されている。ベクター配列は大文字で示してあり、一方、ＭＢ３配列は小 文字で示してある。 図２０：ＧＡＭＰＮＴＴ−単量体およびＧＡＭＰ−ＴＴコンジュゲートの吸光 度スペクトル（エレクトロフェログラム（electropherogram））を示すグラフ。 図２１：ＧＣＭＰ、ＴＴ−単量体およびＧＣＭＰ−ＴＴコンジュゲートの吸光 度スペクトル（エレクトロフェログラム）を示すグラフ。 図２２：１価（Ａ）および３価（Ａ／Ｂ／Ｃ）の髄膜炎菌コンジュゲートワク チンによりマウスで引き起こされたＡ特異的なＩｇＧＥＬＩＳＡ力価を示すグラ フ。 図２３：１価（Ａ）および３価（Ａ／Ｂ／Ｃ）の髄膜炎菌コンジュゲートワク チンによりマウスで引き起こされたＢ特異的なＩｇＧＥＬＩＳＡ力価を示すグラ フ。 図２４：１価（Ａ）および３価（Ａ／Ｂ／Ｃ）の髄膜炎菌コンジュゲートワク チンによりマウスで引き起こされたＣ特異的なＩｇＧＥＬＩＳＡ力価を示すグラ フ。 図２５：１価（Ａ）および３価（Ａ／Ｂ／Ｃ）の髄膜炎菌コンジュゲートワク チンによりマウスで引き起こされたＡ特異的な殺菌作用を示すグラフ。 図２６：１価（Ａ）および３価（Ａ／Ｂ／Ｃ）の髄膜炎菌コンジュゲートワク チンによりマウスで引き起こされたＢ特異的な殺菌作用を示すグラフ。 図２７：１価（Ａ）および３価（Ａ／Ｂ／Ｃ）の髄膜炎菌コンジュゲートワク チンによりマウスで引き起こされたＣ特異的な殺菌作用を示すグラフ。 発明の詳細な説明 ナイセリア・メニンギチジスの外膜グループＢポーリンタンパク質を大腸菌か ら発現および精製するうえでの困難性の幾つかを克服することが可能である。成 熟ポーリンタンパク質、たとえばクラス２およびクラス３並びにその融合タンパ ク質のＤＮＡ配列を、髄膜炎菌の染色体をＰＣＲ反応の鋳型として用いて増幅さ せた。増幅させたポーリン配列をＴ７プロモーターを含む発現ベクター中にライ ゲートおよびクローニングした。ＤＥ３ラムダファージに対して溶原性の大腸菌 株ＢＬ２１（ステュディエ（Studier）およびモファット（Moffatt）、J.Mol.Bi ol.１８９：１１３〜１３０（１９８６））を修飾してｏｍｐＡ遺伝子を除去し たものを、ポーリン遺伝子を含むｐＥＴ−１７ｂプラスミドのための一つの発現 宿主として選択した。誘発させると大量の髄膜炎菌ポーリンタンパク質が宿主菌 に対して明らかな致死作用を示すことなく大腸菌内に蓄積した。発現した髄膜炎 菌ポーリンタンパク質を標準法により抽出および処理し、最終的に分子ふるいク ロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。分子ふ るいクロマトグラフィーからのタンパク質プロフィールからわかるように、組換 え髄膜炎菌ポーリンは三量体としてカラムから溶出した。かかる高発現が可能と なるようにＰＣＲ人工産物が髄膜炎菌ポーリン遺伝子中に導入されていないこと を確認するため、挿入したＰｏｒＢ遺伝子配列を決定した。発現された組換えポ ーリンタンパク質がその天然の抗原性で三量体のコンフォメーションに再生され ているというさらなる証拠を得るために抑制ＥＬＩＳＡアッセイを用いた。 細菌性の大腸菌宿主系に代わるものとして、髄膜炎菌Ｂクラス３ポーリンタン パク質（ＭＢ３）を酵母中で発現させることができる。好ましい宿主はメチロト ローフの酵母ピキア・パストリスであり、このものはインビトロジェンにより開 発されたピキア発現キットで形質転換されてよい。酵母は異種タンパク質の産生 のための魅力的な宿主である。原核細胞系とは違って酵母の真核性細胞下機構は 、「真性の」かつ生物活性なタンパク質を産生するのに必要な翻訳後再生、プロ セシングおよび修飾事象の多くを行うことを可能にする。真核細胞としてピキア ・パストリスは高等な真核細胞発現系の利点の多くを有する一方、大腸菌やサッ カロミセス・セレビシエと同じくらい取り扱いが容易である。酵母としてピキア ・パストリスはサッカロミセス属と同様の分子および遺伝子操作の利点を有する とともに、１０倍〜１００倍高い異種タンパク質の発現レベルおよび高等な真核 生物のタンパク質プロセシング特性という利点をも有する。 ピキアでの発現はまた他の酵母菌での発現と比べても利点を有する。なぜなら ピキアはサッカロミセス・セレビシエがするようにタンパク質を過度にグリコシ ル化することはないからである。さらに、ピキア中で発現および修飾されたタン パク質はサッカロミセス・セレビシエにより産生されたものより治療学的にも一 層有用である。というのはピキアにより付加されるオリゴ糖は、サッカロミセス ・セレビシエにより産生されるタンパク質の高抗原性の主たる原因であると思わ れるα１,３グリカン結合を欠くからである。臨床的に使用されているＢ型肝炎 表面抗原を含む幾つかのワクチン抗原が酵母菌体で産生されている（クレッグ（ Cregg）ら、Bio/Technology １１：９０５〜９１０（１９９３））。 大腸菌および少数の他のグラム陰性細菌のポーリンタンパク質と異なり、ナイ セリアからのポーリンの一次配列における変化がそのイオン選択性、電位差依存 性、および他の生物物理学的機能にどのような影響を及ぼすかについては比較的 ほとんどわかっていない。最近、２つの大腸菌ポーリンであるＯｍｐＦおよびＰ ｈｏＥの結晶構造が、それぞれ２.４Åおよび３.０Åに解像された（コーワン（ Cowan,S.W.）ら、Nature ３５８：７２７〜７３３ （１９９２））。これら大 腸菌ポーリンの両方とも、その異常な安定性および分子遺伝学操作を容易に行え ることのため、詳しく研究されている。これら２つのポーリンの遺伝学について 得られたデータは、結晶構造と良い相関関係を示した。ナイセリアのポーリンを 選択するためにモノクローナル抗体を用いた幾つかの研究においてナイセリアの 表面トポロジーがこれら２つの大腸菌ポーリンのトポロジーと極めて類似してい るということが示されているが（ファン・デア・レイ（van der Ley,P.）ら、In fect.Immun.５９：２９６３〜２９７１（１９９１））、大腸菌のポーリンにつ いて知られているように（コーワンら、Nature ３５８：７２７〜７３３（１９ ９２））、ナイセリアのポーリンの特定領域中のアミノ酸配列の変化がその生物 物理学的特性にどのような影響を及ぼすかについてはほとんど何の情報も得られ ていない。 この研究の障害となっている主要な問題を２つ挙げると、以下の通りである： （１）近代分子技術によりナイセリアの遺伝子操作を容易に行えないこと、およ び（２）さらに精製して生物物理学的および生化学的特性データを得るために充 分な量のナイセリアポーリンを大腸菌または酵母中で発現させることができない こと。実際、淋菌および髄膜炎菌のポーリンにおけるＤＮＡ配列データのほとん どは、該ポーリン遺伝子の重複断片をクローニングし、ついで得られた情報を再 構築して全体の遺伝子配列を明らかにすることによって得られている（ゴットシ ュリッヒら、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ ８４：８１３５〜８１３９（１９８７ ）；ムラカミら、Infect.Immun.５７：２３１８〜２３２３（１９８９））。カ ーボネッティらは初めて、厳しく制御したｐＴ７−５発現プラスミドを用いて淋 菌の全ポーリン遺伝子を大腸菌中にクローニングした。これら研究の結果は、該 ポーリン遺伝子を誘発させたときにポーリンタンパク質はごくわずかしか蓄積せ ず、このタンパク質の発現は大腸菌にとって致死性であることを示した（カーボ ネッティおよびスパーリング、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ ８４：９０８４〜９ ０８８（１９８７））。別の研究においてカーボネッティらは（Proc.Natl.Acad .Sci.ＵＳＡ ８５：６８４１〜６８４５（１９８８）、淋菌のポーリン遺伝子に おける変化をこの系において大腸菌中で起こさせ、ついで淋菌中に再導入するこ とができることを示した。しかしながら、これら操作を容易に行うことができる こと、およびさらに生化学的および生物物理学的特徴付けのために充分なポーリ ンタンパク質を容易に得ることができることについては限度があるように思われ る。 フィーバーズらは、ポーリン遺伝子の５'末端および３'末端の共通配列に対し て２つの合成オリゴヌクレオチドを用い、広範囲の採取源からナイセリアのポー リン遺伝子をＰＣＲにより増幅する方法を記載している（フィーバーズら、Infe ct.Immun.６０；３６２０〜３６２９（１９９２））。オリゴヌクレオチドの構 築は、増幅されたＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼＢｇｌIIおよびＸｈｏＩを用 いてプラスミド中に強制的にクローニングし得るようにして行った。 このフィーバーズらのＰＣＲ系を用い、髄膜炎菌株８７６５血清型１５からの 成熟ＰｏｒＢタンパク質のＤＮＡ配列を増幅し、Ｔ７発現プラスミドｐＥＴ−１ ７ｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位中にライゲートした。このことにより、成熟Ｐ ｏｒＢタンパク質配列は、Ｔ７プロモーターおよびリーダー配列を含むφ１０タ ンパク質の２０アミノ酸のすぐ後ろにインフレームで配置されることとなった。 このプラスミドを含む大腸菌の培養液にＩＰＴＧを加えると、大量のＰｏｒＢタ ンパク質が該細菌中に蓄積した。なぜ該構築物が大腸菌にとって致死性でなく、 大量のポーリンタンパク質が発現されるのかについての完璧な説明は今後の研究 に待たなければならない。しかしながら、一つの可能な仮説は、これらナイセリ アのプロモーターおよびシグナル配列をＴ７およびφ１０のものとそれぞれ置換 することによって、ポーリン産物が外膜よりもむしろ細胞質の方へ向けられたと いうことである。ヘニング（Henning）および彼の共同研究者は、大腸菌のＯｍ ｐＡタンパク質およびその断片が発現された場合に、細胞質中に認められる産物 はペリプラズム空間に向けられた産物よりも毒性が低いことを報告している（ク ローズ（Klose,M.）ら、J.Biol.Chem.２６３：１３２９１〜１３２９６（１９８ ８）；クローズら、J.Biol.Chem.２６３：１３２９７〜１３３０２（１９８８） ；フロイドル（Freudl,R.）ら、J.Mol.Biol.２０５：７７１〜７７５（１９８９ ））。説明がいかようであれ、いったんＰｏｒＢタンパク質が発現されたら、容 易に単離、精製され、天然のポーリンと全く同様に３量体に再生すると思われる 。ヒト免疫血清を用いた抑制ＥＬＩＳＡデータの結果は、このようにして得られ たＰｏｒＢタンパク質が、髄膜炎菌から精製した野性型のＰｏｒＢタンパク質の 抗原特性のすべてではないにしてもそのほとんどを再獲得することを示唆してい る。この発現系は、それ自体、近代の分子技術によるナイセリアのポーリン遺伝 子の操作を容易にするものである。加えて、この発現系は、特徴付けのために純 粋なポーリンタンパク質を大量に得ることを可能にする。加えて、この発現系は 、淋菌および髄膜炎菌の両方のナイセリアの多くの株からの遺伝子を同様の仕方 で調べ特徴付けることを可能にする。 血清型Ｂからのナイセリア・メニンギチジス外膜クラス３タンパク質（ＭＢ３ ）はまた、ＭＢ３ ＤＮＡ断片を強力なピキア・パストリスアルコールオキシダ ーゼプロモーターＡＯＸＩの制御下におくことによりメチロトローフ酵母ピキア ・パストリス中でも発現した。メタノールで誘発すると、組換えプラスミドで形 質転換したピキア・パストリスの株は天然ＭＢ３タンパク質かまたは融合ＭＢ３ タンパク質のいずれかを産生し、これらタンパク質は野生型の対応物に対して産 生させたマウスポリクローナル抗体と反応性であった。振盪フラスコ培養におい て、 遺伝子操作したピキア・パストリスはペレット化した湿潤細胞１ｇ当たり約１〜 ３ｍｇまたは１リットル当たり１００〜６００ｍｇの発現タンパク質を産生した が、これは酵母細胞懸濁液の１０〜１５％あるいは全細胞タンパク質の約３〜５ ％に相当した（表４）。完全長のＭＢ３ ＮＡをインビトロジェンにより開発さ れた４つのピキア発現ベクターのそれぞれにクローニングした。単量体の完全サ イズ３４ｋＤａのＭＢ３タンパク質を発現させるため、細胞内ｐＨＩＬ−Ｄ２ベ クターを用いた。ｐＨＩＬ−Ｄ２ベクターの地図はピキア発現キット、バージョ ンＥのインビトロジェン解説マニュアル（その全内容を参照のため本明細書中に 引用する）の１９頁に記載されている。この構築物は最大の発現レベル（細胞１ ｇ当たり３ｍｇまでのＭＢ３）を与えた（表３および４）。発現された産物は分 泌されず、主として（９５％）不溶性であり、細胞膜に堅固に結合していた。 発現されたＭＢ３の分泌の可能性をさらに高めるため、異なる分泌シグナルを 有する３つの他のベクターも用いた：酸性ホスファターゼ遺伝子ＰＨＯ１からの 天然のピキア・パストリスシグナル配列を含むｐＨＩＬ−Ｓ１、およびサッカロ ミセス・セレビシエのα−交配因子プレプロペプチドからの分泌シグナルを含む ベクターｐＰＩＣ９およびｐＰＩＣ９Ｋ。ｐＨＩＬ−Ｓ１およびｐＰＩＣ９ベク ターの地図は、ピキア発現キット、バージョンＥのインビトロジェン解説マニュ アルの２１〜２２頁に記載されている。ｐＨＩＬ−Ｓ１／ＭＢ３構築物は見かけ の分子量が３６.５ｋＤａのＭＢ３−ＰＨＯ１融合ポリペプチドを発現させ、該 ポリペプチドは部分的にプロセシングを受けて成熟３４ｋＤａ ＭＢ３を生成す ることがわかった。発現されたＭＢ３のうち約５〜１０％が酵母増殖培地へ分泌 され、３６.５ｋＤａ融合ポリペプチドのうち約４０〜５０％が開裂された（表 ４）。ｐＰＩＣ９／ＭＢ３またはｐＰＩＣ９Ｋ／ＭＢ３構築物により形質転換さ れたピキア組換え体はα−因子と融合したＭＢ３のみを発現し、約４５ｋＤａの 融合ポリペプチドを生成した。この融合タンパク質の開裂またはプロセシングに ついてのいかなる証拠もなかった。 組換えＭＢ３（ｐＨＩＬ−Ｄ２／ＭＢ３含有形質転換体）の単離および精製に 関する予備的な研究は、ピキア・パストリス中で発現したときにＭＢ３は天然の 条件下では三量体を形成すること、および該天然タンパク質がトリプシン消化に 対して耐性であることを示唆している。これら結果は野生型の対応物について観 察された結果と同じである。 ＭＢ３の発現収量の増大は、多コピーのMB３発現カセットを含むピキアの株を 用いることにより得られる。多コピーを含む株は形質転換した細胞集団内に＜１ ０％の頻度で天然に存在する。これら株は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥもしくはイムノブ ロッティングによりＭＢ３の発現レベルについて多数の形質転換体を直接スクリ ーニングするか、または多コピーのＭＢ３遺伝子を含むクローンを選択するため の「ドットブロット」ハイブリダイゼーションにより間接的にスクリーニングす ることにより同定できる（クレッグら、Bio/Technology １１：９０５〜９１０ （１９９３））。別法として、このような多導入クローンの構築は、カセット挿 入工程の繰り返しにより所望の遺伝子の多コピーをクローニングすることを可能 にする新規なｐＡＯ８１５ベクター（インビトロジェン）を用いて行うことがで きる（同書、９０７頁）。発酵槽を用いたスケールアップ手順は、酵母菌体密度 を高め、それゆえ発現タンパク質の収量を少なくとも５〜１０倍改善するであろ う。タンパク質発現の最適化（すなわち、増殖培地の組成、緩衝能、カザミノ酸 の補充、メタノール濃度の増加など）は通常の実験手順により行うことができる 。 多コピーのＭＢ３を有するピキア形質転換体を同定する他の方法は、ピキア発 現ベクターｐＰＩＣ９ＫがＧ４１８に対する耐性を付与するカナマイシン耐性遺 伝子を有するという事実を利用するものである；他の点ではｐＰＩＣ９ＫはｐＰ ＩＣ９に対応する。ついで、多挿入事象の自然発生はＧ４１８に対する耐性レベ ルにより同定することができる。ピキア形質転換体はヒスチジン欠失培地にて選 択され、Ｇ４１８に対する耐性レベルについてスクリーングする。Ｇ４１８に対 する耐性レベルの増大は多コピーのカナマイシン耐性遺伝子を示している。 それゆえ、本発明は、外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質、とりわけ クラス２およびクラス３ポーリンタンパク質の発現方法に関する。 一つの態様において、本発明は、 （ａ）選択可能なマーカーおよび （i）成熟ポーリンタンパク質、および （ii）Ｔ７遺伝子φ１０カプシドタンパク質のアミノ酸１〜２０または２２に融 合した成熟ポーリンタンパク質を含む融合タンパク質、 よりなる群から選ばれたタンパク質をコードする遺伝子を含むべクターで大腸菌 を形質転換し、 その際、該遺伝子は該Ｔ７プロモーターに作動可能に連結しており、 （ｂ）該形質転換した大腸菌を選択剤を含む培地中で培養し、ついで （ｃ）該タンパク質の発現を誘発させる、 その際、そのようにして産生された該タンパク質は該大腸菌中で発現された全タ ンパク質の２％以上を占める ことを特徴とする、外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質の大腸菌中での 発現方法に関する。 好ましい態様において、発現された髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質ま たは融合タンパク質は、大腸菌中で発現された全タンパク質の約５％以上を占め る。他の好ましい態様において、発現された髄膜炎菌グループＢポーリンタンパ ク質または融合タンパク質は、大腸菌中で発現された全タンパク質の約１０％以 上を占める。さらに別の好ましい態様において、発現された髄膜炎菌グループＢ ポーリンタンパク質または融合タンパク質は、大腸菌中で発現された全タンパク 質の約３０％以上を占める。 Ｔ７誘発性プロモーターを含むプラスミドの例としては、発現プラスミドｐＥ Ｔ−１７ｂ、ｐＥＴ−１１ａ、ｐＥＴ−２４ａ−ｄ（＋）およびｐＥＴ−９ａが 挙げられ、これらはすべてノバジェン（Novagen）（ウイスコンシン５３７１１ 、マジソン、サイエンス・ドライブ、５６５番地）から市販されている。これら プラスミドは、順番にＴ７プロモーター、任意にｌａｃオペレーター、リボソー ム結合部位、構造遺伝子の挿入を可能とするための制限部位、およびＴ７終止配 列を含む。ノバジェンカタログ、３６〜４３頁（１９９３）参照。 好ましい態様において、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｏｍｐＡを用いる。上 記プラスミドは、この株または野性型株ＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換するこ とができる。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｏｍｐＡが好ましい。というのは、 この株では精製ポーリンタンパク質に混入し所望でない免疫原副作用を引き起こ すかもしれないＯｍｐＡタンパク質が産生されないからである。 形質転換した大腸菌を、選択剤、たとえば大腸菌が感受性のアンピシリンなど のβ−ラクタムを含む培地中で増殖させる。ｐＥＴ発現ベクターは、形質転換さ れた生物に抗生物質耐性を付与する選択マーカーを提供する。 髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質の高レベル発現は大腸菌中で毒性であ りうる。驚くべきことに、本発明は、大腸菌が全細胞性タンパク質の少なくとも ほぼ３０％で＞５０％もの高レベルのタンパク質を発現することを可能にする。 他の態様において、本発明は、 （ａ）選択可能なマーカーを有するプラスミド中に、 （i）成熟ポーリンタンパク質、および （ii）酵母分泌シグナルペプチドに融合した成熟ポーリンタンパク質を含む融 合タンパク質、 よりなる群から選ばれたタンパク質をコードする遺伝子をライゲートし、 その際、該遺伝子は酵母プロモーターに作動可能に連結しており、 （ｂ）該遺伝子を含む該プラスミドを酵母株中に形質転換し、 （ｃ）該形質転換した酵母の選択を可能にする培地中で増殖させることによって 該形質転換した酵母を選択し、 （ｄ）該形質転換した酵母を増殖させ、ついで （ｅ）該タンパク質の発現を誘発することによってを該タンパク質を含む酵母を 得る、 ことを特徴とする、外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質の酵母中での発 現方法に関する。 酵母宿主の形質転換は、当業者によく知られた幾つかの技術のいずれかにより 行うことができる。これら技術としては、細胞壁を部分的または完全に破壊して スフェロプラストを形成した酵母菌体の直接またはリポソーム媒体形質転換、ア ルカリカチオンおよびＰＥＧによる宿主の処理、およびＰＥＧ処理と組み合わせ た凍結−解凍が挙げられる（ウェーバー（Weber）ら、Nonconventional Yeasts ：Their Genetics and Biotechnological Applications,ＣＲＣ Crit.Rev.Biote chnol.７：２８１、３１７（１９８８）およびその引用文献、すべて参照のため 本明細書中に引用する）。 他の好ましい態様において、発現された成熟ポーリンタンパク質または融合タ ンパク質は、酵母宿主中で発現された全タンパク質の約２％以上を占める。