KR19990082265A - 효모중에서 b군 나이세리아 멘인기티디스 외막(mb３)단백질을 발현시키는 방법 및 백신 - Google Patents

효모중에서 b군 나이세리아 멘인기티디스 외막(mb３)단백질을 발현시키는 방법 및 백신

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KR19990082265A
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미카일 도넷츠
밍-더 왕
슈-메이 리앙
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콘세이카오 에이. 에스. 에이. 미네티
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다니엘 제이. 압둔-나비
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Abstract

본 발명은 일반적으로 외막 수막염 B군 포린 단백질, 특히 MB3, 및 이의 융합 단백질을 얻는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 효모중에서 외막 수막염균 B군 포린 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 서열을 효모 코돈 사용에 최적화시킨 단백질을 암호하는 유전자의 5' 영역의 뉴클레오티드 서열을 치환하므로써 단백질 발현 속도를 증가시키는, 전술한 단백질을 다량 발현시키는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 A군 수막염균 다당체(GAMP), B군 수막염균 다당체(GBMP) 및 C군 수막염균 다당체(GCMP) 항원과 함께 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 백신에 관한 것이다. 본 발명은 또한 면역 응답을 유발하기에 충분한 양으로 전술한 백신을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 포유동물의 면역 응답을 유도하는 방법에 관한 것이다.

Description

효모중에서 Ｂ군 나이세리아 멘인기티디스 외막(ＭＢ３) 단백질을 발현시키는 방법 및 백신
수막염균에 의한 수막염은 전세계적으로 문제가 되고 있으며, 풍토병 및 유행병 형태로 발생한다(펠톨라 에이치. Rev. Infect. Dis. 5:71-91(1983); 고취리히 에.체., "Meningococcal Meningitis", in Bacterial Vaccines, Germanier, E., ed., Academic, 뉴욕(1984), p237-255). 유행병은 전세계 어디서나 발생하며 인구 100,000 당 500 정도로 높은 발병율을 나타내는 것이다. 항생제 치료를 하지 않는 경우 사망율이 매우 높고(85%), 항생제로 치료하는 경우에도 사망율이 약 10% 유지되는 병이다. 또한 항생제 처치법에 의해 치유된 환자는 여전히 심각하고 영구적인 신경 결손을 앓을 수 있다. 전술한 사실과 함께 나이세리아 멘인기티디스의 설파디아진-내성 균주의 출현으로 상업용 백신 개발이 급속도로 진척되었다(펠톨라, 에이치., Rev. Infect. Dis. 5:71-91 (1983)).
나이세리아 멘인기티디스는 혈청학적으로 A, B, 29e, W135, X, Y 및 Z군으로 분류되는 그람-음성 유기체이다(고취리히 에.체., "Meningococcal Meningitis", in Bacterial Vaccines, Germanier, E., ed., Academic, 뉴욕(1984), p237-255). 또 다른 H, I 및 K군은 중국에서(딩 에스.큐.등, J. Biol. Stand. 9:307-315(1981)), L군은 캐나다에서(아스톤 에프.이. 등, J. Clin. Microbiol. 17:722-727(1983)) 분리되었다. 군으로 분류하는 시스템은 유기체의 협막 다당체를 기준으로 한다. A군 다당체는 2-아세트아미도-2-데트옥시-D-만노피라노실 포스페이트의 부분적으로 O-아세틸화된 (1→6) 결합된 호모폴리머이며, B군과 C군의 다당체는 모두 시알산의 호모폴리머라는 것이 밝혀졌다(루이 티.와이. J. Biol. Chem. 246:2849-2858)(1971)).
엔. 멘인기티디스 A, B 및 C 군은 수막염균에 의한 수막염 증세의 약 90%를 차지한다. 2가 다당체 백신을 사용하여 A 및 C군 수막염균에 의한 수막염을 예방하는데 성공하였다(고취리히 에.체., J. Exp. Med. 129:1367-1384(1969); 아르텐스테인 엠.에스. 등, N. Engl. J. Med. 282:417-420(1970)); 이 백신은 시판 제품이 되었으며, 지난 10년 동안 전세계적으로 대다수의 수막염 유행병을 예방하고 저지하는데 성공적으로 사용되어 왔다. 그러나, 수막염균에 의한 수막염의 상당 비율이 A군 및 C군 이외의 다른 군에 의해 발생하기 때문에 이 백신을 확대시킬 필요가 있었다. 특히 B군이 역학적으로 중요성하지만, Y 군과 W135군도 또한 중요하다(카도츠, 엠. 등, Vaccine 3:340-342(1985)). 백신내에 B군 다당체를 포함하는 경우 특별한 문제를 갖는다(후술); 그러나, A, C, W135 및 Y 군을 포함하는 4가 백신은 인체에 안전하며 면역원성인 것으로 판명되었으며(카도츠 엠. 등, Vaccine 3:340-342(1985)), 수막염균에 의한 수막염 백신에 현재 사용되고 있다(제닝스 에이치.제이., "Capsular Polysaccharides as Vaccine Candidates," in Current Topics in Microbiol. and Immunol., Jann D. and Jann B., eds, Springer-Verlag, Berlin(1990) Vol 150:97-127).
기타 그람 음성 박테리아와 유사하게 나이세리아 종의 외막은 반투막이며, 이 반투막은 박테리아의 주변세포질 간극내로 또는 이로부터 저분자량의 물질을 접근 및 배출시켜 자유롭게 흐르게 하지만 크기가 큰 분자는 지연시킨다(허슬리 에프. 에이. 등, "Reconstitution and characterization of theN. gonorrhoeaeouter membrane permeability barrier," in Genetics and Immunobiology ofNeisseria gonorrhoeae, 다니엘슨 및 노마크 판, 유니버시티 오브 우메아, 우메아, p12-15(1980); 더글라스, 제이.티., 등, FEMS Microbiol. Lett. 12:305-309(1981)). 이를 수행하는 기작중 하나는 총괄적으로 포린이라 불리우는 단백질을 막에 봉입시키는 것이다. 이들 단백질은 3개의 동일한 폴리펩티드 사슬로 구성되어 있으며(존스 알.비. 등, Infect. Immun. 30:773-780(1980); 맥데이드, 쥬니어 및 존스톤, J. Bacteriol. 141:1183-1191(1980)), 박테리아의 외막이나 또는 기타 단백질이 도입되는 막내에, 이 단백질의 고유 삼량체 구조로 물 충진되고 전압 가변성인 통로를 형성한다(린치 이.씨. 등, Biophys. J. 41:62(1983); 린치 이.씨. 등, Biophys. J. 45:104-107(1984); 영 제이.디. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3831-3835(1983); 마우로 에이. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:1071-1075(1988); 영 제이.디. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:150-154 (1986)). 이들 단백질은 외막 내에 비교적 풍부하기 때문에, 이 단백질의 항원들을 이용하여 나이세리아 고노르호에(Neisseria gonorrhoeae) 및 나이세리아 멘인기티디스 둘 다 역학용의 몇 가지의 혈청형으로 분류할 수 있다(프라쉬 씨.이. 등, Rev. Infect. Dis. 7:504-510(1985); 크냅 제이. 에스. 등, "Overview of epidemiological and clinical applications of auxotype/serovar classification ofNeisseria gonorrhoeae," The PathogenicNeisseria, 스쿨닉, 지.케이. 판, American Society for Microbiology, 워싱톤, p6-12(1985)). 지금까지, 고노코커스(Gonococcus;임균) 및 수막염균에서 많은 이들 단백질을 얻어 정제하였고(헥켈스, 제이.이., J. Gen. Microbiol. 99:333-341(1977); 제임스 및 헥켈스, J. Immunol. Meth. 42:223-228(1981); 쥬드 알.씨., Anal. Biochem. 173:307-316(1988); 블레이크 및 고취리히, Infect. Immun. 36:277-283(1982); 월츠러 엘.엠. 등, J. Exp. Med. 168:1883-1897(1988)), 클로닝 및 서열 결정하였다(고취리히, 에.체. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8135-8139(1987); 맥기니스 비.등, J. Exp. Med. 171:1871-1882(1990); 카보네티 및 스파링, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9084-9088(1987); 피버스 아이.엠. 등, Infect. Immun. 60:3620-3629(1992); 무라카미 케이. 등, Infect. Immun. 57:2318-2323(1989); 울프 및 스턴, FEMS Microbiol. Lett. 83:179-186(1991); 워드, 엠.제이. 등, FEMS Microbiol. Lett. 73:283-289(1992)).
포린 단백질은 처음에 리포다당체(LPS)와 함께 동시-분리되었다. 따라서, 포린 단백질은 "내독소-결합된 단백질"이라고 불리웠다(보른손 등, Infect. Immun. 56:1602-1607(1988)). 야생형 포린에 대한 연구에서 해당 박테리아 균주의 LPS가 단백질 환경에서 존재하지 않는 경우 완전한 조합(assembly) 및 올리고머화는 가능하지 않다는 것이 보고되었다(홀젠버그 등, Biochemistry 28:4187-4193(1989); 센 및 니카이도, J. Biol. Chem. 266:11295-11300(1991)).
수막염균의 포린은 3개의 주 부류로 나눌 수 있으며, 이는 선행된 명명법에서 클래스 1, 클래스 2 및 클래스 3으로 공지되었다(프라쉬, 씨.이. 등, Rev. Infect. Dis. 7:504-510(1985)). 각각 검사된 수막염균은 클래스 2 포린 유전자 또는 클래스 3 포린 유전자에 대한 대립 유전자중 하나를 포함하지만 둘 다를 포함하지는 않았다(피버스 아이.엠. 등, Infect. Immun. 60:3620-3629(1992)); 무라카미, 케이. 등, Infect. Immun. 57:2318-2323(1989)). 클래스 1 유전자의 존재 또는 부재는 선택적인 것으로 보인다. 유사하게, 모든 탐침된 고노코커스는 클래스 2 또는 클래스 3 대립 유전자에 유사성을 갖는 단지 하나의 포린 유전자를 포함한다(고취리히 에.체., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8135-8139(1987); 카보네티 및 스파링, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9084-9088(1987)). 엔. 고노르호에는 클래스 1 대립유전자가 완전히 결핍된 것으로 보인다. 따라서 서열 결정된 유전자의 자료는 모든 나이세리아 포린 단백질이 기본적인 상태에서 각각 일부 변형된 70% 이상의 상동성을 갖는다는 것을 제안하였다(피버스 아이. 엠. 등, Infect. Immun. 60:3620-3629(1992)). 이들 나이세리아 포린 단백질 사이에서 관찰되는 여러 변형은 자연 숙주, 즉 인간내로 이들 병원성 유기체가 침입하여 발생하는 면역학적 억압에 기인하는 것이라고 제안하였다. 그러나, 포린 단백질 서열의 변화가 이들 단백질의 기능적 활성에 어떻게 영향을 주는지는 거의 알지 못한다.
분리된 고노코커스 포린의 클래스 2 대립 유전자 유형은 이온 선택성 및 전압 가변성에 대한 지질 이중막 연구에서 분리된 고노코커스 포린의 클래스 3 유형과는 전기물리학적으로 다소 다르게 작용한다는 것이 이미 보고되어 있다(린치 이.씨. 등, Biophys. J. 41:62(1983); 린치, 이.씨. 등, Biophys. J. 45:104-107(1984)). 또한, 손상되지 않은 생박테리아로부터 이들 지질 이중막을 통과하는 여러 포린의 능력은 포린의 유형 뿐만 아니라 포린을 제공한 나이세리아종과도 관련이 있는 것으로 보인다(린치 이.씨. 등, Biophys. J. 45:104-107(1984)). 최소한 일부의 작용 특성은 포린의 단백질 서열 내의 여러 부분과 관련이 있을 것 같다. 모든 고노코커스 클래스 2-유사 단백질에서 이미 동정된, 이러한 작용부중 하나는 키모트립신 절단 부위이다. 키모트립신 분해시, 이 부류의 포린은 전압 퍼텐셜에 반응하는 능력이 결실되어 폐쇄된다. 고노코커스 클래스 3-유사 포린 뿐만 아니라 수막염균 포린도 이 서열이 결실되어 있고, 따라서 키모트립신에 의해 절단되지 않지만 사용된 전압 퍼텐셜에 폐쇄되므로써 반응한다(그레코 에프. "The formation of channels in lipid bilayers by gonococcal major outer membrane protein, "thesis, 더 록케펠러 유니버시티, 뉴욕 (1981); 그레코 에프. 등, Fed. Proc. 39:1813(1980)).
나이세리아 포린이 이들 유기체의 외막에 존재하는 가장 풍부한 단백질 중 하나이며, 감염 과정에서 (여러 기타 주 표면 항원과는 달리) 항원 불연속변이를 진행하지 않기 때문에, 나이세리아 멘인기티디스 및 나이세리아 고노르호에에서 이들 포린이 보편적으로 존재하고 표면에 노출된다는 사실은 이들 포린을 이들 유기체에 대항하는 백신 성분으로 사용가능하게 한다. 수막염으로부터 회복되는 환자는 항-포린 항체를 형성하고, 포린 단백질로 면역화시켜 유도한 항체는 동종의 혈청형에 살균작용을 한다. 또한, 특정 역학 세팅에서, 수막염을 일으키는 대부분의 균주는 제한된 수의 혈청형, 특히 클래스 2 단백질을 갖는 균주에서는 혈청형 2, 클래스 3 단백질을 갖는 균주에서는 혈청형 15에 속한다. 따라서, 클래스 2 및 3 단백질은 백신용으로 사용가능성이 있다.
이들 연구에 대한 주요 장애는 근대 분자 기술로 포린 유전자를 쉽게 조작하고 충분히 정제된 단백질을 얻어 이들 변경된 포린 단백질의 생체물리적 형질화를 수행할 수 있는 능력에 대한 것이다. 클론된 나이세리아 포린 유전자를 에스케리치아 콜리(Escherichia coli)에서 발현시키는 경우, 이 유전자는 숙주 이. 콜리에 치명적이라는 것은 이미 알려져있다(카르보네티 및 스파링 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9084-9088(1987); 카르보네티 엔. 에이치. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6841-6845(1988); 바로우 에이.케이. 등, Infect. Immun. 55:2734-2740(1987)). 따라서, 다수의 이들 유전자는 전체 유전자의 일부로서 클론되어 서열결정되거나 또는 엄격한 발현 조절하에서 저 복제수의 플라스미드내에 두었다(카르보네티 엔. 에이치. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6841-6845(1988); 이들 조건하에서, 전체 포린 유전자가 발현된다 하더라도, 형질화를 위해 추가로 정제되고 프로세싱될 수 있는 단백질은 거의 축적되지 않는다.
약간의 성공 가능성을 갖는 이 문제에 대한 또 다른 방법은 저 복제수를 갖는 엄격하게 조절되는 발현 플라스미드내로 포린 유전자를 클론시켜 포린 유전자의 변형을 유도한 후 나이세리아내로 다시 변형된 서열을 재도입시키는 것이다(카르보네티 엔. 에이치. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6841-6845(1988)). 그러나, 이 방법은 또한 나이세리아, 특히 고노코커스에 존재하는 정교한 제한 엔도뉴클레아제 시스템에 인한 문제를 수반한다(데이비스 제이.케이. Clin. Microbiol. Rev. 2:S78-S82(1989)).
오랫동안 나이세리아 포린을 포함하는 백신을 연구해왔지만, 모든 혈청군 유기체와 모든 인체에 완전히 적용되는 유효한 수막염균 다당체 백신이 또한 필요하다. 광범위한 다당체 백신을 개발하는데 여러 중대한 문제가 남아있다. 첫 번째 문제는 A군 및 C 다당체가 성인과 청소년에게는 효과적이지만, 유아에서의 효과는 한계가 있다는 것이다(골드쉬나이더, 아이. 등, J. Infect. Dis. 128:769-776(1973); 고츠리히 에.체. 등, "The Immune Responses to Bacterial Polysaccharides in Man," In: Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, 하버 이. 및 카라우제 알.엠. 판, 라벤, 뉴욕(1977), p391-402). 두 번째 문제는 B군 수막염균 다당체는 인체에서는 불량한 면역원성이라는 것이다(웨일 에프.에이., J. Infect. Dis. 126:514-521(1972)). 세 번째 문제는 다가 백신의 각성분이 개별적으로 투여되는 경우 다가 백신이 보다 면역원성이 적어지는 경향이 있다는 것이다(인셀 알.에이., "Potential alterations in immunogenicity by combining or simultaneously administering vaccine components," In: Annals of the New York Academy of Sciences, Vol. 754 Combined Vaccines and Simultaneous Administration: Current Issues and Perspectives, 윌리암스 제이.씨. 등, 뉴욕 아카데미 오브 사이언시스, 뉴욕(1993), p35-47; 클레멘 제이. 등, "Interactions between PRP-T vaccine against Haemophilus influenza type b and conventional infant vaccine: lessons for future studies of simultaneous immunization and combined vaccines," In:Annals of the New York Academy of Sciences, Vol. 754 Combined Vaccines and Simultaneous Administration: Current Issues and Perspectives, 윌리암스 제이.씨. 등, 뉴욕 아카데미 오브 사이언시스, 뉴욕(1993), p255-266; 파라디소 피.알. 등, Pediatrics 92(6):827-832(1993)).
A군 및 C군의 엔. 멘인기티디스에 대해 현재 이용가능한 백신은, 대부분의 항원에 의해 발생되는 면역과는 대조적으로 유아의 경우 다당체-특이 면역 응답이 T-세포 의존성이기 때문에, 유아(2세 이하)에서의 면역원성이 불량하다. T-세포와 관련이 없는 경우, 면역 응답은 단기간 지속된다. 더욱 중요한 것은 기억이 명백하지 않으며, 따라서 "추가항원 자극" 반응이 발생하지 않는다는 것이다. 또한, 항체 친화력 성숙이 발생하지 않는다. 이 단점은 T-세포에 특이적으로 결합하는 다당체의 능력 부재에 기인하는 것이다. T-세포 수용체와 결합하는데 필요한 구조적인 특징은 대부분의 다당체에는 존재하지 않는 것 같다. 면역 응답의 T-세포 의존성 때문에, 유아의 경우 다당체에 응답하는 항체는 IgM 이소타입 항체에 한정된다; 비-IgM 항체 생성을 위해 요구되는 이소타입 전환은 T-세포와의 관련을 필요로 한다. 다당체 항원은, IgG 이소타입 뿐만 아니라 IgM의 항체를 유도할 수 있기 때문에 더 성숙한 인체(2세 이상)에서는 별로 문제가 되지 않는다(욘트 등, J. Exp. Med. 127:633-646(1968)).
B군 수막염균 다당체는 모든 연령의 인체에서 기타 다당체 보다 면역원성이 적다. 이 특징을 설명하기 위한 2가지 주요 의견안이 제안되어 왔다(제닝스 에이치.제이. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 41:155-208(1983); 라이플리 엠.알. 등, Vaccine 5:11-26(1987)). 이중 하나는 B군 수막염균 다당체, 즉 α-(2→8)-결합된 시알산 호모폴리머가 뉴라미니다아제의 작용 때문에 인체 조직에서 급속히 해중합된다는 것이다. 다른 하나는 구조가 인체 면역 시스템에 의해 "자가" 인식되고, 따라서 이 구조에 특이적인 항체 생성이 억제된다는 것이다. C군 수막염균 다당체[α-(2→9)-결합된 시알산 호모폴리머]의 뉴라미니다아제-감응성 변형체가 여전히 인체에서 고도의 면역원성이라는 것이 판명되었기 때문에 후자의 의견안에 더 비중이 있는 것 같다(글로드 엠.피. 등, J. Infect. Dis. 139:52-59(1979)). 또한, 뉴라미니다아제에 대해 다당체를 안정화시키는, 말단의 비환원성 시알산을 통해 단백질 캐리어(파상풍 톡소이드)에 B군 다당체를 접합시키는 것은 면역원성의 현저한 증가를 유발하지 않는다는 것을 보여준다(제닝스 에이치.제이. 및 루고스키 씨. J. Immunol. 127:1011-1018(1981)). 전술한 관찰 결과는, 면역 기작이 α-(2→8)-결합된 시알산 잔기에 대한 특이성을 갖는 항체 생성을 회피한다는 이론과 일치한다. 이 이론은 인체 및 동물 조직의 올리고당체에서 α-(2→8)-결합된 시알산 잔기를 동정하므로써 추가로 확인되었다. B군 다당체의 불량한 면역원성을 극복하기 위한 새로운 접근 방법은 이 다당체를 화학적으로 변형시키는 것이다.
유아에서 다당체 항원의 T-세포 의존 특성은 단백질 캐리어에 다당체를 접합(공유적으로 커플링)시키므로써 해결할 수 있다. 신생아 수막염의 1차적인 원인이 되는 박테리아의 협막 다당체를 단백질 캐리어에 접합시킨다; 캐리어 단백질로는 유형 b 에이치. 인플루엔자(쉬너슨 알. 등, J. Exp. Med 152:361-376(1980); 앤더슨 피.더블유. Infect. Immun. 39:233-238(1983); 마버그 에스. 등, J. Am. Chem. Soc. 108:5282-5287(1986)), A군 엔. 멘인기티디스(제닝스, 에이치.제이. 및 루고스키 씨. J.Immunol. 127:1011-1018(1981); 뷰베리 이.씨. 등, Vaccine 1:31-36(1983)), B군 엔. 멘인기티디스(제닝스, 에이치.제이. 및 루고스키 씨. J.Immunol. 127:1011-1018(1981)) 및 C군 엔. 멘인기티디스(제닝스, 에이치.제이. 및 루고스키 씨. J.Immunol. 127:1011-1018(1981); 뷰베리 이.씨. 등, Infect. Immun. 40:39-45(1983)), 및 유형 6A 스트렙토코커스 뉴모니애(Strep. pneumoniae)(슈 씨. 등, Infect. Immun. 40:245-256(1983))가 있다. 캐리어 단백질을 선택하기 위해서, 여러 연구진들은 파상풍 톡소이드 또는 디프테리아 톡소이드를 사용하였으며, 이 두 개의 단백질은 유아 백신으로 현재 사용되고 있다. 이 분야에서의 근래 새로운 방법은 비-독성인 변이체-유도된 디프테리아 독소(CRM197)(앤더슨 피.더블유. Infect. Immun. 39:233-238(1983))를 사용하는 것이다. 이 단백질은 포름알데히드로 처리하여 탈독성화시킬 필요가 없고, 이의 아미노기는 모두 비유도체화 상태로 남아있어 접합 과정을 상당히 용이하게 하기 때문에 중요하다.
캐리어로서 유효한 기타 박테리아 단백질의 용도는 널리 조사되지는 않았다. 그러나, 엔. 멘인기티디스의 혈청형 외막 단백질은 단백질 캐리어로서 사용되어 왔다(마버그 에스. 등, J. Am. Chem. Soc. 108:5282-5287(1986)).
전술한 것을 고려해 보면, 엔. 멘인기티디스의 외막 B군 포린 단백질을 다량 얻을 수 있는 과정이 절실히 필요하다는 것이 명백해질 것이다. 엔. 멘인기티디스의 3가지 주요 혈청군인, A군, B군 및 C군에 완전히 적용할 수 있고, 유아와 더 성숙한 인체에도 이들 유기체에 대한 면역을 제공할 수 있는 다당체 백신이 요구된다는 것이 명백할 것이다.
본 발명은 재조합 유전체, 단백질 발현 및 백신 분야에 관한 것이다. 본 발명은 재조합 효모 숙주에서 나이세리아 멘인기티디스(Neisseria meningitidis: 수막염균)로부터 외막 B군 포린 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 A군 수막염균(meningococcus) 다당체(GAMP), B군 수막염균 다당체(GBMP) 및 C군 수막염균 다당체(GCMP) 항원과 함께 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 백신에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전술한 백신을 면역 응답을 유발하기에 충분한 양으로 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 포유동물의 면역 응답을 유도하는 방법에 관한 것이다.
도 1: PorB 유전자의 서열 결정 방법을 보여주는 도식. 먼저, 실시예 1(재료 및 방법 부분)에서 기술한 PCR 생성물을 발현 플라스미드 pET-17b의 BamHI-XhoI 부위내로 결찰시켰다. 초기 2본쇄 프라이머 연장 서열 결정은 pET-17b 플라스미드내의 BamHI 부위의 바로 상류와 XhoI 부위의 바로 하류의 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하여 수행하였다. 엔도뉴클레아제 III/녹두 뉴클레아제 반응을 이용하여 유전자의 3' 말단에 여러 결실부를 만들어서 추가의 서열 데이터를 얻었다. 이.콜리내로의 재결찰 및 형질전환 후에, 여러 클론을 삽입물의 크기에 따라 선택하고 서열결정하였다. 이 서열 결정은 항상 Bpu11021 부위의 바로 하류에 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 유전자의 3' 말단으로부터 실시하였다.
도 2: PCR 반응 생성물을 보여주는 겔 전기영동(TAE 완충액을 사용하여 1% 아가로스에서 전기영동).
도 3A 및 도 3B. 도 3A: 삽입체가 없는 대조군 pET-17b 플라스미드의 숙주인 이. 콜리 전체 세포 용균물과, 재료 및 방법 부분에서 기술한 방법으로 얻은 PCR 생성물의 삽입체를 함유하는 pET-17b 플라스미드를 보유한 이. 콜리 클론의 SDS-PAGE 분석. 두 개의 배양물을 600nm에서 0.6의 O.D.로 증식시키고, IPTG를 첨가한 후 2시간 동안 37℃에서 항온 처리하였다. 1.5㎖의 각 배양물을 제거하고, 원심분리하여, 박테리아 펠렛을 100㎕의 SDS-PAGE 정제 완충액에 용해시켰다. 레인 A는 대조 시료 10㎕로부터 얻은 단백질 프로필이고, 레인 B(5㎕) 및 레인 C(5㎕)는 PorB 단백질을 발현하는 이.콜리 숙주의 단백질 프로필을 나타낸다. 도 3B: IPTG로 2시간 유도후에 삽입체 없이 대조군 pET-17b 플라스미드를 넣은 이.콜리의 전체 세포 용균물의 웨스턴블롯 분석, 레인 A, 20㎕, porB-pET-17b 플라스미드를 함유하는 해당 이.콜리 클론의 전체 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석, 레인 B, 5㎕; 레인 C, 10㎕; 및 레인 D, 20㎕. 모노클론 항체 4D11를 1차 항체로서 사용하고 전술한 바와 같이 웨스턴 블롯을 발색시켰다. 각 경우마다 BRL에서 입수한 예비-염색된 저분자량의 표준 물질을 사용하였다.
도 4: 발현 플라스미드 pET-17b내로 클론된 성숙 PorB 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 번역된 아미노산 서열. 이전에 발표된 혈청형 15 PorB와 상이한 2개의 뉴클레오티드가 밑줄로 표시되어 있다.
도 5: 280nm에서 흡광도 및 SDS-PAGE 분석으로 모니터한, 수막염균 균주 8765로부터 분리된 야생형 클래스 3 단백질과 r3pET-17b 플라스미드를 함유하는 BL21(DE3)-△ompA 이.콜리 균주에 의해 생성된 재조합 클래스 3 단백질의 세파크릴(Sephacryl) S-300 칼럼 용출 프로필을 보여주는 그래프. 칼럼의 공극 부피는 화살표로 나타낸다. SDS-PAGE에 의해 결정된 바와 같이 수막염균 포린과 재조합 포린을 포함하는 분획물은 막대기로 표시하였다.
도 6: 6명의 인간 면역 혈청에서 반응성 항체와 경쟁하는 동종 야생형(wt) PorB의 능력을 보여주는 억제 ELISA 분석법의 결과를 나타낸 그래프. 산술 평균 억제율을 굵은 선으로 나타내었다.
도 7: 6명의 인간 면역 혈청에서 반응성 항체와 경쟁하는 정제된 재조합 PorB단백질의 능력을 보여주는 억제 ELISA 분석법의 결과를 나타낸 그래프. 산술 평균 억제율은 굵은 선으로 나타내었다.
도 8: 야생형 및 재조합 PorB 단백질을 이용하여 얻은 2개의 평균 억제율을 비교하는 그래프.
도 9A 및 도 9B: 발현 플라스미드 pET-17b내로 클론된 성숙 클래스 II 포린 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 번역된 아미노산 서열.
도 10A 및 도 10B: 발현 플라스미드 pET-17b내로 클론된 융합 클래스 II 포린 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 번역된 아미노산 서열.
도 11(A 및 B): 도 11A는 pET-17b 플라스미드의 제한효소 지도를 나타낸 것이다. 도 11B는 pET-17b의 BglII 및 XhoI 부위사이의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다. 플라스미드에 의해 제공된 서열은 보통 모양으로 나타내고 PCR 생성물을 삽입한 서열은 굵은 모양으로 나타내었다. 플라스미드로부터 유도된 아미노산은 보통 모양으로 나타내고 삽입체로부터의 아미노산은 굵은 모양으로 나타내었다. 화살표는 이 서열이 도 4의 서열과 일치하는 시작점과 끝점을 표시한 것이다.
도 12: 클론 pnv 322에 의한 MB3의 발현양을 보여주는 그래프. 여기서 사용된 발현 벡터는 pHIL-D2이다. MB3의 발현양은 단위 시간당 세포 펠렛의 g당 불용성 MB3의 양(mg)으로 나타낸다.
도 13A: 코돈 최적화 전인 pNV15(pET24a중 MB3)의 DNA 서열 및 번역된 아미노산 서열.
도 13B: Men. 클래스 3 opt.(효모 코돈용으로 최적화된 MB3)의 DNA 서열 및 번역된 아미노산 서열.
도 14A 및 도 14B: 크기 제한 칼럼으로부터 MB3의 용출을 보여주는 그래프. 세포내 형태로 발현된 MB3을 변성/복원 방법으로 정제한 후 겔 여과 및 이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 얻어진 정제 단백질의 크기 제한 크로마토그래피 결과 이.콜리에서 과발현된 재조합 클래스 3 단백질과 유사한 용출물 프로필을 나타내었으며, 이 둘은 모두 천연 야생형 짝으로서 동일한 용출 프로필을 제공한다. 이는 MB3가 재중첩되고 올리고머화되어, 완전한 고유 구조를 이룬다는 것을 보여준다. 14(A): MB3의 용출 프로필; 14(B): 이.콜리 봉입체로부터 발현되고 재중첩된 클래스 3 단백질의 용출 프로필.
도 15: HPLC(휴렛 팩커드 모델 1090)에 연결된 Superose 12(파마시아) 칼럼에서 정제된 MB3의 크기 제한 크로마토그래피를 보여주는 그래프. 자연 야생형 짝과 MB3의 비교, 및 분자량 표준 물질(화살표로 나타냄)을 사용한 조정에 근거하여, 용출물 프로필이 삼량체 조합물이라는 것을 알려준다. 분자량 표지는 1=티로글로블린(670,000); 2=감마글로블린(158,000); 3=미오글로빈(17,000).
도 16A, 도 16B, 및 도 16C: 클론 pnv 322의 DNA 서열. 이 클론은 인비트로겐 발현 벡터 pHIL-D2의 EcoRI 부위내로 삽입된 MB3 유전자를 갖는다. 따라서, MB3은 AOXI 프로모터의 바로 하류에 삽입된다. 이 작제물은 세포내 발현이 가능하다. 벡터 서열은 대문자로, MB3 서열은 소문자로 나타내었다.
도 17A, 도 17B 및 도 17C: 클론 pnv 318의 DNA 서열. 이 클론은 인비트로겐 발현 벡터 pHIL-S1의 XhoI-BamHI 부위내로 삽입된 MB3 유전자를 갖는다. 따라서, MB3은 발현된 단백질의 분비를 위한 분비 시그널 개방형 해독틀과 정확한 틀 구조로, PHOl 리더 펩티드의 바로 하류에 삽입된다. 벡터 서열은 대문자로, MB3 서열은 소문자로 나타내었다.
도 18A, 도 18B 및 도 18C: 클론 pnv 342의 DNA 서열. 이 클론은 인비트로겐 발현 벡터 pPIC-9의 EcoRI-AvrII 부위내로 삽입된 MB3 유전자를 갖는다. 따라서, MB3은 발현된 단백질 분비를 위한 α-인자 프리프로 펩티드의 분비 시그널 바로 하류에 삽입된다. 벡터 서열은 대문자로, MB3 서열은 소문자로 나타내었다.
도 19A, 도 19B 및 도 19C: 클론 pnv 350의 DNA 서열. 이 클론은 인비트로겐 발현 벡터 pPIC-9K의 EcoRI-AvrII 부위내로 삽입된 MB3 유전자를 갖는다. 따라서, MB3은 발현된 단백질 분비를 위한 α-인자 프리프로 펩티드의 분비 시그널 바로 하류에 삽입된다. 벡터 서열은 대문자, MB3 서열은 소문자로 나타내었다.
도 20: GAMP, TT-모노머 및 GAMP-TT 접합체의 흡광도 스펙트럼[일렉트로페로그램(electropherogram)]을 보여주는 그래프.
도 21: GCMP, TT-모노머 및 GCMP-TT 접합체의 흡광도 스펙트럼(일렉트로페로그램)을 보여주는 그래프.
도 22: 마우스에서 1가(A) 및 3가(A/B/C) 수막염균 접합체 백신에 의해 유발되는 A군-특이적 IgG ELISA 역가를 보여주는 그래프.
도 23: 마우스에서 1가(A) 및 3가(A/B/C) 수막염균 접합체 백신에 의해 유발되는 B군-특이적 IgG ELISA 역가를 보여주는 그래프.
도 24: 마우스에서 1가(C) 및 3가(A/B/C) 수막염균 접합체 백신에 의해 유발되는 C군-특이적 IgG ELISA 역가를 보여주는 그래프.
도 25: 마우스에서 1가(C) 및 3가(A/B/C) 수막염균 접합체 백신에 의해 유발되는 A군-특이적 살균 작용을 보여주는 그래프.
도 26: 마우스에서 1가(C) 및 3가(A/B/C) 수막염균 접합체 백신에 의해 유발되는 B군-특이적 살균 작용을 보여주는 그래프.
도 27: 마우스에서 1가(C) 및 3가(A/B/C) 수막염균 접합체 백신에 의해 유발되는 C군-특이적 살균 작용을 보여주는 그래프.
발명의 상세한 설명
본 발명은 이.콜리중에서 엔. 멘인기티디스의 외막 B군 포린 단백질을 발현 및 정제시키는데 관련된 일부 난점을 해결할 수 있다. 성숙 포린 단백질, 예를 들어 클래스 2 및 3 뿐만 아니라 이의 융합 단백질의 DNA 서열은 PCR 반응의 주형으로서 수막염균 박테리아의 염색체를 사용하여 증폭시켰다. 증폭된 포린 서열은 T7 프로모터를 포함하는 발현 벡터내로 결찰 및 클론시켰다. ompA 유전자를 제거하기 위해서 변형시킨 DE3 람다 파지에 대해 용원성인 이.콜리 균주 BL21(스터디어 및 모파트, J. Mol. Biol. 189:113-130(1986))을 포린 유전자를 함유하는 pET-17b 플라스미드의 발현 숙주로서 선택하였다. 유도시, 다량의 수막염균 포린 단백질이 숙주 박테리아에 명백하게 치명적인 영향을 주지 않고 이.콜리내에 축적되었다. 발현된 수막염균 포린 단백질을 추출하고 표준 과정으로 처리한 후, 최종적으로 분자체 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 분자체 크로마토그래피로 단백질 프로필을 분석해보면, 재조합 수막염균 포린은 삼량체로서 칼럼으로부터 용출된다. PCR 인공물은 수막염균 포린 유전자내로 도입되어 고도로 발현되지 않는다는 것을 확인하기 위해서, 삽입된 PorB 유전자 서열을 결정하였다. 억제 ELISA 분석법을 사용하여 발현된 재조합 포린 단백질이 천연 항원성이고 삼량체인 구조내로 복원된다는 추가의 증거를 제공하였다.
박테리아 이.콜리 숙주 시스템에 대안으로서, 수막염균 B군 클래스 3 포린 단백질(MB3)은 효모에서 발현시킬 수 있다. 바람직한 숙주는 메틸로트로피 효모(meltylotrophic yeast) 피치아 파스토리스이며, 이는 인비트로젠에 의해서 개발된 피치아 발현 키트를 사용하여 형질전환시킬 수 있다. 효모는 이종 단백질을 생성하기 위한 좋은 숙주이다. 원핵 세포계와는 달리, 진핵 아세포내 구조는 "진짜"의 생체 활성 단백질을 제조하는데 필요한 여러 번역후 중첩, 프로세싱 및 변형을 수행할 수 있도록 한다. 진핵세포로서, 피치아 파스토리스는 고등 진핵세포 발현 시스템의 많은 장점을 가지는 반면, 이.콜리 또는 사카로마이시스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)와 같이 조작하기 간편하다. 효모의 경우, 사카로마이시스를 사용한 분자 및 유전자 조작의 장점을 공유하고, 고등 진핵 세포의 단백질 프로세싱 특성 및 10배 내지 100배 높은 이종 단백질 발현양을 나타내는 잇점을 추가로 가진다.
피치아는 에스. 세레비시애에서와 같이 단백질을 과글리코실화시키는 경향이 없기 때문에, 피치아에서의 발현은 기타 효모 균주에서의 발현과 비교하여 장점을 제공한다. 또한, 피치아에 의해 첨가된 올리고당체는 에스. 세레비시애에 의해 생성된 단백질의 초-항원 특성의 1차적 원인으로 생각되는 α1,3-글리칸 결합이 결핍되어 있기 때문에, 피치아에서 발현되고 변형된 단백질은 에스. 세레비시애에 의해 생성된 것들 보다 치료학적으로 더 유용할 수 있다. 몇가지 백신 항원이 임상적 용도인 B형 간염 표면 항원을 비롯하여, 효모 세포에서 생성된다(크레그 등, Bio/Technology 11:905-910(1993)).
이.콜리 및 기타 몇 종의 그람 음성 박테리아의 포린 단백질과는 달리, 나이세리아 포린의 1차 서열의 변화가 이온 선택성, 전압 가변성 및 기타 생체물리학적 작용에 어떠한 영향을 주는지에 관해 알려진 것은 거의 없다. 최근 2가지 이.콜리 포린, 즉 OmpF 및 PhoE의 결정 구조가 각각 2.4Å 및 3.0Å로 밝혀졌다(코완 에스.더블유. 등, Nature 358: 727-733(1992)). 이들 이. 콜리 포린은 분자 유전자 조작이 수행될 수 있는 특별한 안정성과 용이성 때문에, 집중적으로 연구되어 왔다. 이들 2가지 포린의 유전자에 대해 얻은 자료는 결정 구조와 서로 밀접한 관련이 있다. 나이세리아의 표면 형태가 이들 2가지 이.콜리 포린의 것과 유사한 나이세리아 포린을 선택하기 위해서 모노클론 항체를 사용하여 몇가지 연구를 해왔으나, 나이세리아 포린의 특정 영역의 아미노산 서열 변경이, 이.콜리 포린에 대해 알려진 바와 같이 나이세리아 포린의 생체물리학적 특성에 어떻게 영향을 주는지에 대하여 얻은 정보는 거의 없다(코완 에스.더블유 등, Nature 358:727-733(1992)).
이 연구를 저해하는 2가지 주요 문제는 (1) 근대 분자 기술에 의해 유전자적으로 나이세리아를 용이하게 조작할 수 없다는 것과, (2) 생체물리학적 및 생화학적 특성 자료를 얻기 위해 더 정제될 충분한 양의 나이세리아 포린을 이.콜리 또는 효모중에 발현시킬 수 없다는 것이다. 실제로, 고노코커스 및 수막염균 포린에 대한 대부분의 DNA 서열 자료는 포린 유전자의 중첩 부위를 클론한 후, 그 정보를 재구성하여 전체 유전자 서열을 밝히므로써 얻는다(고츠리히 에.체. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8135-8139(1987); 뮤라카미, 케이. 등, Infect. Immun. 57:2318-2323(1989)). 카르보네티 등은 먼저 엄격하게 조절되는 pT7-5 발현 플라스미드를 사용하여 이.콜리내로 전체 고노코커스 포린 유전자를 클론시켰다. 이들 연구 결과로 포린 유전자가 유도되는 경우, 포린 단백질이 거의 축적되지 않으며, 이 단백질의 발현은 이.콜리에 치명적이라는 것을 보여준다[카르보네티 및 스파링, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9084-9088(1987)]. 또 다른 연구에서, 카르보네티 등 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6841-6845(1988)]은 고노코커스 포린 유전자를 이.콜리 시스템에서 변경시킨 후 고노코커스내로 재도입할 수 있다는 것을 보여주었다. 그러나, 이를 조작하고 추가의 생화학 및 생체물리학적 형질화를 위한 에 대한 충분한 포린 단백질을 얻을 수 있는 용이성은 제한되는 것 같다.
피버스 등은 각각 나이세리아 포린 유전자의 5'말단 및 3'말단의 공통 도메인에 대해 합성된 2개의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 각종 공급원 유래의 나이세리아 포린 유전자를 PCR에 의해 증폭시키는 방법을 개시하고 있다(피버스 아이.엠. 등, Infect. Immun. 60:3620-3629(1992)). 제한 엔도뉴클레아제 BglII 및 XhoI를 사용하여 증폭된 DNA가 플라스미드내로 클론되도록, 올리고뉴클레오티드를 작제하였다.
피버스 등의 PCR 시스템을 사용하여, 수막염균 균주 8765 혈청형 15로부터 성숙 PorB 단백질의 DNA 서열을 증폭시키고 T7 발현 플라스미드 pET-17b의 BamHI-XhoI 부위내로 결찰시켰다. 이에 따라 성숙 PorB 단백질 서열은 리더 서열을 함유하는 Φ10 단백질의 20 아미노산 및 T7 프로모터의 바로 뒤에 정확한 틀 구조로 위치하게 된다. 이 플라스미드를 함유하는 이.콜리의 배양액에 IPTG를 첨가하면, 다량의 PorB 단백질이 박테리아내에 축적된다. 이 작제물이 이.콜리에 치명적이지 않으며 다량의 포린 단백질을 발현하는 이유에 대한 완벽한 해석은 계속 연구중이다. 그러나, 가능한 가설은 나이세리아 프로모터 및 시그널 서열을 각각 T7 및 Φ10의 것으로 대체하므로써, 포린 생성물이 외막을 향하기 보다는 세포질을 향하게 된다는 것이다. 헨닝 및 공동 연구진들은 이. 콜리 OmpA 단백질 및 이의 단편이 발현될 때, 세포질에서 발견되는 이들 생성물은 주변세포질 간극을 향하는 것들보다 독성이 적다는 것을 보고하였다(클로세 엠. 등, J. Biol. Chem. 263:13291-13296(1988); 클로세 엠. 등, J. Biol. Chem. 263:13297-13302(1988); 프로이들 알. 등, J. Mol. Biol. 205:771-775(1989)). 설명이 어떻든 간에, 일단 PorB 단백질이 발현되면, 쉽게 분리 및 정제되고 천연 포린과 매우 유사한 삼량체로 다시 만들어진다. 인체 면역 혈청을 사용한 억제 ELISA 데이터 결과는 이 방법으로 얻은 PorB 단백질이 수막염균으로부터 정제된 야생형 PorB 단백질의 항원 특성을 전부는 아니라도 대부분은 재수득할 수 있다는 것을 제안한다. 상기 발현 시스템은 근대 분자 기술로 나이세리아 포린 유전자를 쉽게 조작할 수 있도록 한다. 또한, 이 시스템은 형질화를 위한 다량의 순수한 포린 단백질을 얻을 수 있도록 한다. 또한, 본 발명의 발현 시스템은 나이세리아, 즉 고노코커스 및 수막염균의 여러 균주로부터 얻은 유전자를 유사한 방법으로 조사하고 형질화할 수 있도록 한다.
강력한 피.파스토리스 알코올 산화효소 프로모터 AOX1의 조절하에 MB3 DNA 단편을 위치시키므로써 메틸로트로피 효모 피치아 파스토리스에서 혈청군 B의 나이세리아 멘인기티디스 외막 클래스 3 단백질(MB3)을 발현시켰다. 메탄올상에서 유도시, 재조합 플라스미드로 형질전환시킨 피. 파스토리스 균주는 천연 또는 융합 MB3 단백질을 생성하며, 이는 야생형 짝에 대해 발생된 마우스 폴리클론 항체와 반응성이 있었다. 플라스크 진탕 배양시, 유전자 조작된 피. 파스토리스는 펠렛화된 습윤 세포 1g당 약 1 내지 3㎎의 발현된 단백질 또는 1ℓ당 100 내지 600㎎을 산출하며, 이는 효모 세포 현탁액의 10 내지 15% 또는 총 세포 단백질의 약 3 내지 5%에 해당한다(표 4). 전장 MB3 DNA를 인비트로겐에서 개발한 4개의 피치아 발현 벡터 각각에 클론시켰다. 단량체인 전체 크기가 34kDa의 MB3 단백질을 발현시키기 위해서, 세포내 pHIL-D2 벡터를 사용하였다. pHIL-D2 벡터의 지도는, 본원에서 참고로 인용한 피치아 발현 키트, E 형태에 대한 인비트로겐 지시서의 p19에서 찾을 수 있다. 이 작제물은 최대 발현양을 제공하였다(세포 1g당 최대 3㎎의 MB3)(표 3a, 표 3b 및 표 4). 발현된 생성물은 분비되지 않았으며, 이는 주로(95%) 불용성이고, 세포막에 단단하게 결합되어 있었다.
발현된 MB3의 분비 가능성을 더 증가시키기 위해서, 또한 상이한 분비 시그널을 갖는 3가지 다른 벡터; 벡터 pHIL-S1(자연 피치아 파스토리스 유래의 산 포스파타제 유전자 PHO1의 시그널 서열을 운반), 및 벡터 pPIC9 및 pPIC9K(에스. 세레비시애 α-접합 인자 프리프로-펩티드의 분비 시그널을 운반)를 사용하였다. pHIL-S1 및 pPIC9 벡터의 지도는 피치아 발현 키트, E 형태에 대한 인비트로겐 지시서의 p21-22에서 찾을 수 있다. pPHIL-S1/MB3 작제물은 36.5kDa의 외관상 분자량을 갖는 MB3-PHO1 융합 폴리펩티드를 발현시키며, 성숙 34kDa MB3을 산출하기 위해서 부분적으로 처리되었다. 약 5 내지 10%의 발현된 MB3이 효모 증식 배지로 분비되고, 약 40 내지 50%의 36.5kDa 융합 폴리펩티드가 절단되었다(표 4). pPIC9/MB3 또는 pPIC9K/MB3 작제물에 의해 형질전환된 피치아 재조합체는 α-인자와 융합된 MB3만을 발현하며, 약 45kDa의 융합 폴리펩티드를 산출하였다. 융합 단백질의 절단 또는 프로세싱에 대한 증거는 없었다.
재조합 MB3(pHIL-D2/MB3 함유 형질전환체)의 분리 및 정제에 대한 예비 연구는 MB3이 피. 파스토리스에서 발현된 경우, 자연 조건하에서 삼량체를 형성할 수 있으며, 자연 단백질이 트립신 분해에 대한 내성이 있다는 것을 제안하였다. 이들 결과는 야생형에 대해 관찰한 것과 유사하였다.