さら に他の好ましい態様において、発現された成熟ポーリンタンパク質または融合タ ンパク質は、酵母宿主中で発現された全タンパク質の約３〜５％を占める。 他の好ましい態様において、成熟ポーリンタンパク質は血清グループＢからの ナイセリア・メニンギチジス成熟外膜クラス３タンパク質である。 他の好ましい態様において、本発明は、外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタン パク質または融合タンパク質を酵母中で発現させる上記方法において、該酵母が 、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharo myces pombe）、サッカロミセス・ウバルム（Saccharomyces uvarum）、サッカ ロミセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロ ミセス・ジアスタチクス（Saccharomyces diastaticus）、カンジダ・トロピカ リス（Candida tropicalis）、カンジダ・マルトサ（Candida maltosa）、カン ジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）、ピキア・パストリス、ピキア ・ファリノサ（Pichia farinosa）、ピキア・ピヌス（Pichia pinus）、ピキア ・バンリジイ（Pichia varijii）、ピキア・ファーメンタンス（Pichia ferment ans）、ピキア・ギリエルモンディイ（Pichia guilliermondii）、ピキア・スチ ピチス（Pichia stipitis）、サッカロミセス・テルリス（Saccharomyces ellur is）、カンジダ・ユーティリス（Candida utilis）、カンジダ・ギリエルモンデ ィイ（Candida guilliermondii）、ハンセヌラ・ヘンリチイ（Hansenula henric ii）、ハンセヌラ・カプスラタ（Hansenula capsulata）、ハンセヌラ・ポリモ ーファ（Hansenula polymorpha）、ハンセヌラ・サツルヌス（Hansenula saturn us）、リポミセス・コノネンコエ （Lypomyces kononenkoae）、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Kluyveromyc es marxianus）、カンジダ・リポリティカ（Candida lipolytica）、サッカロミ コプシス・フィブリゲラ（Saccaromycopsis fibuligera）、サッカロミコデス・ ルドウィギイ（Saccharomycodes ludwigii）、サッカロミセス・クルイベリ（Sa ccharomyces kluyveri）、トレメラ・メセンテリカ（Tremella mesenterica）、 チゴサッカロミセス・アシドファシエンス（Zygosaccharomyces acidofaciens） 、チゴサッカロミセス・ファーメンタチ（Zygosaccharomyces fermentati）、ヤ ロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、およびチゴサッカロミセス ・ソヤ（Zygosaccharomyces soja）よりなる群から選ばれる方法を行うことに関 する。これら酵母宿主の多くはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション 、ロックビル、メリーランドから入手できる。 他の好ましい態様において、成熟ポーリンタンパク質または融合タンパク質を コードする遺伝子のヌクレオチド配列は、酵母のコドン使用頻度を最適化したコ ドンを含む。さらに他の好ましい態様において、酵母のコドン使用頻度を最適化 した成熟ポーリンタンパク質または融合タンパク質をコードする遺伝子のヌクレ オチド配列は、ヌクレオチド配列配列番号：２６である。 他の好ましい態様において、酵母の分泌シグナルペプチドは、サッカロミセス ・セレビシエのα−交配因子プレプロペプチドの分泌シグナルおよびピキア・パ ストリスの酸性ホスファターゼ遺伝子の分泌シグナルよりなる群から選ばれる。 他の好ましい態様において、酵母は該タンパク質または融合タンパク質を分泌 する。 他の好ましい態様において、該遺伝子が作動可能に連結される酵母プロモータ ーは、ＡＯＸ１プロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター 、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３）プロモーター 、ＡＤＨＩプロモーター、ＭＦα１プロモーター、およびＧＡＬ１０プロモータ ーよりなる群から選ばれる。ＡＯＸ１プロモーターを含むプラスミドの例として は、発現プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ９、およびｐＰ ＩＣ９Ｋが挙げられる。これらプラスミドは、順番にＡＯＸ１プロモーター、構 造遺 伝子の挿入を可能とする制限部位、ＡＯＸ１転写終止断片、ＨＩＳ４（ヒスチジ ノールデヒドロゲナーゼ）をコードするオープンリーディングフレーム、アンピ シリン耐性遺伝子、およびＣｏｌＥ１複製起点を含む。さらに、プラスミドｐＰ ＩＣ９およびｐＰＩＣ９Ｋはサッカロミセス・セレビシエのα−因子分泌シグナ ルを含み、プラスミドｐＨＩＬ−Ｓ１はピキア・パストリスのＰＨＯ１分泌シグ ナルを含む。ｐＰＩＣ９Ｋはまたカナマイシン耐性遺伝子を含み、これはピキア においてＧ４１８に対する耐性を付与する。ピキア形質転換体におけるＧ４１８ 耐性レベルはまた、多挿入事象を受けた細胞を同定するのにも用いることができ る。これは１〜１０％の頻度で起こる。Ｇ４１８に対する耐性レベルの増大は、 多コピーのカナマイシン耐性遺伝子および目的遺伝子の存在を示す。ノバジェン カタログ、バージョンＥ、１９〜２２頁（１９９５）を参照。 他の好ましい態様において、特別の栄養要求性を引き起こす変異を適当なマー カー遺伝子中に有する酵母宿主株を用いる。ついで、変異した遺伝子の機能的な コピーおよび髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパク質のコ ピーを有する発現プラスミドを該酵母宿主株中に形質転換し、要求される栄養を 欠く培地で増殖する能力に基づいて形質転換体を選択する。適当なマーカー遺伝 子としては（サッカロミセス・セレビシエ表記を併記）、イミダゾールグリセロ ールリン酸デヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ３）をコードする遺伝子、リンゴ酸ベータ −イソプロピルデヒドロゲナーゼ（ＬＥＵ２）をコードする遺伝子、トリプトフ ァンシンターゼ（ＴＲＰ５）をコードする遺伝子、アルギニノコハク酸リアーゼ （ＡＲＧ４）をコードする遺伝子、Ｎ−（５'−ホスホリボシル）アントラニル 酸イソメラーゼ（ＴＲＰ１）をコードする遺伝子、ヒスチジノールデヒドロゲナ ーゼ（ＨＩＳ４）をコードする遺伝子、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラ ーゼ（ＵＲＡ３）をコードする遺伝子、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（Ｕ ＲＡ１）をコードする遺伝子、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）をコードする遺伝 子、およびアルファ−アミノアジピン酸レダクターゼ（ＬＹＳ２）をコードする 遺伝子が挙げられる。形質転換した酵母宿主細胞を適当な栄養を欠く培地で増殖 する能力に基づいて選択した後、正しい遺伝子座での髄膜炎菌グループＢポーリ ンタ ンパク質または融合タンパク質の組み込みについて細胞をスクリーニングする。 このスクリーニングは当業者によく知られた方法により、たとえば、形質転換確 認用に栄養を欠きＡＯＸ１プロモーターから外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタ ンパク質または融合タンパク質の発現を誘発するためにメタノールを含む培地で ゆっくりと増殖する形質転換体を選択することにより行う。ついで、これら形質 転換体をグリセロール含有培地中で増殖させ、ついでメタノールの添加により髄 膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパク質の発現を誘発させる 。 さらに好ましい態様において、ピキア・パストリス宿主株ＧＳ１１５またはＫ Ｍ７１を用いる。これら株はヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｈｉｓ４ ）に変異を有するため、ヒスチジンを合成することができない。発現プラスミド ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ９およびｐＰＩＣ９ＫはＨＩＳ４遺 伝子を有するため、宿主のｈｉｓ４を補足し、ヒスチジン欠失培地での形質転換 体の選択を可能にする。形質転換したピキア・パストリス宿主細胞をヒスチジン 欠失培地で選択した後、ｈｉｓ^-、メタノール⁺プレート上でゆっくりと増殖する 形質転換体について選択することにより正しい遺伝子座での髄膜炎菌グループＢ ポーリンタンパク質または融合タンパク質の組み込みについて細胞をスクリーニ ングする。これら形質転換体はＭＢ３遺伝子が宿主ゲノム中に挿入したときにＡ ＯＸ１遺伝子座において変異を起こしたものであり、より効率の悪いＡＯＸ２遺 伝子産物でメタノールを代謝するためにメタノール上でゆっくりとしか増殖でき ない。ついで、これら形質転換体をグリセロール含有培地で増殖させ、ついでメ タノールの添加により髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパ ク質の発現を誘発させる。 最も好ましい態様において、本発明は、外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタン パク質を酵母中で発現させる上記方法において該酵母がピキア・パストリスであ る方法を行うことに関する。 他の好ましい態様において、本発明は、薬理学的に許容しうる希釈剤、担体ま たは賦形剤とともに、上記方法によって産生された外膜髄膜炎菌グループＢポー リンタンパク質またはその融合タンパク質を含む、動物において免疫応答を誘発 するためのワクチンに関し、その際、該ワクチンは、動物においてナイセリア・ メニンギチジスに対する免疫応答を誘発するのに有効な量にて投与する。好まし い態様において、動物は、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジおよびニワトリよりなる群 から選ばれる。他の好ましい態様において、動物はヒトである。 他の好ましい態様において、本発明は、該外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタ ンパク質またはその融合タンパク質が髄膜炎菌グループＢ莢膜多糖（ＣＰ）に結 合した上記ワクチンに関する。そのような莢膜多糖は、アシュトン（Ashton,F.E .）ら、Microbial Pathog.６：４５５〜４５８（１９８９）；ジェニングスら、 J.Immunol.１３４：２６５１（１９８５）；ジェニングスら、J.Immunol.１３７ ：１７０８〜１７１３（１９８６）；ジェニングスら、J.Immunol.１４２：３５ ８５〜３５９１（１９８9)；ジェニングスら、Current Topics in Microbiology and Immunology、１５０：１０５〜１０７（１９９０）中の「ワクチン候補と しての莢膜多糖（Capsular Polysaccharides as Vaccine Candidates）」の記載 に従って調製することができ、これら文献の内容は参照のため本明細書中に完全 に引用される。 本発明はまた、幾つかのナイセリア・メニンギチジス血清グループのいずれに 対しても免疫応答を同時に誘発しうるワクチンにも関する。それゆえ、他の好ま しい態様において、本発明は、ナイセリア・メニンギチジスの３つの異なる血清 グループのそれぞれからの莢膜多糖を含む３価ワクチンに関する。とりわけ、本 発明のワクチンは、薬理学的に許容しうる担体とともに、グループＡの髄膜炎菌 多糖（ＧＡＭＰ）抗原、グループＢの髄膜炎菌多糖（ＧＢＭＰ）抗原、およびグ ループＣの髄膜炎菌多糖（ＧＣＭＰ）抗原を含む。 好ましい態様において、グループＡの髄膜炎菌多糖（ＧＡＭＰ）抗原、グルー プＢの髄膜炎菌多糖（ＧＢＭＰ）抗原、およびグループＣの髄膜炎菌多糖（ＧＣ ＭＰ）抗原はそれぞれタンパク質担体に結合されてＧＡＭＰ、ＧＣＭＰおよびＧ ＢＭＰ多糖抗原コンジュゲートを生成する。 もちろん、当業者には、多くの担体タンパク質が本発明のワクチンに含まれる 多糖−タンパク質コンジュゲートに使用するのに適しているであろうことが理解 されるであろう。適した担体タンパク質は、哺乳動物に投与するのに安全であり 、担体として免疫学的に有効なものであろう。安全性には主たる毒性の欠如およ びアレルギー性合併症のリスクが最小であることが含まれる。 一般に、いかなる異種タンパク質も担体抗原として用い得る。かかるタンパク 質は、たとえば、天然毒素または無毒化した毒素（トキソイドともよばれる）で あってよい。さらに、抗原としては毒素と同じであるが非毒性である遺伝的に改 変したタンパク質を当業者によく知られた突然変異法により製造することができ る。かかる改変毒素は「交差反応物質」またはＣＲＭともよばれる。ＣＲＭ₁₉₇ は注目に値する。なぜなら、これは天然のジフテリア毒素とわずかに１つのアミ ノ酸残基のみが異なり、天然の毒素とは免疫学的には区別がつかないからである （アンダーソン（Anderson,P.W.）、Infect.Immun.３９：２３３〜２３８（１９ ８３））。 ワクチンの多糖−タンパク質担体コンジュゲートが幾つかの異なる方法により 製造しうることが当業者には理解されるであろう。多糖をタンパク質担体に結合 させる共有結合のタイプ、および該結合を形成する手段は当業者にはよく知られ ている。２つの残基を結合しうる化学的手段の詳細は米国特許第５,３７１,１９ ７号および同第４,９０２,５０６号（その内容をすべて参照のため本明細書中に 引用する）に記載されている。そのような方法の一つは、シュワルツ（Schwartz ）およびグレイ（Gray）により記載された還元的アミノ化法である（Arch.Bioch im.Biophys.１８１：５４２〜５４９（１９７７））。この方法は、還元性の莢 膜多糖断片を細菌毒素またはトキソイドと水素化シアノホウ素イオンまたは他の 還元剤の存在下で反応させることを含む。そのような方法は、毒素もしくはトキ ソイドまたは莢膜多糖に悪影響を与えないであろう（米国特許第４,９０２,５０ ６号）。そのような結合プロセスは以下の実施例１２〜１４にも記載されている 。 破傷風毒素およびジフテリア毒素がその安全性の歴史により担体タンパク質の 主たる候補であるが、他のタンパク質を使用することにつき当業者によく知られ た圧倒的な理由がある。たとえば、他のタンパク質は担体として一層有効である か、または製造の経費も重要である。他の候補としては、シュードモナス（pseu domonas）、スタフィロコッカス（staphylococcus）、ストレプトコッカス（str eptococcus）、パーツシス（pertussis）および毒素原性細菌（大腸菌を含む） の毒素またはトキソイドが挙げられる。グループＢ髄膜炎菌多糖を結合させるの に好ましい担体タンパク質は、グループＢナイセリア・メニンギチジスのクラス ３ポーリンタンパク質（ＰｏｒＢ）である。ＧＡＭＰ抗原およびＧＣＭＰ抗原を 結合させるのに好ましい担体タンパク質は破傷風トキソイドである。 ＧＢＭＰの免疫原性は、ヒト、とりわけヒトの幼児において限られていること 、グループＢ多糖の破傷風トキソイドへの直接の共有結合は、ウサギ（ジェニン グスおよびルゴウスキー、J.Immunol.１２７：１０１１〜１０１８（１９８１） ）またはマウス（ジェニングスら、J.Immunol.１３７：１７０８〜１７１３（１ ９８６））のいずれにおいても有意の多糖特異的な応答を引き起こすことのでき ないコンジュゲートを生成することが当該技術分野において知られている。この 失敗は、グループＢ多糖の直接化学的な修飾への関心を促した。このことは、交 差反応性のＢ多糖特異的抗体の高レベルの産生を可能とするような仕方で免疫応 答を調節しうる合成エピトープを形成するという考えのもとに行われた（ジェニ ングスら、J.Immunol.１３７：１７０８〜１７１３（１９８６））。 グループＢ多糖の可能な化学的修飾（ジェニングスら、J.Immunol.１３７：１ ７０８〜１７１３（１９８６））を選択するうえで２つの要因を考慮すべきであ ることが当業者には理解されるであろう。第一に、化学的修飾は容易に、しかも 多糖の分解を最小にしながら行うことができなければならない。第二に、交差反 応性のＢ多糖特異的抗体を産生するために、該修飾多糖のＢ多糖特異的抗体に対 する抗原性は保存されなければならない。グループＢ多糖の理想的な化学的修飾 はカルボン酸基およびＮ−カルボニル基の両者を保持しているであろうことが当 業者には理解されるであろう（ジェニングスら、J.Immunol.１３７：１７０８〜 １７１３（１９８６））。上記基準を満足する最も好ましい修飾は、Ｂ多糖のシ アル酸残基のＮ−アセチル基を強塩基で除去し、Ｎ−プロピオニル基で置換した ものである（実施例６および１４参照）。 より好ましい態様において、Ｎ−プロピオニル化ＧＢＭＰをその後に担体タン パク質に結合させる。Ｎ−プロピオニル化ＧＢＭＰの免疫原性を高めるいかなる 担体タンパク質をも用いることができるが、好ましいタンパク質担体はグループ Ｂナイセリア・メニンギチジスのクラス３外膜タンパク質（ＭＢ３、またはＰｏ ｒＢ）である。 それゆえ、さらに他の好ましい態様において、Ｎ−プロピオニル化した後にＧ ＢＭＰ抗原をＰｏｒＢに結合させる。 好ましくは、莢膜多糖（ＣＰ）は、フラッシュ（Frasch,C.E.）のBacterial V accines、Alan R.Liss,Inc.、１２３〜１４５頁（１９９０）中の「ナイセリア ・メニンギチジスワクチンの製造および制御（Production and Control of Neis seria meningitidis Vaccines）」（その内容は参照のため本明細書中に完全に 引用される）に従い、以下のようにして単離する： 変性フランツ（Franz）培地中で生物を１０〜２０時間増殖させる ↓ ５５℃にて１０分間、加熱により死滅させる 遠心分離により不活化細胞を除去する ↓ セタブロンを０.１％まで添加 培地ブロスからＣＰを沈殿 ↓ 塩化カルシウムを１Ｍまで添加 ＣＰを溶解、ついで遠心分離にかけて細胞の破片を除去する ↓ エチルアルコールを２５％まで添加 沈殿した核酸を遠心分離により除去する ↓ エチルアルコールを８０％まで添加 粗製のＣＰを沈殿させ、アルコールを除去する。 ついで、この粗製ＣＰを希酸、たとえば酢酸、ギ酸、およびトリフルオロ酢酸 （０.０１〜０.５Ｎ）で部分的に脱重合した後、ゲル濾過クロマトグラフィーに よりさらに精製して平均分子量が１０,０００〜２０,０００の多糖の混合物を得 る。ＣＰがＧＢＭＰである場合は、ついで、精製ＧＢＭＰを水素化ホウ素ナトリ ウムの存在下、ＮａＯＨでＮ−脱アセチル化し、Ｎ−プロピオニル化してＮ−Ｐ ｒ ＧＢＭＰを得る。それゆえ、本発明のコンジュゲートワクチン中に用いるこ とのできるＣＰは、ＣＰ−ポーリンタンパク質コンジュゲートの一部として用い た場合に活性な免疫を誘発する限りにおいて、ＣＰ断片、Ｎ−脱アシル化ＣＰお よびその断片、並びにＮ−Ｐｒ ＣＰおよびその断片であってよい（実施例６お よび１４参照）。 さらに好ましい態様において、本発明は、上記外膜髄膜炎菌グループＢポーリ ンタンパク質またはその融合タンパク質を得、ナイセリア・メニンギチジスから ＣＰを得、ついで該タンパク質を該ＣＰに結合させることからなる多糖コンジュ ゲートの製造方法に関する。 本発明のコンジュゲートは、ＣＰの還元性末端基を還元的アミノ化によってポ ーリンの第一級アミノ基に反応させることにより形成させることができる。還元 性基は、選択的加水分解または特異的な酸化的開裂、またはその両方により形成 させることができる。ＣＰのポーリンタンパク質への結合は、ジェニングスらの 米国特許第４,３５６,１７０号（その内容を参照のため本明細書中に完全に引用 する）に記載された方法によって行うのが好ましい。この方法は、ＣＰを過ヨウ 素酸塩で制御酸化し、ついでポーリンタンパク質を還元的にアミノ化することを 含む。 本発明のワクチンは、髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質、融合タンパク 質またはコンジュゲートワクチン、または３価ＧＡＭＰ、ＧＢＭＰおよびＧＣＭ Ｐワクチンを、投与経路に依存した有効量で含む。