MB3 발현 카세트의 다수 복사체를 포함하는 피치아의 균주를 사용하여 발현된 MB3의 생성율을 증가시킬 수 있다. 다수 복사체를 포함하는 균주는 <10% 빈도수로 형질전환된 세포 개체군내에서 자연적으로 존재한다. 이들 균주는 SDS-PAGE 또는 면역 블롯팅을 통해 MB3 발현 양을 위해 다량의 형질전환체를 직접 선별하거나, 또는 MB3 유전자의 다수 복사체를 포함하는 클론을 선택하기 위해서 "도트 블롯팅" 하이브리드화에 의해 간접적으로 선별하여 동정할 수 있다(크레그 등, Bio/Technology 11:905-910(1993)). 대안적으로, 여러 개가 통합된 클론을 새로운 pAO815 벡터(인비트로겐)을 사용하여 작제할 수 있으며, 이는 반복된 카세트 삽입 단계를 통해 대상 유전자의 다수 카피를 클론시킨다(전술한 동일 문헌. p907). 발효기를 사용한 스케일 업(scale-up) 과정은 더 높은 효모 세포 밀도를 제공하며, 따라서 발현된 단백질의 수율도 5 내지 10배 이상 증가시킬 것이다. 단백질 발현의 최적화(즉, 증식 배지 조성, 완충 용량, 카사미노 산 보조제, 메탄올 농도의 증가 등)는 일상적인 실험법으로 수행할 수 있다.
MB3의 다수 복사체를 갖는 피치아 형질전환체를 동정하는 또 다른 방법은 피치아 발현 벡터 pPIC9K가 G418에 대한 내성을 부여하는 카나마이신 내성 유전자를 보유한다는 사실을 이용하는 것이다; 기타의 경우 pPIC9K는 pPIC9에 해당한다. 이어서, 다수 삽입체의 자발적인 세대교번은 G418에 대한 내성 정도에 의해 확인할 수 있다. 피치아 형질전환체는 히스티딘-결핍 배지에서 선택되고, G418에 대한 내성 정도로 검색한다. G418에 대한 증가된 내성은 카나마이신 내성 유전자의 다수 복사체가 존재함을 나타내는 것이다.
따라서, 본 발명은 외막 수막염균 B군 포린 단백질, 특히 클래스 2 및 클래스 3 포린 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제1양태에서, 본 발명은 하기 (a) 내지 (c) 단계를 포함하여, 이.콜리내에서 외막 수막염균 B군 포린 단백질을 발현하는 방법에 관한 것으로서, 이렇게 생성된 단백질은 이.콜리에서 발현되는 총 단백질의 약 2% 이상을 차지한다:
(a) (i) 성숙 포린 단백질, 및
(ii) T7 유전자 φ10캡시드 단백질의 아미노산 1 내지 20 또는 1 내지 22에 융합된 성숙 포린 단백질을 포함하는 융합 단백질로 구성된 군에서 선택된 단백질을 암호하는 유전자 및 선택성 마커를 포함하는 벡터로 이.콜리를 형질전환시키는 단계(상기 유전자는 T7 프로모터에 작동가능하게 결합된다);
(b) 선택 제제를 함유하는 배양 배지에서 형질 전환된 이.콜리를 증식시키는 단계;
(c) 상기 단백질의 발현을 유도하는 단계.
바람직한 일양태에서, 발현된 수막염균 B군 포린 단백질 또는 융합 단백질은 이.콜리에서 발현되는 총 단백질의 약 5% 이상을 차지한다. 또 다른 바람직한 일양태에서, 발현된 수막염균 B군 포린 단백질 또는 융합 단백질은 이.콜리에서 발현되는 총 단백질의 약 10% 이상을 차지한다. 또 다른 바람직한 일양태에서, 발현된 수막염균 B군 포린 단백질 또는 융합 단백질은 이.콜리에서 발현되는 총 단백질의 약 30% 이상을 차지한다.
T7 유도성 프로모터를 포함하는 플라스미드의 예로는 발현 플라스미드 pET-17b, pET-11a, pET-24a-d(+) 및 pET-9a가 있으며, 이들은 모두 노바겐(위스콘신주 53711 매디슨에 소재하는 사이언스 드라이브 565)의 시판용이다. 이들 플라스미드는 서열상에서 T7 프로모터, 임의적으로 lac 작동유전자, 리보좀 결합 부위, 구조 유전자 삽입용 제한부위 및 T7 종결유전자 서열을 포함한다. 참고, 노바겐 카탈로그, p36-43(1993).
바람직한 일양태에서, 이.콜리 균주 BL21(DE3)ΔompA를 사용한다. 전술한 플라스미드를 이용하여 상기 균주 또는 야생형 균주 BL21(DE3)를 형질전환시킬 수 있다. 이.콜리 균주 BL21(DE3)ompA는 바람직하지 않은 면역원성 부작용을 일으키고 정제된 포린 단백질을 오염시키는 OmpA 단백질을 생성하지 않는 것이 바람직하다.
형질 전환된 이.콜리를, 선택 제제, 예를 들어, 엠피실린과 같이 이.콜리가 감응성인 임의의 β-락탐을 함유하는 배지에서 증식시킨다. pET 발현 벡터는 형질전환된 유기체에 항생제 내성을 부여하는 선택성 표지를 제공한다.
다량으로 발현된 수막염균 B군 포린 단백질은 이.콜리에서 독성이 될 수 있다. 놀랍게도, 본 발명은 이.콜리가 총 세포내 단백질의 거의 30% 이상, 그리고 >50% 정도로 많은 양으로 단백질을 발현시키게 한다.
본 발명의 제2 양태에서, 본 발명은 하기 (a) 내지 (e) 단계를 포함하여, 외막 수막염균 B군 포린 단백질을 발현하는 방법에 관한 것이다:
(a) (i) 성숙 포린 단백질,
(ii) 효모 분비 시그널 펩티드에 융합된 성숙 포린 단백질을 포함하는 융합 단백질로 구성된 군에서 선택된 단백질을 암호하는 유전자를, 선택성 표지를 갖는 플라스미드내로 결찰시키는 단계(상기 유전자는 효모 프로모터에 작동가능하게 결합됨);
(b) 상기 유전자를 함유하는 플라스미드로 효모 균주를 형질전환시키는 단계;
(c) 상기 형질전환된 효모를 선택할 수 있는 배양 배지에서 효모를 증식시켜 형질전환된 효모를 선택하는 단계;
(d) 형질전환된 효모를 증식시키는 단계; 및
(e) 상기 단백질의 발현을 유도하여 단백질을 함유하는 효모를 제공하는 단계.
효모 숙주의 형질 전환은 당업자들에게 공지된 몇가지 임의의 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 이들 기술로는 효모 세포벽을 부분적으로 또는 완전히 파괴시켜 스페로플라스트(spheroplast)를 형성시키는 효모 세포의 직접 또는 리포좀-매개된 형질 전환, 알카리 양이온 및 PEG로 숙주 처리, 및 PEG 처리와 병행하는 동결-해동법이 있다(참고, 웨버 등, Nonconventional Yeasts; Their Genetics and Biotechnological Applications, CRC Crit. Rev. Biotechnol. 7:281, 317(1988) 및 본원에서 인용한 참고문헌, 이들은 모두 본원에서 전체적으로 참고로 인용하였다).
또 다른 바람직한 일양태에서, 발현된 성숙 포린 단백질 또는 융합 단백질은 효모 숙주에서 발현된 총 단백질의 약 2% 이상을 차지한다. 또 다른 바람직한 일양태에서, 발현된 성숙 포린 단백질 또는 융합 단백질은 효모 숙주에서 발현된 총 단백질의 약 3%∼5% 를 차지한다.
또 다른 바람직한 일양태에서, 성숙 포린 단백질은 혈청군 B로부터의 나이세리아 멘인기티디스 성숙 외막 단백질 클래스 3 단백질이다.
또 다른 바람직한 일양태에서, 본 발명은 효모에서 외막 수막염균 B군 포린 단백질 또는 융합 단백질을 발현하는 전술한 방법을 수행하는 것에 관한 것이며, 상기 효모는 하기로 구성된 군에서 선택된다. 사카로마이시스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이시스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이시스 우바룸(Saccharomyces uvarum), 사카로마이시스 칼스버겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이시스 디아스타티커스(Saccharomyces diastaticus), 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 캔디다 말토사(Candida maltosa), 캔디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 파리노사(Pichia farinosa), 피치아 피너스(Pichia pinus), 피치아 반리지(Pichia vanrijii), 피치아 퍼멘탄스(Pichia fermentans), 피치아 길리어몬디(Pichia guilliermondii), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis), 사카로마이시스 텔루리스(Saccharomyces telluris), 캔디다 우틸리스(Candida utilis), 캔디다 길리어몬디(Candida guilliermondii), 핸세눌라 헨리시(Hansenula henricii), 핸세눌라 캡슐라타(Hansenula capsulata), 핸세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 핸세눌라 사투너스(Hansenula saturnus), 리포마이시스 코노넨코애(Lypomyces konoenkoae), 클루이버로마이시스 마시아누스(Kluyveromyces marxianus), 캔디다 리포리티카(Candida lipolytica), 사카로마이콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera), 사카로마이코데즈 루드뷔기(Saccharomycodes ludwigii), 사카로마이시스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 트레멜라 멘젠테리카(Tremella mesenterica), 지고사카로마이시스 에시도파시엔스(Zygosaccharomyces acidofaciens), 지고사카로마이시스 퍼멘타티(Zygosaccharomyces fermentati), 야로뷔아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 및 지고사카로마이시스 소야(Zygosaccharomyces soja). 이들 여러 효모 숙주는 메릴랜드주 록빌에 소재하는 미국 모식균 배양소로부터 입수 가능하다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, 성숙 포린 단백질 또는 융합 단백질을 암호하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 효모 코돈용으로 최적화한 코돈에 도입시킨다. 또 다른 바람직한 일양태에서, 효모 코돈용으로 최적화시킨 성숙 포린 단백질을 암호하는 유전자의 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열, 서열 번호 26이다.
본 발명의 또 다른 일양태에서, 효모 분비 시그널 펩티드는 에스. 세레비시애 α-접합 인자 프리프로-펩티드의 분비 시그널 및 피.파스토리스 산 포스파타제 유전자의 분비 시그널로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 일양태에서, 효모는 단백질 또는 융합 단백질을 분비한다.
본 발명의 또 다른 일양태에서, 유전자가 작동가능하게 결합하는 효모 프로모터는 AOX1 프로모터, GAPDH 프로모터, PHO5 프로모터, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(TDH3) 프로모터, ADHI 프로모터, MFα1 프로모터, 및 GAL10 프로모터로 구성된 군에서 선택된다. AOX1 프로모터를 포함하는 플라스미드의 예로는 발현 플라스미드 pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC9 및 pPIC9K가 있다. 이들 플라스미드는 서열중, AOX1 프로모터, 구조 유전자를 삽입시키는 제한 부위, AOX1 전사 종결 단편, HIS4(히스티디놀 탈수소효소)를 암호하는 개방 해독틀, 앰피실린 내성 유전자 및 ColE1 기원을 포함한다. 또한, 플라스미드 pPIC9 및 pPIC9K는 에스.세레비시애의 α-인자 분비 시그널을 포함하고, 플라스미드 pHIL-S1은 피. 파스토리스의 PHO1 분비 시그널을 포함한다. pPIC9K는 또한 카나마이신 내성 유전자를 포함하는데, 이 유전자는 피치아에서 G418에 대한 내성을 부여한다. 피치아 형질전환체의 G418 내성 정도를 이용하여 다수 삽입이 진행된 세포를 동정할 수 있다. 이는 1%∼10%의 빈도로 발생한다. G418에 대한 내성 정도의 증가는 대상 유전자 및 카나마이신 내성 유전자의 다수 복사체가 존재한다는 것을 의미한다. 참고, 노바겐 카탈로그, E판, p19-22(1995).
또 다른 바람직한 일양태에서, 균주에 특이적 영양 요구성을 부여하는 적절한 표지 유전자에 변이를 갖는 효모 숙주 균주를 사용한다. 이어서, 변이된 유전자의 작용성 복사체 뿐만 아니라 수막염균 B군 포린 단백질 또는 융합 단백질을 운반하는 발현 플라스미드로 효모 숙주 균주를 형질 전환시키고, 형질 전환체를 필요 영양분이 결핍된 배지에서 증식할 수 있는 능력을 기준으로 선택한다. 에스.세레비시애 표기 앞에 적절한 표지 유전자의 예로는, 이미다졸 글리세롤 포스페이트 탈수소효소(HIS3), 베타-이소프로필말레이트 탈수소효소(LEU2), 트립토판 신타아제(TRP5), 아르기니노숙시네이트 리아제(ARG4), N-(5'-포스포릴로실)안트라닐레이트 이소머라제(TRP1), 히스티디놀 탈수소효소(HIS4), 오로티딘-5-포스페이트 탈탄산효소(URA3), 디히드로오로테이트 탈수소효소(URA1), 갈락토키나아제(GAL1), 및 α-아미노디페이트 리덕타제(LYS2)가 있다. 형질 전환된 효모 숙주 세포를 적당한 영양이 결핍된 배지에서 증식하는 능력을 기준으로 선택하고, 이 세포들이 정확한 유전자좌에서 수막염균 B군 포린 단백질 또는 융합 단백질을 삽입하였는지를 검색한다. 당업자들에게 공지된 방법으로 검색하여, 예를 들어, AOX1 프로모터로부터 외막 수막염균 B군 포린 단백질 또는 융합 단백질의 발현을 유도하기 위해서 메탄올을 포함하고 형질 전환체를 확인하는데 필요한 영양분이 결핍된 배지에서 서서히 증식시켜 형질전환체를 선택하는 방법이 있다. 이어서, 이들 형질 전환체를 글리세롤-함유 배지에서 증식시킨 후, 메탄올을 첨가하여 수막염균 B군 포린 단백질 또는 융합 단백질을 유도한다.
더욱 바람직한 일양태에서, 피.파스토리스 숙주 균주 GS115 또는 KM71을 사용한다. 이들 균주는 히드티딘 합성을 방지하는 히스티디놀 탈수소효소 유전자(his4)내에 변이를 갖는다. 발현 플라스미드 pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC9 및 pPIC9K는 숙주에서 his4를 상보하는 HIS4 유전자를 운반하여 히스티딘-결핍 배지에서 형질 전환체를 선택할 수 있게 한다. 형질 전환된 피.파스토리스 숙주 세포를 히스티딘-결핍 배지에서 선택한 후에, 히스티딘-, 메탄올+평판에서 서서히 증식하는 형질 전환체를 선택하므로써 정확한 유전자좌에 수막염균 B군 포린 단백질 또는 융합 단백질이 통합되었는지를 검색한다. MB3 유전자를 숙주 게놈으로 삽입시킨 경우 AOX1 유전자좌에서 변이가 생기는, 이들 형질 전환체는 덜 효과적인 AOX2 유전자 생성물을 생성하면서 메탄올로 대사작용을 하기 때문에 메탄올에서는 단지 서서히 증식할 수 있다. 이어서, 글리세롤-함유 배지에서 형질 전환체를 증식시킨 후, 메탄올을 첨가하여 수막염균 B 포린 단백질 또는 융합 단백질의 발현을 유도한다.
가장 바람직한 일양태에서, 본 발명은 피치아 파스토리스 효모에서 외막 수막염균 B군 포린 단백질을 발현시키는 상기 방법을 수행하는 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 일양태에서, 본 발명은 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제와 함께 전술한 방법에 따라 제조된 외막 수막염균 B군 포린 단백질 또는 이의 융합 단백질을 포함하여, 동물중에서 면역 응답을 유도하는 백신에 관한 것이며, 이 백신은 나이세리아 멘인기티디스에 대해 동물의 면역 응답을 유발하기에 유효한 양으로 투여할 수 있다. 바람직한 일양태에서, 동물은 인간, 소, 돼지, 양 및 닭으로 구성된 군에서 선택된다. 또 다른 바람직한 일양태에서, 동물은 인간이다.
또 다른 바람직한 일양태에서, 본 발명은 외막 수막염균 B군 포린 단백질 또는 이의 융합 단백질이 수막염균 B군 협막 다당체(CP)에 접합되어 있는, 전술한 백신에 관한 것이다. 이러한 협막 다당체는 문헌[아스톤 에프.이.등, Microbial Pathog. 6:455-458(1989); 제닝스 에이치.제이.등, J.Immunol. 134:2651 (1985); 제닝스 에이치.제이. 등, J. Immunol. 137:1708-1713(1986); 제닝스 에이치.제이. 등, J. Immunol. 142:3585-3591(1989); 제닝스 에이치.제이., "Capsular Polysaccharides as Vaccine Candidates," in Current Topics in Microbiology and Immunology, 150:105-107(1990); 각 문헌의 내용은 참고로 인용하였다]에 개시된 방법으로 제조하였다.
본 발명은 또한 몇가지 엔. 멘인기티디스 혈청군중 임의의 하나에 대해 면역 응답을 동시에 유도할 수 있는 백신에 관한 것이다. 따라서, 또 다른 바람직한 일양태에서, 본 발명은 엔. 멘인기티디스의 3가지 다른 혈청군으로부터 협막 다당체를 포함하는 3가 백신에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 백신은 A군 수막염균 다당체(GAMP), B군 수막염균 다당체(GBMP) 및 C군 수막염균 다당체(GCMP)의 항원들과, 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 포함한다.
바람직한 일양태에서, A군 수막염균 다당체(GAMP), B군 수막염균 다당체(GBMP) 및 C군 수막염균 다당체(GCMP) 항원을 각각 단백질 캐리어에 접합시켜 GAMP, GCMP 및 GBMP 다당체 항원 접합체를 형성한다.
물론, 여러 종류의 캐리어 단백질이 본 발명의 백신에 포함된 다당체-단백질 접합체에 사용하기 적합하다는 것을 당업자라면 알 수 있을 것이다. 적절한 캐리어 단백질은 포유동물에게 투여하기 안전하고, 캐리어로서 면역학적으로 효과적인 것일 수 있다. 안전성이란 1차 독성이 없고 알러지성 합병증의 위험을 최소화한다는 의미이다.
일반적으로, 임의의 이종 단백질은 캐리어 항원으로서 사용할 수 있다. 단백질은 예를 들어, 천연 독소 또는 탈독성화된 독소(톡소이드라고 칭하기도 함)일 수 있다. 또한, 독소와 항원적으로 유사하나 비-독성인 유전자적으로 변경된 단백질은 당업자들에게 공지된 변이 기술로 제조할 수 있다. 이 변경된 독소를 "교차 반응성 물질" 또는 CRM이라고 부른다. CRM197은 단 하나의 아미노산 잔기가 천연 디프테리아 독소와 다르고 천연 독소와 면역학적으로는 구별되지 않기 때문에 가치가 있다(앤더슨 피.더블유., Infect. Immun. 39:233-238(1983)).
백신의 다당체-단백질 캐리어 접합체는 여러 상이한 방법으로 제조할 수 있다는 것을 당업자라면 알 것이다. 다당체를 단백질 캐리어에 커플링시키는 공유 결합의 형태, 및 이를 생성하는 수단은 당업자들에게 공지되어 있다. 2개의 부분을 결합시킬 수 있는 화학적 수단에 관한 상세한 설명은 미국 특허 제5,371,197호 및 제4,902,506호에 개시되어 있으며, 본원에서 전체 내용을 참고로 인용하였다. 이중 하나의 방법은 쉬바르츠 및 그레이의 문헌[Arch. Biochim. Biophys. 181:542-549(1977)]에 개시되어 있는 환원성 아민화 방법이다. 이 방법은 환원성 협막 다당체 단편과 박테리아 독소 또는 톡소이드를, 시아노보로히드리드 이온 또는 다른 환원제의 존재하에서 반응시키는 단계를 포함한다. 이 방법은 독소 또는 톡소이드나 협막 다당체에 역효과를 미치지 않을 것이다(미국 특허 제4,902,506호). 접합 방법은 또한 하기 실시예 12 내지 14에 개시되어 있다.
파상풍 독소와 디프테리아 독소는 안전성 때문에 캐리어 단백질로 주로 사용되지만, 당업자들에게 공지된, 다른 단백질을 사용해야 하는 합당한 이유가 있을 수 있다. 예를 들어, 다른 단백질이 캐리어로서 더욱 효과적일 수 있으며, 생산 경제성이 우수할 수 있다. 기타 가능한 단백질로는 슈도모나스(Pseudomonas), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus) 퍼투시스(Pertussis) 및 에스케리치아 콜리를 비롯한 내독소 생성 박테리아가 있다. B군 수막염균 다당체를 접합시킬 수 있는 바람직한 캐리어 단백질은 B군 엔.멘인기티디스의 클래스 3 포린 단백질(PorB)이다. GAMP 항원 및 GCMP 항원을 접합시킬 수 있는 바람직한 캐리어 단백질은 파상풍 톡소이드이다.
GBMP의 면역원성은 인체, 특히 유아에서 제한되며, 파상풍 톡소이드에 B군 다당체의 직접적인 공유 결합은 토끼(제닝스 에이치.제이. 및 루고스키 씨. J.Immunol. 127:1011-1018(1981)) 또는 마우스(제닝스 에이치.제이.등, J.Immunol. 137:1708-1713(1986))에서 현저한 다당체-특이 응답을 유도할 수 없는 접합체를 형성한다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 실패는 B군 다당체의 직접적인 화학적 변형에 대한 관심을 자극하였다. 교차 반응성 B군 다당체-특이적 항체의 증가된 양을 생성시키는 방식으로 면역 응답을 조절할 수 있는 합성 에피토프를 제조하게 되었다(제닝스 에이치.제이. 등, J. Immunol. 137:1708-1713(1986)).
B군 다당체의 가능한 화학적 변형을 선택하는데(제닝스 에이치.제이. 등, J.Immunol. 137:1708-1713(1986)), 2가지 인자를 고려해야 한다는 것을 당업자라면 알 것이다. 먼저, 화학적 변형은 다당체의 분해를 최소로 하고 간편하게 조작할 수 있어야 한다. 둘째로, 교차 반응성 B 다당체-특이 항체를 제조하기 위해서, B군 다당체-특이적 항체에 대한 변형된 다당체의 항원성을 유지해야만 한다. B군 다당체의 이상적인 화학적 변형은 카르복실레이트 및 N-카르보닐기를 모두 보유하는 것이며(제닝스 에이치.제이. 등, J.Immunol. 137:1708-1713 (1986)), 당업자라면 이를 알 수 있을 것이다. 전술한 기준을 만족시키는 가장 바람직한 변형은 B군 다당체의 시알산 잔기의 N-아세틸기를 강염기로 제거하고 N-프로피오닐기로 대체하는 것이다(참고, 실시예 6 및 14).
더욱 바람직한 일양태에서, N-프로피오닐화된 GBMP는 결과적으로 캐리어 단백질에 접합된다. N-프로피오닐화된 GBMP의 면역원성을 증가시키는 임의의 캐리어 단백질을 사용할 수 있지만, 바람직한 단백질 캐리어는 B군 엔. 멘인기티디스의 클래스 3 외막 단백질(MB3 또는 PorB)이다.
따라서, 또 다른 바람직한 일양태에서, GBMP 항원은 N-프로피오닐화시킨 후 PorB에 접합시킨다.
A, B 또는 C군 수막염균 다당체일 수 있는 협막 다당체(CP)를 프라쉬 씨.이.의 문헌["Production and Control ofNeisseria meningitidisVaccines" in Bacterial Vaccines, 알란 알. 리스, 인코오포레이티드 p123-145(1990), 본원에서 참고로 인용하였다]에 따라 하기와 같이 분리하는 것이 바람직하다.
변형 프란츠(Franz) 배지에서 10시간 내지 20 시간동안 유기체를 증식
↓ 55℃, 10분동안 가열하여 사멸
원심분리에 의해 불활성화된 세포를 제거
↓ 0.1%로 세타브론(Cetavlon) 첨가
배양 브로스로부터 CP 침전
↓ 1M로 염화칼슘 첨가
CP 용해시킨 후 원심분리하여 세포 조각을 제거
↓ 25%로 에틸 알코올 첨가
원심분리에 의해 침전된 핵산 제거
↓ 80%로 에틸 알코올 첨가
미정제 CP를 침전시키고 알코올 제거
이어서, 미정제 CP를 묽은 산, 예를 들어 아세트산, 포름산 및 트리플루오로아세트산(0.01-0.5N)을 사용하여 부분적인 해중합시킨 후에 겔 여과 크로마토그래피로 추가 정제하여 10,000∼20.000의 평균 분자량을 갖는 다당체 혼합물을 제공한다. CP가 GBMP인 경우, 정제된 GBMP를 나트륨 보로히드리드의 존재하에 NaOH로 N-탈아세틸화시킨 후, N-프로피오닐화시켜 N-Pr GBMP를 제공한다. 따라서, 본 발명의 접합체 백신에 사용할 수 있는 CP는, CP-포린 단백질 접합체의 일부분으로 사용한 경우 활성 면역을 유도하는 한 CP 단편, N-탈아세틸화된 CP 및 이의 단편 뿐만 아니라 N-Pr CP 및 이의 단편일 수 있다(실시예 6 및 14).
추가의 바람직한 일양태에서, 본 발명은 전술한 외막 수막염균 B군 포린 단백질 또는 이의 융합 단백질을 얻는 단계; 나이세리아 멘인기티디스 유기체로부터 CP를 얻는 단계; 및 단백질을 CP에 접합시키는 단계를 포함하는 다당체 접합체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 접합체는 환원성 아민화에 의해 포린의 1차 아미노기에 CP의 환원성 말단기를 반응시키므로써 형성할 수 있다. 환원성기는 선택적 가수분해 또는 특정 산화성 절단, 또는 이 둘의 조합에 의해 수행될 수 있다. CP는 참고로 인용한 제닝스 등의 미국 특허 제4,356,170호에 개시된 방법으로 포린 단백질에 접합시킬 수 있으며, 페리오데이트로 CP의 산화를 조절한 후 포린 단백질로 환원성 아민화시키는 것을 포함한다.
본 발명의 백신은 투여 경로에 따라 유효량의 수막염균 B군 포린 단백질, 융합 단백질 또는 접합체 백신, 또는 3가 GAMP, GBMP 및 GCMP 백신을 포함한다. 피하 또는 근육내 투여 경로가 바람직하지만, 본 발명의 수막염균 B군 포린 단백질, 융합 단백질 또는 백신을 복강내 또는 정맥내 경로로 투여할 수 있다. 당업자라면 과도한 실험을 하지 않고 임의의 특정 치료 계획안에 따른 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 적절한 양은 체중 1㎏ 당 2㎍∼100㎍의 범위내에 있는 것으로 예상된다.
따라서, 바람직한 양태에서, 백신은 약 2㎍의 GAMP, GCMP 및 GBMP 다당체 항원 접합체를 포함한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 백신은 약 5㎍의 GAMP, GCMP 및 GBMP 다당체 항원 접합체를 포함한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 백신은 약 2㎍의 GAMP 및 GCMP 다당체 항원 접합체와, 약 5㎍의 GBMP 다당체 항원 접합체를 포함한다.
본 발명의 백신은 경구 투여용 캡슐, 액체 용액, 현탁액 또는 엘릭시르 형태, 또는 용액이나 현탁액과 같은 무균 액체 형태로 사용할 수 있다. 임의의 불활성 캐리어는 염수, 포스페이트-완충된 염수, 또는 수막염균 B군 포린 단백질, 융합 단백질 또는 접합체 백신이 적절한 가용 특성을 갖는 임의의 캐리어를 사용하는 것이 바람직하다. 백신은 집단 백신화 계획에 사용할 수 있는 단일 복용 제제 형태 또는 다중-복용 플라스크일 수 있다. 백신의 제조 방법과 이용 방법은 문헌[레밍톤의 Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, Osol(ed.)(1980); 및 New Trends and Developments in Vaccines, Voller 등(ed.), 메릴랜드주 발티모너에 소재하는 유니버시티 파크 프레스]을 참고하였다.
본 발명의 백신은 또한 포린-특이 항체의 생성을 증가시키는 보조제를 더 포함할 수 있다. 보조제로는 프로인트 완전 보조제(CFA)와 같은 각종 오일 제제, 스테아릴 티로신(ST, 참고 미국 특허 제4,258,029), MDP로 알려진 디펩티드, 사포닌, 수산화 알루미늄 및 림프 시토킨이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
프로인트 보조제는 면역원성 물질과 혼합된 광유 및 물의 유화액이다. 프로인트 보조제가 유용하기는 하지만, 일반적으로 인체에 투여하지는 않는다. 대신, 보조제 백반(수산화 알루미늄) 또는 ST를 인체 투여용으로 사용할 수 있다. 수막염균 B군 포린 단백질 또는 이의 접합체 백신은 주사후에 서서히 방출되는 수산화 알루미늄상에 흡착시킬 수 있다. 수막염균 B군 포린 단백질 또는 A군, B군 및 C군 수막염균 다당체 접합체 백신은 풀레톤 등의 미국 특허 제4,235,877호에 따라 리포좀내에 캡슐화시킬 수 있다.
또 다른 바람직한 일양태에서, 본 발명은 전술한 방법으로 제조한, 면역 응답을 유도하기 위한 유효량의 본 발명의 백신을 동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 동물의 면역 응답을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 3 양태에서, 본 발명은 형질 전환된 이.콜리를 용균시켜 수막염균 B군 포린 단백질 또는 융합 단백질을 불용성 봉입체의 일부로서 방출시키는 단계; 봉입체를 완충액으로 세척하여 오염성 이.콜리 세포 단백질을 제거하는 단계; 변성제 수용액중에 봉입체를 재현탁 및 용해시키는 단계; 세정제로 생성 용액을 희석하는 단계; 가용화된 수막염균 B군 포린 단백질을 겔 여과법으로 정제하는 단계를 포함하여, 전술한 외막 수막염균 B군 포린 단백질 또는 융합 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다.
당업자들에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어 초음파, 효소 분해, 삼투압 쇼크 또는 면포 압축 통과에 의해 용균 단계를 수행할 수 있다.
수막염균 B군 포린 단백질을 포함하는 봉입체를 가용화시키지 않고 이.콜리 세포 단백질을 용해시킬 수 있는 임의의 완충액으로 봉입체를 세척할 수 있다. 이 완충액에는 TEN 완충액(50mM 트리스 HCl, 1mM EDTA, 100mM NaCl, pH8.0), 트리신, 비신 및 HEPES를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시에 사용할 수 있는 변성제는 2M 내지 8M의 우레아 또는 약 2M 내지 6M의 구아니딘 HCl, 더욱 바람직하게는 4M 내지 8M 우레아 또는 약 4M 내지 6M 구아니딘 HCl, 가장 바람직하게는 약 8M 우레아 또는 약 6M 구아니딘 HCl을 포함한다.
가용화된 수막염균 B군 포린 단백질을 희석시키는데 사용할 수 있는 세정제의 예로는 SDS 및 세타브론(칼바이오켐)과 같은 이온계 세정제; Tween, Triton X, Brij 35 및 옥틸 글루코시드와 같은 비이온계 세정제; 및 3,14-쯔비터젠트(Zwittergent), 엠피겐 BB 및 Champs와 같은 쯔비터이온성 세정제가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
마지막으로, 가용화된 외막 수막염균 B군 포린 단백질을 겔 여과시켜 정제하여 고 분자량 물질과 저 분자량 물질을 분리한다. 여과 겔의 유형은 Sephacryl-300, Sepharose CL-6B, 및 Bio-Gel A-1.5m을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 칼럼은 가용화된 단백질을 희석시키기 위해 사용한 완충액으로 용출시킨다. 이어서, 포린 또는 이의 융합체를 포함하는 분획물을 겔 전기영동으로 동정하고, 분획물을 모은 후, 투석하고 농축시켰다.
최종적으로, 농축된 분획물을 Q 세파로스 고 성능 칼럼을 통해 거의 순수한(>95%) 포린 단백질 및 융합 단백질을 통과시키면 얻을 수 있다.
본 발명의 제4양태에서, 본 발명은 유도성이고, T7 프로모터를 포함하는 벡터의 일부분인 수막염균 B군 포린 단백질 유전자의 발현에 관한 것이다. 프로모터가 유도성 프로모터인 경우, 전사 속도는 유도제에 반응하여 증가한다. T7 프로모터는 배양 배지에 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 첨가하여 유도할 수 있다. 대안적으로, Tac 프로모터 또는 열처리 프로모터를 사용할 수 있다. 수막염균 B군 포린 단백질 유전자를 pET-17 발현 벡터 또는 pET-11a 발현 벡터로부터 발현시키는 것이 바람직하며, 이 두 개의 발현 벡터는 모두 T7 프로모터를 포함한다.
결찰을 위한 평활-말단화된 또는 파상-말단화된 터미날, 적절한 터미날을 제공하기 위한 제한 효소 분해, 점착말단의 적절한 충전, 바람직하지 않은 결합을 피하기 위한 알카리 포스파타제 처리, 및 적절한 리가아제로 결찰시키는 것을 비롯하여, 종래의 기술로 발현 벡터내로 수막염균 B군 포린 단백질 유전자 또는 융합 유전자를 클로닝시킬 수 있다. 클로닝의 일반적인 방법은 문헌[삼브룩 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor, 뉴욕, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]을 참조하였다.
본 발명에 따라 발현된 수막염균 B군 포린 단백질 및 융합 단백질을 적절히 재중첩시켜 천연 단백질의 면역학적 특성을 갖는 구조를 얻을 수 있다. 본 발명의 제5양태에서, 본 발명은 형질 전환된 세포를 용균시켜 수막염균 B군 포린 단백질 또는 융합 단백질을 불용성 봉입체의 일부로서 방출하는 단계; 봉입체를 완충액으로 세척하여, 오염성 세포 단백질을 제거하는 단계; 변성제 수용액에 봉입체를 재현탁 및 용해시키는 단계; 세정제로 생성 용액을 희석시키는 단계; 및 겔 여과로 가용화된 수막염균 B군 포린 단백질 또는 융합 단백질을 정제하여 용리제내에 재중첩된 단백질을 제공하는 단계를 포함하여, 전술한 외막 단백질 및 융합 단백질을 재중첩시키는 방법에 관한 것이다. 놀랍게도, 중첩된 삼량체 수막염균 B군 클래스 2 및 클래스 3 포린 단백질 및 융합 단백질을 겔 여과 칼럼으로부터 용리제내에서 직접 얻을 수 있는다는 것을 발견하였다.
본 발명의 또 다른 바람직한 일양태에서, 본 발명은 전술한 방법으로 제조한 거의 순수한 재중첩된 외막 수막염군 B군 포린 단백질 및 융합 단백질에 관한 것이다. 일반적으로, 거의 순수한 단백질이란 예를 들어 전기 영동법에 의해 확인되는 나이세리아 멘인기티디스 기타 세포 성분이 없는 단백질이다. 거의 순수한 단백질은 쿠마씨 블루 또는 실버 착색제로 염색한 후에 전기영동 겔에서 농도계로 측정했을 때 >95%의 순도를 갖는다.
하기 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 예시하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 기술 분야에서 일반적으로 사용하는 각종 조건 및 변수의 기타 적절한 변형 및 적용이 당업자들에게는 분명할 것이며, 본 발명의 취지 및 범위내에 있다.
본 발명의 개요
본 발명의 총괄적인 목적은 수막염균 B군 포린 단백질, 특히 클래스 3 포린 단백질을 효모에서 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1목적은 하기 (a) 내지 (e)단계를 포함하여, 효모에서 외막 수막염균 B군 포린 단백질 또는 이의 융합 단백질을 발현시키는 방법을 제공하는 것이며, 발현된 단백질은 효모에서 발현된 총 단백질의 약 2% 이상을 차지한다:
(a) (i) 성숙 포린 단백질,
(ii) 효모 분비 시그널 펩티드에 융합된 성숙 포린 단백질인 융합 단백질로 구성된 군에서 선택된 단백질을 암호하는 유전자를, 선택성 표지를 갖는 플라스미드내로 클론시키는 단계(상기 유전자는 효모 프로모터에 작동가능하게 결합됨);
(b) 상기 유전자를 함유하는 플라스미드로 효모 균주를 형질전환시키는 단계;
(c) 상기 형질전환된 효모를 선택할 수 있는 배양 배지에서 효모를 증식시켜 형질전환된 효모를 선택하는 단계;
(d) 형질전환된 효모를 증식시키는 단계; 및
(e) 상기 단백질의 발현을 유도하여 단백질을 함유하는 효모를 제공하는 단계.
본 발명의 제2목적은 성숙 단백질 또는 이의 융합 단백질을 발현시키는 방법을 제공하는 것이며, 이렇게 발현된 단백질은 효모에서 발현된 총 단백질의 약 3 내지 5%를 차지한다.
본 발명의 제3목적은 단백질이 나이세리아 멘인기티디스 외막의 수막염균 B군 포린 단백질(MB3)인, 성숙 포린 단백질을 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제4목적은 효모 프로모터가 AOX1 프로모터인, 성숙 포린 단백질 또는 이의 융합 단백질을 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제5목적은 효모 분비 시그널 펩티드가 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) α-접합 인자 프리프로(prepro)-펩티드의 분비 시그널과 피. 파스토리스(P. pastoris) 산 포스파타아제 유전자(PHO)의 분비 시그널로 구성된 군에서 선택되는, 외막 수막염균 B군 포린 단백질 또는 이의 융합 단백질을 효모에서 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제6목적은 플라스미드가 pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC9 및 pPIC9K로 구성된 군에서 선택되는, 전술한 바와 같이 MB3 또는 이의 융합 단백질을 효모에서 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제7목적은 단백질을 암호하는 유전자의 5' 영역의 하나 이상의 코돈을 변경하여 효모 코돈용으로 최적화시킨, 전술한 수막염균 B군 포린 단백질 또는 융합 단백질을 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제8목적은 단백질을 암호하는 유전자의 5' 영역이 피. 파스토리스 코돈용으로 최적화된 코돈을 도입시킨 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 전술한 수막염균 B군 포린 단백질 또는 융합 단백질을 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제9목적은 코돈 변경이 하기로 구성된 변경 군에서 선택되는 전술한 바와 같은 방법을 제공하는 것이다:(자연 서열의 위치 4∼6에서 GTT를 GTC로), (자연 서열의 위치 7∼9에서 ACC를 ACT로), (자연 서열의 위치 10∼12에서 CTG를 TTG로), (자연 서열의 위치 16∼18에서 GGC를 GGT로), (자연 서열의 위치 19∼21에서 ACC를 ACT로), (자연 서열의 위치 22∼24에서 ATC를 ATT로), (자연 서열의 위치 25∼27에서 AAA를 AAG로), (자연 서열의 위치 28∼30에서 GCC를 GCT로), (자연 서열의 위치 31∼33에서 GGC를 GGT로), (자연 서열의 위치 34∼36에서 GTA를 GTT로), (자연 서열의 위치 37∼39에서 GAA를 GAG로); 상기 위치는 단백질을 암호하는 자연 뉴클레오티드 서열의 제1 뉴클레오티드로부터 번호매김한 것이다.
본 발명의 제10목적은 유전자의 5'영역이 피.파스토리스 코돈용으로 최적화된 코돈을 포함하고, 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 26인, 전술한 바와 같은 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제11목적은 효모가 단백질 또는 융합 단백질을 분비하는, 전술한 단백질을 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제12목적은 분비 단백질이 발현되는 벡터가 pHIL-S1, pPIC9 및 pPIC9K로 구성된 군에서 선택되는, 전술한 단백질을 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제13목적은 하기의 단계 (a) 내지 (e)를 포함하여, 본 발명에 따라 얻은 불용성이고, 세포내 외막 수막염균 B군 포린 단백질 또는 이의 융합 단백질을 정제하는 방법을 제공하는 것이다:
(a) 단백질을 발현하는 전술한 효모를 용균시켜 불용성 막 결합 분획물로서 상기 단백질을 방출하는 단계;
(b) 단계(a)에서 얻은 불용성 물질을 완충액으로 세척하여 오염성 효모 세포 단백질을 제거하는 단계;
(c) 단계(b)에서 얻은 불용성 분획물을 변성제 수용액에 현탁 및 용해시키는 단계;
(d) 단계(c)에서 얻은 용액을 세정제로 희석시키는 단계; 및
(e) 상기 단백질을 겔 여과법 및 이온 교환 크로마토그래피로 정제시키는 단계.
본 발명의 제14목적은 하기 (a) 내지 (f)단계를 포함하여, 본 발명에 따라 얻은 외막 수막염균 B군 포린 단백질 또는 이의 융합 단백질을 정제하는 방법을 제공하는 것이다:
(a) 단백질을 발현하는 전술한 효모 배양액을 원심분리하여 가용성 분비 물질로서 단백질을 분리하는 단계;
(b) 약 20% 에탄올로 불순물을 침전시켜 단계(a)에서 얻은 가용성 분비 물질로부터 오염성 효모 배양 불순물을 제거하는 단계(가용성 분비 물질은 가용성 분획물에 잔존한다);
(c) 단계(b)의 가용성 분획물로부터 분비 물질을 약 80% 에탄올로 침전시키는 단계;
(d) 단계(c)에서 얻은 침전 물질을 완충액으로 세척하여 오염성 효모 분비 단백질을 제거하는 단계;
(e) 단계(d)에서 얻은 침전 물질을 세정제 수용액에 현탁 및 용해시키는 단계; 및
(f) 이온 교환 크로마토그래피로 단백질을 정제시키는 단계.
본 발명의 제15목적은
(a) 성숙 포린 단백질 및
(b) 효모 분비 시그널 펩티드에 융합된 성숙 포린 단백질인 융합 단백질로 구성된 군에서 선택된 단백질을 암호하는 유전자(유전자는 효모 프로모터에 작동가능하게 결합됨)를 포함하는 효모 숙주 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 제16목적은 혈청군 B의 나이세리아 멘인기티디스 성숙 외막 클래스 3 단백질(MB3)을 발현할 수 있는 전술한 바와 같은 효모 숙주 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 제17목적은 효모 프로모터가 AOX1 프로모터인 전술한 바와 같은 효모 숙주 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 제18목적은 A군 수막염균 다당체(GAMP), B군 수막염균 다당체(GBMP) 및 C군 수막염균 다당체(GCMP) 항원과 함께, 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 제19목적은 포유동물에게 면역 응답을 유도하기에 충분한 양으로 전술한 백신을 투여하는 단계를 포함하여, 포유 동물에서 면역 응답을 유도하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적 및 장점은 하기의 상세한 설명으로부터 분명해질 것이다.
실시예 1
B군 나이세리아 멘인기티디스로부터 클래스 3 포린 단백질의 클로닝
재료 및 방법
유기체:B군 나이세리아 멘인기티디스 균주 8765(B:15:P1,3)을 벤델 졸링거 박사(연구를 위한 발터 리드 아미 인스티튜트)로부터 얻어, 30℃에서 유지되는 항온기내의 촛불 소멸병 중 전술한 아가 배지에서 증식시켰다(스완슨 제이.엘., Infect. Immun. 21:292-302(1978)). 에스케리치아 콜리 균주 DME558(에스. 벤슨의 수집물로부터; 실하비 티.제이. 등, "Experments with Gene Fusions," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1984), BRE51(브레메, 이. 등, FEMS Microbiol. Lett. 33:173-178(1986)) 및 BL21(DE3)을 37℃의 LB 아가 평판에서 증식시켰다.
P1 형질 도입:이.콜리 균주 DME558의 Plvir용균물을 사용하여 전체 ompA 유전자가 결실된 균주 BRE51(브레머 이. 등, FEMS Microbiol. Lett. 33:173-178(1986))에 테트라사이클린 내성 표지를 형질도입시켰다(실하비 티.제이. 등, "Experments with Gene Fusions," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)). ompA 유전자 근위에 테트라사이클린 내성 표지를 포함하는 균주 DME558를, 600nm에서 약 0.6 OD의 밀도에 도달할 때까지 LB 배지에서 증식시켰다. 0.1㎖의 0.5M CaCl2를 10㎖의 배양액과 P1vir1×109PFU를 함유하는 용액 0.1㎖에 첨가하였다. 배양액을 37℃에서 3시간 동안 항온처리하였다. 이 후, 박테리아 세포 밀도는 명백하게 감소하였다. 0.5㎖의 클로로포름을 첨가하고 파지 배양액을 4℃에서 저장하였다. 전형적으로 이.콜리 염색체의 1%∼2%가 각 파지에서 패키징될 수 있기 때문에, 생성된 수 많은 파지가 ompA 유전자에 밀접한 테트라사이클린 내성 표지를 비롯하여 전체 박테리아 염색체를 덮는다.
이어서, ompA 유전자가 결핍된 균주 BRE51을 37℃에서 밤새 LB 배지에 증식시켰다. 밤새 배양액을 새로운 LB 배지내에 1:50으로 희석하여 2 시간 동안 증식시켰다. 세포를 원심분리하여 제거하고, MC 염에 재현탁시켰다. 0.1㎖의 박테리아 세포를 전술한 파지 용균물 0.05와 혼합하고 실온에서 20분 동안 항온처리하였다. 이후, 동일한 부피의 1M 구연산 나트륨을 첨가하고, 박테리아 세포를 12.5㎍/㎖의 테트라사이클린을 함유하는 LB 평판상에서 평판배양시켰다. 평판을 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 테트라사이클린 내성(12㎍/㎖) 형질 도입체를 전술한 바와 같이 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석으로 OmpA 단백질 발현의 결핍을 검색하였다. 항생제에 대한 내성이 있는 박테리아는 ompA 유전자가 이 균주로부터 결실된 바로 그 부근의 염색체내로 통합된 테트라사이클린 내성 유전자를 갖는다. 하나의 특정 균주를 BRE-TR로 명명하였다.
이어서, 전술한 방법과 동일한 방법을 사용하여, 균주 BRE-TR로 파지 생성의 제2단계를 수행하였다. 대표적인 파지 개체군은 테트라사이클린 내성 유전자 및 OmpA 결실을 모두 포함한다. 이들 파지는 수거된 후 저장된다. 이어서, 이들 파지를 사용하여 이.콜리 BL21(DE3)를 감염시켰다. 감염 후에, 박테리아는 테트라사이클린 내성 표지를 포함한다. 또한, OmpA 결실이 테트라사이클린을 함유하는 LB 평판에서 선택될 가능성이 높다.
평판에서 증식한 박테리아 콜로니를 별도로 LB 배지에서 증식시키고, OmpA 단백질의 존재를 시험하였다. 시험용으로 선택된 콜로니는 모두 SDS-PAGE 웨스턴 블롯에서 항체 반응성으로 판단할 때 OmpA 단백질이 결핍되어 있었다.
SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯:SDS-PAGE는 전술한 바와 같이(블레이크 및 고츠리히, J. Exp. Med. 159:452-462 (1984)), 라엠리의 방법(라엠리 유.케이., Nature 227:680-685(1970))의 변형이다. 임모빌론(Immobilon) P(매사츄세츠주 베드포드에 소재하는 밀리포어 코포레이션)로의 전기 영동 이동은, 먼저 종이를 메탄올로 적신 것을 제외하고는 토우빈 등의 문헌[토우빈 에이치. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4353(1979))에 개시된 방법으로 수행하였다. 웨스턴 블롯은 포스파타제 결합된 시약으로 탐침시켰다(블레이크 엠.에스. 등, Analyt. Biochem. 136:175-179(1984)).
폴리머라제 연쇄 반응:피버스 등(피버스 아이.엠. 등, Infect. Immun. 60:3620-3629(1992))의 방법을 사용하여 PorB를 암호하는 유전자를 증폭시켰다. 전술한 바와 같이(피버스 아이.엠. 등, Infect. Immun. 60:3620-3629(1992)), 선택된 프라이머는 프라이머 33(GGG GTA GAT CTG CAG GTT ACC TTG TAC GGT ACA ATT AAA GCA GGC GT) 및 프라이머 34(GGG GGG GTG ACC CTC GAG TTA GAA TTT GTG ACG CAG ACC AAC)였다. 요약하면, 반응 성분은 하기와 같다: 수막염균 균주 8765 염색체 DNA(100ng/㎕), 1㎕; 5' 및 3' 프라이머(1μM) 각각 2㎕; dNTP(10mM 저장물), 각각 4㎕; 10 X PCR 반응 완충액(100mM 트리스 HCl, 500mM KCl, pH8.3), 10㎕; 25mM MgCl2, 6㎕; 2회 증류시킨 H2O, 62㎕; 및 Taq 폴리머라아제(세투스 코포레이션, 5μ/㎕) 1㎕. 0℃로 설정한 라우다(Lauda) 4/K 메탄올/물 냉각 시스템(뉴욕주 웨스트버리에 소재하는 브링크만 인스트루멘츠 인코포레이티드)에 연결된 GTC-2 제네틱 써모사이클러(일리노이주 시카고에 소재하는 프리시젼 인스트. 인코포레이티드)에서 반응을 수행하였다. 써모사이클러는 94℃, 2분; 40℃, 2분; 및 72℃, 3분을 30회 사이클로 프로그램하였다. 30 사이클이 끝난 후에, 반응을 72℃에서 3분간 연장하고, 최종적으로 매니아티스의 문헌[매니아티스 티. 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labortory, Cold Spring Harbor, NY(1982)]에 개시된 바와 같이 TAE 완충액중 1% 아가로스 겔에서 분석 준비가 완료될 때까지 4℃로 유지시켰다.