皮下または筋肉内経路の投与 が好ましいが、本発明の髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質、融合タンパク 質またはワクチンはまた腹腔内または静脈内経路で投与することもできる。当業 者であれば、不当な実験を行うことなく、特定の処置プロトコールに対する投与 量を容易に決定できることを評価するであろう。適当な量は、体重１ｋｇ当たり 該タンパク質２μｇ〜体重１ｋｇ当たり１００μｇの範囲にあることが期待され るであろう。 それゆえ、好ましい態様において、本発明のワクチンは、約２μｇのＧＡＭＰ 、ＧＣＭＰおよびＧＢＭＰ多糖抗原コンジュゲートを含む。 他の好ましい態様において、本発明のワクチンは、約５μｇのＧＡＭＰ、ＧＣ ＭＰおよびＧＢＭＰ多糖抗原コンジュゲートを含む。 さらに他の好ましい態様において、本発明のワクチンは、約２μｇのＧＡＭＰ およびＧＣＭＰ多糖抗原コンジュゲート、および約５μｇのＧＢＭＰ多糖抗原コ ンジュゲートを含む。 本発明のワクチンは、経口投与のためのカプセル剤、液剤、懸濁化剤またはエ リキシル剤などの剤型で、または液剤または懸濁化剤などの滅菌した液状剤型に て用いることができる。食塩水やリン酸緩衝食塩水などのあらゆる不活性な担体 を用いるのが好ましく、また髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質、融合タン パク質またはコンジュゲートワクチンが適当な溶解特性を有するあらゆる担体を 用いるのが好ましい。ワクチンは、１回投与製剤の形態または大量ワクチン接種 プログラムに用いることのできるバイアル（multi-dose）フラスコとすることが できる。ワクチンの調製法および使用法については、レミングトンのP harmaceu tical Sciences、マック・パブリッシング、イーストン、ペンシルベニア、オソ ル（Osol）編（１９８０）；およびNew Trends and Developments in Vaccines 、ボラー（Voller）ら（編）、ユニバーシティー・パーク・プレス、ボルチモア 、メリーランド（１９７８）を参照。 本発明のワクチンは、ポーリン特異的な抗体の産生を促進するアジュバントを さらに含んでいてよい。そのようなアジュバントとしては、フロイントの完全ア ジュバント（ＣＦＡ）、ステアリルチロシン（ＳＴ、米国特許第４,２５８,０２ ９号参照）、ＭＤＰとして知られるジペプチド、サポニン、水酸化アルミニウム およびリンパ球サイトカインなどの種々の油状調合物が挙げられるが、これらに 限られるものではない。 フロイントのアジュバントは鉱油および水の乳濁液を免疫原性物質と混合した ものである。フロイントのアジュバントは強力ではあるが、通常、ヒトには投与 しない。代わりに、アジュバントのアルム（水酸化アルミニウム）またはＳＴを ヒトへの投与用に用いる。髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質またはそのコ ンジュゲートワクチンは水酸化アルミニウム上に吸着され、そこから注射後にゆ っ くりと放出される。髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質またはグループＡ、 ＢおよびＣ髄膜炎菌多糖コンジュゲートワクチンはまた、フラートン（Fullerto n）の米国特許第４,２３５,８７７号に従ってリポソーム中に包括することもで きる。 他の好ましい態様において、本発明は、本発明の方法に従って製造した本発明 のワクチンを免疫応答を引き起こすのに充分な量で動物に投与することからなる 、動物において免疫応答を誘発する方法に関する。 他の態様において、本発明は、形質転換した大腸菌を溶解させて髄膜炎菌グル ープＢポーリンタンパク質または融合タンパク質を不溶性の封入体の一部として 放出させ、該封入体を緩衝液で洗浄して混入する大腸菌の細胞性タンパク質を除 去し、該封入体を変性剤の水溶液中に再懸濁および溶解し、得られた溶液を界面 活性剤中に希釈し、ついで可溶化された髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質 をゲル濾過により精製することを特徴とする、上記外膜髄膜炎菌グループＢポー リンタンパク質または融合タンパク質の精製方法に関する。 溶解工程は当業者に知られたいかなる方法によっても行うことができ、たとえ ば、超音波処理、酵素消化、浸透圧ショック、またはマルプレス（mull press） に通すことによって行うことができる。 封入体の洗浄は、髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質を含む封入体は可溶 化することなく大腸菌の細胞性タンパク質を可溶化することができる緩衝液であ ればいずれも使用できる。そのような緩衝液としては、ＴＥＮ緩衝液（５０ｍＭ トリスＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８.０）、トリシ ン、ビシンおよびＨＥＰＥＳが挙げられるが、これらに限られるものではない。 本発明の実施に使用できる変性剤としては、２〜８Ｍの尿素または約２〜６Ｍ のグアニジンＨＣｌ、さらに好ましくは４〜８Ｍの尿素または約４〜６Ｍのグア ニジンＨＣｌ、および最も好ましくは約８Ｍの尿素または約６ＭのグアニジンＨ Ｃｌが挙げられる。 可溶化された髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質を希釈するのに使用する ことのできる界面活性剤の例としては、ＳＤＳおよびセタブロン（カルバイオケ ム（Calbiochem））などのイオン性界面活性剤；トゥイーン、トリトンＸ、ブリ ジ３５およびオクチルグルコシドなどの非イオン性界面活性剤；３,１４−ツビ ッタージェント（Zwittergent）、エンピゲン（empigen）ＢＢおよびシャンプス （Champs）などの双イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限られるもの ではない。 最後に、可溶化された外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質をゲル濾過 により精製して高分子量物質および低分子量物質を分離させる。濾過ゲルのタイ プとしては、セファクリル−３００、セファロースＣＬ−６Ｂ、およびバイオ− ゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）Ａ−１.５ｍが挙げられるが、これらに限られるもので はない。カラムの溶出は、可溶化タンパク質の希釈に用いた緩衝液を用いて行う 。ついで、ポーリンまたはその融合タンパク質を含むフラクションをゲル電気泳 動によって同定し、フラクションをプールし、透析し、濃縮する。 最後に、濃縮したフラクションをＱセファロース高速カラムに通すことにより 実質的に純粋な（＞９５％）ポーリンタンパク質および融合タンパク質を得るこ とができる。 他の態様において、本発明は、誘発性であるＴ７プロモーターを含むベクター の一部である髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質遺伝子の発現に関する。プ ロモーターが誘発性である場合には、転写速度は誘発剤に応答して増加する。Ｔ ７プロモーターは培地にイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴ Ｇ）を加えることによって誘発することができる。代わりに、Ｔａｃプロモータ ーまたは熱ショックプロモーターを用いることができる。髄膜炎菌グループＢポ ーリンタンパク質遺伝子の発現は、ｐＥＴ−１７発現ベクターまたはｐＥＴ−１ １ａ発現ベクター（両ベクターともＴ７プロモーターを含む）から行うのが好ま しい。 髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質遺伝子または融合タンパク質遺伝子の 発現ベクター中へのクローニングは、ライゲーションのための平滑末端化または 粘着末端化、制限酵素消化による適当な末端の生成、粘着末端を適当に充填する こと、所望でない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および適 当なリガーゼによるライゲーションを含む常法に従って行うことができる。クロ ーニングの一般法に関しては、サンブルック（Sambrook）らのモレキュラー・ク ローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning：A Laborator y Manual）、第２版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、コールドス プリングハーバーラボラトリープレス（１９８９）を参照のこと。 本発明に従って発現させた髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質および融合 タンパク質は、天然のタンパク質の免疫学的特性を示す構造を達成するために適 切に再生される必要がある。さらに他の態様において、本発明は、形質転換細胞 を溶解させて髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパク質を不 溶性の封入体の一部として放出させ、該封入体を緩衝液で洗浄して混入する大腸 菌の細胞性タンパク質を除去し、該封入体を変性剤の水溶液中に再懸濁および溶 解し、得られた溶液を界面活性剤中に希釈し、ついで可溶化された髄膜炎菌グル ープＢポーリンタンパク質または融合タンパク質をゲル濾過により精製して溶出 液中に再生タンパク質を得ることを特徴とする、上記外膜タンパク質および融合 タンパク質の再生方法に関する。驚くべきことに、折り畳まれた３量体の髄膜炎 菌グループＢクラス２およびクラス３ポーリンタンパク質および融合タンパク質 がゲル濾過カラムからの溶出液中で直接得られることがわかった。 他の好ましい態様において、本発明は、上記方法によって産生された実質的に 純粋な再生された外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質および融合タンパ ク質に関する。実質的に純粋なタンパク質とは、たとえば電気泳動によって認め られるように、一般にナイセリア・メニンギチジスの他の細胞性成分を含まない タンパク質である。そのような実質的に純粋なタンパク質は、クマシーブルー染 色または銀染色の後の電気泳動ゲル上の濃度測定により測定されるように、＞９ ５％の純度を有する。 以下の実施例は、本発明の方法および組成物を説明するものであるが、これら を限定するものではない。当業者に自明な当該技術分野で通常認められる種々の 条件およびパラメータの他の適当な改変および適合は本発明の範囲に含まれる。 実施例実施例１．グループＢナイセリア・メニンギチジスからのクラス３ポーリンタン パク質のクローニング 材料および方法 生物：グループＢナイセリア・メニンギチジス株８７６５（Ｂ１５：Ｐ１,３ ）をウエンデル・ゾリンガー（Wendell Zollinger）博士（ウォルター・リード ・アーミー・インスチチュート・フォア・リサーチ（Walter Reed Army Institu te for Research））から得、３０℃に保持したインキュベーター中のロウソク 消光ジャー中、以前に記載された寒天培地（スワンソン（Swanson,J.L.）、Infe ct.Immun.２１：２９２〜３０２（１９７８））上で増殖させた。大腸菌株ＤＭ Ｅ５５８（ベンソン（Ｓ.Benson）のコレクションから；シルヘービー（Silhavy ,T.J.）ら、「遺伝子融合による実験（Experiments with Gene Fusions）」、コ ールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニュー ヨーク、１９８４）、ＢＲＥ５１（ブレマー（Bremer,E.）ら、ＦＥＭＳ Microb iol.Lett.３３：１７３〜１７８（１９８６））およびＢＬ２１（ＤＥ３）を３ ７℃にてＬＢ寒天プレート上で増殖させた。 Ｐ１形質導入：大腸菌株ＤＭＥ５５８のＰ１_vir溶解液を用い、全ｏｍｐＡ遺 伝子が欠失した（シルヘービーら、遺伝子融合による実験、コールドスプリング ハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８４ ））株ＢＲＥ５１（ブレマーら、ＦＥＭＳ Microbiol.Lett.３３：１７３〜１７ ８（１９８６））にテトラサイクリン耐性マーカーを形質導入した。ｏｍｐＡ遺 伝子に極めて近接してテトラサイクリン耐性マーカーを含有する株ＤＭＥ５５８ を、６００ｎｍにおける吸光度が約０.６となる密度までＬＢ培地上で増殖させ た。１ｍｌの１／１０の０.５ＭＣａＣｌ₂を、１０ｍｌ培地および１×１０⁹Ｐ ＦＵのＰ１_virを含む溶液０.１ｍｌに加えた。この培養液を３７℃にて３時間イ ンキュベートした。この時間の後、細菌の細胞密度は視覚でわかるほど減少した 。０.５ｍｌのクロロホルムを加え、ファージ培養液を４℃にて貯蔵した。一般 に大腸菌染色体の１〜２％を各ファージ中にパッケージングすることができる ので、生成したファージの数は、ｏｍｐＡ遺伝子に近接したテトラサイクリン耐 性マーカーを含む細菌宿主の全染色体をカバーしている。 つぎに、ｏｍｐＡ遺伝子を欠失している株ＢＲＥ５１を３７℃にてＬＢ培地中 で一夜増殖させた。この一夜培養液を新たなＬＢ中に１：５０に希釈し、２時間 増殖させた。菌体を遠心分離により除去し、ＭＣ塩中に再懸濁した。０.１ｍｌ の細菌菌体を上記ファージ溶解液０.０５と混合し、室温にて２０分間インキュ ベートした。その後、等容量の１Ｍクエン酸ナトリウムを加え、細菌菌体を１２ .５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢプレート上においた。プレー トを３７℃にて一夜インキュベートした。テトラサイクリン耐性（１２μｇ／ｍ ｌ）形質導入体を、以下に記載するようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブ ロット分析によりＯｍｐＡタンパク質発現の欠失によりスクリーニングした。こ の抗生物質に耐性の細菌は、ｏｍｐＡ遺伝子が欠失されていた部位に非常に近接 して染色体中にテトラサイクリン耐性遺伝子が組み込まれている。一つの特定の 株をＢＲＥ−Ｔ^Rと称した。 ついで、上記と同様の方法を用い、該株ＢＲＥ−Ｔ^Rで２回目のファージ産生 を行った。このファージ集団の典型はテトラサイクリン耐性遺伝子およびＯｍｐ Ａ欠失の両者を有する。ついで、これらファージを回収し、貯蔵した。ついで、 これらファージを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を感染させた。感染後、該細 菌はテトラサイクリン耐性マーカーを含む。さらに、テトラサイクリンを含有す るＬＢプレート上でＯｍｐＡ欠失が選択される高い蓋然性がある。 上記プレート上で増殖した細菌のコロニーをＬＢ培地中で別に増殖させ、Ｏｍ ｐＡタンパク質の存在について試験した。調べた選択コロニーのうち、ＳＤＳ− ＰＡＧＥウエスタンブロット上での抗体活性により判断されるように、すべてＯ ｍｐＡタンパク質が欠失していた。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット：ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、以前に記 載されているように（ブレイク（Blake）およびゴットシュリッヒ（Gotschlich ）、J.Exp.Med.１５９：４５２〜４６２（１９８４））、レムリ法（レムリ（La emmli,U.K.）、Nature ２２７：６８０〜６８５（１９７０））の変法 である。イモビロン（Immobilon）Ｐ（ミリポア、ベッドフォード、マサチュー セッツ州）への電気泳動移動を、紙を最初にメタノール中で湿らせた他はトウビ ンらの方法（トウビン（Towbin,H.）、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ７６：４３５ ０〜４３５４（１９７９））に従って行った。ウエスタンブロットをホスファタ ーゼ結合試薬でプローブした（ブレイクら、Analyt.Biochem.１３６：１７５〜 １７９（１９８４））。 複製連鎖反応：フィーバーズらによって記載された方法（フィーバーズら、In fect.Immun.６０：３６２０〜３６２９（１９９２））を用い、ＰｏｒＢをコー ドする遺伝子を増幅させた。選択したプライマーは、以前に記載されているよう に（フィーバーズら、Infect.Immun.６０：３６２０〜３６２９（１９９２）） 、プライマー３３ であった。簡単に説明すると、反応成分は以下の通りであった：髄膜炎菌株８７ ６５染色体ＤＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）、１μ１；５'および３'プライマー（１ μＭ）各２μｌ；ｄＮＴＰ（１０ｍＭストック）、各４μｌ；１０×ＰＣＲ反応 緩衝液（１００ｍＭトリスＨＣｌ、５００ｍＭＫＣｌ、ｐＨ８.３）、１０μｌ ；２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、６μｌ；２回蒸留Ｈ₂Ｏ、６２μｌ；およびＴａｑポリ メラーゼ（シータス・コーポレーション、５単位／μｌ）、１μｌ。反応は、０ ℃にセットしたラウダ（Lauda）４／Ｋメタノール／水冷却システム（ブリンク マン・インスツルメンツ（Brinkman Instruments,Inc.、ウエストベリー、ニュ ーヨーク州））に連結したＧＴＣ−２ジェネティックサーモサイクラー（Geneti c Thermocycler）（プレシジョン・インスツルメンツ（Precision Inst.Irlc.、 シカゴ）、イリノイ州）中にて行った。サーモサイクラーは、９４℃、２分；４ ０℃、２分；および７２℃、３分で３０回サイクルするようにプログラムされて いた。これら３０サイクルの終了時、反応を７２℃で３分続け、マニアチスらに よって記載されているように（マニア チスら、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル、コール ドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨー ク州（１９８２））ＴＡＥ緩衝液中の１％アガロースゲル上での分析の準備がで きるまで、最後に４℃に保持した。 ＰＣＲ産物のサブクローニング：ｐＥＴ−１７ｂプラスミド（ノバジェン）を サブクローニングに用い、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ（ ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Bjolabs,Inc.）、ビバリー 、マサチューセッツ州）で該プラスミドを二重消化することにより調製した。つ いで、消化した末端をウシ腸管アルカリホスファターゼ（ベーリンガー・マンハ イム、インディアナポリス、インディアナポリス州）で脱リン酸化した。ついで 、消化したプラスミドを１％アガロースゲル上で分析し、切断したプラスミドを 除去し、ジーンクリーン（Gene Clean）キット（Ｂｉｏ１０１、ラジョラ、カリ フォルニア州）を用いて精製した。ＰＣＲ産物の調製は、フェノール−クロロホ ルム、クロロホルムで抽出し、最後にジーンクリーンキット（Ｂｉｏ１０１）を 用いて精製することにより行った。ＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＢｇｌ IIおよびＸｈｏＩ（ニュー・イングランド・バイオラブズ）で消化した。ついで 、ＤＮＡをフェノールークロロホルムで抽出し、０.１容量の３Ｍ酢酸ナトリウ ム、５μｌグリコーゲン（２０μｇ／μｌ)、および２.５容量のエタノールを加 えて沈殿させた。このＤＮＡを７０％エタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で洗浄した 後、ＴＥ緩衝液中に再溶解した。消化したＰＣＲ産物を、標準Ｔ４リガーゼ法（ Current Protocol in Molecular Biology）ジョン・ウイリー＆サンズ、ニュー ヨーク（１９９３））を用いて１６℃にて一夜、上記二重消化したｐＥＴ−１７ ｂプラスミドにライゲートした。ついで、ライゲーション生成物を、シャングら の方法（シャング（Chung,C.T.）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ８６：２１７ ２〜２１７５（１９８９））によりコンピテントにした上記ＢＬ２１（ＤＥ３） −ΔｏｍｐＡ中に形質転換した。形質転換体の選択を、５０μｇ／ｍｌカルベニ シリンおよび１２μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＬＢプレート上で行っ た。