PCR 생성물의 서브클로닝:pET-17b 플라스미드(노바겐 인코포레이티드)를 서브클로닝에 사용하고, 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 및 XhoI(매사츄세츠주 비버리에 소재하는 뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드)로 플라스미드를 2중 분해하여 제조하였다. 이어서, 분해된 말단을 소 내장 알카리 포스파타제(인디아나주 인디아나폴리스에 소재하는 보에링거 만하임)로 탈인산화시켰다. 그 후, 분해된 플라스미드를 1% 아가로스 겔에서 분석하고, 절단 플라스미드를 제거한 후, GeneClean 키트(캘리포니아주 라 졸라에 소재하는 바이오101)를 사용하여 정제하였다. PCR 생성물을 페놀-클로로포름, 클로로포름으로 추출하고, 마지막으로 GeneClean 키트(바이오 101)를 사용하여 정제하였다. PCR 생성물을 제한 엔도뉴클레아제 BglII 및 XhoI(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드)로 분해하였다. 이어서, DNA를 페놀-클로로포름으로 추출하고, 0.1부피의 3M 아세트산 나트륨, 5㎕ 글리코겐(20㎍/㎕), 및 2.5 부피의 에탄올을 첨가하여 침전시켰다. DNA를 70% 에탄올(vol/vol)로 세척한 후, TE 완충액에 재용해시켰다. 분해된 PCR 생성물은 16℃에서 밤새 표준 T4 리가아제 과정을 사용하여 전술한 2중 분해된 pET-17b 플라스미드에 결찰시켰다(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 뉴욕(1993)). 이어서, 정 등(정 씨.티. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2172-2175(1989))의 방법으로 제조된 능력 세포인 전술한 BL21(DE3) ΔompA 내로 결찰 생성물을 형질 전환시켰다. 50㎍/㎖의 카르베니실린 및 12㎍/㎖의 테트라사이클린을 포함하는 LB 평판에서 형질 전환체를 선택하였다. 몇 개의 형질 전환체를 선택하고, 30℃에서 6시간 동안 카르베니실린 및 테트라사이틀린을 모두 함유하는 LB에서 배양시킨 후, IPTG를 첨가하여 플라스미드 유전자 발현을 유도하였다. 온도를 37℃로 증가시키고 추가의 2시간 동안 더 배양하였다. 각 배양액의 세포를 원심분리로 수거하고, 전체 세포 용균물을 제조한 후, 모든 나이세리아 포린과 반응하는 모노클론 항체(4D11)를 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
뉴클레오티드 서열 분석:클론된 클래스 3 포린 유전자 DNA의 뉴클레오티드 서열을 변성된 2본쇄 플라스미드 DNA를 주형으로 사용하여 전술한 바와 같이 디데옥시 방법으로 결정하였다(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 뉴욕(1993)). 서열 II 키트(오하이오주 클리브랜드에 소재하는 미국 바이오케미칼 코포레이션)를 제조 지침서에 따라 사용하였다. 3개의 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머(캘리포니아 알라메다에 소재하는 오페론 테크놀러지 인코포레이티드)를 이들 반응에 사용하였다. 5'TCAAGCTTGGTACCGAGCTC로 된 5' 말단용의 1개와, 5'TTTGTTAGCAGCCGGATCTG 및 5'CTCAAGACCCGTTTAGAGGCC로 된 3' 말단용 2개. 중첩시, 네스트(nest)된 결실부를 제한 엔도뉴클레아제 Bpu11021로 플라스미드 DNA를 선형화하여 만들고, 말단을 티오-dNTP 및 클레노우 폴리머라제를 첨가하여 평활화시킨다(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 뉴욕(1993)). 이어서 선형화된 플라스미드를 제한 엔도뉴클레아제 XhoI로 절단하고 exoII/녹두 뉴클레아제 결실 키트를 사용하여 공급자에 의해 지시받은 대로 플라스미드의 3' 결실부(캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타젠 인코포레이티드)를 만들었다. 이 방법의 지도는 도 1에 도시하였다.
PorB 유전자 생성물의 발현 및 정제:무균 마이크로피펫 팁을 사용하여, PorB pET-17b 플라스미드를 함유하는 BL21(DE3)-ΔompA의 단일 콜로니를 선택하고 50㎍/㎖ 카르베니실린을 함유하는 10㎖의 LB 브로스내로 접종하였다. 배양물을 진탕하면서 30℃에서 밤새 항온처리하였다. 이어서, 10㎖의 밤새 항온처리한 배양물을, 카르베니실린의 동일한 농도를 포함하는 1ℓ의 LB 브로스에 무균적으로 첨가하고, OD600이 0.6 내지 1.0에 도달할 때까지 배양액을 37℃의 항온조에서 계속 진탕하였다. IPTG(100mM)의 저장 용액 3㎖를 배양액에 첨가하고, 배양액을 30분 더 항온처리하였다. 이어서, 리팜피신을 첨가하고(5.88㎖의 저장액; 메탄올중 34mg/㎖), 2시간 더 배양하였다. GS3 로터에서 10,000rpm, 10분 동안 원심분리하여 세포를 수거하고 칭량하였다. 세포의 습윤 중량 1g당 3㎖의 TEN 완충액(50mM 트리스 HCl, 1mM 트리스 HCl, 1mM EDTA, 100mM NaCl, pH 8.0)에 세포를 완전하게 재현탁시켰다. 여기에 세포의 습윤 질량 1g당 8㎕의 PMSF 저장액(무수 에탄올중 50mM) 및 80㎕의 리소자임 저장액(물중 10mg/㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 20분 동안 실온에서 교반하였다. 교반하면서, 세포의 습윤 질량 1g당 4mg의 데옥시콜레이트를 첨가하였다. 혼합물을 37℃의 수조에 두고 유리 막대기로 교반하였다. 혼합물에 점성이 생기면, 습윤 세포 1g당 20㎕의 DNase I 저장액(1mg/㎖)를 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 수조에서 제거하고, 용액이 더 이상 점성을 갖지 않을 때까지 실온에 두었다. 이어서, 혼합물을 SS-34 로터에서 15,000rpm, 20분 동안, 4℃에서 원심분리하였다. 펠렛을 유지하고 TEN 완충액으로 2회 철저하게 세척하였다. 이어서, 0.1mM PMSF 및 8M 우레아를 함유하는 새로 제조한 TEN 완충액에 재현탁시키고 배스 초음파기(뉴욕주, 플레인 뷰에 소재하는 힛 시스템즈 인코포레이티드)로 초음파 처리하였다. BCA 키트(일리노이주 록빌에 소재하는 피어스)를 사용하여 단백질 농도를 측정하고 TEN-우레아 완충액을 사용하여 10mg/㎖ 미만으로 단백질 농도를 조정하였다. 이어서, 샘플을 10%(중량/부피) 쯔비터젠트 3,14(캘리포니아주 라 졸라에 소재하는 칼바이오켐)로 1:1 희석하고, 초음파 처리한 후, Sephacryl S-300 분자체 칼럼상에 적재하였다. Sephacryl S-300(2.5㎝×200㎝)을 100mM 트리스 HCl, 200mM NaCl, 10mM EDTA, 0.05% 쯔비터젠트 3,14 및 0.02% 아지드, pH8.0으로 미리 평형시켰다. 칼럼 유속을 8㎖/시간으로 조정하고 10㎖의 분획을 수거하였다. 각 분획물의 OD280를 측정하고 SDS-PAGE 분석을 단백질을 함유하는 분획물에서 수행하였다.
억제 ELISA 분석:0.02% 아지드와 0.1M 카보네이트 완충액, pH9.6에서 야생형 균주 8765로부터 정제된 PorB(2㎍/㎖)의 웰당 0.1㎖를 첨가하여 미세역가 평판(일리노이주 나페빌에 소재하는 넌크-이뮤노 플레이트 IIF, 넌크 인코포레이티드)을 감작시켰다. 이 평판을 실온에서 밤새 항온처리하였다. 평판을 0.9% NaCl, 0.05% Brij 35, 10mM 아세트산 나트륨 pH 7.0, 0.02% 아지드로 5회 세척하였다. 유형 15 클래스 3 PorB 단백질에 대해 발생된 인체 면역 혈청을 뉴욕주 뉴욕, 메모리알-슬로안 케터링 암 센터의 닥터 필립 오. 리빙스톤으로부터 얻었다. 인체 면역 혈청을 0.5% Brij 35를 함유하는 PBS로 희석하고, 평판에 첨가하고 2시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 전과 같이 평판을 다시 세척하고, 2차 항체, 즉 알카리 포스파타제 접합된 염소 항-인체 IgG(캘리포니아주 버린게임에 소재하는 타고 인코포레이티드)를 PBS-Brij에서 희석하고, 평판에 첨가한 후 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 평판을 전과 같이 세척하고, 0.1 디에탄올아민, 1mM MgCl2, 0.1mM ZnCl2, 0.02% 아지드, pH 9.8중 p-니트로페닐 포스페이트를 첨가하였다. 평판을 37℃에서 1시간 동안 항온처리하고 Elida-5 미세역가 평판 판독기(뉴욕주 뉴욕에 소재하는 피지카)를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군의 웰은 1차 및/또는 2차 항체가 결핍되어 있었다. 이를 수행하여 ELISA 분석에서 최대의 1/2의 번역을 제공하는 각각의 인체 혈청에 대해 역가를 얻었다. 각각의 인체 혈청에 대한 역가는 억제 ELISA에서 사용할 것이다. ELISA 미세역가 평판을 정제된 야생형 PorB 단백질로 감작시키고 전술한 바와 같이 세척한다. 별도의 V-96 폴리프로필렌 미세역가 평판(넌크 인코포레이티드)에서, 정제된 야생형 PorB 단백질 또는 정제된 재조합 PorB 단백질의 양을 다양하게 하여 총 75㎕의 부피로 첨가하였다. 인체 혈청을 PBS-Brij 용액에서 희석하여 최대의 1/2 역가를 2배로 하고, 75㎕를 PorB 또는 재조합 PorB 단백질을 함유하는 각각의 웰에 첨가하였다. 이 평판을 실온에서 2 시간 동안 항온 처리하고 미세역가 평판 캐리어가 장착된 Sorvall RT6000 냉장 원심 분리기(델러웨어주 윌밍톤)로 3000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. V자의 것은 피하면서, 각각의 웰로부터 100㎕를 분리하고, 감작되고 세척된 ELISA 미세역가 평판으로 이동시켰다. ELISA 평판을 2시간 더 항온처리하고, 세척한 후 접합된 2차 항체를 전과 같이 첨가하였다. 이어서, 전술한 바와 같이 평판을 처리하고 판독하였다. 이어서, 전술한 바와 같이 억제율(%)을 처리하여 판독한다. 억제율(%)을 하기와 같이 계산하였다:
결과
폴리머라제 연쇄 반응 및 서브클로닝:
추가의 항원성 및 생체물리학적 형질을 위해 용이하게 클론하고, 유전자적으로 조작하여, 결국 임의의 수의 여러 나이세리아 포린 유전자로부터 충분히 순수한 포린 단백질을 얻는 방법이 개발되어 왔다. 이를 위한 제1단계는 나이세리아로부터 포린 유전자를 클로닝하는 것이다. 원래 피버스 등의 문헌[피버스 아이.엠.등, Infect. Immun. 60:3620-3629(1992))에 의해 개시된 기술을 사용하여, 클래스 3, 혈청형 15 포린으로부터 성숙 포린 단백질의 DNA 서열을, PCR 반응의 주형으로서 수막염균 균주 8765의 염색체로 증폭시켰다. 적절한 엔도뉴클레아제 제한 부위를 올리고뉴클레오티드 프라이머의 말단상에서 합성하여, 절단시 증폭된 성숙 포린 서열을 직접 결찰시키고 선택된 발현 플라스미드내로 클론시켰다. 30사이클 후, 도 2에 도시된 바와 같이 PCR 생성물을 얻었다. 이미 연구된 대로(피버 아이.엠. 등, Infect. Immun. 60:3620-3629(1992)), 주 생성물은 900bp 내지 1000bp 사이로 이동하였다. 그러나, PCR을 낮은 어닐링 스트린젠시(annealing stringencies)하에서 수행하더라도(40℃, 50mM KCl) 고분자량의 생성물은 관찰되지 않는다.
다량의 클론된 포린 단백질을 제조하기 위해서, 스튜디어 등[스튜디어 및 모파트, J. Mol. Biol. 189:113-130(1986))의 엄격하게 조절되는 발현 시스템을 사용하였으며, 이 시스템은 노바겐 인코포레이티드에서 시판된다. 증폭된 PCR 생성물을 플라스미드 pET-17b의 BamHI-XhoI 부위로 클론시켰다. 이 방법은 틀상에서 T7 프로모터, 9개 아미노산 리더 서열과 11개 아미노산 성숙 φ10 단백질을 암호하는 DNA 서열의 바로 뒤에 성숙 포린 단백질을 위한 DNA 서열을 둔다. DE3 람다 유도체에 대해 용원성인 스튜디어 이.콜리 균주 BL21(스튜디어 및 모파트, J. Mol. Biol. 189:113-130(1986))을, 포린 유전자를 함유하는 pET-17b 플라스미드의 발현 숙주로 선택하였다. 그러나, 이.콜리 발현 숙주로부터 유래하는 OmpA 단백질이 발현된 수막염균 포린 단백질과 동시 정제되는 경향이 있기 때문에, 이 균주의 변형은 ompA 유전자를 균주로부터 제거하여 P1을 형질도입시켜 제조하였다. 따라서, PCR 생성물 및 pET-17b 벡터를 모두 제한 엔도뉴클레아제로 분해하고 결찰시킨 후, 생성물을 BL21(DE3)-ΔompA내로 형질전환시키고 형질 전환체를 앰피실린 및 테트라사이클린 내성에 대해 선택하였다. pET-17b의 제한 효소 지도를 도 11A에 표시하였으며, pET-17b의 BglII 및 XhoI 부위사이의 뉴클레오티드 서열은 도 11B에 나타내었다. 선택 평판에서 관찰되는 수 많은 콜로니중, 추가의 형질화를 위해 10개를 취하였다. 대수기로 증식하고 IPTG로 유도하는 경우, 10개 모두는 PorB 단백질의 대략적인 분자량에 따라 이동하는, 다량의 단백질을 발현시켰다. 상기 하나의 배양액의 전체 세포 용균물을 도 3A에 도시하였다. 4D11 모노클론 항체로 웨스턴 블롯 분석하여 발현된 단백질이 PorB 단백질이라는 것을 제안하였다(도 3B). 다른 연구와는 반대로, 나이세리아 포린을 이.콜리내로 클론하고 발현시킨 경우, 숙주 박테리아 세포는 IPTG의 첨가후에 임의의 독성 또는 치명적 효과의 징후가 보이지 않았다. 이.콜리 세포는 생존가능하였으며, 발현 상태중 어느 시간에도 재배양시킬 수 있다.
뉴클레오티드 서열 분석:이들 실험에서 발현된 PorB의 양은 이전에 관찰된 것보다 상당히 많으며, 숙주 이.콜리에서 발현에 대한 역효과가 나타나지 않았다. 어떠한 PCR 인공물도 수막염균 포린 유전자내로 도입되어 높은 발현을 나타내지 않는다는 것을 보여주기 위해서, 전체 φ10 포린 융합체을 플라스미드로부터 2본쇄 프라이머를 연장시켜 서열결정하였다. 이 결과를 표 4에 나타내었다. 뉴클레오티드 서열은 도시된 2개를 제외하고는 헥켈 등의 문헌[워드 엠.제이. 등, FEMS Microbiol. Lett. 73:283-289(1992))에 이미 보고된 또 다른 수막염균 혈청형 15 PorB 유전자 서열과 동일하였다. 이들 2개의 뉴클레오티드 차이는 코돈의 제 3위치에서 각각 발생하며 발현된 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않는다. 따라서, 뉴클레오티드 서열로부터, 이.콜리내에 독성의 결핍과 높은 단백질 발현양을 설명해줄 임의의 PCR 인공물 또는 변이가 존재하는 것으로 보이지 않는다. 또한, 이 자료는 전형적인 PorB 단백질이 제조되었다는 것을 제안한다.
발현된 PorB 유전자 생성물의 정제:이.콜리내에 발현된 PorB 단백질은 TEN 완충액에 불용성이며, 발현시 PorB 단백질을 봉입체내에 형성시킨다고 제안되었다. 그러나, 불용성 PorB 단백질을 TEN 완충액으로 세척하여 대부분의 오염성 이.콜리 단백질을 제거하였다. 이어서, PorB 단백질을 새로 제조한 8M 우레아에 용해시키고, 쯔비터젠트 3,14 세정제로 희석시켰다. 우레아 뿐만 아니라 남아 있는 오염 단백질을 제거하는 Sephacryl S-300 분자체 칼럼을 사용하여 최종 정제를 수행하였다. PorB 단백질의 대부분은 야생형 PorB와 거의 유사한 겉보기 분자량의 삼량체로 칼럼으로부터 용출되었다. 이.콜리에서 발현된 PorB 및 야생형의 PorB 비교용 용출 패턴을 도 5에 도시하였다. 쯔비터젠트 세정제로 희석하기 전에 8M 우레아중 PorB 단백질 농도가 10㎎/㎖를 초과하는 경우, 삼량체로서 발견된 PorB 단백질의 상대량이 감소하고 공극 부피에서 용출되는 응집물로서 나타난다는 것을 인지하는 것이 중요하다. 그러나, 우레아 완충액중 10mg/㎖ 미만의 단백질 농도에서, 대부분의 PorB는 야생형 PorB에서와 같이 정확하게 동일한 분획에서 용출되었다. 또한 T7-Tag 모노클론 항체 및 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 성숙 T7 캡시드 단백질의 11 아미노산이 아미노 말단에 보유된다는 것을 결정하였다. 이.콜리 1ℓ로부터 얻는 수막염균 포린 단백질의 총 수득량은 약 50mg이었다.
억제 ELISA 분석:정제된 삼량체 재조합 PorB가 야생형 수막염균 균주 8765에서 생성되는 PorB과 비교하여 유사한 항원 구조를 갖는지의 여부를 결정하기 위해서, 야생형 수막염균 유형 15 PorB 단백질로 예방접종한 6명의 환자의 혈청을 억제 ELISA 분석에 사용하였다. 억제 분석시, 천연 PorB에 반응하는 항체는 정제된 재조합 PorB 또는 동종의 정제된 야생형 PorB의 다양한 양으로 경쟁적으로 억제되었다. 각각 6명의 인체 혈청의 동종의 정제된 PorB를 이용한 억제 및 이들 혈청의 평균 억제율 결과를 도 6에 도시하였다. 정제된 재조합 PorB를 이용한 이들 혈청의 해당 억제율은 도 6에 도시되어 있다. 도 6 및 도 7의 평균 억제율 비교는 표 8에 플롯하였다. 이들 자료는 이들 6명의 환자의 혈청에 포함된 항체가 동종의 정제된 야생형 PorB 및 정제된 재조합 PorB상의 에피토프와 유사하다는 것을 제안한다. 이는 또한 재조합 PorB가 야생형 PorB에서 발견되는 천연 구조를 전부는 아니라도 거의 대부분 회복했다는 추가의 증거를 제기한다.
실시예 2
B군 나이세리아 멘인기티디스 균주 BNCV M986로부터 클래스 2 포린의 클로닝
전술한 방법[삼브룩 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor, 뉴욕, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]을 사용하여 약 0.5g의 B군 나이세리아 멘인기티디스 균주 BNCV M986(혈청형 2a)으로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 이어서, 표준 PCR 반응에서, 상기 DNA는 2개의 클래스 2 포린 특이적 올리고뉴클레오티드에 대해 주형으로 작용하였다. 이들 올리고뉴클레오티드는 클래스 2 포린의 5' 측부 및 3' 측부에 상보적이고 EcoRI 제한 부위를 함유하여 단편의 클로닝을 용이하게 하도록 고안되었다. 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기와 같다:
5'AGC GGC TTGGAA TTCCCG GCT GGC TTA AAT TTC3' 및
5'CAA ACG AATGAA TTCAAA TAA AAA AGC CTG3'.
이어서, 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 클래스 2 포린을 얻었다. 이 반응 조건은 하기와 같다: BNCV M986 게놈 DNA 200ng, 전술한 바와 같은 각각 1μM의 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 200μM의 각각의 dNTP, PCR 반응 완충액(10mM 트리스 HCl, 50mM의 KCl, pH 8.3), 1.5mM MgCl2및 2.5 유니트의 Taq 폴리머라제, 증류수로 100㎕를 채움. 이어서 반응 혼합물을 95℃에서 1분, 50℃에서 2분, 및 72℃에서 1.5분 동안 25 사이클을 수행하였다. 사이클 종료 후에, 반응 혼합물을 1% 아가로스 겔에 적재하고, 2시간 동안 전기영동을 한 후, 1.3kb의 밴드를 분리하고 젠클린(GeneClean) 키트(바이오 101)를 사용하여 DNA를 회수하였다. 이어서, DNA를 EcoRI로 분해하고, 재정제한 후 T4DNA 리가아제를 사용하여 EcoRI로 분해된 pUC19에 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 능력세포 이.콜리 DH5α를 형질전환시켰다. 재조합 플라스미드를 선택하여 서열결정하였다. 삽입체는 클래스 2 포린의 것과 일치하는 DNA 서열을 갖는 것으로 발견되었다. 참고, 뮤라카미 케이.등, Infect. Immun. 57:2318-2323(1989).
플라스미드 pET-17b(노바겐)을 사용하여 클래스 2 포린을 발현시켰다. 전술한 바와 같이, 2개의 상이한 단백질을 생성하는 2개의 플라스미드를 작제하였다. 하나의 플라스미드는 성숙 클래스 2 포린을 생성하도록 고안되었고, 다른 하나는 T7 유전자 φ10 캡시드 단백질 유래의 20 아미노산에 융합된 클래스 2 포린을 산출하도록 고안되었다.