幾つかの形質転換体を選択し、カルベニシリンおよびテトラ サイクリンをともに含有するＬＢブロス中、３０℃にて６時間培養し、ＩＰＴＧ を加えてプラスミド遺伝子発現を誘発させた。温度を３７℃に上げ、培養をさら に２時間続けた。各培養液の菌体を遠心分離により回収し、全細胞溶解液を調製 し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびすべてのナイセリアポーリンと反応するモノクロー ナル抗体（４Ｄ１１）を用いたウエスタンブロットにより分析した。 ヌクレオチド配列分析：クローニングしたクラス３ポーリン遺伝子ＤＮＡのヌ クレオチド配列の決定を、記載に従い（Current Protocol in Molecular Biolog y、ジョン・ウイリー＆サンズ、ニューヨーク（１９９３））、変性二本鎖プラ スミドＤＮＡを鋳型として用いたジデオキシ法により行った。シークエナーゼ（ Sequenase）IIキット（ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル（United Stat es Biochemical Corp.）、クリーブランド、オハイオ州）を製造業者の指示に従 って使用した。３つの合成オリゴヌクレオチドプライマー（オペロン・テクノロ ジーズ（Operon Technologies,Inc.）、アラメダ、カリフォルニア州）をこれら 反応に用いた。１つは５'末端用のものであり、５'ＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣ ＣＧＡＧＣＴＣからなり、２つは３'末端用のものであり、５'ＴＴＴＧＴＴＡＧ ＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＴＧおよび５'ＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＧＴＴＴＡＧＡＧＧ ＣＣであった。該プラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢｐｕ１１０２１ で線状化することにより重複する入れ子状の欠失を作成し、チオ−ｄＮＴＰおよ びクレノーポリメラーゼを添加することにより末端を平滑化した（Current Prot ocol in Molecular Biology、ジョン・ウイリー＆サンズ、ニューヨーク（１９ ９３））。ついで、線状化したプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩで 開裂し、供給者により教示されているようにプラスミドの３'欠失を作成するた めにｅｘｏII／ヤエナリヌクレアーゼ欠失キットを用いた（ストラタジーン、ラ ジョラ、カリフォルニア州）。この戦略の地図を図１に示す。 ＰｏｒＢ遺伝子産物の発現および精製：滅菌マイクロピペットの先端を用い、 ＰｏｒＢ−ｐＥＴ−１７ｂプラスミドを含むＢＬ２１（ＤＥ３）−ΔｏｍｐＡの 単一のコロニーを選択し、５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する１０ｍｌの ＬＢブロス中に接種した。この培養液を震盪しながら３０℃にて一夜インキュベ ートした。ついで、１０ｍｌの一夜培養液を同濃度のカルベニシリンを含有する １リットルのＬＢブロスに滅菌的に加え、ＯＤ₆₀₀が０.６〜１.０に達するまで ３７℃にてシェーキングインキュベーター中で培養を続けた。この培養液にＩＰ ＴＧ（１００ｍＭ）のストック溶液（３ｍｌ）を加え、培養液をさらに３０分間 インキュベートした。ついで、リファンピシンを加え（５．８８ｍｌのストック 溶液；メタノール中に３４ｍｇ／ｍｌ）、培養をさらに２時間続けた。ＧＳ３ロ ーター中、１０,０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行うことにより菌体を回 収し、重さを測った。これら菌体を、菌体の湿重量１ｇ当たり３ｍｌのＴＥＮ緩 衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８.０、中に充分に再懸濁した。これに菌体の湿重量１ｇ当 たり８μｌのＰＭＳＦストック溶液（無水エタノール中に５０ｍＭ）および８０ μｌのリゾチームストック溶液（水中に１０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。この混合物 を室温にて２０分間撹拌した。撹拌しながら、菌体の湿重量１ｇ当たり４ｍｇの デオキシコール酸塩を加えた。この混合物を３７℃の水浴中に入れ、ガラス棒で 撹拌した。混合物が粘稠になったら、菌体の湿重量１ｇ当たり２０μｌのＤＮア ーゼＩストック溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を加えた。ついで、この混合物を水浴から 取り、溶液がもはや粘稠でなくなるまで室温にて放置した。ついで、この混合物 をＳＳ−３４ローター中、４℃にて２０分間、１５,０００ｒｐｍにて遠心分離 にかけた。ペレットを確保し、ＴＥＮ緩衝液で２回充分に洗浄した。ついで、こ のペレットを０.１ｍＭＰＭＳＦおよび８Ｍ尿素を含有する新たに調製したＴＥ Ｎ緩衝液中に再懸濁し、バス（bath）ソニケーター（ヒート・システムズ（Heat Systems,Inc.）、プレインビュー、ニューヨーク州）中で超音波処理した。Ｂ ＣＡキット（ピアス（Pierce）、ロックビル、イリノイ州）を用いてタンパク質 濃度を測定し、ＴＥＮ−尿素緩衝液を用いてタンパク質濃度を１０ｍｇ／ｍｌ未 満に調節した。ついで、試料を１０％（ｗ／ｖ）ツビッタージェント３,１４（ カルバイオケム、ラジョラ、カリフォルニア州）で１：１に希釈し、超音波処理 し、セファクリルＳ−３００分子ふるいカラムに負荷した。セファクリルＳ−３ ００カラム（２.５ｃｍ×２００ｃｍ）は、１００ｍＭトリスＨＣｌ、２０ ０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０５％ツビッタージェント３,１４、 および０.０２％アジド、ｐＨ８.０で前以て平衡化してあった。カラムの流速を ８ｍｌ／時に調節し、１０ｍｌフラクションを回収した。各フラクションのＯＤ₂₈₀ を測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析をタンパク質含有フラクションについて行 った。 抑制ＥＬＩＳＡアッセイ：ウエル当たり０.１ｍｌの野性型株８７６５から精 製したｐｏｒＢ（２μｇ／ｍｌ）（０.０２％アジドを含有する０.１Ｍ炭酸緩衝 液、ｐＨ９.６中）を加えることにより、マイクロタイタープレート（ヌンク− イムノ・プレート（Nunc−Immuno Plate,Inc.）、ネイパービル、イリノイ州） を感作させた。プレートを室温にて一夜インキュベートした。プレートを０.９ ％ＮａＣｌ、０.０５％ブリジ３５、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ７.０、０.０ ２％アジドで５回洗浄した。タイプ１５クラス３ＰｏｒＢタンパク質に対して産 生させたヒト免疫血清を、フィリップ・オー・リビングストン（Phillip O.Livi ngston）博士（メモリアルースローン・ケッタリング・キャンサー・センター（ Memorial−Sloan Kettering Cancer Center）、ニューヨーク、ニューヨーク州 ）から入手した。このヒト免疫血清を０.５％ブリジ３５を含有するＰＢＳ中に 希釈し、プレートに加え、室温にて２時間インキュベートした。プレートを上記 と同様にして再び洗浄し、二次抗体、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩ ｇＧ（タゴ（Tago Inc.）、バーリンゲイム、カリフォルニア州）をＰＢＳ−ブ リジ中に希釈し、プレートに加え、室温にて１時間インキュベートした。プレー トを上記と同様にして洗浄し、０.１ジエタノールアミン、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、 ０.１ｍＭ ＺｎＣｌ₂、０.０２％アジド、ｐＨ９.８中のｐ−ニトロフェニルホ スフェート（シグマホスファターゼ基質１０４）（１ｍｇ／ｍｌ）を加えた。プ レートを３７℃にて１時間インキュベートし、エリダ（Elida）−５マイクロタ イタープレートリーダー（フィジカ（Physica）、ニューヨーク、ニューヨーク 州）を用いて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。対照のウエルは一次抗体お よび／または二次抗体のいずれかを欠失していた。このことは、ＥＬＩＳＡアッ セイにおいて最大読み取りの半分を与える各ヒト血清に対する力価を得 るために行った。この各ヒト血清に対する力価を抑制ＥＬＩＳＡにおいて用いる 。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを精製した野性型ＰｏｒＢタンパク質で 感作し、上記と同様にして洗浄した。別のＶ−９６ポリプロピレンマイクロタイ タープレート（ヌンク）中で、種々の量の精製した野性型ＰｏｒＢタンパク質か または精製した組換えＰｏｒＢタンパク質のいずれかを７５μｌの全量で加えた 。ヒト血清をその最大力価の半分の２倍までＰＢＳ−ブリジ溶液中で希釈し、７ ５μｌをＰｏｒＢタンパク質かまたは組換えＰｏｒＢタンパク質を含有する各ウ エルに加えた。このプレートを室温にて２時間インキュベートし、マイクロタイ タープレートキャリヤを備えたソーバル（Sorvall）ＲＴ６０００冷蔵遠心管（ ウイルミングトン（Wilmington）、デラウエア州）中、３０００ｒｐｍにて１０ 分間で遠心分離にかけた。Ｖ−底（Ｖ−bottom）を回避するため、各ウエルから １００μｌを取り、感作させ洗浄したＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに移 した。ＥＬＩＳＡプレートをさらに２時間インキュベートし、洗浄し、結合二次 抗体を上記と同様にして加えた。ついで、プレートを記載のようにして処理し、 読み取った。ついで、抑制％を記載にようにして処理し、読み取った。抑制％は 以下のようにして計算する： 結果 複製連鎖反応およびサブクローニング：容易にクローニングし、遺伝子操作し 、最終的にさらなる抗原性および生物物理学的特徴付けのためにいかなる数の異 なるナイセリアのポーリン遺伝子からも純粋なポーリンタンパク質を充分に得る 方法を開発した。この目的のための第一の工程はナイセリアからポーリン遺伝子 をクローニングすることであった。フィーバーズらによって最初に記載された技 術を用い（フィーバーズら、Infect.Immun.60：３６２０〜３６２９（１９９２ ））、クラス３、血清型１５ポーリンからの成熟ポーリンタンパク質のＤＮＡ配 列を、ＰＣＲ反応の鋳型として髄膜炎菌株８７６５の染色体を用いて増幅させ た。オリゴヌクレオチドプライマーの末端側に適当なエンドヌクレアーゼ制限部 位を合成し、開裂したときに、増幅させた成熟ポーリン配列が選択した発現ベク ター中に直接ライゲートされクローニングされうるようにした。３０サイクル後 、図２に示すＰＣＲ生成物を得た。主要な生成物は９００ｂｐと１０００ｂｐと の間に移動したが、これは以前の研究結果と一致していた（フィーバーズら、In fect.Immun.６０：３６２０〜３６２９（１９９２））。しかしながら、ＰＣＲ を低アニーリング厳格さ（４０℃；５０ｍＭＫＣｌ）で行ったにもかかわらず、 高分子量生成物は認められなかった。 大量のクローニングポーリンタンパク質を産生できるように、ストゥディエら の厳しく制御された発現系（ストゥディエおよびモファット、J.Mol.Biol.１８ ９：１１３〜１３０（１９８６））を用いたが、これはノバジェンから市販され ているものである。増幅させたＰＣＲ生成物をプラスミドｐＥＴ−１７ｂのＢａ ｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位中にクローニングした。この戦略により、成熟ポーリンタ ンパク質のＤＮＡ配列は、Ｔ７プロモーター、９アミノ酸リーダー配列および成 熟φ１０タンパク質の１１アミノ酸をコードするＤＮＡ配列のすぐ後ろにインフ レームで配置された。ポーリン遺伝子を含有するｐＥＴ−１７ｂプラスミドの発 現宿主として、ＤＥ３ラムダ誘導体に対して溶原性のストゥディエの大腸菌株Ｂ Ｌ２１（ストゥディエおよびモファット、J.Mol.Biol.１８９：１１３〜１３０ （１９８６））を選択した。しかしながら、大腸菌発現宿主に由来するＯｍｐＡ タンパク質は発現した髄膜炎菌ポーリンタンパク質とともに精製されるおそれが あることが考えられるので、この株をＰ１形質導入により修飾し、この株からｏ ｍｐＡ遺伝子を除去した。それゆえ、ＰＣＲ生成物およびｐＥＴ−１７ｂベクタ ーの両者の制限エンドヌクレアーゼ消化およびライゲーション後、生成物をＢＬ ２１（ＤＥ３）−ΔｏｍｐＡ中に形質転換し、形質転換体をアンピシリンおよび テトラサイクリン耐性について選択した。ｐＥＴ−１７ｂの制限地図を図１１Ａ に示し、ｐＥＴ−１７ｂのＢｇｌII部位とＸｈｏＩ部位との間のヌクレオチド配 列を図１１Ｂに示す。選択プレート上で観察した多数のコロニーのうち、１０を さらに特徴付けるために選び取った。これら１０のものはすべて、対数期ま で増殖させＩＰＴＧで誘発させたときに、ほぼＰｏｒＢタンパク質の分子量にて 移動する大量のタンパク質を発現した。一つのそのような培養の全細胞溶解液を 図３ａに示す。４Ｄ１１モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット分析に より、発現されたタンパク質がＰｏｒＢタンパク質であることがさらに示唆され た（図３ｂ）。他の研究とは対照的に、ナイセリアのポーリンを大腸菌中にクロ ーニングし発現させたときに、ＩＰＴＧ添加後においてさえも宿主細菌菌体は何 らの毒性または致死作用の兆候を示さなかった。大腸菌菌体は生存可能なように 思われ、発現相を通じていずれの時期においても再培養することができた。 ヌクレオチド配列分析：これら実験において発現されたＰｏｒＢの量はこれま でに観察されたものに比べて有意に大きく、この宿主大腸菌上での発現には有害 な作用はないものと思われた。そのような高発現を可能とするためにＰＣＲ人工 産物が髄膜炎菌ポーリン遺伝子中に導入されなかったことを確かめるため、該プ ラスミドからの二本鎖プライマー伸長により全φ１０ポーリン融合を配列決定し た。その結果を図４に示す。ヌクレオチド配列は、ヘッケルス（Heckels）らに よって以前に報告された他の髄膜炎菌血清型１５ＰｏｒＢ遺伝子配列（ウォード （Ward,M.J.）ら、ＦＥＭＳ Microbiol.Lett.７３：２８３〜２８９（１９９２ ））と同一であったが、図示した２つの例外があった。これら２つのヌクレオチ ド差異はコドンの第三位で起こっており、発現されるタンパク質のアミノ酸配列 を変えないであろう。それゆえ、ヌクレオチド配列からは、大腸菌内での高タン パク質発現および毒性の欠如を説明するＰＣＲ人工産物も変異もないように思わ れた。さらに、このデータは、真のＰｏｒＢタンパク質が産生されたことを示唆 しているであろう。 発現されたｐｏｒＢ遺伝子産物の精製：大腸菌中で発現されたＰｏｒＢタンパ ク質はＴＥＮ緩衝液中で不溶であり、このことは、ＰｏｒＢタンパク質が発現さ れたときに封入体に形成されることを示唆していた。しかしながら、不溶性のＰ ｏｒＢタンパク質をＴＥＮ緩衝液で洗浄することによって混入する大腸菌タンパ ク質のほとんどが除去された。ついで、ＰｏｒＢタンパク質を新たに調製した８ Ｍ尿素中に可溶化し、ツビッタージェント３,１４界面活性剤中に希釈した。最 終精製はセファクリルＳ−３００分子ふるいカラムを用いて行い、これにより尿 素のみならず残留する混入タンパク質も除去された。カラムから溶出されたＰｏ ｒＢタンパク質の大部分は野性型のＰｏｒＢと全く同様に３量体のみかけの分子 量を有していた。野性型のＰｏｒＢおよび大腸菌中で発現されたＰｏｒＢの対比 溶出パターンを図５に示す。ツビッタージェント界面活性剤中に希釈する前の８ Ｍ尿素中のＰｏｒＢタンパク質の濃度が１０ｍｇ／ｍｌを越える場合には、３量 体として認められるＰｏｒＢタンパク質の相対的量が減少し、ボイド容量中に溶 出する凝集物として出現することに注目することは重要である。しかしながら、 尿素緩衝液中のタンパク質濃度が１０ｍｇ／ｍｌ未満である場合は、ＰｏｒＢの 大部分は野性型のＰｏｒＢが溶出するのと正確に同じフラクション中に溶出した 。また、Ｔ７−Ｔａｇモノクローナル抗体およびウエスタンブロット分析を用い 、成熟Ｔ７カプシドタンパク質の１１アミノ酸がアミノ末端として保持されるこ とも決定された。１リットルの大腸菌からの髄膜炎菌ポーリンタンパク質の全収 量は約５０ｍｇであった。 抑制ＥＬＩＳＡアッセイ：精製した３量体の組換えＰｏｒＢが野性型の髄膜炎 菌株８７６５で産生されるＰｏｒＢに比較して同様の抗原性のコンホメーション を有するかどうかを決定するため、野性型の髄膜炎菌タイプ１５ＰｏｒＢタンパ ク質をワクチンした６人の患者の血清を抑制ＥＬＩＳＡアッセイに用いた。抑制 アッセイにおいて、天然のＰｏｒＢに反応性の抗体は、種々の量の精製組換えＰ ｏｒＢかまたは相同な精製野性型ＰｏｒＢのいずれかにより競合的に抑制された 。これら６人のヒト血清のそれぞれの相同な精製ＰｏｒＢによる抑制の結果およ びこれら血清の平均抑制を図６に示す。これら血清の精製組換えＰｏｒＢによる 対応抑制は図６Ｂに示してある。図６および図７からの平均抑制の比較を図８に プロットしてある。これらデータは、これら６人の患者の血清に含まれる抗体が 相同な精製野性型ＰｏｒＢおよび精製組換えＰｏｒＢの両者において同様のエピ トープを認識していることを示唆している。このことから、組換えＰｏｒＢは野 性型ＰｏｒＢに認められる天然のコンホメーションのすべてではないにしてもそ のほとんどを保持しているという証拠がさらに得られた。実施例２．グループＢナイセリア・メニンギチジス株ＢＮＣＶＭ９８６からのク ラス２ポーリンのクローニング 以前に記載された方法を用い（サンブルックら、モレキュラー・クローニング ：ア・ラボラトリー・マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバー、ニュ ーヨーク、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（１９８９））、約 ０.５ｇのグループＢナイセリア・メニンギチジス株ＢＮＣＶ Ｍ９８６（血清型 ２ａ）からゲノムＤＮＡを単離した。ついで、このＤＮＡを、標準ＰＣＲ反応に おいて２つのクラス２ポーリン特異的オリゴヌクレオチドに対する鋳型として用 いた。これらオリゴヌクレオチドは、クラス２ポーリンの５'および３'フランキ ング領域に相補的で、断片のクローニングを容易にするためにＥｃｏＲＩ制限部 位を有するように設計されていた。これらオリゴヌクレオチドの配列は以下の通 りであった： および ついで、複製連鎖反応を用いてクラス２ポーリンを得た。反応条件は以下の通り であった：ＢＮＣＶ Ｍ９８６ゲノムＤＮＡ ２００ｎｇ、上記２つのオリゴヌク レオチドプライマーをそれぞれ１μＭ、各ｄＮＴＰを２００μＭ、ＰＣＲ反応緩 衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８.３）、１.５ｍＭ Ｍｇ Ｃｌ₂、および２.５単位のＴａｑポリメラーゼ、以上を蒸留Ｈ_2Oで１００μｌに 調整。ついで、この反応混合物を、９５℃にて１分、５０℃にて２分および７２ ℃にて１.５分の２５サイクルに供した。このサイクル期間の終了時、反応混合 物を１％アガロースゲル上に負荷し、２時間電気泳動した後、１.３ｋｂのバン ドを除去し、ジーンクリーンキット（Ｂｉｏ１０１）を用いてＤＮＡを回収した 。ついで、このＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、再精製し、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼを 用いてＥｃｏＲＩ消化ｐＵＣ１９にライゲートした。このライゲーション混合物 を用いてコンピテントな大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。組換えプラスミドを選 択し、配列決定した。挿入配列はクラス２ポーリンのものと一致するＤＮＡ配 列を有していることがわかった。ムラカミら、Infect.Immun.５７：２３１８〜 ２３２３（１９８９）を参照。 プラスミドｐＥＴ−１７ｂ（ノバジェン）を用いてクラス２ポーリンを発現さ せた。以下に記載するように、２つのプラスミドを構築し、２つの異なるタンパ ク質を産生した。一方のプラスミドは成熟クラス２ポーリンを産生するように設 計し、他方のプラスミドはＴ７遺伝子φ１０カプシドタンパク質からの２０アミ ノ酸に融合したクラス２ポーリンを産生するように設計した。成熟クラス２ポーリンの構築 オリゴヌクレオチド： および を用いてｐＵＣ１９−クラス２ポーリン構築物を増幅することにより、成熟クラ ス２ポーリンを構築した。