성숙 클래스 2 포린 작제
올리고뉴클레오티드: 5'-CCT GTT GCA GCACAT ATGGAC GTT ACC TTG TAC GGT ACA ATT AAA GC-3' 및 5'-CGA CAG GCT TTT TCT CGA GAC CAA TCT TTT CAG-3'를 사용하여 pUC19-클래스 2 포린 작제물을 증폭시켜 성숙 클래스 2 포린을 작제하였다. 이 방법으로 플라스미드 pET-17b의 NdeI 및 XhoI 부위내로 증폭된 클래스 2 포린을 클로닝시키므로써 성숙 클래스 2 포린을 제조하였다. 주형으로 pUC19-클래스 2 및 전술한 2개의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 표준 PCR을 수행하였다. 이 PCR 반응으로 1.0% 아가로스 겔에서 분석할 때 1.1kb의 생성물을 얻었다. PCR 반응으로 얻은 DNA를 겔 정제하고 제한 효소 NdeI 및 XhoI로 분해시켰다. 생성된 1.1kb의 DNA를 다시 겔 정제하고 T4DNA 리가아제를 사용하여 NdeI 및 XhoI로 분해된 pET-17b에 결찰시켰다. 이어서 결찰 혼합물을 사용하여 능력세포 이.콜리 DH5α를 형질전환시켰다. 1.1kb 삽입체를 포함하는 콜로니를 선택하여 추가 분석하였다. DH5α 클론으로부터의 DNA를 제한 지도로 분석하고 선택된 플라스미드의 클로닝 접합부를 서열결정하였다. 이 분석 후에, DHα 클론으로부터 얻은 DNA를 사용하여 이.콜리 BL21(DE3)-ΔompA를 형질전환시켰다. 형질 전환체를 100㎍/㎖의 카르베니실린을 함유하는 LB 아가에서 선택하였다. 클래스 2 포린 단백질을 만들 수 있는 능력을 이용하여 몇 개의 형질 전환체를 선별하였다. 이는 100㎍/㎖의 카르베니실린 및 0.4% 글루코스를 함유하는 30℃의 LB 액체 배지에서 클론을 OD600=0.6으로 증식시킨 후 IPTG(0.4mM)로 배양액을 유도하므로써 수행하였다. 이어서, 세포를 파괴하고 세포 추출물을 SDS-PAGE로 분석하였다. pET-17b내로 클론된 성숙 클래스 II 포린 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 번역된 아미노산 서열을 도 9A 및 9B에 나타내었다.
융합 클래스 2 포린의 작제
올리고뉴클레오티드: 5'-CCT GTT GCA GCG GAT CCA GAC GTT ACC TTG TAC GGT ACA ATT AAA GC-3' 및 5'-CGA CAG GCT TTT TCT CGA GAC CAA TCT TTT CAG-3'를 사용하여 pUC19-클래스 2 포린 작제물을 증폭시켜 융합 클래스 2 포린을 작제하였다. 이 방법으로 플라스미드 pET-17b의 BamHI 및 XhoI 부위내로 증폭된 클래스 2 포린을 클로닝시키므로써 플라스미드내에 함유된 T7 φ10 캡시드 단백질로부터 유도된 N-말단에 22개 아미노산을 더 포함하는 융합 클래스 2 포린을 제조하였다. 주형으로 pUC19-클래스 2 및 전술한 2개의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 표준 PCR을 수행하였다. 이 PCR 반응으로 1.0% 아가로스 겔에서 분석할 때 1.1kb의 생성물을 얻었다. PCR 반응으로 얻은 DNA를 겔 정제하고 제한 효소 BamHI 및 XhoI로 분해시켰다. 생성된 1.1kb의 생성물을 다시 겔 정제하고 T4DNA 리가아제를 사용하여 BamHI 및 XhoI로 분해된 pET-17b에 결찰시켰다. 이어서 결찰 혼합물을 사용하여 능력세포 이.콜리 DH5α를 형질전환시켰다. 1.1kb 삽입체를 포함하는 콜로니를 선택하여 추가 분석하였다. DH5α 클론으로부터의 DNA를 제한 효소 지도로 분석하고 선택된 플라스미드의 클로닝 접합부를 서열결정하였다. 발현 플라스미드 pET-17b내에 클론된 융합 클래스 II 포린 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 번역된 아미노산 서열은 도 10A 및 도 10B에 도시되어 있다. 이 분석 후에, DH5α 클론으로부터 얻은 DNA를 사용하여 이.콜리 BL21(DE3)-ΔompA를 형질전환시켰다. 형질 전환체를 100㎍/㎖의 카르베니실린을 함유하는 LB 아가에서 선택하였다. 클래스 2 포린 단백질을 만들 수 있는 능력을 이용하여 몇 개의 형질 전환체를 선별하였다. 이는 100㎍/㎖의 카르베니실린 및 0.4% 글루코스를 함유하는 30℃의 LB 액체 배지에서 클론을 OD600=0.6으로 증식시킨 후 IPTG(0.4mM)로 배양액을 유도하므로써 수행하였다. 이어서, 세포를 파괴하고 세포 추출물을 SDS-PAGE로 분석하였다.
실시예 3
이.콜리내에 B군 나이세리아 멘인기티디스 균주 8765의 성숙 클래스 3 포린의 클로닝 및 발현
전술한 방법[삼브룩 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor, 뉴욕, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]을 사용하여 약 0.5g의 B군 나이세리아 멘인기티디스 균주 8765로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 이어서, 표준 PCR 반응에서, 상기 DNA는 2개의 클래스 3 포린 특이적 올리고뉴클레오티드에 대해 주형으로 작용하였다.
올리고뉴클레오티드: 5'-GTT GCA GCACAT ATGGAC GTT ACC CTG TAC GGC ACC-3' 및 5'-GGG GGG ATG GAT CCA GAT TAG AAT TTG TGG CGC AGA CCG ACA CC-3'를 사용하여 8765로부터 게놈 DNA를 증폭시켜 성숙 클래스 3 포린을 작제하였다. 이 방법으로 플라스미드 pET-24a+(도 13A 및 도 13B)의 NdeI 및 BamHI 부위내로 증폭된 클래스 3 포린을 클로닝시키므로써 성숙 클래스 3 포린을 제조하였다. 주형으로 8765로부터 분리된 게놈 DNA 및 전술한 2개의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 표준 PCR을 수행하였다
상기 반응 조건은 하기와 같다: 8765 게놈 DNA 200ng, 전술한 바와 같은 각각 1μM의 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 200μM의 각각의 dNTP, PCR 반응 완충액(10mM 트리스 HCl, 50mM의 KCl, pH 8.3), 1.5mM MgCl2및 2.5 유니트의 Taq 폴리머라제, 및 증류수로 100㎕를 채움. 이어서 반응 혼합물을 95℃에서 1분, 50℃에서 2분, 및 72℃에서 1.5분 동안 25 사이클을 수행하였다.
이 PCR 반응으로 1% 아가로스 겔에서 분석할 때 약 930bp의 생성물을 얻었다. PCR 반응으로 얻은 DNA를 겔 정제하고 제한 효소 NdeI 및 BamHI로 분해시켰다. 930bp 생성물을 다시 겔 정제하고 T4DNA 리가아제를 사용하여 NdeI 및 BamHI로 분해된 pET-24a(+)에 결찰시켰다. 이어서 결찰 혼합물을 사용하여 능력세포 이.콜리 DH5α를 형질전환시켰다. 930bp의 삽입체를 포함하는 콜로니를 선택하여 추가 분석하였다. 이.콜리 DH5α 클론으로부터의 DNA를 제한 효소 지도로 분석하고 선택된 플라스미드의 클로닝 접합부를 서열결정하였다. 이 분석 후에, 이.콜리 DH5α 클론으로부터 얻은 DNA를 사용하여 이.콜리 BL21(DE3)-ΔompA를 형질전환시켰다. 형질 전환체를 50㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 LB 아가에서 선택하였다. 클래스 3 포린 단백질을 만들 수 있는 능력을 이용하여 몇 개의 형질 전환체를 선별하였다. 이는 50㎍/㎖의 카나마이신 및 0.4%의 글루코스를 함유하는 30℃의 LB 액체 배지에서 클론을 OD600=0.6으로 증식시킨 후 IPTG(1mM)로 배양액을 유도하므로써 수행하였다. 이어서, 세포를 파괴하고 세포 추출물을 SDS-PAGE로 분석하였다.
실시예 4
재조합 클래스 2 포린의 정제 및 재중첩
이. 콜리 균주 BL21(DE3)ΔompA[pNV-5]를 30℃의 루리아 브로스에서 중간 대수기(600nm에서 OD=0.6)로 증식시킨다. 이어서 IPTG를 첨가하고(최종 0.4mM) 세포를 37℃에서 추가의 2 시간 동안 증식시킨다. 그 후, 세포를 수거하고 몇 부피의 TEN 완충액(50mM 트리스-HCl, 0.2M NaCl, 10mM EDTA, pH=8.0)으로 세척하고 세포 페이스트를 -75℃로 냉동 저장한다.
정제를 위해 예비 칭량된 세포를 해동시키고 TEN 완충액에 1:15 비율(g/v)로 현탁시킨다. 현탁액을 8,000psi에서 2회 스탠스티드 세포 파괴기(스탠스티드 플루이드 파워 리미티드)를 통과시킨다. 이어서, 생성 용액을 20분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하고 상등액을 버린다. 이어서 펠렛을 0.5% 데옥시콜레이트를 함유하는 TEN 완충액에 2회 현탁시키고 상등액을 버린다. 그 후, 펠렛을 8M 탈이온된 우레아(전기 영동 등급) 및 0.1mM PMSF(3g/10㎖)를 포함하는 TEN 완충액에 현탁시킨다. 현탁액을 10분 동안 또는 균일한 현탁액을 얻을 때까지 초음파처리한다. 10㎖의 3,14-쯔비터젠(칼바이오켐)의 10% 수용액을 첨가하고 용액을 확실하게 혼합한다. 이 용액을 다시 10분 동안 초음파처리한다. 임의의 잔여 불용성 물질을 원심분리하여 제거한다. 단백질 농도를 측정하고 단백질 농도를 8M 우레아-10% 쯔비터젠 완충액(1:1 비율)을 사용하여 2mg/㎖로 조정한다.
이어서, 혼합물을 100mM 트리스-HCl, 1M NaCl, 10mM EDTA, 20mM CaCl2, 0.05% 3,14-쯔비터젠, 0.02% 아지드산 나트륨, pH8.0으로 평형시킨 Sephacryl S-300 2.6×100㎝ 칼럼에 적용하였다. 칼럼 유속을 1㎖/분으로 유지하였다. 10㎖의 분획을 수거하였다. 겔 여과동안 포린을 삼량체내로 재중첩시켰다. 각 분획물의 OD=280nm를 측정하고 단백질을 함유하는 분획물을 포린에 대해 SDS 겔 전기 영동 분석하였다. 포린을 포함하는 분획물을 모았다. 모은 분획물을 50mM 트리스 HCl pH=8.0, 0.05% 3,14-쯔비터젠, 5mM EDTA, 0.1M NaCl에서 1:10으로 투석 또는 희석시켰다. 이어서 생성 용액은 동일한 완충액으로 평형시킨 2.6×10㎝ Q 세파로스 고 성능 칼럼(파마시아)에 적용시켰다. 포린을 0.1M 내지 1M의 NaCl의 선형 구배로 용출시켰다.
실시예 5
재조합 클래스 3 포린의 정제 및 재중첩
PorB-pET-17b 플라스미드를 포함하는 이. 콜리 균주 BL21(DE3)ΔompA를 30℃의 루리아 브로스에서 중간 대수기(600nm에서 OD=0.6)로 증식시킨다. 이어서 IPTG를 첨가하고(최종 0.4mM) 세포를 37℃에서 추가의 2 시간 동안 증식시킨다. 그 후, 세포를 수거하고 몇 부피의 TEN 완충액(50mM 트리스-HCl, 0.2M NaCl, 10mM EDTA, pH=8.0)으로 세척하고 세포 페이스트를 -75℃에서 냉동 저장하였다.
정제를 위해 약 3g의 세포를 해동시키고 9㎖의 TEN 완충액에 현탁시킨다. 리소자임, 데옥시콜레이트(시그마, 1.3mg/㎖) 및 PMSF(시그마, ㎍/㎖)을 첨가하고(시그마, 0.25mg/㎖) 및 혼합물을 실온에서 1시간 동안 부드럽게 진탕하였다. 이 때, 세포가 용균하여 방출된 DNA로 인해 용액은 매우 점성이 된다. 이어서 DNase를 첨가하고(시그마, 2㎍/㎖) 실온에서 1 시간 동안 용액을 다시 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 S-600 로터에서 30분 동안 15K rpm으로 원심분리하고 상등액은 버린다. 이어서, 펠렛을 10㎖의 TEN 완충액에 2회 현탁시키고 상등액을 버린다. 펠렛을 TEN 완충액중 10㎖의 8M 우레아(피어스)내에 현탁시킨다. 혼합물을 부드럽게 교반하여 임의의 덩어리들을 분쇄한다. 현탁액을 20분 동안 또는 균일한 현탁액을 얻을 때까지 초음파처리한다. 10㎖의 3,14-쯔비터젠(칼바이오켐)의 10% 수용액을 첨가하고 용액을 확실하게 혼합한다. 이 용액을 다시 10분 동안 초음파 처리한다. 임의의 잔여 불용성 물질을 원심분리하여 제거한다. 단백질 농도를 측정하고 단백질 농도를 8M 우레아-10% 쯔비터젠 완충액(1:1 비율)으로 2mg/㎖로 조정한다.
이어서, 혼합물을 100mM 트리스-HCl, 1M NaCl, 10mM EDTA, 20mM CaCl2, 0.05% 3,14-쯔비터젠, pH8.0으로 평형시킨 Sephacryl S-300(파마시아) 180×2.5㎝ 칼럼에 적용한다. 칼럼 유속을 1㎖/분으로 유지한다. 10㎖의 분획을 수거한다. 겔 여과동안 포린을 삼량체내로 재중첩시킨다. 각 분획물의 OD280nm를 측정하고 단백질을 함유하는 분획물을 포린에 대해 SDS 겔 전기 영동 분석한다. 포린을 포함하는 분획물을 모은다.
모은 분획물을 투석하고 100mM 트리스-HCl, 0.1M NaCl, 10mM EDTA, 0.05% 3,14-쯔비터젠, pH=8.0을 포함하는 완충액에 대해 PM10 막을 구비한 아미콘 농축기를 사용하여 4 내지 6배로 농축한다. 대안적으로, 모은 분획물을 80% 에탄올로 침전시키고 전술한 완충액으로 재현탁시킨다. 이어서, 6 내지 10mg의 물질을 동일한 완충액으로 평형시킨 모노 Q 10/10 칼럼(파마시아)에 적용시킨다. 50분 동안 분당 1.2%의 증가를 나타내도록 얕은 0.1 내지 0.6M NaCl 구배로 포린을 용출시킨다. 유속은 1㎖/분이다. 포린을 함유하는 피크를 수거하고 TEN 완충액 및 0.05% 3,14-쯔비터젠에 대해 투석한다. 또 다른 S-300 크로마토그래피로 포린을 추가 정제할 수 있다.
실시예 6
다당체의 정제 및 화학적 변형
B군 나이세리아 멘인기티디스 및 이.콜리 K1의 협막 다당체는 α(2→8) 폴리시알산으로 구성된다(GBMP 또는 K1 다당체로서 통칭함). 침전시켜 증식 배지에서 분리한 고 분자량 다당체를 정제하고(참고, 프라쉬 씨.이., "Production and Control ofNeisseria meningitidisVaccines" in Bacterial Vaccines, 알란 알. 리스, 인코포레이티드 123-145(1990)), 포린 단백질에 커플링시키기 전에 화학적으로 변형시켰다. 고 분자량의 다당체를 0.1M 아세트산(7mg 다당체/㎖), pH 6.0∼6.5(70℃,3 시간)으로 부분 해중합시켜 평균 분자량이 12,000∼16,000인 다당체를 제공하였다. 겔 여과 칼럼 크로마토그래피(Superdex 200 정제 등급, 파마시아)로 정제한 후, NaBH4의 존재하에 다당체를 N-탈아세틸화시킨 후 제닝스 등의 문헌[J. Immunol. 137:1808(1986)]에 개시된 바와 같이 N-프로피오닐화시켜 N-Pr GBMP를 얻었다(참고, 실시예 14). NaIO4로 처리한 후 겔 여과 칼럼 정제하여 12,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 산화된 N-Pr GBMP를 얻었다.
실시예 7
B군 수막염균 클래스 3 포린 단백질(PP)에 산화된 N-Pr GBMP의 커플링
산화된 N-Pr GBMP(9.5mg)을 10% 옥틸 글루코시드를 더 포함하는 0.21㎖의 0.2M 포스페이트 완충액, pH 7.5에 용해시킨 정제 클래스 3 포린 단백질(3.4mg)에 첨가하였다. 다당체를 용해시킨 후, 나트륨 시아노보로히드리드(7mg)을 첨가하고 반응 용액을 4일 동안 37℃에서 항온처리하였다. 반응 혼합물을 0.01% 티메로살을 함유하는 0.15M 염화 나트륨 용액으로 희석하고 Superdex 200PG를 사용하여 겔 여과 칼럼 크로마토그래피로 분리하였다. 접합체(N-Pr GBMP-PP)를 공극 부피 부근에 있는 단일 피크 용출물로서 얻었다. 시알산 및 단백질의 접합체 용액 분석으로 접합체가 43 중량% 다당체를 포함한다는 것을 알 수 있었다. 포린 단백질은 접합체 44% 수율 및 다당체 12% 수율로 회수하였다. 다른 실험에서 단백질 회수율은 일반적으로 50% 내지 80% 범위이며 다당체의 회수율은 9% 내지 13% 이다(참고, 실시예 14).
실시예 8
면역원성 연구
N-Pr GBMP-PP 접합체의 면역원성 및 유사한 커플링 과정으로 제조된 N-Pr GBMP-파상풍 톡소이드(N-Pr GBMP-TT) 접합체의 면역원성을 4 주 내지 6주된 이계교배된 스위스 웹스터 CFW 암컷 마우스에서 분석하였다. 다당체(2㎍)-접합체를 1일, 14일과 28일에 투여하고, 38일 째 혈청을 수거하였다. 염수 용액으로, 수산화 알루미늄에 흡착시키거나, 스테아릴 티로신과 혼합한 상태로 접합체를 투여하였다. 다당체 항원에 대한 혈청 ELISA 역가 및 엔.멘인기티디스 B군에 대한 살균 역가가 표 1에 요약되어 있다.
실시예 9
효모 피치아 파스토리스 발현 시스템을 이용한 B군 나이세리아 멘인기티디스 외막(MB3)의 발현
재료 및 방법
균주 및 플라스미드
피치아 파스토리스 GS 115(인비트로겐에서 공급)는 히스티딘을 합성하지 못하도록 하는 히스티디놀 탈수소효소 유전자(his4)에 결점이 있다. 모든 발현 플라스미드는 숙주에서 his4를 상보하는 HIS4 유전자를 보유하며, 따라서 형질전환체는 히스티딘 결핍 배지에서 증식하는 능력으로 선택한다. 형질 전환될 때까지, GS115는 최소 배지에서 단독으로 증식하지 않을 것이다.
발현 벡터
강력하고, 높은 유도성이 있는 AOX1 프로모터를 포함하는 4개의 다른 발현 벡터를 이종 단백질을 발현시키는데 사용하였다(피치아 발현 키트, 인비트로겐). 하나의 벡터, pHIL-D2는 세포내 발현에 사용하는 반면, 다른 3개의 벡터(pHIL-S1, pPIC9 및 pPIC9K)는 분비 발현에 사용한다. pHIL-D2, pHIL-S1, 및 pPIC9 벡터 지도는 피치아 발현 키트, E 형태용 인비트로겐 지시서 p19-22에 나타나있으며, 그 내용을 참고로 인용한다. 분비는 분비 경로에 표적화시키는 발현 단백질상에 시그널 서열의 존재를 필요로한다. 성공할 확율을 높이기 위해서, 2개의 상이한 종류의 벡터를 키트내에 포함시킨다. 벡터 pHIL-S1은 산 포스파타제 유전자, PHO1유래의 자연 피치아 파스토리스 시그널을 운반한다. 벡터, pPIC9 및 pPIC9K(보정된 HIS4 영역)는 모두 에스.세레비시애 α-접합 인자 프리프로 펩티드 유래의 분비 시그널을 운반한다. 분비 단백질을 발현시키는 경우의 장점은 피. 파스토리스가 천연 단백질을 매우 적은 양으로 분비한다는 것이다. 따라서, 분비된 이종 단백질은 배지에 다량의 총 단백질을 포함하며 단백질의 정제시 제1단계로서 작용한다(바르 등, Pharm. Eng 12(2): 48-51(1992)).
수막염균 B 클래스 3 단백질 유전자(MB3)의 클로닝
표준 PCR에서 클래스 3 포린(MB3)의 증폭을 위해 주형으로서 B군 나이세리아 멘인기티디스(균주 8765)의 게놈 DNA를 사용하였다. 성숙 포린 단백질의 증폭된 DNA 단편(930bp 길이)을, 스튜디어[J. Mol. Biol. 189:113-130(1986); Meth. Enzymol. 185:60-89(1990); J. Mol. Biol. 219;37-44 (1991)]에 의해 처음 작제되고 노바겐에 의해 제조된 pET-24a 클로닝/발현 벡터의 NdeI-BamH I 클로닝 부위에 결찰시켰다. 강력한 T7 전사 및 번역 시그널하에서 표적 DNA 단편을 클로닝하고 발현하기 위해서 pET 벡터를 개발하였다. T7 RNA 폴리머라아제의 공급원과 숙주세포를 제공하므로써 T7 프로모터로부터 발현을 유도한다. T7 발현 시스템을 이용한 더 새롭고 편리한 벡터는 현재 노바겐(위스콘신주 53711 매디슨)으로부터 얻을 수 있다. 이.콜리중 MB3의 발현을 위해 T7 발현 시스템을 성공적으로 사용하였다.
발현된 MB3 유전자용 번역연장율의 최적화
코돈 용법은 번역연장율에 영향을 주는 것으로 알려져 있으며, 따라서 생성 수율에 영향을 주는 중요한 인자로 생각되어 왔다(로마노스 등, Yeast 8:423-488(1992)). 코돈 용법은 발현된 단백질의 수율 및 양에 모두 영향을 줄 수 있다는 증거가 있다. 다량 발현되는 다수의 유전자는 코돈의 서브세트에 강하게 편중되어 있다(벤네첸 등, J. Biol. Chem. 257:3026-3031(1982)). 유기체 마다 상당히 다양할 수 있는 이러한 "주요 코돈 편중"은 증식 최적화 방법이라고 생각된다. tRNA의 서브세트 및 아미노아실-tRNA 신타아제만이 고 농도로 존재할 필요가 있기 때문에, 이 기작은 유기체가 급속한 증식 과정중에 고도로 발현되는 유전자의 번역을 효율적으로 할 수 있게 한다. 쿠란드 등, TIBS 12:126-128(1987). mRNA가 희소 코돈을 함유하는 경우, 아미노아실-tRNA는 제한될 수 있으며, 아미노산의 삽입 오류 가능성을 증가시키고, 리보좀이 감소를 가능하게 한다. 실제로, 높은 빈도수의 삽입 오류가 최근 이.콜리에서 생성되는 이종 단백질에서 관찰되고 있다(스코러 등, Nucleic Acids Res. 19:3511-3516(1991)). 더구나, 아미노산 삽입 오류를 포함하는 단백질은 정제하기 어렵고 감소된 활성과 항원성을 갖을 수 있다. 몇 개의 희소 코돈의 존재는 이.콜리중 파상풍 독소 단편 C의 생성을 억제하는 것으로 보여진다(막코프 등, Nucleic Acids Res. 17:10191-10201(1989)). 효모에서, 호에크마 등(Mol. Cell Biol. 7:2914-2924(1987))은 PGK (포스포글리세레이트 키나아제) 유전자의 5' 부분에 희소 코돈을 바람직한 코돈으로 다량 치환하면 발현양이 감소된다는 것을 보여주었다. 최근, 효모중 면역글로블린 카파 사슬의 발현이 합성 코돈-최적화된 유전자를 사용하는 경우 50배 증가되지만, 카파 사슬 mRNA의 양은 동일하게 남아있다는 것을 보여주었다.