この戦略により、プラスミドｐＥＴ−１７ｂのＮｄｅ ＩおよびＸｈｏＩ部位中に増幅クラス２ポーリンをクローニングすることができ 、それゆえ成熟クラス２ポーリンを産生させることができた。鋳型としてのｐＵ Ｃ１９−クラス２および上記２つのオリゴヌクレオチドを用いて標準ＰＣＲを行 った。このＰＣＲ反応により、１.０％アガロースゲル上で分析したときに１.１ ｋｂの生成物が得られた。このＰＣＲ反応で得られたＤＮＡをゲル精製し、制限 酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化した。生成された１.１ｋｂＤＮＡを再びゲ ル精製し、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼを用いてＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ消化したｐＥＴ −１７ｂにライゲートした。ついで、このライゲーション混合物を用いてコンピ テントな大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。１.１ｋｂ挿入を含有するコロニーを さらに分析するために選択した。ＤＨ５αクローンからのＤＮＡを制限マッピン グにより分析し、選択したプラスミドのクローニング結合部の配列を決定した。 この分析後、ＤＨ５αクローンから得られたＤＮＡを用いて大腸菌ＢＬ２１（Ｄ Ｅ３）−ΔｏｍｐＡを形質転換した。１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有 す るＬＢ−寒天上で形質転換体を選択した。クラス２ポーリンタンパク質を生成す る能力について幾つかの形質転換体をスクリ−ニングした。このことは、クロー ンを１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび０.４％グルコースを含有するＬ Ｂ液体培地中、３０℃にてＯＤ₆₀₀＝０.６まで増殖させ、ついでＩＰＴＧ（０. ４ｍＭ）で培養液を誘発することにより行った。ついで、菌体を破砕し、菌体抽 出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ｐＥＴ−１７ｂ中にクローニングした 成熟クラスIIポーリン遺伝子のヌクレオチド配列および翻訳アミノ酸配列を図９ Ａおよび図９Ｂに示す。融合クラス２ポーリンの構築 オリゴヌクレオチド： および を用いてｐＵＣ１９−クラス２ポーリン構築物を増幅することにより、融合クラ ス２ポーリンを構築した。この戦略により、プラスミドｐＥＴ−１７ｂのＢａｍ ＨＩおよびＸｈｏＩ部位中に増幅クラス２ポーリンをクローニングすることがで き、それゆえ該プラスミドに含まれるＴ７φ１０カプシドタンパク質に由来する ２２アミノ酸をさらにＮ末端に含む融合クラス２ポーリンを産生させることがで きた。鋳型としてのｐＵＣ１９−クラス２および上記２つのオリゴヌクレオチド を用いて標準ＰＣＲを行った。このＰＣＲ反応により、１.０％アガロースゲル 上で分析したときに１.１ｋｂの生成物が得られた。このＰＣＲ反応で得られた ＤＮＡをゲル精製し、反応酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化した。生成され た１.１ｋｂ生成物を再びゲル精製し、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼを用いてＢａｍＨＩお よびＸｈｏＩ消化したｐＥＴ−１７ｂにライゲートした。ついで、このライゲー ション混合物を用いてコンピテントな大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。１.１ｋ ｂ挿入を含有するコロニーをさらに分析するために選択した。ＤＨ５αクローン からのＤＮＡを制限酵素マッピングにより分析し、選択したプラスミドのクロー ニング結合部の配列を決定した。発現プラスミドｐＥＴ−１７ｂ中にクローニン グした融合クラスIIポーリン遺伝子のヌクレオチド配列および翻訳アミノ酸配列 を図１０Ａおよび図１０Ｂに示す。この分析後、ＤＨ５αクローンから得られた ＤＮＡを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ΔｏｍｐＡを形質転換した。１００ μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ−寒天上で形質転換体を選択した。 幾つかの形質転換体を、クラス２ポーリンタンパク質を生成する能力についてス クリーニングした。このことは、クローンを１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン および０.４％グルコースを含有するＬＢ液体培地中、３０℃にてＯＤ₆₀₀＝０. ６まで増殖させ、ついでＩＰＴＧ（０.４ｍＭ）で培養液を誘発することにより 行った。ついで、菌体を破砕し、菌体抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した 。実施例３．グループＢナイセリア・メニンギチジス株８７６５からの成熟クラス ３ポーリンの大腸菌中でのクローニングおよび発現 上記方法を用い（サンブルックら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラ トリー・マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、コ ールドスプリングハーバーラボラトリープレス（１９８９））、約０.５ｇのグ ループＢナイセリア・メニンギチジス株８７６５からゲノムＤＮＡを単離した。 ついで、このＤＮＡを、標準ＰＣＲ反応において２つのクラス３ポーリン特異的 オリゴヌクレオチドに対する鋳型として用いた。 オリゴヌクレオチド： および を用いて８７６５からのゲノムＤＮＡを増幅することにより、成熟クラス３ポー リンを構築した。この戦略により、プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）のＮｄｅＩ およびＢａｍＨＩ部位中に増幅クラス３ポーリンをクローニングすることができ （図１３Ａおよび図１３Ｂ）、それゆえ成熟クラス３ポーリンを産生させること ができた。鋳型としての８７６５から単離したゲノムＤＮＡおよび上記２つのオ リゴヌクレオチドを用いて標準ＰＣＲを行った。 反応条件は以下の通りであった：８７６５ゲノムＤＮＡを２００ｎｇ、上記２ つのオリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ１μＭ、各ｄＮＴＰを２００μＭ 、ＰＣＲ反応緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８.３）、 １.５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、および２.５単位のＴａｑポリメラーゼ、以上を蒸留水で １００μｌに調整。ついで、この反応混合物を、９５℃にて１分、５０℃にて２ 分および７２℃にて１.５分の２５サイクルに供した。 このＰＣＲ反応により、１％アガロースゲル上で分析したときに約９３０ｂｐ の生成物が得られた。このＰＣＲ反応で得られたＤＮＡをゲル精製し、制限酵素 ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化した。この９３０ｂｐ生成物を再びゲル精製し 、Ｔ４リガーゼを用いてＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ消化したｐＥＴ−２４ａ（＋ ）にライゲートした。ついで、このライゲーション混合物を用いてコンピテント な大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。９３０ｂｐ挿入を含有するコロニーをさらに 分析するために選択した。大腸菌ＤＨ５αクローンからのＤＮＡを制限酵素マッ ピングにより分析し、選択したプラスミドのクローニング結合部の配列を決定し た。この分析後、大腸菌ＤＨ５αクローンから得られたＤＮＡを用いて大腸菌Ｂ Ｌ２１（ＤＥ３）−ΔｏｍｐＡを形質転換した。５０μｇ／ｍｌのカナマイシン を含有するＬＢ−寒天上で形質転換体を選択した。幾つかの形質転換体を、クラ ス３ポーリンタンパク質を生成する能力についてスクリーニングした。このこと は、クローンを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび０.４％グルコースを含有 するＬＢ液体培地中、３０℃にてＯＤ₆₀₀＝０.６まで増殖させ、ついでＩＰＴＧ （１ｍＭ）で培養液を誘発することにより行った。ついで、菌体を破砕し、菌体 抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。実施例４．組換えクラス２ポーリンの精製および再生 大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｏｍｐＡ［ｐＮＶ−５］をルリアブロス中、３０ ℃にて対数中期まで（６００ｎｍにおけるＯＤ＝０.６）増殖させる。ついで、 ＩＰＴＧ（最終０.４ｍＭ）を加え、菌体を３７℃にてさらに２時間増殖させる 。ついで、菌体を回収し、幾つかの容量のＴＥＮ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣ ｌ、 ０.２ＭＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８.０）で洗浄し、菌体ペースト を−７５℃にて凍結貯蔵した。 精製のため、前以て重量を計測した菌体を解凍し、ＴＥＮ緩衝液中に１：１５ の比率（ｇ／ｖ）で懸濁させる。この懸濁液をスタンステッド（Stansted）セル ディスラプター（スタンステッド・フルーイッド・パワー（Stansted fluid pow er Ltd.））中に８,０００ｐｓｉにて２回通す。ついで、得られた溶液を１３, ０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離にかけ、上澄み液を廃棄する。ついで、ペレ ットを０.５％デオキシコール酸塩を含有するＴＥＮ緩衝液中に２回懸濁し、上 澄み液を廃棄する。ついで、ペレットを８Ｍの脱イオン化尿素（電気泳動グレー ド）および０.１ｍＭ ＰＭＳＦ（３ｇ／１０ｍｌ）を含有するＴＥＮ緩衝液中に 懸濁する。この懸濁液を１０分間、または均質な懸濁液が得られるまで超音波処 理する。３,１４−ツビッタージェン（カルバイオケム）の１０％水溶液（１０ ｍｌ）を加え、溶液を充分に混合する。この溶液を再び１０分間超音波処理する 。残留する不溶性の物質をすべて遠心分離により除去する。タンパク質濃度を測 定し、８Ｍ尿素−１０％ツビッタージェン緩衝液（１：１比）でタンパク質濃度 を２ｍｇ／ｍｌに調節する。 ついで、この混合物を、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＣａＣｌ₂、０.０５％３,１４−ツビッタージェン、０. ０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ＝８.０中で平衡化したセファクリルＳ−３００ の２.６×１００ｃｍカラムに適用する。流速は１ｍｌ／分に維持する。１０ｍ ｌの画分を回収する。ポーリンはゲル濾過の間に３量体に再生する。各画分のＯ Ｄ＝２８０ｎｍを測定し、タンパク質を含有する画分をポーリンのためのＳＤＳ ゲル電気泳動アッセイに供する。ポーリンを含有する画分をプールする。プール した画分を透析するか、または５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ＝８.０、０.０５％ ３,１４−ツビッタージェン、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１Ｍ ＮａＣｌ中に１：１０ に希釈する。ついで、得られた溶液を、同緩衝液中で平衡化した２.６×１０ｃ ｍ Ｑセファロース高速カラム（ファルマシア）に適用する。ポーリンは０.１〜 １Ｍ ＮａＣｌの直線勾配で溶出される。実施例５．組換えクラス３ポーリンの精製および再生 ｐｏｒＢ−ｐＥＴ−１７ｂプラスミドを含有する大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３） ΔｏｍｐＡをルリアブロス中、３０℃にて対数中期まで（６００ｎｍにおけるＯ Ｄ＝０.６）増殖させる。ついで、ＩＰＴＧを加え（最終０.４ｍＭ）、菌体を３ ７℃にてさらに２時間増殖させる。ついで、菌体を回収し、幾つかの容量のＴＥ Ｎ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０.２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｐＨ８.０）で洗浄し、菌体ペーストを−７５℃にて凍結貯蔵した。 精製のため、約３ｇの菌体を解凍し、９ｍｌのＴＥＮ緩衝液中に懸濁させる。 リゾチーム（シグマ、０.２５ｍｇ／ｍｌ）を加え、デオキシコール酸塩（シグ マ、１.３ｍｇ／ｍｌ）およびＰＭＳＦ（シグマ、μｇ／ｍｌ）を加え、混合物 を室温にて１時間穏やかに震盪する。この時間の間に菌体は溶解し、放出された ＤＮＡによって溶液は非常に粘稠となる。ついで、ＤＮアーゼを加え（シグマ、 ２μｇ／ｍｌ）、溶液を再び室温にて１時間混合する。ついで、混合物をＳ−６ ００ローター中で１５Ｋｒｐｍにて３０分間遠心分離にかけ、上澄み液を廃棄す る。ついで、ペレットを１０ｍｌのＴＥＮ緩衝液中に２回懸濁し、上澄み液を廃 棄する。ついで、ペレットをＴＥＮ緩衝液中の８Ｍ尿素（ピアス）（１０ｍｌ） 中に懸濁する。この混合物を穏やかに撹拌し、塊をすべて破壊する。この懸濁液 を２０分間、または均質な懸濁液が得られるまで超音波処理する。３,１４−ツ ビッタージェン（カルバイオケム）の１０％水溶液（１０ｍｌ）を加え、溶液を 充分に混合する。この溶液を再び１０分間超音波処理する。残留する不溶性の物 質をすべて遠心分離により除去する。タンパク質濃度を測定し、８Ｍ尿素−１０ ％ツビッタージェン緩衝液（１：１比）でタンパク質濃度を２ｍｇ／ｍｌに調節 する。 ついで、この混合物を、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＣａＣｌ₂、０.０５％３,１４−ツビッタージェン、ｐ Ｈ＝８.０中で平衡化したセファクリルＳ−３００（ファルマシア）の１８０× ２.５ｃｍカラムに適用する。流速は１ｍｌ／分に維持する。１０ｍｌの画分を 回収する。ポーリンはゲル濾過の間に３量体に再生する。各画分のＯＤ₂₈₀ｎｍ を測定し、タンパク質を含有する画分をポーリンのためのＳＤＳゲル電気泳動ア ッセイに供する。ポーリンを含有する画分をプールする。 プールした画分を、ＰＭ１０膜を有するアミコン濃縮器を用い、１００ｍＭト リス−ＨＣｌ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０５％３,１４−ツ ビッタージェン、ｐＨ８.０を含有する緩衝液に対して透析し、４〜６倍に濃縮 する。別法として、プールした画分を８０％エタノールで沈殿させ、上記緩衝液 で再懸濁させる。ついで、６〜１０ｍｇの物質を同緩衝液で平衡化したモノＱ１ ０／１０カラム（ファルマシア）に適用する。１分間当たり１.２％増加させな がら浅い（shalow）０.１〜０.６Ｍ ＮａＣｌ勾配からポーリンを５０分間かけ て溶出する。流速は１ｍｌ／分である。ポーリンを含有するピークを回収し、Ｔ ＥＮ緩衝液および０.０５％３,１４−ツビッタージェンに対して透析する。ポー リンは他のＳ−３００クロマトグラフィーによりさらに精製してもよい。実施例６．多糖の精製および化学的修飾 グループＢナイセリア・メニンギチジスおよび大腸菌Ｋ１の両者の莢膜多糖は 、α（２→８）ポリシアル酸からなる（一般に、ＧＢＭＰまたはＫ１多糖と呼ば れる）。増殖培地から沈殿によって単離した高分子量多糖を（フラッシュら、Ba cterial Vaccines、アラン・アール・リス（Alan R.Liss,Inc.）、１２３〜１４ ５頁（１９９０）中、「ナイセリア・メニンギチジスワクチンの製造および調節 （Production and Control of Neisseria meningitidis Vaccines）」参照）、 ポーリンタンパク質に結合させる前に精製し、化学的に修飾した。この高分子量 多糖を０.１Ｍ酢酸（７ｍｇ多糖／ｍｌ；ｐＨ＝６.０〜６.５）で部分的に脱重 合して（７０℃、３時間）平均分子量が１２,０００〜１６,０００の多糖を得た 。ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（スーパーデックス（Superdex）２００調 製グレード、ファルマシア）により精製した後、ＮａＢＨ₄の存在下で多糖をＮ −脱アセチル化し、ついでジェニングスらの記載（J.Immunol.１３７：１８０８ （１９８６）に従ってＮ−プロピオニル化してＮ−Ｐｒ ＧＢＭＰを得た（実施 例１４参照）。ＮａＩＯ₄で処理した後にゲル濾過カラム精製して、平均分子量 １２,０００ダルトンの酸化Ｎ−Ｐｒ ＧＢＭＰを得た。実施例７．酸化Ｎ−ＰｒＧＢＭＰのグループＢ髄膜炎菌クラス３ポーリンタンパ ク質（ＰＰ）への結合 酸化Ｎ−Ｐｒ ＧＢＭＰ（９.５ｍｇ）を、０.２１ｍｌの０.２Ｍリン酸緩衝液 （ｐＨ７.５）（１０％オクチルグルコシドをも含有）中に溶解した精製クラス ３ポーリンタンパク質（３.４ｍｇ）に加えた。多糖が溶解した後、水素化シア ノホウ素ナトリウム（７ｍｇ）を加え、反応溶液を３７℃にて４日間インキュベ ートした。この反応混合物を０.０１％チメロサールを含有する０.１５Ｍ塩化ナ トリウム溶液で希釈し、スーパーデックス２００ＰＧを用いたゲル濾過カラムク ロマトグラフィーにより分離した。コンジュゲート（Ｎ−ＰｒＧＢＭＰ−ＰＰ） を、ボイド容量の近くで溶出する単一のピークとして得た。このコンジュゲート 溶液をシアル酸およびタンパク質について分析したところ、該コンジュゲートは ４３重量％の多糖からなることが示された。ポーリンタンパク質は該コンジュゲ ート中で４４％収率で回収され、多糖は１２％収率で回収された。種々の実験に おいて、一般にタンパク質の回収は５０〜８０％の範囲で得られ、多糖の回収は ９〜１３％の範囲で得られた（実施例１４をも参照）。実施例８．免疫原性の研究 上記Ｎ−Ｐｒ ＧＢＭＰ−ＰＰコンジュゲートの免疫原性、および同様の結合 手順により調製したＮ−Ｐｒ ＧＢＭＰ−破傷風トキソイド（Ｎ−Ｐｒ ＧＢＭＰ −ＴＴ）コンジュゲートの免疫原性を、４〜６週齢の非近交系スイスウエブスタ −ＣＦＷ雌マウスでアッセイした。多糖（２μｇ）−コンジュゲートを第１日、 １４日、および２８日目に投与し、血清を第３８日目に採取した。コンジュゲー トの投与は、食塩溶液として、水酸化アルミニウムに吸着させて、またはステア リルチロシンと混合して行った。多糖抗原に対する血清ＥＬＩＳＡ力価およびナ イセリア・メニンギチジスグループＢに対する殺菌力価を表１にまとめて示す。実施例９．酵母ピキア・パストリス発現系を用いたグループＢナイセリア・メニ ンギチジス外膜（ＭＢ３）の発現 材料および方法 株およびプラスミド ピキア・パストリスＧＳ１１５（インビトロジェンより提供）はヒスチジンデ ヒドロゲナーゼ遺伝子（ｈｉｓ４）に欠陥を有するため、ヒスチジンを合成する ことができない。すべての発現プラスミドがＨＩＳ４遺伝子を有していて宿主の ｈｉｓ４を補足するため、形質転換体はヒスチジン欠失培地での増殖能力により 選択される。形質転換されるまではＧＳ１１５は最小培地単独では増殖しないで あろう。発現ベクター 外来タンパク質の発現のために強力で高誘発性のＡＯＸ１プロモーターを含む ４つの異なる発現ベクターを用いた（ピキア発現キット、インビトロジェン）。 一つのベクター、ｐＨＩＬ−Ｄ２は細胞丙発現のために用い、他の３つ（ｐＨＩ Ｌ−Ｓ１、ｐＰＩＣ９、およびｐＰＩＣ９Ｋ）は分泌発現のために用いる。ｐＨ ＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、およびｐＰＩＣ９の地図は、ピキア発現キット、 バージョンＥのインビトロジェンインストラクションマニュアルの１９〜２２頁 （その内容を参照のため本明細書中に引用する）に記載されている。分泌には、 発現されたタンパク質上に該タンパク質を分泌経路にターゲティングするための シグナル配列が存在していることが必要である。成功の可能性を高めるため、２ つの異なる種類のベクターがキットに含まれている。ベクターｐＨＩＬ−Ｓ１は 酸性ホスファターゼ遺伝子ＰＨＯ１からの天然のピキア・パストリスシグナルを 有する。ベクターｐＰＩＣ９およびｐＰＩＣ９Ｋ（補正したＨＩＳ４領域を有す る）はともにサッカロミセス・セレビシエのα−交配因子プレプロペプチドから の分泌シグナルを有する。分泌タンパク質を発現させる利点は、ピキア・パスト リスが天然タンパク質を非常の低レベルでしか分泌しないことである。それゆえ 、分泌された異種タンパク質は培地中の全タンパク質の大部分を占め、タンパク 質の精製の第一ステップとなる（バー（Barr）ら、Pharm.Eng.１２（２）：４８ 〜５１（１９９２））。