피치아와 MB3의 코돈 사용 프로필의 현저한 차이가 발견되었다(표 5). 번역효율, 특히 번역연장의 개시를 최적화하기 위해서, 피치아에 최적인 코돈을 MB3 유전자의 5' 영역내로 도입시켰다. MB3을 pHIL-S1으로 클론시키는데 사용한 링커의 작제시, 피치아 발현에 최적인 서열을 포함하도록 올리고머를 합성하였다. 51개 길이의 뉴클레오티드 올리고머(51개)를 이 용도로 합성하였다. 올리고머의 서열은 하기와 같다:
5'-TCGAGACGTCACTTTGTACGGTACTATTAAGGCTGGTGTTGAGACTTCCCG-3'
51개에 상보적인 47개 올리고뉴클레오티드 올리고머를 또한 합성하였다. 이 올리고머의 서열은 하기와 같다:
5'-CGGGAAGTCTCAACACCAGCCTTAATAGTACCGTACAAAGTGACGTC-3'
XhoI 및 BsrI 제한 부위를 포함하는 이들 2개의 올리고머를 커넥터로 사용하기 위해서 어닐링한 후, XhoI 분해로 선형화된 벡터 pHIL-S1에 결찰시켰다. 이어서, 결찰된 단편을 BamHI으로 분해하고, 겔 정제한 후 BsrI 및 BamHI 효소로 pNV15 벡터를 절단하여 얻은 MB3으로 결찰시켰다. 이어서, 단편을 피치아 pHIL-S1 발현 벡터에 클론시켰다. MB3의 5' 영역의 새로운 DNA 서열을 피치아로부터 분리된 pHIL-S1/MB3의 DNA 서열에 의해 확인하였다.
성숙 MB3(NT1 유래)용 유전자의 본래 5' 말단 서열은 하기와 같다:
해당 아미노산 서열과 함께, 동일한 단편의 코돈-최적화된 서열(대문자로 나타낸 치환된 뉴클레오티드)은 하기와 같다:
코돈-최적화된 MB3 DNA를 함유하는 벡터 pHIL-S1/MB3은 표준 PCR에서 MB3의 증폭을 위한 주형으로 사용하였다. 올리고머를 합성하여 PCR 프라이머로 사용하였다. MB3의 PCR 단편을 직접 또는 오리지날 TA 클로닝 키트(인비트로겐)를 사용하여 피치아 발현 벡터내로 삽입하였다: 하기에 상세히 설명하였다.
MB3을 pHIL-D2의 EcoRI 부위내로 클로닝하기 위한 경우:
정 프라이머(39개 뉴클레오티드, 유전자 조작한 EcoRI 부위 및 개시 메티오닌을 암호하는 서열(5'ATG)을 가짐):
5'-CGAGAATTCATGGACGTCACTTTGTACGGTACTATTAAG-3'
역 프라이머(45개 뉴클레오티드, 유전자 조작한 EcoRI 부위 및 종지 코돈을 가짐):
5'-GCTGAATTCTTAGAATTTGTGGCGCAGACCGACACCGCCGGCAGT-3'
MB3을 pPIC9 및 pPIC9의 EcoRI-AvrII 부위내로 클로닝하기 위한 경우:
정 프라이머(39개 뉴클레오티드(nt), 유전자 조작한 EcoRI 부위를 가짐; 리더 펩티드가 개시 메티오닌을 갖기 때문에 개시 메티오닌을 암호하는 서열은 필요하지 않다):
5'-AGCGAATTCGACGTCACTTTGTACGGTACTATTAAGGCT-3'
역 프라이머(36개 뉴클레오티드, 유전자 조작한 AvrII 부위 및 종지 코돈을 갖음):
5'-CACCCTAGGTTAGAATTTGTGACGCAGACCGACACC-3'
완전 MB3 유전자의 PCR 증폭을 위해, Vent(등록상표) DNA 폴리머라제(NEB)를 사용하였다. 이 폴리머라제의 복제성은 Taq 폴리머라제의 경우 관찰되는 것보다 5∼15배 더 높다. 발현 카세트 플라스미드를 생성하기 위해서, MB3의 PCR 단편(전장 및 절단된 단편)을 직접 또는 오리지날 TA Cloning(등록 상표)키트(인비트로겐)를 사용하여 피치아 발현 벡터에 삽입시켰으며, 이는 PCR 단편의 서브클로닝용 pCRTMII 벡터를 포함한다. Vent(등록상표) DNA 폴리머라제 또는 pfu DNA 폴리머라제에 의해 증폭된 DNA를 벡터 pCRTMII 내로 직접 클로닝하는 것은, 클로닝 효율이 종종 매우 낮기 때문에, 어렵다. 이는 Vent(등록상표) 및 Pfu의 3' →5' 엑소뉴클레아제의 교정 활성에 의한 것이며, TA 클로닝에 필수적인 3'A 돌출을 제거하여 평활 말단을 형성한다. Original TA Cloning(등록 상표) 키트는 이들 평활-말단화된 단편이 클론될 수 있도록 한다. 이 방법을 사용하면 PCR 생성물의 임의의 효소적 변형을 없앨 수 있고, 제한 부위를 포함하는 PCR 프라이머를 사용할 필요가 없다. 클로닝 효율을 더 증가시키기 위해서, 인비트로겐 계획안을 하기와 같이변형시켰다. Vent(등록상표) 또는 Pfu로 증폭시킨 후(참고, Original TA Cloning(등록 상표) 키트 사용서, 증폭후 3'A-돌출을 첨가하기 위한 방법), 용기를 얼음상에 두기 보다는, 키트 사용서에서 제시한 대로, PCR 혼합물에서 광유를 ParafilmTM을 사용하여 즉시 제거하였다. PCR 혼합물을 파라필름상에 붓고, 모든 오일이 파라필름 표면에 부착될 때까지 부드럽게 흔들면서 파라필름의 표면에 지그재그형으로 소량씩 떨어뜨린다. 이어서, 오일이 없는 반응 혼합물을 새로운 튜브에 모은다. 그 후, Taq 폴리머라제를 사용하여 인비트로겐 계획안을 계속 수행하였다. 이 방법은 PCR 단편을 거대 발현 벡터로 클로닝하는데 어려움이 있다.
통합 벡터(인비트로겐)의 발현 카세트는 메탄올-유도된 AOX1 프로모터 및 이의 종결인자를 포함하며, 이는 AOX1 유전자의 상류 및 하류 방향의 뉴클레오티드 확장에 의해 측면에 연장된다. 피.파스토리스 His4 유전자는 영양 요구주 표지로 사용한다. 이들 벡터는 효모 ori는 포함하지 않으며, 따라서 His+콜로니는 발현 카세트의 통합에 해당되는 것이다. MB3의 모든 PCR 단편을 피치아 코자크(Kozak) 공통 서열(CAAAAAACAA)(카베노 등, Nucleic Acids Res. 19:3185-3192(1991); 코자크 Nucleic Acids Res. 15:8125-8148(1987); 코자크 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8301-8305(1990))과 함께 정확한 구조로 삽입시켜 MB3 유전자의 가장 우수한 번역개시를 제공한다. 모든 삽입체를 AOX1 프로모터의 조절하에 두어 대상 유전의 발현을 추진하였다. MB3 단편을 적절한 발현 벡터내로 결찰시킨 후에, 화학적으로 능력 세포인 이.콜리 세포를 형질 전환시켰다(TOP 10F')(F'{proAB, laqIq, lacZΔM15, Tn10(TetR)} mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), φ80 lacZΔM15, ΔlacX74, deoR, recA1, araD139, Δ(ara-leu)7697, galU, galK, rpsL(StrR), endA1, nupGγ-). 적절한 기타 균주는 DH5αF', JM109, 또는 선택성 F' 에피솜을 보유하고 recA가 결핍된(endA가 바람직하다) 임의의 균주이다(피치아 발현 키트 지시서, 인비트로겐). MB3 삽입체를 포함하는 콜로니는 피치아 형질 전환용 플라스미드 DNA의 CsCl 정제된 맥시-프랩(maxi-prep)을 제조하기 위해서 사용하였다(삼브룩 J. 등, Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor Press(1989), p1.42-1.43). 제한효소 분석 및 DNA 서열 결정(DNA 서열 결정 키트, 2판 (USB))으로 이들 작제물이 맞는지를 확인하였다.
출발 MB3 서열의 변형은 포린 유전자(pHIL-D2/MB3 작제물)의 세포내 발현에 특히 적절하다. MB3 분비에 사용된 기타 작제물(pHIL-S1/MB3 및 pPIC9/MB3)은 MB3 삽입체의 상류 리더 펩티드 서열에 있어서 피치아용으로 적절한 코돈을 함유하기 때문에, 번역 개시는 속도를 제한하지 않는다. 대조적으로, pHIL-D2 벡터는 임의의 리더 서열을 포함하지 않으며, 번역 개시는 MB3 삽입체의 희소 코돈으로부터 개시되어야 한다. 이 서열의 최적화는 pHIL-D2/MB3 작제물이 시험할 임의 클론의 MB3 발현양을 최대화시키는 원인이 되는 것으로 생각된다(표 3a, 표 3b 및 표 4).
효모 세포의 형질 전환 및 통합체의 DNA 분석
단일 또는 이중(더 높은 통합 효율을 위해) 분해로 플라스미드 DNA를 선형화시키고, 피. 파스토리스 균주 GS115(his4-)는 자이모리아제를 이용한 스페로플라스트 방법을 수행한 후 PEG 및 Ca+2의 존재하에 스페로플라스트 소공을 통해 피치아 세포내로 형질 전환시킬 DNA를 흡착시키고 이 DNA 를 침투시켜 His+표현형으로 형질 전환시킨다(피치아 발현 키트 지시서, 인비트로겐, p33-38). 최소 덱스트로스(MD: 1.34% 효모 질소 염기(YNB-디프코), 4×10-5% 비오틴, 2% 덱스트로스) 대 최소 메탄올(MM: 1.34% YNB, 4×10-5% 비오틴, 0.5% 메탄올)상에서 레플리카법이나 및 패치법을 사용하므로써, His+형질 전환체가 또한 AOX1 유전자의 파괴를 나타내는지를 결정할 수 있다. 형질 전환된 스페로플라스트를 히스티딘이 없는 선택 증식 배지(MD)를 사용하여 아가로스-함유 평판에 접종하였다. 4∼6일 후에, 효모 형질 전호나체 분리된 백색 콜로니가 나타났다. 이들 콜로니를 취하여 AOX1-파괴된(MutS또는 Mut--) 형질 전환체를 선별하기 위해서 선택성 메탄올-함유 배지(MM)에 접종하였다(피치아 발현 키트 지시서, 인비트로겐, p60).
효모의 증식 및 메탄올 유도
단백질 발현양에 영향을 주는 여러 방식으로 재조합이 일어날 수 있기 때문에, 16개 이상의 검증된 재조합 클론을 선별하여 MB3 발현양을 결정하였다. 이들 콜로니는 인노바 항온조 진탕기(뉴 브룬스윅 사이언스)의 50㎖ 2098 Bluemax 튜브(팔콘)중 30℃에서, 5㎖의 글리세롤-함유 완충된 글리세롤-복합 배지(BMGY:1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 100mM 인산 칼륨, pH 6.0, 1.34% YNB, 4×10-5% 비오틴, 1.0% 글리세롤)(피치아 발현 키트 설명서, 인비트로겐, p61)에서 증식시켰다("파일럿" 발현). 1 내지 2일 후에, 배양액이 OD600=5∼10에 도달하면, 세포를 원심분리(실온에서 400rpm, 10분)로 수거하고, AOX1 프로모터를 유도하기 위해서 메탄올-함유 완충된 메탄올-복합 배지(BMMY:1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 100mM 인산 칼륨, pH 6.0, 1.34% YNB, 4×10-5% 비오틴, 0.5% 메탄올)(피치아 발현 키트 설명서, 인비트로겐, p61)에 재현탁시켰다. 소모된 메탄올을 재공급하기 위해서, 0.5%의 새로운 메탄올을 매일 유도 세포에 공급하였다. 세포의 분액을 6일 동안 매일 원심분리로 수거하고, 시험 전에 -70℃에서 저장하였다(펠렛 및 상등액을 따로 저장). 가장 유망한 클론을 단백질 발현의 최적화에 대해 검사하고 더 많은 단백질을 제조하기 위한 발현 계획을 스케일 업시켰다.
피. 파스토리스 세포의 용균, SDS-PAGE에 의한 분석 및 웨스턴 블롯 분석법
파괴 완충액(50mM 인산 나트륨, pH 7.4; 1 mM PMSF(페닐메틸설포닐 플로라이드), 1mM EDTA 및 5% 글리세롤)에서 교반하여 세포를 파괴하였다. 동일한 부피의 산-세척 유리 비드(0.5mm 직경)를 첨가하였다. 혼합물을 각 30초 혼합, 총 4 분 동안 와동시킨 후, 30 초동안 얼음상에 두었다. 가용성 분획물을 4℃, 14000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 회수하였다. 상등액(또는 세포 용균물 또는 "가용성" 단백질의 분획물)을 분리하여, -70℃에서 저장하였으며, 잔여 세포 펠렛을 SDS 샘플 완충액(1% SDS, 5% 베타-머캅토에탄올, 10% 글리세롤, 10mM EDTA, 0.025% 브로모페놀 블루)으로 와동시킨 후 10분 동안 비등시켜 추출하였다. 용균물을 다시 원심분리하고, 수성 층을 "불용성" 또는 막결합 단백질의 분획으로서 검사하였다. 라엠리(Nature 227:680-685) (1970))에 따라 단백질을 분리하기 위해 NOVEX 프리-캐스트 8∼16% 구배 겔을 사용하였다. 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(SDS-PAGE)으로 분리한 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루 R250을 사용하여 염색하거나, 또는 사용 설명서에 따라 트랜스블롯(Transblott) 장치(바이오래드 래보러터리즈)를 사용하여 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막으로 이동시켰다.
스엥 및 슈스터의 문헌[Bio Technique 13:704-708(1992)]에 개시된 바와 같이 일부 변형된 차단 과정을 사용하여 세정제 없이 웨스턴 블롯과정을 수행할 수 있다. 이 방법은 낮은 기준치하에 높은 특이성과 감도를 제공한다. 이동시, 웨스턴 이동 막 및 SDS-PAGE 분리 겔을 전기 이동전에 20분 동안 이동 완충액(24mM 트리스-HCl/192mM 글리신/20% 메탄올)으로 평형화시켰다. 3 내지 4 시간 동안 90V 및 4℃에서 이동시켰다. 단백질을 PVDF막으로 이동시키는 것을 예비 염색한 분자량 표지(BRL)로 모니터하였다.
단백질의 면역 염색을 하기와 같이 수행하였다. 이동 막을 TBS(10mM 트리스-HCl/0.09% NaCl, pH 7.2)로 세정하였다. 이어서, 막을 37℃에서 3시간 동안(또는 밤새 4℃) 0.02% 아지드산 나트륨과 1% 탈지분유 PBS 용액(M-PBS)중에 항온처리하였다. 그 다음, 막을 TBS/0.5% BSA(BSA/TBS)로 3회 세척하고 TBS로 1회 세척하였다. 막을 PBS/1% BSA(BSA/PBS)중 약 1:4000로 희석시킨 1차 마우스 항-MB3 항체(정제된 OMP 클래스 3에 대한 마우스 폴리클론 항혈청)와 함께 항온처리하고, 다시 막을 TBS/0.5% BSA(BSA/TBS)로 3회 세척하고 TBS로 1회 세척하였다. 이어서 막을 실온에서 30분 동안 부드럽게 진탕하면서 1% M-PBS에서 항온처리하였다. TBS/0.5% BSA(BSA/TBS)로 3회 세척하고 TBS로 1회 세척하였다. 이어서, 막을 1% BSA/PBS중 1:4000으로 희석한 2차 알카리 포스파타제-접합된 항-마우스 항체(커케가드 & 페리 래보러터리(KPL), 메들랜드주 게이터스버그에 소재)에서 항온처리하였다. 막을 0.5% BSA/TBS로 2회 세척하고 PBS중 25% 트윈 20으로 3회 세척하였다. 이들 세척 단계는 스엥 및 슈스터 등에 의해 추천된 방법과는 상이하며; 이 개선된 계획안은 참고 문헌의 세척 단계보다 적은 구성 요건을 제공하여, 0.5% BSA/PBS에서 6회 세척하였다. 이어서 막을 알카리 포스파타제 완충액(0.05% M 트리스-HCl, pH 9.5; 10mM MgCl2)에서 항온처리한 후 BCIP/NBT 기질 용액(KPL)에서 항온처리하였다. PBS/50mM EDTA에서 막을 세척하여 발색을 중단하였다. 검출 한계는 자연 MB3 단백질의 약 2ng∼5ng이었다.
결과 및 토의
이 방법을 사용하여 성숙 MB3을 암호하는 cDNA를 발현 벡터내로 삽입하고, 피. 파스토리스의 형질 전환을 위해 이 작제물을 이용한 방법을 하기에 요약하였다. 제 1단계에서 MB3 유전자를 4개의 피치아 발현 벡터중 1개의 벡터내로 클론시킨다. 제2 단계에서 생성 작제물을 NotI 또는 BglII로 분해시켜 선형화하고 his4 피치아 스페로플라스트를 선형화된 작제물로 형질전환시킨다. 제3단계에서, 벡터 및 게놈내의 5' 및 3' AOX1 서열사이에서 생체내 재조합이 발생하여, 그 결과 AOX1 유전자가 MB3 유전자로 치환된다. 제4단계에서 피치아 형질전환체를 히스티딘-결핍 배지에서 선택하며, 이 배지는 유전자 치환이 진행된 세포만 증식할 수 있다. 에스.세레비시애용으로 개시된 단일 단계 유전자 치환 방법(로트스테인, Meth. Enzymol. 101:202-211 (1983))은 피. 파스토리스 AOX1 구조 유전자의 대체용으로 크레그 등(Biological Research on Industrial Yeast, Vol. II, 슈트어드 등, eds, CRC Press, Boca Raton, p1-8)(1987))에 의해 성공적으로 사용되었다. MB3 삽입체를 갖는 10㎍의 선형화된 발현 벡터(pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC9 및 pPIC9K)로 GS115을 형질 전환시키면 각 실험에서 100개 이상의 콜로니가 형성되었다. 따라서, 이 과정은 DNA 1㎍당 >102His+콜로니를 산출하며, 이는 피. 파스토리스 형질 전환의 가장 우수한 결과로 보고된 것과 비견할 만하다. 이들 형질 전환체는 히스티딘 결핍 배지(MD-최소 덱스트로스)에서 증식할 능력이 있으며, 따라서 His-이다. 약 10% 내지 40%의 재조합체가 "메탄올 지체성"(MutS--"메탄올 이용이 느림"), 즉, 유일한 탄소원과 에너지원으로 메탄올을 함유하는 MM(최소 메탄올)과 같은 배지에서 감소된 증식을 나타낸다. 이들 His+/MutS형질 전환체는 이중 교차를 통해 His+유전자를 포함하는 MB 발현 카세트로 AOX1 구조적 유전자를 대체한 결과이다. 재조합은 AOX1 유전자를 손상시키지 않는 5' 및 3' AOX1 영역내로 발현 카세트를 통합 또는 삽입(단일 교차)시켜 발생할 수도 있다. His+/MutS클론중, 25%∼35%가 양성, MB3-발현 형질 전환체였다(표 2). AOX1-결실된 형질 전환체가 메탄올 배지에서 조금이라도 증식하는 이유는 AOX2 유전자 생성물에 의해 알코올 산화효소가 소량 발현되기 때문이다. 5' AOX1, 3'AOXI, 5' MB3, 3' MB3 및 기타 특이적 프라이머를 이용한 PCR로 "양성"재조합체로부터 분리된 DNA를 분석하면, 실제로 AOX1 구조 유전자가 MB3 및 HIS4 유전자를 포함하는 단편에 의해 대체된다는 것을 알 수 있다. His+/Mut+형질 전환체로부터 분리된 DNA를 분석하면, AOX1 구조 유전자가 손상되지 않았으며 His4 DNA를 함유하는 전체 벡터가 다른 장소에 통합된다는 것을 알 수 있다. MB3을 발현하는 39 AOX1-파괴된 형질 전환체 중에서, His+/Mut+형질 전환체는 발견되지 않았으며, 이는 통합에 의한 AOX1 대체 방식이 선호된다는 것을 의미한다.
84 피치아 형질 전환체의 면역 블롯 분석 결과로 모든 작제된 재조합 플라스미드, pHIL-D2/MB3, pHIL-S1/MB3, pPIC9/MB3, 및 pPIC9K/MB3을 사용하여 MB3 단백질을 발현할 수 있다는 것을 알 수 있다(표 3a 및 표 3b). MB3 단백질을 발현하는 39개의 클론을 분리하였다. 발현된 MB3 단백질의 항원 특이성을 검사하고, 야생형 엔.멘인기티디스 OMP 클래스 3에 대해 형성된 모노클론 항체 및 폴리클론 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 이들 결과로 모든 발현 벡터가 바르게 작제되었고, 피치아 스페로플라스트의 형질 전환체가 적절히 형성되었다는 것을 알 수 있다.
발현된 MB3의 양은 모델 GDS-7500 스캐닝 밀도계(UVP 라이프 사이언스) 또는 모델 IS-1000 밀도계(알파 인노텍 코포레이션)을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 분류된, 쿠마씨 브릴리언트 블루 염색된 단백질 밴드의 밀도계 스캐닝에 의해 측정하였다. 야생형의 엔.멘인기티디스에서 추출된 정제 OMP 클래스 3을 표준물질로 사용하였다. 이 결과(표 3a 및 표 3b에 요약)를 근거로하여, 단백질 발현 양이 중간 내지 다량이라고 추정하였다.
MB3 유전자(상기 재료 및 방법 참고)의 발현을 위해 번역 연장율을 최적화하는 것이 매우 유용하다. 출발 MB3 서열을 변형시키는 것이 포린 유전자(pHIL-D2/MB3 작제물)의 세포내 발현에 특히 효과적이다. 기타 작제물(pHIL-S1/MB3 및 pPIC9/MB3, MB3 분비를 위해 사용)이 MB3 삽입체의 리더 펩티드 서열 상류에 피치아에 최적인 코돈을 포함하기 때문에, 이들 카세트의 번역 개시는 속도-제한적이 아니다. 대조적으로, pHIL-D2/MB3 작제물은 리더 서열을 포함하지 않으며, 코돈의 최적화 없이 MB3 삽입체의 희소 코돈에서 번역을 개시해야 한다. 피치아 염색체 DNA내로 형질 전환되는 경우, 코돈-최적화된 pHIL-D2/MB3 작제물은 모든 기타 언급된 MB3 발현 작제물(표 3a, 표 3b 및 표 4)의 다량의 MB3 발현을 제공하였다. 따라서, MB3 번역 출발 서열의 변형은 pHIL-D2/MB3 작제물중 고 수율의 단백질 발현과 관련이 있는 것으로 보인다.
가장 좋은 클론(pHIL-D2/MB3 작제물로 형질 전환된 피치아)에 의한 MB3 발현양은 세포 현탁액 1ℓ당 0.1g∼0.6g이거나 또는 세포 펠렛당 1mg∼3mg이다(표 3a 및 표 3b, 도 12). 효모중 발현의 효율이 하기 제조된 여러 단백질에 대해 보고되어 있다: 간염 B 표면 항원(0.3g/L), 슈퍼옥시드 디스뮤타제(0.75g/L), 소 및 인체 라이소자임(각각, 0.3 g/L 및 0.7g/L), 인체 및 마우스 상피 증식 인자(각각 0.5g/L 및 0.45g/L), 인체 인슐린-유사 증식 인자(0.5g/L), 인체 인터루킨-2(1.0g/L), 아프로티닌 유사체(0.8g/L), 쿠니츠 프로테아제 억제인자(1.0g/L) 등(크레그 등, Biotechnology, 11:903-906, 표 1(1003)).
이전에 목록화한 모든 제조된 단백질의 발현 양은 고 세포 밀도 발효기에서 발효하는 동안 이들 단백질이 생성된 결과라는 것을 강조하는 것이다. 대개 발효시 보다 더 적은 발현양을 제공하는 진탕 플라스크 배양만을 이용하여 MB3을 발현시켰다. 최근 보고된 관찰 결과로 발효기에서 MB3의 더 높은 수율(5 내지 10 배 증가)을 예상할 수 있게 되었다(크레그 등, 1993). 피. 파스토리스는 진탕 플라스크를 정률 증가시킨 고 밀도의 발효기 배양에 잘 적응한다. 또한, AOX-결실된 피치아 균주를 발효에 사용하는 경우, 이종 단백질의 생성은 먼저 급속한 증식을 유발한 후, 추가의 세포 증식을 최소화하면서 단백질 생성을 유도하는 메탄올을 첨가하여 최적화될 수 있다. 피치아가 메탄올에서 증식하는 경우 요구되는 장시간은 몇가지 혼합된-공급 발효 방법중 하나를 사용하여 감소시킬 수 있다(시에겔 등, Biotechnol. Bioeng. 34:403-404(1989); 브리어리 등, Int. Patent Application No. WO 90/03431; 브리어리 등, Biochem. Eng. 589:350-362(1990); 시에겔 등, Int. Patent Application No. WO 90/10697(1990)).