髄膜炎菌Ｂクラス３タンパク質遺伝子（ＭＢ３）のクローニング グループＢナイセリア・メニンギチジス（株８７６５）のゲノムＤＮＡを、標 準ＰＣＲにおいてクラス３ポーリン（ＭＢ３）の増幅の鋳型として用いた。成熟 ポーリンタンパク質の増幅ＤＮＡ断片（９３０ｂｐ長）を、ｐＥＴ−２４ａクロ ーニング／発現ベクター（ストゥディエらによって最初に構築され（J.Mol.Biol .１８９：１１３〜１３０（１９８６）：Meth.Enzymol.１８５：６０〜８９（１ ９９０）；J.Mol.Biol.２１９：３７〜４４（１９９１））、ノバジェンによっ て製造された）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩクローニング部位にライゲートした。ｐ ＥＴベクターは、標的ＤＮＡ断片のクローニングおよび強力なＴ７転写および翻 訳シグナル下での発現のために開発された。Ｔ７プロモーターからの発現は、Ｔ ７ＲＮＡポリメラーゼ源を宿主細胞に提供することにより誘発される。Ｔ７発現 系を利用した一層新しく便利なベクターが、今やノバジェン（マジソン、ウイス コンシン５３７１１）から利用できる。Ｔ７発現系は大腸菌中でのＭＢ３の発現 に首尾よく用いられた（実施例３参照）。発現されたＭＢ３遺伝子の翻訳伸長速度の最適化 コドン使用頻度は翻訳伸長速度に影響を及ぼすことが知られており、それゆえ 生成物の収量に影響を及ぼす重要な因子であると考えられている（ロマノス（Ro manos）ら、Yeast ８：４２３〜４８８（１９９２））。コドン使用頻度が発現 されたタンパク質の収量および質の両方に影響を及ぼすとの証拠がある。多くの 高発現遺伝子は一部のコドンに対して強い偏向を示す（ベネッツェン（Bennetze n）ら、J.Biol.Chem.２５７：３０２６〜３０３１(１９８２)）。この「主要な コドンへの偏向（major codon bias）」（生物により大きく異なりうる）は、増 殖最適化戦略であると思われる。この機構は、ごく一部のｔＲＮＡおよびアミノ アシルｔＲＮＡシンテターゼのみが高濃度で存在すればよいことから、生物が迅 速な増殖の際に高発現遺伝子の効率的な翻訳をすることを可能にする。カーラン ド（Kurland）ら、ＴＩＢＳ １２：１２６〜１２８（１９８７）。ｍＲＮＡが稀 なコドンを含む場合には、アミノアシルｔＲＮＡは限られ、アミノ酸の誤導入の 確率が高まり、おそらくリボソームがはずれることも起こりうる。実際、最近、 大腸菌で産生された外来タンパク質において高い誤導入頻度が観察されている（ スコラー（Scorer）ら、Nucleic Acids Res.１９：３５１１〜３５１６（１９９ １））。さらに、アミノ酸の誤導入を含むタンパク質は精製す るのが難しく、活性および免疫原性がともに損なわれていることがある。幾つか の稀なコドンの存在が大腸菌での破傷風毒素断片Ｃの産生を制限することが示さ れている（マコフ（Makoff）ら、Nucleic Acids Res.１７：１０１９１〜１０２ ０１（１９８９））。酵母において、ヘケマ（Hoekema）らは（Mol.Cell.Biol. ７：２９１４〜２９２４（１９８７））、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ ）遺伝子の５'部分において好ましいコドンの大きな比率の部分を稀なコドンで 置換することが発現レベルの減少をもたらすことを示した。最近、合成のコドン 最適化遺伝子を用いた場合に、カッパ鎖ｍＲＮＡレベルは同じであるにもかかわ らず、免疫グロブリンカッパ鎖の酵母での発現が５０倍高くなることが示された 。 ピキアとＭＢ３とのコドン使用頻度に有意の差異が認められた（表５）。とり わけ翻訳伸長の開始において翻訳効率を最適化するため、ピキアに最適なコドン をＭＢ３遺伝子の５'領域に導入した。ＭＢ３をｐＨＩＬ−Ｓ１中にクローニン グするのに使用するリンカーを構築するに際して、ピキア発現に最適な配列を含 むようにオリゴマーを合成した。５１ヌクレオチド長のオリゴマー（５１−ｍｅ ｒ）をこの目的のために合成した。このオリゴマーの配列は以下の通りである： 上記５１−ｍｅｒに相補的な４７ヌクレオチドオリゴマーも合成した。このオリ ゴマーの配列は以下の通りである： これら２つのオリゴマー（ＸｈｏＩおよびＢｓｒＩ制限部位を含む）はアニー ルしてコネクターとして働き、ついでＸｈｏＩ消化により直線状にしたベクター ｐＨＩＬ−Ｓ１にライゲートした。ついで、ライゲートした断片をＢａｍＨＩで 消化し、ゲル精製し、ついでｐＮＶ１５ベクターをＢｓｒｌおよびＢａｍＨＩの 両酵素で切断して得られたＭＢ３断片とライゲートした。ついで、この断片をピ キアｐＨＩＬ−Ｓ１発現ベクター中にクローニングした。ＭＢ３の５'領域の新 たなＤＮＡ配列を、ピキアから単離したｐＨＩＬ−Ｓ１／ＭＢ３のＤＮＡ配列決 定により確認した。 成熟ＭＢ３の遺伝子の本来の５'末端の配列（ＮＴＩから）は以下の通りであ る： 同じ断片のコドンを最適化した配列を対応アミノ酸配列とともに示すと以下のよ うになる（置換したヌクレオチドは大文字で示す）： ベクターｐＨＩＬ−Ｓ１／ＭＢ３（コドン最適化ＭＢ３ ＤＮＡを含む）を標 準ＰＣＲにおけるＭＢ３の増幅のための鋳型として用いた。オリゴマーを合成し たＰＣＲプライマーとして使用した。ＭＢ３のＰＣＲ断片を直接またはオリジナ ルＴＡクローニングキット（Original ＴＡ Cloning Kit）（インビトロジェン ）を用いてピキア発現ベクター中に挿入した。詳細は以下の通りである。： ｐＨＩＬ−Ｄ２のＥｃｏＲＩ部位へのＭＢ３のクローニングのため： フォアウォードプライマー（３９ヌクレオチド、創製したＥｃｏＲＩ部位および 開始メチオニンをコードする配列（５'ＡＴＧ）を有する）： リバースプライマー（４５ヌクレオチド、創製したＥｃｏＲＩ部位および終止コ ドンを有する）： ｐＰＩＣ９およびｐＰＩＣ９のＥｃｏＲＩ−ＡｖｒII部位へのＭＢ３のクローニ ングのため： フォアウォードプライマー（３９ヌクレオチド、創製したＥｃｏＲＩ部位を有す る；リーダーペプチドが開始メチオニンを有していたので開始メチオニンをコー ドする配列は必要なかった）： リバースプライマー（３６ヌクレオチド、創製したＡｖｒII部位および終止コド ンを有する）： 完全なＭＢ３遺伝子のＰＣＲ増幅のため、ベント（Vent^R）ＤＮＡポリメラー ゼ（ＮＥＢ）を用いた。このポリメラーゼの忠実度（fidelity）は、Ｔａｑ Ｄ ＮＡポリメラーゼで観察されるものに比べて５〜１５倍高い。発現カセットプラ スミドを生成するため、ＭＢ３のＰＣＲ断片（全長断片および切断した断片）を ピキア発現ベクター中に直接またはオリジナルＴＡクローニングキット（インビ トロジェン）（ＰＣＲ断片のサブクローニングのためのｐＣＲ^TMIIベクターを含 む）を用いて挿入した。ベントＤＮＡポリメラーゼかまたはＰｆｕ ＤＮＡポリ メラーゼのいずれかにより増幅したＤＮＡのベクターｐＣＲ^TMII中への直接クロ ーニングは、クローニング効率がしばしば非常に低いため困難である。これは、 ＴＡクローニングに必要な３'Ａ突出を除去して平滑末端を残すベントおよびＰ ｆｕの３'→５'エクソヌクレアーゼ校正活性のためである。オリジナルＴＡクロ ーニングキットは、これら平滑末端化した断片をクローニングすることを可能に する。この方法を使用するとＰＣＲ産物の酵素的修飾の必要がなく、制限部位を 含むＰＣＲプライマーを使用する必要がない。クローニング効率をさらに高める ため、インビトロジェンプロトコールを以下のように改変した。ベントまたはＰ ｆｕで増幅した後（オリジナルＴＡクローニングキットのマニュアル、増幅後の ３'Ａ突出の付加のプロトコール、１９頁を参照）、キットにおいて推奨されて いるようにバイアルを氷上に入れるのではなく、ＰＣＲ混合物中の鉱油をパラフ ィルム（Parafilm^TM）を用い直ちに取り除いた。このことは、ＰＣＲ混合物をパ ラフィルムに注ぎ、すべての油滴がパラフィルム表面に吸着するまで穏やかにゆ する動作をしながらパラフィルム表面上で油滴をジグザグに下降させることによ り行った。ついで、今や油を含まなくなった反応混合物を新たな管に回収した。 ついで、Ｔａｑポリメラーゼを添加してインビトロジェンプロトコールを再開し た。この方法は、大きな発現ベクター中へのＰＣＲ断片の困難なクローニングを 可能にした。 組み込みベクター（インビトロジェン）の発現カセットは、ＡＯＸ１遺伝子の 上流および下流ヌクレオチド配列によりフランキングされた、メタノール誘発性 ＡＯＸ１プロモーターおよびそのターミネーターを含む。ピキア・パストリスの Ｈｉｓ４遺伝子は栄養要求マーカーとして機能した。これらベクターは酵母の複 製起点を含まないのでＨｉｓ⁺コロニーは発現カセットの組み込みに対応するに 違いない。ＭＢ３のすべてのＰＣＲ断片をピキアのコザック共通配列（ＣＡＡＡ ＡＡＡＣＡＡ）（カベナー（Cavenor）ら、Nucleic Acids Res.１９：３１８５ 〜３１９２（１９９１）；コザック（Kozak）、Nucleic Acids Res.１５：８１ ２５〜８１４８（１９８７）；コザック、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ ８７：８ ３０１〜８３０５（１９９０））とインフレームで挿入してＭＢ３遺伝子の最良 の翻訳開始とした。すべての挿入配列をＡＯＸプロモーターの制御下において所 望の遺伝子の発現を行った。ＭＢ３断片を適当な発現ベクター中にライゲートし た後、化学的にコンピテントな大腸菌菌体を形質転換した（ＴＯＰＩＯＦ'）（ Ｆ’{ｐｒｏＡＢ、ｌａｑＩ_q、ｌａｃＺΔＭ１５、Ｔｎ（Ｔｅｔ^R）}ｍｃｒＡ、 Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）、φ８０ｌａｃＺΔＭ１５、Δｌａｃ Ｘ７４、ｄｅｏＲ、ｒｅｃＡ１、ａｒａＤ１３９、Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９ ７、ｇａｌＵ、ｇａｌＫ、ｒｐｓＬ（Ｓｔｒ^R）、ｅｎｄＡ１、ｎｕｐＧλ^-）。 他の適した株はＤＨ５αＦ'、ＪＭ１０９、または選択可能なＦ'エピソームを含 みｒｅｃＡ欠失である他の株である（ｅｎｄＡが好ましい）（ピキア発現キット イントラクションマニュアル、インビトロジェン）。ＭＢ３挿入を有す るコロニーを用いてピキア形質転換のためのプラスミドＤＮＡのＣｓＣｌ精製マ クシープレプを調製した（サンブルックら編、モレキュラー・クローニング：ア ・ラボラトリー・マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバープレス（１ ９８９）、１.４２〜１.４３頁）。制限分析およびＤＮＡ配列決定（ＤＮＡシー クエンシングキット、バージョン２（ＵＳＢ））は、これら構築物が正しいこと を確認した。 出発材料であるＭＢ３配列の修飾は、ポーリン遺伝子の細胞内発現（ｐＨＩＬ −Ｄ２／ＭＢ３構築物）に特に有用であった。ＭＢ３分泌に用いた他の構築物（ ｐＨＩＬ−Ｓ１／ＭＢ３およびｐＰＩＣ９／ＭＢ３）はＭＢ３挿入配列の上流の リーダーペプチド配列中にピキアに最適なコドンを含んでいたので、翻訳の開始 は速度を制限するものではなかった。対照的に、ｐＨＩＬ−Ｄ２ベクターはリー ダー配列を含んでおらず、翻訳の開始はＭＢ３挿入配列の稀なコドンから開めな ければならない。この配列の最適化が、ｐＨＩＬ−Ｄ２／ＭＢ３構築物が試験し たすべてのクローンの中で最高レベルのＭＢ３発現を与えたという事実の理由で あると思われる（表３、４）。酵母細胞の形質転換および組み込み体のＤＮＡ分析 プラスミドＤＮＡを単独または二重（一層高い組み込み効率のため）消化して 直線状にし、ザイモリアーゼを用い、ついで形質転換ＤＮＡの吸着およびＰＥＧ およびＣａ⁺²の存在下でスフェロプラスト孔を通してピキア菌体中へ該ＤＮＡを 浸透させるスフェロプラスト法により（ピキア発現キットマニュアル、インビト ロジェン、３３〜３８頁）ピキア・ペクトリス株ＧＳ１１５（ｈｉｓ４^-）を形 質転換してＨｉｓ⁺表現型とした。最小デキストロース（ＭＤ：１.３４％酵母窒 素ベース（ＹＮＢ−ジフコ）、４×１０^-5％ビオチン、２％デキストロース）と 最小メタノール（ＭＭ：１.３４％ＹＮＢ）４×１０^-5％ビオチン、０.５％メタ ノール）に対するレプリカプレーティングおよびパッチングにより、どのＨｉｓ⁺ 形質転換体がＡＯＸ１遺伝子の破砕をも示すかを決定することが可能であった 。形質転換したスフェロプラストを、ヒスチジン不含の選択増殖培地（ＭＤ）を 用いてアガロース含有プレート上に植え込んだ。４〜６日目の終わりに、酵母形 質 転換体の白色の分離コロニーが出現した。これらコロニーを拾い、ＡＯＸ１破砕 （Ｍｕｔ^sまたはＭｕｔ^-）形質転換体のスクリーニングのために選択メタノール 含有培地（ＭＭ）上に植え込んだ（ピキア発現キットマニュアル、インビトロジ ェン、６０頁）。酵母の増殖およびメタノール誘発 組換え事象はタンパク質発現レベルに影響を及ぼす多くの異なる仕方で起こり うるので（クローン変異）、少なくとも１６の確認された組換えクローンをスク リーニングしてＭＢ３発現レベルを決定した。これらコロニーを、イノバインキ ュベーターシェーカー（ニュー・ブルンスウィック・サイエンス）中の５０ｍｌ 容２０９８ブルーマックス管（ファルコン）中にて、３０℃で、５ｍｌのグリセ リン含有緩衝グリセリン複合培地（Buffered Glycerol−complex Medium）（Ｂ ＭＧＹ：１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６. ０、１.３４％ＹＮＢ、４×１０^-5％ビオチン、１.０％グリセリン）（ピキア発 現キットマニュアル、インビトロジェン、６１頁）中で増殖させた（「パイロッ ト」発現）。１〜２日後に培養液がＯＤ６００＝５〜１０に達したときに、ＡＯ Ｘ１プロモーターの誘発のために菌体を遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分間、 室温）により回収し、メタノール含有緩衝メタノール複合培地（Buffered Metha nol−complex Medium）（ＢＭＭＹ：１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍ Ｍリン酸カリウム、ｐＨ６.０、１.３４％ＹＮＢ）４×１０^-5％ビオチン、０. ５％メタノール）（ピキア発現キットマニュアル、インビトロジェン、６１頁） 中に再懸濁した。使い果たしたメタノールを補給するため、０.５％の新たなメ タノールを誘発細胞に毎日加えた。細胞のアリコートを遠心分離により６日間、 毎日回収し、調べる前に−７０℃で貯蔵した（ペレットおよび上澄み液を別々に ）。タンパク質発現の最適化のため、および発現プロトコールをスケールアップ して一層多くのタンパク質を産生させるため、最も期待されるクローンを調べた 。ピキア・ペクトリスの溶解、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析およびウエスタンブロ ット分析 菌体を破壊緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７.４；１ｍＭ ＰＭＳＦ （フェニルメチルスルホニルフルオライド）、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび５％グリ セリン）中で撹拌することにより破砕した。等容量の酸洗浄ガラスビーズ（直径 ０.５ｍｍ）を加えた。混合物を合計４分間（各３０秒混合、ついで各３０秒氷 上）、撹拌した。可溶性画分を１４０００ｒｐｍで４℃にて１０分間遠心分離に かけることにより回収した。上澄み液（または細胞溶解液、または「可溶性」タ ンパク質の画分）を取り、−７０℃で貯蔵し、残留細胞ペレットをＳＤＳ試料緩 衝液（１％ＳＤＳ、５％ベーターメルカプトエタノール、１０％グリセリン、１ ０ｍＭ ＥＤＴＡ、０,０２５％ブロモフェノールブルー）で撹拌し、ついで１０ 分間沸騰させることにより抽出した。溶解液を再び遠心分離にかけ、水性層を「 不溶性」または膜結合タンパク質の画分として調べた。レムリらの方法（Nature ２２７：６８０〜６８５（１９７０））に従い、ノベックス（ＮＯＶＥＸ）プ レーキャスト８〜１６％勾配ゲルを用いてタンパク質を分離した。ドデシル硫酸 ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離 したタンパク質を、クマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色するか、または 企業の説明書に従ってトランスブロット装置（バイオラド・ラボラトリーズ）を 用いてポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）に移した。 シェング（Sheng）およびシャスター（Schuster）により記載された方法 （BioTechnique １３：７０４〜７０８（１９９２））に若干の変更を加え、界 面活性剤を用いることなく、ブロッキング法のみを用いてウエスタンブロット法 を行った。この方法は、低バックグラウンドで高い特異性および感度を与える。 移行については、電気移行に先立ってウエスタン移行膜およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ 分離ゲルの両者を移行緩衝液（２４ｍＭトリス−ＨＣｌ／１９２ｍＭグリシン／ ２０％メタノール）で２０分間平衡化した。移行は９０Ｖ、４℃にて３〜４時間 行った。タンパク質のＰＶＤＦ膜への移行は、前以て染色した分子量マーカー（ ＢＲＬ）の移行によりモニターした。 タンパク質のイムノステイニングを以下のようにして行った。移行膜をＴＢＳ （１０ｍＭトリス−ＨＣｌ／０.０９％ＮａＣｌ、ｐＨ７.２）で濯いだ。ついで 、 膜を０.０２％アジ化ナトリウムを含む１％脱脂粉乳ＰＢＳ溶液（Ｍ−ＰＢＳ） 中、３７℃で３時間（または４℃で一夜）インキュベートした。ついで、膜をＴ ＢＳ／０.５％ＢＳＡ（ＢＳＡ／ＴＢＳ）で３回、およびＴＢＳで１回洗浄した 。ついで、膜をＰＢＳ／１％ＢＳＡ（ＢＳＡ／ＰＢＳ）中で約１：４０００に希 釈した一次マウス抗ＭＢ３抗体（精製ＯＭＰクラス３に対するマウスポリクロー ナル抗血清）とともにインキュベートし、膜を再びＴＢＳ／０.５％ＢＳＡ（Ｂ ＳＡ／ＴＢＳ）で３回、およびＴＢＳで１回洗浄した。ついで、膜を１％Ｍ−Ｐ ＢＳ中、室温で穏やかに振盪しながら３０分間インキュベートした。膜をＴＢＳ ／０.５％ＢＳＡ（ＢＳＡ／ＴＢＳ）で３回、およびＴＢＳで１回洗浄した。つ いで、膜を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１：４０００に希釈した二次アルカリホスフ ァターゼ結合抗マウス抗体（キルケガール＆ペリー・ラボラトリー（ＫＰＬ）、 ゲイサーズバーグ、メリーランド）中でインキュベートした。ついで、膜を０. ５％ＢＳＡ／ＴＢＳで２回、ＰＢＳ中の０.２５％トゥイーン２０で３回洗浄し た。これら洗浄工程はシェングおよびシャスターにより推奨されるものと異なっ ていた。改良されたプロトコールは、０.５％ＢＳＡ／ＰＢＳ中での６回の洗浄 を利用する文献の洗浄工程よりも低いバックグラウンドを提供した。ついで、膜 をアルカリホスファターゼ緩衝液（０.０５％Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９.５、１ ０ｍＭ ＭｇＣｌ₂）中でインキュベートし、ついでＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液（ ＫＰＬ）中でインキュベートした。膜をＰＢＳ／５０ｍＭＥＤＴＡ中で洗浄する ことにより発色を停止させた。検出限界は天然ＭＢ３タンパク質の約２〜５ｎｇ であった。 結果および検討 成熟ＭＢ３をコードするｃＤＮＡを発現ベクター中に挿入するのに用いた戦略 および該構築物をピキア・パストリスの形質転換に用いる工程を以下に概説する 。まず、ＭＢ３遺伝子を４つのピキア発現ベクターの一つにクローニングする。 次工程において、得られた構築物をＮｏｔＩまたはＢｇｌIIで消化することによ り直線状にし、ｈｉｓ４ピキアスフェロプラストを該直線状構築物で形質転換す る。次工程において、組換え事象がインビボにてベクターおよびゲノム中の５' およ び３'ＡＯＸ１配列間で起こり、ＡＯＸ１遺伝子がＭＢ３遺伝子と置換される結 果となる。ついで、遺伝子置換の起こった菌体のみが増殖できるヒスチジン欠失 培地上でピキア形質転換体を選択する。サッカロミセス・セレビシエについて記 載された１工程遺伝子置換法（ロートスタイン（Rothstein）、Meth.Enzymol.１ ０１：２０２〜２１１（１９８３））が、ピキア・パストリスのＡＯＸ１構造遺 伝子の置換のためにクレッグら（Biological Research on Industrial Yeast、V ol.II、スチュワート（Stewart）ら編、ＣＲＣプレス、ボカレィトン、１〜１８ 頁（１９８７））によって首尾よく用いられた。ＭＢ３挿入配列を有する１０μ ｇの直線状発現ベクター（ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ９、およ びｐＰＩＣ９Ｋ）によるＧＳ１１５の形質転換は、各実験において１００以上の コロニーを与えた。それゆえ、この手順により１μｇのＤＮＡ当たり＞１０²の Ｈｉｓ⁺コロニーが得られ、これはピキア・パストリス形質転換の最良の結果に ついて報告されたものに匹敵する。これら形質転換体はヒスチジン欠失培地（Ｍ Ｄ−最小デキストロース）上で増殖する能力を有し、それゆえＨｉｓ^-である。 これら組換え体の約１０〜４０％が「メタノールスロー(methanolslow）」(Ｍｕ ｔ^s−「メタノール利用スロー（methanol utilization slow）」）であった、す なわち、メタノールを唯一の炭素およびエネルギー源として含有するＭＭ（最小 メタノール）などの培地上での増殖が損なわれていた。これらＨｉｓ⁺／Ｍｕｔ^s 形質転換体は、二重交差現象によるＡＯＸ１構造遺伝子とＨｉｓ⁺遺伝子を含む ＭＢ３発現カセットとの置換の結果である。組換え現象はまた、５'または３'Ａ ＯＸ１領域中への発現カセットの組み込みまたは挿入（単一交差現象）によって も起こり、ＡＯＸ１遺伝子を完全なまま残す。Ｈｉｓ⁺／Ｍｕｔ^sクローンのうち ２５〜３５％が陽性のＭＢ３発現形質転換体であった（表２）。ＡＯＸ１欠失形 質転換体メタノール培地上でいやしくも増殖する理由は、ＡＯＸ２遺伝子産物に よるアルコールオキシダーゼ活性の低レベル発現によるものである。５'ＡＯＸ １、３'ＡＯＸ１、５'ＭＢ３、３'ＭＢ３および他の特異的なプライマーによる ＰＣＲを用いたこれら「陽性」組換え体から単離したＤＮＡの分析は、ＡＯＸ１ 構造遺伝子がＭＢ３遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子を含む断片により確か に置換されていることを示した。Ｈｉｓ⁺／Ｍｕｔ⁺形質転換体から単離したＤＮ Ａの分析は、ＡＯＸ１構造遺伝子が完全であること、およびＨｉｓ４ＤＮＡを含 むベクター全体がいずれかの部位に組み込まれていることを示した。ＭＢ３を発 現した３９のＡＯＸ１破砕形質転換体の間でＨｉｓ⁺／Ｍｕｔ⁺形質転換体は認め られず、組み込みのＡＯＸ１置換モードが優先されることを示していた。 ８４のピキア形質転換体のイムノブロット分析の結果は、構築した組換えプラ スミド、ｐＨＩＬ−Ｄ２／ＭＢ３、ｐＨＩＬ−Ｓ１／ＭＢ３、ｐＰＩＣ９／ＭＢ ３、およびｐＰＩＣ９Ｋ／ＭＢ３のいずれを用いてもＭＢ３タンパク質を発現し うることを示していた（表３）。ＭＢ３タンパク質を発現する３９のクローンが 単離された。発現されたＭＢ３タンパク質の抗原特異性を、野生型のナイセリア ・メニンギチジスＯＭＰクラス３に対して産生したモノクローナル抗体およびポ リクローナル抗体を用いたウエスタンブロット分析により調べ、確認した。これ ら結果は、すべての発現ベクターが正しく構築されており、ピキアスフェロプラ ストの形質転換が適切に行われているという結論に導いた。 発現されたＭＢ３の量の測定を、モデルＧＤＳ−７５００走査型濃度計 （scanning densitometer）（ＵＶＰ・ライフ・サイエンス）またはモデルＩＳ −１０００濃度計（アルファ・イノテック）を用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分 画したクーマシーブリリアントブル一染色タンパク質バンドの濃度走査（densit ometric scanning）により行った。野生型のナイセリア・メニンギチジスから抽 出した精製ＯＭＰクラス３を標準として用いた。得られた結果（表３に要約して ある）に基づき、タンパク質発現レベルは中くらいから高いものとして評価され た。 ＭＢ３遺伝子の発現についての翻訳伸長速度の最適化（上記材料および方法を 参照）は非常に有用であった。開始ＭＢ３配列の修飾は、ポーリン遺伝子の細胞 内発現（ｐＨＩＬ−Ｄ２／ＭＢ３構築物）にとって特に有用であった。他の構築 物（ｐＨＩＬ−Ｓ１／ＭＢ３およびｐＰＩＣ９／ＭＢ３、ともにＭＢ３分泌のた めに使用）はＭＢ３挿入配列の上流のリーダーペプチド配列中にピキアに最適な コドンを含んでいたので、これらカセットの翻訳の開始は速度を制限するもので はなかった。対照的に、ｐＨＩＬ−Ｄ２／ＭＢ３構築物はリーダー配列を含んで おらず、それゆえコドンの最適化がなければ翻訳はＭＢ３挿入配列の稀なコドン で開始せざるを得なかった。コドンを最適化したｐＨＩＬ−Ｄ２／ＭＢ３構築物 は、ピキアの染色体ＤＮＡ中に形質転換したときに上記他のすべてのＭＢ３発現 構築物のうちで最高レベルのＭＢ３発現を与えた（表３および４）。それゆえ、 このＭＢ３の翻訳開始配列の修飾はｐＨＩＬ−Ｄ２／ＭＢ３構築物における発現 タンパク質の高収量の原因であると思われる。 最良のクローン（ｐＨＩＬ−Ｄ２／ＭＢ３構築物で形質転換したピキア）によ るＭＢ３発現レベルは、１Ｌの細胞懸濁液当たり０.１〜０.６ｇの範囲、あるい は１ｇの細胞ペレット当たり１〜３ｍｇであった（表３、図１２）。酵母におけ るこのような発現効率は、以下のような多くの製造タンパク質について報告され ている：Ｂ型肝炎表面抗原（０.３ｇ／Ｌ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ ０.７５ｇ／Ｌ）、ウシおよびヒトリゾチーム（それぞれ、０.３ｇ／Ｌおよび０ .７ｇ／Ｌ）、ヒトおよびマウス上皮成長因子（それぞれ、０.５ｇ／Ｌおよび０ .４５ｇ／Ｌ）、ヒトインシュリン様成長因子（０.５ｇ／Ｌ）、ヒトインターロ イキン−２（１.０ｇ／Ｌ）、アプロチニンアナログ（０.８ｇ／Ｌ）、クニッツ プロテアーゼインヒビター（１.０ｇ／Ｌ）など（クレッグら、Biotechnology、 １１：９０３〜９０６、表１（１９９３））。 上記に掲げた製造タンパク質の発現レベルは、これらタンパク質を高細胞密度 発酵器中で発酵させた際に製造した結果であることが強調されなければならない 。ＭＢ３は振盪フラスコ培養を利用してしか発現されなかったが、これは原則と して発酵に比べてはるかに低レベルの発現をもたらすのである。最近報告された 観察は、発酵器中でのＭＢ３（クレッグら、１９９３）のはるかに高い収量（５ 〜１０倍またはそれ以上の増加）の期待へと導くものである。ピキア・パストリ スは、振盪フラスコ培養から高密度発酵器培養へとスケールアップすることに充 分に適応する。さらに、ＡＯＸの欠失したピキア株を発酵に用いる場合には、ま ず迅速な増殖を引き起こさせ、ついでメタノールを加えてさらなる細胞増殖を最 小限に抑えながらタンパク質産生を誘発させることによって外来タンパク質の産 生 を最適化することができる。ピキアをメタノール上で増殖させるときにタンパク 質を産生するのに必要とされる長期の時間は、幾つかの混合食餌発酵戦略（mixe d-feed fermentation strategies）の一つを適用することによって低減させるこ とができる（シーゲル（Siegel）ら、Biotechnol.Bioeng.３４：３０４〜４０４ （１９８９）；ブリアリー（Brierley）ら、国際特許出願ＷＯ９０／０３４３１ （１９８９）；ブリアリーら、Bichem.Eng.５８９：３５０〜３６２（１９９０ ）；シーゲルら、国際特許出願ＷＯ９０／１０６９７（１９９０））。 ピキアにおけるＭＢ３タンパク質の発現レベルの他の期待できる側面は、調べ たすべてのクローンについて同様の結果が得られたことである。他の研究者が振 盪フラスコ誘発において発現レベルが所望の挿入遺伝子のコピー数に正比例する ことを見出していることから（クレッグら、１９９１）、試験したすべてのＭＢ ３クローンが単一コピーの染色体組み込み体であること、それゆえＭＢ３断片の 多組み込みコピーを有するピキア組換え体は単離されなかったことが導き出され る。 ピキア・パストリスを用いて高発現レベルを得るうえでの重要な因子は、多コ ピー置換（transplacement）または組み込みを有する組換え体を得る能力である （ロマノス（Romanos）ら、Vaccine９：９０１〜９０６（１９９１）；クレア（ Clare）ら、Bio/Technology９：４５５〜４６０（１９９１）；クレアら、Gene １０５：２０５〜１２１（１９９１））。多コピー形質転換体は、高細胞密度発 酵での増殖および誘発の間に複数の世代にわたって驚くほど安定であることがわ かった。この多遺伝子の挿入現象はスフェロプラスト形質転換では低頻度でしか 起こらないので、多数の組換え体の特別の（special）ドットブロットスクリー ニングを用いる（スコラーら、Bio/Technology１２：１８１〜１８４（１９９３ ））。自然多挿入現象のスクリーニングに代わる方法は、ピキア発現ベクターｐ ＡＯ８１５（この目的のためにインビトロジェンにより開発された）中に所望の 遺伝子の多コピーを挿入することである。 ＭＢ３の発現を試みる前に、発現レベルを低減させると思われる因子が存在す るかどうかを決定するために該タンパク質を評価した。タンパク質の予想された 高レベルの蓄積を低減させ得る因子の一つはタンパク質分解的な安定性である。 高発現タンパク質は完全な（good）ＰＥＳＴ配列を欠くことが今や知られている 。ＰＥＳＴ配列はプロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）およびス レオニン（Ｔ）を含み、既知配列の速やかに分解される真核細胞タンパク質のす べてに見出されている。かかるタンパク質はカルシウム活性化プロテアーゼの良 好な基質であると思われている（ロジャーズ（Rogers）ら、Science２３４：３ ６４〜３６９（１９８６））。酵母において高レベルで発現されるタンパク質は 、いわゆる「完全な」ＰＥＳＴ配列（ロジャーズら（１９８６）によって開発さ れたアルゴリズムにより計算して＞５のスコアを有する）（タンパク質加水分解 を受け易くする）を含んでおらず、リソソーム経路による細胞質タンパク質の分 解に選択的である（ダイス（Dice,J.F.）、Fed.Am.Soc.Exp.Biol.（ＦＡＳＥＢ ）J.１：３４９〜３５７（１９８７））ペンタペプチド配列ＸＦＸＲＱまたはＱ ＲＸＦＸ（Ｘはあらゆるアミノ酸）をも含まない。酵母において高レベルで発現 されるタンパク質はこれらペンタペプチド配列を含まない。ＭＢ３配列のコンピ ューター分析は、配列：ＥＴＳＲＳＶＦＨＱＮＧＱＶＴＥＶＴＴＡＴを有する「 不充分な（poor）」しかし「完全」ではないＰＥＳＴ配列（１３〜３２アミノ酸 ）を同定した。ロジャーズら（１９８６）によれば、かかる不充分なＰＥＳＴ配 列は真核生物タンパク質のタンパク質分解的安定性に対して弱い影響しか及ぼさ ない。それゆえ、タンパク質分解に導く因子の一つはＭＢ３には存在しない。 ＭＢ３はまた、高度に保存された上記ペンタペプチド配列をも含まない。配列 ：ＲＱＳＦＩ（７５〜７９アミノ酸）がＭＢ３中に存在する。この配列は分解ペ ンタペプチドＱＲＸＦＸに対して若干のホモロジーを示すが、ＭＢ３を大きく不 安定化するとは思われない。 ＮＨ₂末端アミノ酸残基の性質もまた、タンパク質の分解の受け易さの重要な 因子でありうる。バーシャフスキー（Varshavsky）らは、ＮＨ₂末端にある種の アミノ酸が存在することがユビキチン媒体経路（Ｎ末端則経路）による迅速な分 解に対して安定化作用をもたらすことを示している（バーシャフスキーら、Yeas t Genetic Engineering、バターワース、１０９〜１４３頁(１９８９)）。酵母 において高レベルで発現されるほとんどのタンパク質は、安定化アミノ末端アミ ノ酸残基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＶ）を有している。かかるタンパク質 の例としては、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ、ヒト腫瘍壊死因子、サッカ ロミセス・セレビシエからのホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロミセス・セ レビシエからのインベルターゼ、ピキア・パストリスからのアルコールデヒドロ ゲナーゼ、およびヤロウィア・リポリティカ（Y.lipolytica）からの細胞外アル カリプロテアーゼが挙げられる（スリークリシュナ（Sreekrishna）ら、Biochem istry ２８：４１１７〜４１２５（１９８９））。ＭＢ３は酵母中でよく発現さ れるが、ＭＢ３のＮＨ₂末端アスパラギン酸（Ｄ）はユビキチン媒体経路による 迅速な分解に対して安定化効果をもたらさない。 ＭＢ３のＮＨ₂末端アスパラギン酸は、大スケール製造においてピキアから産 生されるＭＢ３レベルにおいて役割を果たしているであろう可能性がある。ＭＢ ３の第一のアミノ酸を、タンパク質のＮＨ₂末端を安定化させることが知られて いる上記アミノ酸の一つで置換するとＭＢ３産生レベルが改善されうるにちがい ない。 発現レベルを低減させることが知られている因子のほとんどがＭＢ３には存在 しなかったので、酵母においてＭＢ３の発現を試みる実験の開始を決定した。 ＭＢ３の最良の発現は、ｐＨＩＬ−Ｄ２／ＭＢ３発現カセットで形質転換した ピキアクローンによりもたらされた（表３および４）。このｐＨＩＬ−Ｄ２ベク ターは、予想される分子量が約３４ｋＤａの完全で単量体で非融合性で非分泌性 のＭＢ３の細胞内発現をもたらした。これらクローンは、６００ｍｇ／Ｌまたは ３ｍｇ／ｇ湿潤細胞ペレットまでの最高レベルのＭＢ３発現をもたらした（表４ ）。この生成物の約９０〜９５％は、不溶性の膜結合物質、すなわち１０,００ ０ｇで５分間の遠心分離で沈降する物質であり、これはＳＤＳ含有緩衝液（ＰＡ ＧＥ試料緩衝液）で処理した後に沸騰させることにより抽出することができる。 ついで、該タンパク質を、抗髄膜炎菌ＯＭＰクラス３抗体により容易に認識され うる コンホメーションに再生することができる。 ｐＨＩＬ−Ｄ２／ＭＢ３構築クローンのメタノール誘発は、細胞内ＭＢ３の迅 速な発現および急速な蓄積という結果となった。メタノール誘発の２４時間後に ＭＢ３の発現レベルは最大発現（５〜６日後に到達された）の８０％以上と推定 された。 ｐＨＩＬ−Ｄ２／ＭＢ３を含有するピキア組換え体は、市販の製造に最も期待 されるものである。このクローンは比較的高レベルの発現をもたらすが、これは 多コピー組換え体を用いることにより、およびタンパク質を発酵器中で産生させ ることにより、有意に改善しうるにちがいない。ＭＢ３が速やかに産生されると いう事実もまた、大スケール製造にとって利点をもたらす。 細胞内形態で発現されたＭＢ３は、変性／再現プロトコールとそれに続くゲル 濾過およびイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。得られた精製タンパ ク質は、大腸菌で過剰発現された組換えクラス３タンパク質と類似した溶出プロ フィールをサイズ排除クロマトグラフィーにおいて示す。大腸菌かまたはピキア ・パストリスのいずれかにより発現されたＭＢ３は、天然の野生型対応物といっ しょに溶出し、大腸菌かまたはピキア・パストリスのいずれかにより発現された ＭＢ３が再生しオリゴマー化して完全な天然のコンホメーションを達成すること を示していた（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。 天然の（ピキア）分泌シグナル（ＰＨＯ１）およびサッカロミセス・セレビシ エ由来のα−因子シグナル配列の両者を、発現ポーリンの分泌経路へのターゲテ ィングについて試験した。予期しないことに、より短いＰＨＯ１リーダーの方が ＭＢ３分泌を引き起こすのに一層有効であった。ｐＨＩＬ−Ｓ１ピキア移行ベク ターは、ピキア・パストリスの分泌シグナルペプチドである２.５ｋＤａのＰＨ Ｏ１リーダーペプチドをコードする配列を含む。ｐＨＩＬ−Ｓ１／ＭＢ３構築物 において、ＭＢ３をコードする配列はＰＨＯ１リーダー配列の下流に挿入されて いた。ｐＨＩＬ−Ｓ１／ＭＢ３クローンにより産生された３６.５ｋＤａの発現 融合タンパク質ＰＨＯ１／ＭＢ３の４０〜５０％は適切に開裂されて３４ｋＤａ のＭＢ３単量体を生成し（表２および３）、発現された可溶性ポーリンの５〜１ ０ ％が分泌された。ｐＰＩＣ９およびｐＰＩＣ９Ｋピキア移行ベクターは、サッカ ロミセス・セレビシエ由来の１０ｋＤａのα−因子リーダーをコードする配列を 含む。ｐＰＩＣ９／ＭＢ３またはｐＰＩＣ９Ｋ／ＭＢ３により形質転換されたピ キアクローンはポーリンを分泌しなかった。これら組換え体は４４ｋＤａのα− 因子プレプロ／ＭＢ３融合タンパク質をよく発現したが、正しい開裂およびプロ セシングの証拠は観察されなかった。発現されたＭＢ３の改善された分泌は、Ｐ ＨＯＩリーダーペプチドかまたはα−因子リーダーペプチドのいずれかに融合し た３'切断断片を使用することによっては得られなかった。実施例１０．分泌タンパク質として発現されたＭＢ３タンパク質の単離、精製お よび特徴付け ＭＢ３の遺伝子を含む発現ベクター（ｐＨＩＬ−Ｓ１−ｐＮＶ３１８）を有す る酵母菌体培養液を調製し、該タンパク質を可溶性分泌物質として単離した。２ ０％エタノール（ｖ／ｖ）で沈殿することにより上澄み液を清澄にして混入する 酵母培養不純物を除去した。ついで、上澄み液を８０％エタノール（ｖ／ｖ）で 沈殿させた。他の水溶性の混入分泌タンパク質を除去するため、得られたペレッ トをＴＥＮ緩衝液（トリスＨＣｌ、ｐＨ８.０、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍ Ｍ ＥＤＴＡ）で洗浄した。ＭＢ３を含有するペレットを、界面活性剤の水溶液 （５％Ｚ３−１４を含むＴＥＮ緩衝液からなる）中に溶解した。この溶液を、５ ０ｍＭトリス、０.２Ｍ ＮａＣｌおよび１.０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）中で 平衡化したハイートラップＱセファロースイオン交換カラム（１ｍｌ）（ファル マシア）に適用した。０.２〜１.０Ｍ勾配のＮａＣｌを適用し、ＭＢ３タンパク 質を単一のピークとして溶出した。実施例１１．不溶性の膜結合性タンパク質として発現されたＭＢ３タンパク質の 単離、精製および特徴付け ＭＢ３の遺伝子を含む発現ベクター（ｐＨＩＬＤ２−ｐＮＶ３２２）（表３を 参照）を有する酵母菌体培養液を、５０〜１０００Ｄに等価な濃度まで破砕緩衝 液（すなわち、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.４、１ｍＭ ＥＤＴＡ 、および５％グリセリン）中に再懸濁した。この懸濁液を等容量の酸処理ガラス ビ ーズに加えた。この懸濁液を、ミニビード−ビーター（Minibead−Beater）（バ イオスペック・プロダクツ、バートルスビル、オクラホマ）を用い、各サイクル １分間の連続８サイクルを各サイクルの間に１分間氷上において行うことにより 溶解させた。別法として、破壊緩衝液にザイモラーゼを加えることにより溶解過 程を容易にした。この懸濁液をガラス焼結フィルターに移してガラスビーズを分 離し、菌体懸濁液を濾液中に回収した。ビーズをさらに洗浄して濾液と合わせた 。ついで、懸濁液を１２,０００ｒｐｍ、４℃にて１５分間遠心分離にかけた。 得られたペレットに、下記からなる連続洗浄工程を適用した：（ａ）０.５％デ オキシコール酸塩を含むＴＥＮ（トリスＨＣｌ、ｐＨ８.０、１００ｍＭ ＮａＣ ｌ、および１ｍＭ ＥＤＴＡ）；（ｂ）０.１％ＳＤＳおよび１％ノニデートを含 むＴＥＮ、その後に懸濁液を２５℃にて３０分間回転させた；（ｃ）ＴＥＮ緩衝 液での洗浄、ついで（ｄ）４℃で一夜回転させながら、５％Ｚ３−１４を含むＴ ＥＮ緩衝液で洗浄。各洗浄工程の後に、１２,０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間 遠心分離にかけて次工程のためにペレットを回収した。ペレット洗浄の別法とし て、工程（ｂ）および（ｄ）の回転の代わりに懸濁液を１８ゲージの針に通した 。最後に、ＭＢ３を８Ｍ尿素または６ＭグアニジンＨＣｌで抽出し、抽出物を水 浴ソニケーターを用いて１０分間超音波処理した。抽出物を遠心分離（１２,０ ００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により清澄化し、同容量の３,１４−ツビッター ジェン（カルバイオケム）の１０％水溶液を加え、溶液を充分に混合した。この 溶液を再び１０分間超音波処理した。残留物質を遠心分離により除去した。つい で、この混合物を、０.１Ｍトリス−ＨＣｌ、０.２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤ ＴＡ、２０ｍＭ ＣａＣｌ₂および０.０５％Ｚ３−１４（ｐＨ８.０）からなる緩 衝液中で平衡化したセファクリルＳ−３００（５×１００ｃｍ）カラム（ファル マシア）に負荷した。クラス２タンパク質を含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより 同定し、プールし、ついで５０ｍＭトリス、０.２ＭＮａＣｌおよび１.０ＭＥＤ ＴＡ（ｐＨ８.０）中で平衡化したハイートラップＱセファロースイオン交換カ ラム（１ｍｌ）（ファルマシア）に負荷した。０.２〜１.０Ｍの勾配のＮａＣｌ を適用し、ＭＢ３タンパク質を単一のピークとして溶出させた。図１４Ａ、１４ Ｂおよび１ ５は、ＨＰＬＣ（ヒューレット・パッカード、モデル１０９０）に連結したセフ ァロース１２（ファルマシア）での精製ＭＢ３の溶出プロフィールを示す。天然 の野生型クラス３タンパク質並びに分子量標準を用いた検量との比較に基づき、 溶出プロフィールは三量体集合を示している。実施例１２．ＧＡＭＰ−ＴＴコンジュゲートの調製 １２.１ コンジュゲーションのためのＮＭＡ多糖の調製 ナイセリア・メニンギチジスグループＡ（ＮＭＡ）株６０４Ａを改変フランツ 培地（フランツ（Franz,I.D.）ら、J.Ｂact.７３：７５７〜７６１（１９４２） ）中で増殖させた。多糖を陽イオン界面活性剤複合体として沈殿させ、ついでエ タノールで分別沈殿して、高分子量のＮＭ−Ａ莢膜多糖を得た。この高分子量多 糖を限外濾過によりさらに精製した。この多糖を１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝 液（ｐＨ５.０）で７０℃にて部分加水分解して、１０,０００〜２０,０００ダ ルトンの範囲の低分子量多糖を得た。この多糖の遊離の還元性末端残基を冷所に てＮａＢＨ₄で還元してＯ−アセチル置換基を保存し、ついで過ヨウ素酸ナトリ ウムで酸化して末端アルデヒド基を生成した。この酸化多糖をサイズ排除クロマ トグラフィーにより精製および分画して、平均分子量が約１３,０００ダルトン の活性化グループＡ髄膜炎菌多糖（ＧＡＭＰ）を得た。１２.２ＧＡＭＰ−ＴＴコンジュゲートの調製 破傷風トキソイド（シーラム・スタテンス・インスティチュート、デンマーク ）を、まずスーパーデックスＧ−２００カラム（ファルマシア）を用いたサイズ 排除クロマトグラフィーによりその単量体形態（分子量１５０,０００）に精製 した。凍結乾燥した破傷風トキソイド単量体（１重量部）および酸化ＧＡＭＰ（ ２.５重量部）を０.２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.５）に溶解した。再結晶ＮａＢ Ｈ₃ＣＮ（１部）を加え、反応混合物を３７℃で４日間インキュベートした。ス ーパーデックスＧ−２００カラム（ファルマシア）および０.０１％チメロサー ルを含有するＰＢＳを溶出液として用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより 、コンジュゲートを遊離成分から精製した。精製したＧＡＭＰ−破傷風トキソイ ドコンジュゲートを４℃で該緩衝液中に貯蔵した。リン分析（チェンアッセイ） に基 づくコンジュゲートの多糖含量は約１８〜２０重量％であった。実施例１３．ＧＣＭＰ−ＴＴコンジュゲートの調製 １３.１ コンジュゲーションのためのＮＭＣ多糖の調製 莢膜多糖をナイセリア・メニンギチジスグループＣ（ＮＭＣ）株Ｃ１１の増殖 培地から単離した。この株を改変フランツ培地上で増殖させた。ＮＭＣ多糖（グ ループＣ髄膜炎菌多糖（ＧＣＭＰ））を、ＧＡＭＰについて記載したセタブロン 沈殿により培地から単離した。天然のＧＣＭＰを塩基でＯ−脱アセチル化し、Ｎ ａＩＯ₄で酸化的開裂することにより平均分子量１０,０００〜２０,０００まで 脱重合した。開裂した多糖をゲル濾過クロマトグラフィーによりサイズをそろえ 精製して、平均分子量が約１２,０００ダルトンで両末端にアルデヒド基を有す る高度に精製した生成物を得た。１３.２ ＧＣＭＰ−ＴＴコンジュゲートの調製 破傷風トキソイド単量体（１部）および固体の酸化ＧＣＭＰ（１部）を０.２ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.５）に溶解し、再結晶ＮａＢＨ₃ＣＮ（１部）とともに ３７℃で４日間インキュベートした。０.０１％チメロサールを含有するＰＢＳ を溶出液として用いたスーパーデックスＧ−２００上のサイズ排除クロマトグラ フィーにより、コンジュゲートをぞの遊離成分から精製した。精製したコンジュ ゲートを、動物試験用に調製する前に４℃で貯蔵した。コンジュゲート中の多糖 の含量は、スベナーホルムリソルシノール（Svennerholm resorcinol）アッセイ （Biochim.Biophys.Acta ２４４：６０４〜６１１（１９５７））により測定し たシアル酸含量に基づいて約３３％であった。実施例１４．Ｎ−プロピオニル化グループＢ髄膜炎菌多糖−ｒＰｏｒＢコンジュ ゲートの調製 １４.１ ナイセリアｒＰｏｒＢの調製 クラス３ナイセリア・メニンギチジスポーリンタンパク質（ＰｏｒＢ）の大腸 菌中での発現およびポーリン遺伝子産物の精製は上記に記載してある。組換えｒ ＰｏｒＢタンパク質の精製を、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、２００ｎＭ ＮａＣ ｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０５％ツビッタージェン３,１４（カルバイオケム 、 ラジョラ、カリフォルニア）、０.０２％アジ化ナトリウム（ｐＨ８.０）で平衡 化したセファクリルＳ−３００モレキュラーシーブカラムにより行った。ＯＤ_{28 0} により測定されるように三量体の見かけの分子量で溶出するタンパク質画分を プールし、０.２５Ｍ ＨＥＰＥＳ、０.２５Ｍ ＮａＣｌ、０.０５％ツビッター ジェン３,１４、ｐＨ８.５に対して１０〜１２ｍｇ／ｍｌの濃度までダイフィル トレーションした。１４.２ Ｎ−プロピオニル化グループＢ髄膜炎菌多糖（ＧＢＭＰ）の調製 Ｎ−プロピオニル化ＧＢＭＰおよびその酸化形態の調製を、米国特許第４,７ ２７,１３６号およびＥＰＯ ０５０４２０２号（ともに、その全内容を参照のた め本明細書中に引用する）の記載に従って行った。１４.３ Ｎ−Ｐｒ−ＧＢＭＰ−ｒＰｏｒＢコンジュゲートの調製 平均分子量１２,０００の酸化Ｎ−Ｐｒ−ＧＢＭＰ（１０ｍｇ）に、０.２５Ｍ ＨＥＰＥＳ）０.２５％Ｍ ＮａＣｌ、０.０５％ツビッタージェン３,１４、ｐＨ ８.５中の１２ｍｇ／ｍｌのｒＰｏｒＢタンパク質（３３μｌ）に加えた。この 溶液をすべての固体成分が溶解するまで混合し、再結晶ＮａＢＨ₃ＣＮを加えた 。この溶液を３７℃で４日間インキュベートし、ＰＢＳ−０.０１％チメロサー ルで平衡化したスーパーデックスＧ−２００カラム（ファルマシア）を用いてコ ンジュゲートを混合物から精製した。タンパク質画分を合わせ、４℃で貯蔵した 。コンジュゲートを、リソルシノールアッセイによりそのシアル酸含量を、ピア スクマシープラスアッセイによりタンパク質を分析した。得られたコンジュゲー トは多糖含量が約２０〜２５％であり、ＬＡＬおよびウサギ発熱原性試験により 測定されるようにいかなる発熱原をも含んでいない。実施例１５．キャピラリー電気泳動によるコンジュゲートの分析 １５.１ システムおよび方法 寸法が４７ｃｍ全長（４０ｃｍ有効長）で５０ｐｍ内径（３７５μｍ外径）の 未処理溶融シリカキャピラリーおよび電解質液として０.４Ｎホウ酸塩緩衝液（ ｐＨ１０.２）（ヒューレット・パッカード、パロアルト、カリフォルニア）を 用い、ベックマン２０００シリーズＣＥシステム（ベックマン・インストゥルメ ン ツ、フラートン、カリフォルニア）上のキャピラリーゾーン電気泳動（Capillar y Zone Electrophoresis）により分析を行った。システム制御およびデータ取得 はベックマンゴールドシステムソフトウエアを用いて行った。電圧を２５ＫＶに セットし、検出器を２００ｎｍ検出波長にセットした。キャピラリー温度を２０ ℃にセットした。キャピラリーの各実験の間の条件を、０.１Ｍ水酸化ナトリウ ムで２.０分間、ついで脱イオン水で２.０分間の高圧の濯ぎとした。すべての試 料を圧注入した。すべての緩衝液および試料媒体を約２.０ｐｍのメンブランフ ィルターで濾過し、使用前に脱気した。１５.２ コンジュゲートの分析 精製後、コンジュゲートをアミコンセントリコン−３コンセントレーター（ア ミコン、ビバリー、マサチューセッツ）を用いた限外濾過により濃縮した。髄膜 炎菌多糖および破傷風トキソイド単量体の検量試料を、脱イオン水中でそれぞれ ０.２５ｍｇ／ｍｌおよび０.２８ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。この方法は、多 糖およびタンパク質付加（spiked）糖タンパク質コンジュゲートのエレクトロフ ェログラムにおいて示されるように（図２０および図２１）、糖タンパク質およ びコンジュゲートの成分に選択的であり、隣接する成分は完全に分離された（Ｒ ｓ＞１.５）。図２０はＧＡＭＰおよびＴＴ−単量体コンジュゲート成分を付加 したＧＡＭＰ−ＴＴコンジュゲートを示し、一方、図２１はＧＣＭＰおよびＴＴ −単量体コンジュゲート成分を付加したＧＣＭＰ−ＴＴコンジュゲートを示す。 この方法での遊離形態の多糖成分およびタンパク質成分の検出下方限界（ＬＬＤ ）はナノグラム以下のレベルであると決定された。遊離形態の各成分について約 ０.５ｎｇの定量下方限界（ＬＬＱ）が得られた。各成分の選択された全質量に ついて直線状の応答が得られた。多糖およびタンパク質のそれぞれについて０. ６〜２.６ｎｇおよび０.６〜２.４ｎｇの範囲の選択された全質量に対して直線 状の応答が得られ、両曲線の測定係数は０.９９であった。このＣＺＥベースの アッセイを用い、髄膜炎菌多糖−破傷風トキソイドコンジュゲートの分析は、約 ５％未満の遊離多糖含量および約２％未満の遊離タンパク質含量を示した。実施例１６．免疫およびイムノアッセイ １６.１ ３価コンジュゲートワクチン製剤 各個々のコンジュゲート成分（Ａ、Ｂ、Ｃ）を、３価ワクチン１ｍｌ当たり１ ｍｇの最終Ａｌ濃度にて水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）₃）アルヒドロゲル （スーパーフォス、デンマーク）に吸着させた。各コンジュゲート多糖の投与量 を変えた３種のワクチンを調製した。製剤は、０．２ｍｌのＰＢＳ．０１％チメ ロサールの投与量当たり、約２μｇの各Ａ）Ｂ）およびＣコンジュゲート多糖か ；または約２μｇのＡコンジュゲート多糖、約５μｇのＢコンジュゲート多糖、 および約２μｇのＣコンジュゲート多糖か；または約５μｇの各Ａ、Ｂ、および Ｃコンジュゲート多糖のいずれかを含んでいた。１６.２ 免疫 ４〜６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（チャールズ・リバー・ラボラトリーズ） に、０日目、２８日目および４２日目に腹腔内注射した。０日目、１４日目、２ ８日目、および４２日目に採血を行い、マウスを最終的に５２日目に放血した。 血清学的分析の前に血清を−７０℃で貯蔵した。１６.３ イムノアッセイ ＥＬＩＳＡ ： Ａ多糖、Ｎ−プロピオニル化Ｂ多糖およびＣ多糖のそれぞれに対する抗体力価 を、コーティング抗原として対応ＨＳＡコンジュゲートを用いたＥＬＩＳＡによ り決定した（図２２、２３、および２４）。抗体力価は、吸光度ｖｓ吸光度×希 釈倍数の直線回帰曲線のｘ軸切片として定義した。殺菌アッセイ ： 本アッセイにおいて補体源としてベビーウサギ血清およびグループＢ髄膜炎菌 、グループＣ髄膜炎菌、およびグループＣ髄膜炎菌生物としてそれぞれナイセリ ア・メニンギチジス株Ｈ４４／７６（血清型１５）、Ｃ１１およびＡ１を用いて 殺菌アッセイを行った（図２５、２６、および２７）。殺菌力価は、生存数を５ ０％低減させる血清希釈倍数として定義した。 表１ グループＢ髄膜炎菌結合体ワクチン(Ｎ−Ｐｒ ＧＢＭＰ− タンパク質)のＥＬＩＳＡ力価および殺菌力価 ¹ST＝ステアリルチロシン² CFA＝フロイントの完全アジュバント 表２.酵母（ピキア）菌体の形質転換の効力 表３.組換えピキア・パストリスによるＭＢ３ポーリンタンパク質の発現表３（続き） 表４.異なる発現カセットを有する組換えクローンによるＭＢ３の発現。 最良のクローンの主たる特徴 表５.ピキア・パストリスおよびＭＢ３のコドン使用頻度

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ドネッツ，ミハイル アメリカ合衆国20878メリーランド州 エ ヌ・ポトマック、オーウェンズ・グレン・ テラス15514番 (72)発明者 ワン，ミン―ダー アメリカ合衆国92129カリフォルニア州 サンディエゴ、スパレン・アベニュー 13248番 (72)発明者 リアン，シュ―メイ アメリカ合衆国20817メリーランド州 ベ セズダ、リバー・ロード6627番 (72)発明者 ポルビーノ―ボドナー，メアリーエレン アメリカ合衆国21401メリーランド州 ア ナポリス、ローリング・デイル・ロード 621番 (72)発明者 ミネッティ，コンセイカオ・エイ・エス・ エイ アメリカ合衆国20906メリーランド州 シ ルバー・スプリング、イズベル・ストリー ト 3904番 (72)発明者 ミション，フランシス アメリカ合衆国20723メリーランド州 ロ ーレル、カントリー・メドーズ・レイン 9735番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）選択可能なマーカーを有するプラスミド中に （i）成熟ポーリンタンパク質、 （ii）酵母分泌シグナルペプチドに融合した成熟ポーリンタンパク質である融合 タンパク質、 よりなる群から選ばれたタンパク質をコードする遺伝子をライゲートし、その際 、該遺伝子は酵母プロモーターに作動可能に連結しており、 （ｂ）該遺伝子を含む該プラスミドを酵母株中に形質転換し、 （ｃ）形質転換した酵母の選択を可能とする培地中で該酵母を増殖させることに よって形質転換した酵母を選択し、 （ｄ）該形質転換した酵母を増殖させ、ついで （ｅ）該タンパク質の発現を誘発させて該タンパク質を含む酵母を得、 その際、かくして発現された該タンパク質は該酵母中で発現された全タンパク質 の約２％以上を占める ことを特徴とする、外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質またはその融合 タンパク質の酵母中での発現方法。 ２．かくして発現されたタンパク質が該酵母中で発現された全タンパク質の約 ３〜５％を占める、請求項１に記載の方法。 ３，該成熟ポーリンタンパク質が血清グループＢからのナイセリア・メニンギ チジス成熟外膜クラス３タンパク質である、請求項１に記載の方法。 ４．該酵母プロモーターがＡＯＸ１プロモーターである、請求項１に記載の方 法。 ５．該酵母分泌シグナルペプチドが、サッカロミセス・セレビシエのα−交配 因子プレプロペプチドの分泌シグナルおよびピキア・パストリスの酸性ホスファ ターゼ遺伝子の分泌シグナルよりなる群から選ばれたものである、請求項１に記 載の方法。 ６．該プラスミドがｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ９およびｐＰ ＩＣ９Ｋよりなる群から選ばれたものである、請求項１に記載の方法。 ７．該遺伝子が、酵母のコドン使用頻度を最適化するコドンを採用したヌクレ オチド配列を含む、請求項１に記載の方法。 ８．酵母のコドン使用頻度を最適化する該コドンが該遺伝子の５'領域に存在 する、請求項７に記載の方法。 ９．該遺伝子の該５'領域がヌクレオチド配列： である、請求項８に記載の方法。 １０．該酵母がピキア・パストリスである、請求項８に記載の方法。 １１．該酵母が該タンパク質または融合タンパク質を増殖培地中に分泌する、 請求項１に記載の方法。 １２．該プラスミドがｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ９およびｐＰＩＣ９Ｋよりな る群から選ばれたものである、請求項１１に記載の方法。 １３．請求項１に記載の方法に従って得られた外膜髄膜炎菌グループＢポーリ ンタンパク質またはその融合タンパク質の精製方法であって、 （ａ）工程（ｄ）で得た該酵母を溶解して該タンパク質または融合タンパク質を 不溶性の膜結合画分として放出し、 （ｂ）工程（ａ）で得た該不溶性の膜結合画分を緩衝液で洗浄して混入する酵母 細胞タンパク質を除去し、 （ｃ）工程（ｂ）で得た該不溶性の膜結合画分を変性剤の水溶液中に懸濁および 溶解し、 （ｄ）工程（ｃ）で得た該溶液を界面活性剤で希釈し、ついで （ｅ）該タンパク質または融合タンパク質をゲル濾過クロマトグラフィーおよび イオン交換クロマトグラフィーにより精製する ことを特徴とする方法。 １４．請求項１１に記載の方法に従って得られた外膜髄膜炎菌グループＢポー リンタンパク質またはその融合タンパク質の精製方法であって、 （ａ）該タンパク質を発現した該酵母培養液を遠心分離にかけて該タンパク質を 可溶性の分泌物質として単離し、 （ｂ）工程（ａ）で得た該可溶性の分泌物質から、混入する酵母培養不純物を約 ２０％のエタノールで沈殿させることにより除去し、その際、該可溶性の分泌物 質は可溶性画分に残留し、 （ｃ）工程（ｂ）の該可溶性画分から該分泌物質を約８０％のエタノールで沈殿 させ、 （ｄ）工程（ｃ）で得た該沈殿物質を緩衝液で洗浄して、混入する酵母の分泌タ ンパク質を除去し、 （ｅ）工程（ｄ）で得た該沈殿物質を界面活性剤の水溶液中に懸濁および溶解し 、ついで （ｆ）該タンパク質をイオン交換クロマトグラフィーにより精製する ことを特徴とする方法 １５．（ａ）成熟ポーリンタンパク質、 （ｂ）酵母分泌シグナルペプチドに融合した成熟ポーリンタンパク質である融合 タンパク質 よりなる群から選ばれたタンパク質をコードする遺伝子を含む酵母宿主細胞。 １６．該酵母が１を越えるコピーの該遺伝子を含む請求項１５に記載の酵母宿 主細胞。 １７．該成熟ポーリンタンパク質が血清型Ｂからのナイセリア・メニンギチジ ス成熟外膜クラス３タンパク質である、請求項１５に記載の酵母宿主細胞。 １８．該プラスミドがｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩ Ｃ９ＫおよびｐＡＯ８１５よりなる群から選ばれたものである、請求項１７に記 載の酵母宿主細胞。 １９．該酵母がピキア・パストリスである請求項１５に記載の酵母宿主細胞。 ２０．該タンパク質をコードする該遺伝子の５'領域がヌクレオチド配列： によってコードされる、請求項１５に記載の酵母宿主細胞。 ２１．少なくとも一つのコドンが酵母のコドン使用頻度を最適化すべく変化さ せられている、外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質をコードするヌクレ オチド配列。 ２２．該ポーリンタンパク質が血清型Ｂからの成熟外膜クラス３タンパク質で あり、該コドン変化が、（天然配列の位置４〜６におけるＧＴＴ→ＧＴＣ）、（ 天然配列の位置７〜９におけるＡＣＣ→ＡＣＴ）、（天然配列の位置１０〜１２ におけるＣＴＧ→ＴＴＧ）、(天然配列の位置１６〜１８におけるＧＧＣ→ＧＧ Ｔ)、（天然配列の位置１９〜２１におけるＡＣＣ→ＡＣＴ）、（天然配列の位 置２２〜２４におけるＡＴＣ→ＡＴＴ）、（天然配列の位置２５〜２７における ＡＡＡ→ＡＡＧ）、（天然配列の位置２８〜３０におけるＧＣＣ→ＧＣＴ）、（ 天然配列の位置３１〜３３におけるＧＧＣ→ＧＧＴ）、（天然配列の位置３４〜 ３６におけるＧＴＡ→ＧＴＴ）、（天然配列の位置３７〜３９におけるＧＡＡ→ ＧＡＧ）よりなる変化の群から選ばれたものであり、その際、該位置は該タンパ ク質をコードする天然のヌクレオチド配列の第一のヌクレオチドから数えたもの である、請求項２１に記載のヌクレオチド配列。 ２３．薬理学的に許容しうる担体とともにグループＡ髄膜炎菌多糖（ＧＡＭＰ ）抗原、グループＢ髄膜炎菌多糖（ＧＢＭＰ）抗原、およびグループＣ髄膜炎菌 多糖（ＧＣＭＰ）抗原を含むワクチン。 ２４．該グループＡ髄膜炎菌多糖（ＧＡＭＰ）抗原、グループＢ髄膜炎菌多糖 （ＧＢＭＰ）抗原、およびグループＣ髄膜炎菌多糖（ＧＣＭＰ）抗原がそれぞれ タンパク質担体に結合している、請求項２３に記載のワクチン。 ２５．該ＧＢＭＰ抗原が結合している該タンパク質担体が、クラス３ナイセリ ア・メニンギチジスポーリンタンパク質（ＰｏｒＢ）である、請求項２４に記載 のワクチン。 ２６．該ＧＡＭＰ抗原および該ＧＣＭＰ抗原が結合している該タンパク質担体 が破傷風トキソイドである、請求項２４に記載のワクチン。 ２７．該ＧＢＭＰ抗原がＰｏｒＢに結合される前にＮ−プロピオニル化される 、請求項２５に記載のワクチン。 ２８．該ワクチンが約２μｇの該ＧＡＭＰ多糖抗原コンジュゲート、該ＧＣＭ Ｐ多糖抗原コンジュゲートおよび該ＧＢＭＰ多糖抗原コンジュゲートを含む、請 求項２４に記載のワクチン。 ２９．該ワクチンが約５μｇの該ＧＡＭＰ多糖抗原コンジュゲート、該ＧＣＭ Ｐ多糖抗原コンジュゲートおよび該ＧＢＭＰ多糖抗原コンジュゲートを含む、請 求項２４に記載のワクチン。 ３０．該ワクチンが約２μｇの該ＧＡＭＰ多糖抗原コンジュゲートおよび該Ｇ ＣＭＰ多糖抗原コンジュゲート、および約５μｇの該ＧＢＭＰ多糖抗原コンジュ ゲートを含む、請求項２４に記載のワクチン。 ３１．グループＡ髄膜炎菌多糖（ＧＡＭＰ）抗原、グループＢ髄膜炎菌多糖（ ＧＢＭＰ）抗原、およびグループＣ髄膜炎菌多糖（ＧＣＭＰ）抗原を薬理学的に 許容しうる担体とともに含むワクチンを哺乳動物に免疫応答を引き起こすのに充 分な量にて該哺乳動物に投与することを特徴とする、哺乳動物において免疫応答 を誘発する方法。 ３２．該グループＡ髄膜炎菌多糖（ＧＡＭＰ）抗原、グループＢ髄膜炎菌多糖 （ＧＢＭＰ）抗原、およびグループＣ髄膜炎菌多糖（ＧＣＭＰ）抗原がそれぞれ タンパク質担体に結合されている、請求項３１に記載の方法。 ３３．該哺乳動物がヒトである請求項３１に記載の方法。