피치아중 MB3 단백질 발현양에 대한 또 다른 바람직한 양태는 검사 결과가 모든 검사된 클론에 대해서 유사한 것이다. 여러 연구진들이 진탕 플라스크 유도에서 발현 양이 대상 삽입 유전자의 복사에 비례한다는 것을 발견하였기 때문에(클레어 등, 1991), 이로부터 시험한 모든 MB3 클론은 단일-복사 염색체 성분이고, 따라서 MB3 단편의 다중 통합된 복사를 갖는 피치아 재조합체는 분리할 수 없다는 것을 추론할 수 있다.
피. 파스토리스를 사용하여 고 발현양을 얻는데 중요한 인자는 다수 복사의 경태반 또는 통합으로 재조합체를 얻을 수 있는 능력이다(로만스 등, Vaccine 9:901-906(1991); 클래어 등, Bio/Technology 9:455-460(1991); 클래어 등, Gene 105:205-121(1991)). 다수복사 형질 전환체는 놀랍게도 고 세포 밀도 발효의 증식 및 유도시 다수 세대에 걸쳐 안정하다는 것을 발견하였다. 이 다수 유전자 삽입이 스페로플라스트 형질 전환 과정에서 낮은 빈도로 발생하기 때문에, 수 많은 재조합체의 특정 도트 블롯 선별법을 사용한다(스코러 등, Bio/Technology 12:181-184(1993)). 자발적인 다수 삽입체를 선별하는 다른 방법은 피치아 발현 벡터 pAO815내로 대상 유전자 다수 복사를 삽입시키는 것으며, 상기 벡터는 이 용도로 인비트로겐에서 최근 작제되었다.
MB3을 발현시키기 전에, 발현 양을 감소시킬 것으로 예상되는 기타의 요소가 존재하는지를 결정하기 위해서 단백질을 평가하였다. 예상되는 많은 양의 단백질 축적을 감소시킬 수 있는 요소중 하나는 단백질 분해에 대한 안정성이다. 다량 발현된 단백질은 우수한 PEST 서열이 결핍되어 있는 것으로 알려져 있다. PEST 서열은 프롤린(P), 글루탐산(E), 세린(S) 및 트레오닌(T)을 포함하며, 급속도로 분해되는 모든 진핵세포 단백질의 공지된 서열에서 발견된다; 이 단백질은 칼슘-활성화된 프로테아제가 선호하는 기질과 관련이 있다(로저 등, Science 234:364-369(1986)). 효모에서 다량 발현되는 단백질은, 단백질 분해에 감수성을 부여하는 소위 말하는 "우수한" PEST 서열(로저 등(1986)에 의해 개발된 연산에 의해 계산한 바에 의하면 스코어 >5 를 갖음)을 포함하지 않으며, 또한 라이소솜 경로에 의해 세포질 단백질의 분해에 선택적인 펜타펩티드 서열 XFXRQ 또는 QRXFX(X는 임의의 아미노산)을 포함하지도 않는다(디세, 제이.에프., Fed. Am. Soc. Exp. Biol.(FASEB) J. I:349-357 (1987)). 효모에서 다량으로 발현된 단백질은 이들 펜타펩티드 서열을 포함하지 않는다. MB3 서열의 컴퓨터 분석으로 서열ETSRSVFHQNGQVTEVTTAT를 갖는, "우수한" PEST 영역이 아니라 "불량한" PEST 영역(13-32a)으로 확인되었다. 로저 등(1986)에 따라, 불량한 PEST 서열은 진핵 세포 단백질의 단백질 분해 안정성에 대한 영향이 적다. 따라서, 단백질 분해를 유도하는 요인중 하나는 MB3에 존재하지 않는다.
MB3은 또한 고도로 보존된 전술한 펜타펩티드 서열을 포함하지 않는다. 서열 ROSFI(75-79aa)이 MB3에 존재한다; 이 서열은 분해 펜타펩티드 QRXFX에 일부 상동성을 갖지만 MB3을 크게 불안정화시키지는 않을 것으로 생각된다.
NH2-말단 아미노산 잔기의 특성은 분해에 대한 단백질의 감수성에 중요한 요소일 수 있다. 바샤브스키 등은 NH2-말단에 있는 특정 아미노산의 존재가 유비키틴-매개된 경로(N-말단 통제 경로)에 의한 빠른 분해에 대해 안정화 효과를 제공한다는 것을 증명하였다(바샤브스키 등, Yeast Genetic Engineering, Butterworths, p 109-143 (1989)). 효모에서 다량 발현되는 대부분의 단백질은 안정화 아미노-말단 아미노산 잔기(A, C, G, M, S, T 또는 V)를 갖는다. 이 단백질의 예로는 인체 슈퍼옥시드 디스뮤타아제, 인체 종량 괴사 인자, 에스. 세레비시애의 포스포글리세레이트 키나아제, 에스. 세레비시애의 전환효소, 피. 파스토리스의 알코올 산화효소, 및 와이. 리포리티카(Y. lipolytica)의 세포외 알카리 프로테아제가 있다(스렉리쉬나 등, Biochemistry 28:4117-4125(1989)). MB3이 효모에서 잘 발현되지만, MB3의 NH2-말단 아스파트산(D)은 유비퀴논-매개된 경로에 의한 급속한 분해에 대해 안정화 효과를 제공하지 않는다.
MB3의 NH2-말단 아스파르트산은 피치아로부터 MB3을 다량으로 생성하게 하는 역할을 한다. MB3의 제1아미노산을 전술한 단백질의 NH2-말단을 안정화시키는 것으로 알려진 아미노산 중 하나로 치환시키면, MB3 생성 양을 증가시킬 수 있다.
발현양을 감소시키는 것으로 알려진 대부분의 요소가 MB3에 존재하지 않을 때, 효모에서 MB3을 발현시키려는 실험을 진행하기로 하였다.
MB3의 가장 우수한 발현은 pHIL-D2/MB3 발현 카세트로 형질 전환시킨 피치아 클론에 의해 제공되었다(표 3a, 표 3b 및 4). pHIL-D2 벡터는 약 34kDa의 예상 분자량을 갖는, 완전히 단량체이고, 비융합되고 비분비되는 MB3를 세포내 발현시켰다. 이들 클론은 다량, 최대 600mg/ℓ 또는 습윤 세포 펠렛 1g당 3mg의 양으로 MB3을 발현시켰다. 이 생성물의 약 90%∼95%는 불용성이며, 막-결합 물질, 즉 10,000g에서 5분 동안 원심분리하면 침강되고 SDS-함유 완충액(PAGE 샘플 완충액)으로 처리한 후 비등시켜 추출할 수 있는 물질이다. 그 다음, 이 단백질은 수막염균 OMP 클래스 3 항체에 의해 쉽게 인식될 수 있는 구조로 복원될 수 있다.
메탄올로 pHIL-D2/MB3 작제된 클론을 유도하면 세포내 MB3이 급속도로 발현되어 빠르게 축적되었다. 메탄올로 유도한 지 24시간 후, 발현된 MB3의 양은, 5 내지 6일 후에 도달하는 최대량의 80% 이상으로 추정되었다.
pHIL-D2/MB3-함유 피치아 재조합체는 시판용으로 가장 유망하다. 이 클론은 상대적으로 많은 양의 발현을 제공하며, 이 발현양은 다수-복사 재조합체를 사용하고 발효기에서 단백질을 생산하여 현저히 개선시킬 수 있다. 또한 MB3이 급속도로 생성된다는 사실은 대규모 제조에 유리하다.
세포내 형태에서 발현된 MB3은 변성/재변성 방법을 사용한 후, 겔 여과 및 이온 교환 크로마토그래피시켜 정제하였다. 생성 정제 단백질은 크기 제한 크로마토그래피에서 이.콜리중 과발현된 재조합 클래스 3 단백질과 유사한 용출 프로필을 나타낸다. 이.콜리 또는 피.파스토리스에 의해 발현된 MB3을 천연 야생형 짝과 동시-용출시키면, 이.콜리 또는 피.파스토리스에 의해 발현된 MB3이 재중첩되고 올리고머화되어 천연 구조를 이룬다는 것을 알 수 있다(도 14A 및 14B).
에스.세레비시애의 천연(피치아) 분비 시그널(PHO1) 및 α-인자 시그널 서열은 발현된 포린을 분비 경로에 표적화시키는지를 검사하였다. 예상 밖으로, 단형 PHO1 리더가 MB3 분비를 유도하는데 더 효과적이었다. pHIL-S1 피치아 전달 벡터는 2.5kDa PHO1 리더 펩티드, 피. 파스토리스의 분비 시그널 펩티드를 암호하는 서열을 포함한다. pHIL-S1/MB3 작제물에서, MB3을 암호하는 서열은 PHO1 리더 서열의 하류에 삽입하였다. pHIL-S1/MB3 클론에 의해 생성된 36.5 kDa 발현된 융합 단백질 PHO1/MB3의 40%∼50%를 적절히 절단하여 34kDa MB3 단량체를 형성하고(표 2 및 표 3a 및 표 3b), 발현된 가용성 포린의 5%∼10%를 분비하였다. pPIC9 및 pPIC9K 피치아 전달 벡터는 에스.세레비시애로부터 유도된 10kDa의 α-인자 리더을 암호하는 서열의 포함한다. pPIC9/MB3 또는 pPIC9K/MB3으로 형질 전환시킨 피치아 클론은 포린을 분비하지 않는다. 이들 재조합체는 44kDa α-인자 프리프로/MB3 융합 단백질을 잘 발현시키나, 절단 및 프로세싱이 정확하다고 관찰된 것은 없다. PHO1 리더 또는 α-인자 리더 펩티드와 융합시킨 3'절단된 단편을 사용하여 발현된 MB3의 분비를 증가시키지 못하였다.
실시예 10
분비 단백질로서 발현된 MB3 단백질의 분리, 정제 및 특성화
MB3을 위한 유전자를 함유하는 발현 벡터(pHIL-S1-pNV318)를 보유한 효모 세포 배양액을 원심분리하여 가용성 분비 물질로서 단백질을 분리하였다. 20% 에탄올(v/v)로 침전시켜 오염 효모 배양 불순물을 제거하여 상등액을 맑게하였다. 이어서, 80% 에탄올(v/v)로 상등액을 침전시켰다. 기타 수용성 오염 분비 단백질을 제거하기 위해서, 생성 펠렛을 TEN 완충액(트리스 HCl, pH 8.0, 100mM NaCl 및 1mM EDTA)으로 세척하였다. MB3을 함유하는 펠렛을 세정액(가용화 완충액)의 수용액에 용해시키며, 상기 세정액은 TEN 완충액과 5% Z 3-14로 구성된다. 이 용액을 50mM 트리스, 0.2M Nacl 및 1.0mM EDTA(pH 8.0)로 평형시킨 Hi-Trap Q 세파로스 이온 교환 칼럼(1㎖)(파마시아)에 적용하였다. 0.2M∼1.0M NaCl의 구배를 적용하고, MB3 단백질을 단일 피크로 용출시켰다.
실시예 11
불용성-막 결합 단백질로서 발현된 MB3 단백질의 분리, 정제 및 특성화
파괴 완충액(즉, 50mM 인산 나트륨 완충액, pH 7.4, 1 mM EDTA 및 5% 글리세롤)에 MB3을 위한 유전자를 함유하는 발현 벡터(pHILD-2-pNV322)(표 3a 및 표 3b 참고)를 보유한 효모 세포 배양액을 50∼100 OD 농도로 재현탁시켰다. 동일한 부피의 산-세척 유리 비드에 현탁액을 첨가하였다. 미니비드-비이터(바이오스펙 프로덕츠, 오클라호마주 발트레스빌에 소재)를 사용하여 1분에 각각 8 연속 사이클, 각 사이클 사이에 얼음상에서 1분을 유지하여, 현탁액을 용균시켰다. 대안적인 방법으로, 자이모라아제를 파괴 완충액에 첨가하여 용균 과정을 용이하게 하였다. 현탁액을 유리 규화된 필터로 이동시켜 유리 비드를 분리하고, 세포 현탁액을 여과물에서 수거하였다. 추가로 비드를 세척하고 여과물을 혼합하였다. 이어서, 현탁액을 12,000rpm, 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 하기로 구성된, 일련의 연속적인 세척 단계를 생성 펠렛에 수행하였다: (a) 0.5% 데옥시콜레이트를 함유하는 TEN(트리스 HCl, pH 8.0, 100mM NaCl, 및 1mM EDTA); (b) 0.1% SDS 및 1% Nonidet를 함유하는 TEN 30분 동안 25℃에서 현탁액을 회전시킴; (c) TEN 완충액으로 세척; 및 (d) 4℃에서 밤새 회전시키면서 5% Z 3-14를 함유하는 TEN 완충액으로 세척. 각 세척 단계를 수행한 후 10분 동안 4℃에서 12,000rpm으로 원심분리하여 하기 단계를 위해 펠렛을 수거하였다. 펠렛을 세척하는 대안적인 방법으로서, 단계(b) 및 (d)의 회전 장소에서 현탁액을 18 게이지 바늘로 통과시켰다. 최종적으로, MB3을 8M 우레아 또는 6M 구아나디늄 HCl로 추출하고, 추출물을 수조 초음파기를 사용하여 초음파 처리하였다. 원심분리(12,000rpm, 10분, 4℃)하여 추출물을 맑게하고, 동일한 부피의 3,14-쯔비터겐(칼바이오켐) 10% 수용액을 첨가한 후, 용액을 완전하게 혼합하였다. 용액을 10분 동안 다시 초음파 처리하였다. 임의의 잔여 물질을 원심 분리로 제거하였다. 이어서, 혼합물을 0.1M 트리스-HCl, 0.2M NaCl, 10mM EDTA, 20mM CaCl2및 0.05% 3-14 쯔비터젠(pH8.0)으로 평형시킨 세파크릴 S-300(5×100cm) 칼럼(파마시아)에 적용하였다. 클래스 2 단백질을 함유하는 분획물을 SDS-PAGE로 동정하고, 모은 후, 50mM 트리스, 0.2M NaCl, 및 1.0mM EDTA(pH8.0)로 평형시킨 Hi-Trap Q 세파로스 이온 교환 칼럼(1㎖)에 적용하였다. 0.2M∼1.0M NaCl의 구배를 적용하고, MB3 단백질을 단일 피크로 용출시켰다. 도 14A, 도 14B 및 도 15는 HPLC(휴렛 팩커드, 모델 1090)에 연결된 세파로즈 12(파마시아)에서 정제된 MB3의 용출 프로파일을 보여준다. 천연 야생형 클래스 3 단백질과의 비교 뿐만 아니라 분자량 표준 물질을 사용한 측정을 기준으로 하여 용출 프로필로 삼량체 회합체라는 것을 알 수 있다.
실시예 12
GAMP-TT 접합체의 제조
12.1 접합체를 위한 NMA 다당체의 제조
엔. 멘인기티디스 A군(NMA) 균주 604A를 변형된 프란츠(Franz) 배지에서 증식시켰다(프란츠, 아이.디., J. Bact. 73:757-761(1942)). 양이온계 세정제 복합체로 다당체를 침전시킨 후 에탄올로 부분 침전시켜 고 분자량의 NMA 협막 다당체를 제공하였다. 고 분자량 다당체를 초 여과법으로 추가 정제하였다. 100mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 5.0)으로 70℃에서 다당체를 부분적으로 가수분해시켜 10,000∼20,000 달톤의 저 분자량 다당체를 생성하였다. 다당체의 유리 환원 말단 잔기를 차가운 NaBH4로 환원시켜 O-아세틸 치환체를 보존한 후 나트륨 페리오데이트로 산화시켜 말단 알데히드기를 생성하였다. 산화된 다당체를 정제하고 크기 제한 크로마토그래피로 분류하여 평균 분자량이 약 13,000 달톤인 활성화된 A군 수막염균 다당체(GAMP)를 제공하였다.
12.2 GAMP-TT 접합체의 제조
파상풍 톡소이드(세룸 스테이턴스 인스티튜트, 덴마크)를 먼저 정제하여 슈퍼덱스 G-200 칼럼(파마시아)을 사용하여 크기 제한 크로마토그래피애 의해 단량체 형태(분자량 150,000)로 정제하였다. 냉동 건조된 파상풍 톡소이드(1중량부) 및 산화된 GAMP(2.5 중량부)를 0.2M 인산 완충액 pH 7.5에 용해시켰다. 재결정화된 NaBH3CN(1부)를 첨가하고 반응 혼합물을 4일 동안 37℃에서 항온처리하였다. 슈퍼덱스 G-200 칼럼(파마시아) 및 용출물로서 0.01% 티메로살을 함유하는 PBS를 사용하여 크기 제한 크로마토그래피로 유리 성분으로부터 접합체를 정제하였다. 정제된 GAMP-파상풍 톡소이드 접합체를 이 완충액중 4℃에서 저장하였다. 인 분석(첸(Chen) 분석)을 기준으로 접합체의 다당체 함량은 약 18 중량%∼20중량%였다.
실시예 13
GCMP-TT 접합체의 제조
13.1 접합체용 NMC 다당체의 제조
협막 다당체를 나이세리아 멘인기티디스 C군(NMC) 균주 C11의 증식 배지로부터 분리하였다. 이 균주를 변형시킨 프란츠 배지에서 증식시켰다. NMC 다당체(C군 수막염균 다당체(GCMP))를 GAMP에 대해 전술한 바와 같이 세타블론 침전에 의해 배양 배지로부터 분리하였다. 천연 GCMP를 염기로 O-탈아세틸화시키고 NaIO4를 이용한 산화성 절단에 의해 해중합시켜 10,000∼20,000의 평균 분자량으로 만들었다. 절단된 다당체를 겔 여과 크로마토그래피에 의해 크기순으로 배열하고 정제하여 평균 분자량이 약 12,000 달톤이고 양 말단에 알데히드기를 갖는 고도로 정제된 생성물을 얻었다.
13.2 GCMP-TT 접합체의 제조
파상풍 톡소이드 단량체(1부) 및 고체 산화된 GCMP(1부)를 0.2M 인산 완충액 pH7.5에 용해시켜 4일 동안 1부의 재결정화된 NaBH3CN과 함께 37℃에서 항온처리하였다. 0.01% 티메로살을 함유하는 PBS를 용출물로 사용한 슈퍼덱스 G-200에서 겔 여과 크로마토그래피하여 유리 성분으로부터 접합체를 분리하였다. 정제된 접합체를 동물 연구를 위해 제제화하기 전에 4℃에서 저장하였다. 접합체중 다당체의 함량은 스베너홀름(Svennerholm) 레조르시놀 분석(Biochem. Biophys. Acta 244: 604-611(1957))으로 측정할 때 시알산 함량을 기준으로 33%였다.
실시예 14
N-프로피오닐 B군 수막염균 다당체-rPorB 접합체의 제조
14.1 나이세리아 PorB의 제조
이.콜리중 클래스 3 엔. 멘인기티디스 포린 단백질(PorB)의 발현 및 포린 유전자 생성물의 정제는 상기에 개시되어 있다. 100mM 트리스-HCl, 200nM Nacl, 10mM EDTA, 0.05% 쯔비터젠 3,14(칼바이오켐, 캘리포니아주 라 졸라 소재) 0.02% 아지드산 나트륨 pH 8.0으로 평형시킨 세파크릴 S-300 분자체 칼럼을 사용하여 재조합 rPorB 단백질을 정제하였다. 명백한 삼량체의 분자량을 갖는 OD280용출에 의해 측정된 단백질 분획물을 모으고, 0.25HEPES, 0.25M NaCl, 0.05% 쯔비터젠 3,14 pH8.5에 대해 투석 여과시켜 10mg/㎖∼12mg/㎖의 농도를 얻었다.
14.2 N-프로피오닐화된 B군 수막염균 다당체(GBMP)의 제조
N-프로피오닐화된 GBMP 및 이의 산화형을 미국 특허 제4,727,136호 및 EPO 0504202에 개시된 방법으로 제조하였으며, 이는 본원에서 참고로 인용하였다.
14.3 N-Pr-GBMP-rPorB 접합체의 제조
평균 분자량이 12,000인 10mg의 산화된 N-Pr-GBMP에 33㎕의 0.25M HEPES, 0.25% M NaCl, 0.05% 쯔비터젠 3,14 pH8.5중 12mg/㎖의 rPorB 단백질을 첨가하였다. 모든 고체가 용해될 때까지 용액을 혼합하고 6.5mg의 재결정화된 NaBH3CN을 첨가하였다. 용액을 37℃에서 4일 동안 항온처리하고, PBS-0.01% 티메로살로 평형시킨 슈퍼덱스 G-200 칼럼(파마시아)을 사용하여 혼합물로부터 접합체를 정제하였다. 단백질 분획물을 혼합하고 4℃에서 저장하였다. 시알산 함량에 대해 레조르시놀 분석법을, 단백질 함량에 대해 피어스 쿠마씨 플러스(Pierce Coomassie Plus) 분석을 수행하여 접합체를 분석하였다. 생성 접합체는 약 20%∼25%의 다당체 함량을 갖으며, LAL 및 토끼 발열성 시험으로 측정시 임의의 발열 물질이 없었다.
실시예 15
모세관 전기 영동에 의한 접합체 분석
15.1 시스템 및 방법
총 길이 47cm(유효 길이 40cm)×50㎛ 내경(375㎛ 외경)의 치수를 갖고 0.4N 보레이트 완충액(pH 10.2)를 전해질(캘리포니아주 팔로 알토에 소재하는 휴렛 팩거드)로 사용하여 미처리된 발연 실리카 모세관을 이용하여 벡크만 2000 시리즈 CE 시스템(캘리포니아 풀러톤에 소재하는 벡크만 인스트루멘츠 인코오포레이티드)상에 모세관 구간 전기 영동법으로 분석하였다. 벡크만 골드 시스템 소프트웨어를 사용하여 시스템 조절을 조절하고 데이터를 얻었다. 전압을 25KV로 설정하고 검출기는 200nm 검출 파장으로 설정하였다. 모세관 온도는 20℃로 하였다. 조작 중간사이에 모세관을 2.0분 동안 0.1M 수산화 나트륨으로 고압 세정한 후 2.0분 동안 탈이온수로 고압세정하도록 조건 설정하였다. 모든 샘플은 압력 주입하였다. 모든 완충액과 샘플 배지를 적절한 0.2㎛ 막 필터를 통과시키고 사용전에 탈기시켰다.
15.2 접합체 분석
정제 후에, 아미콘 센트리콘-3 농축기(매사츄세츠주 비버리에 소재하는 아미콘)를 통해 한외여과시켜 접합체를 농축하였다. 수막염균 다당체 및 파상풍 톡소이드 단량체 측정 샘플을 각각 0.25mg/㎖ 및 0.28mg/㎖의 농도로 탈이온수중에 제조하였다. 당단백질 접합체와 스파이크된 다당체 및 단백질의 일렉트로페로그램에서 증명되는 바와 같이, 이웃한 성분이 완전히 분리되는(Rs>1.5) 당단백질 및 접합체 성분을 선택하는 방법을 결정해야 한다(도 20 및 도 21). 도 20은 GAMP 및 TT-모노머 접합체 성분과 스파이크된 GAMP-TT 접합체를 보여주는 반면, 도 21은 GCMP 및 TT-모노머 접합체 성분과 스파이크된 GCMP-TT 접합체를 보여준다. 이 방법을 위한 유리 형태의 다당체 및 단백질 성분의 하한선(LLD)은 서브나노그램으로 측정하였다. 약 0.6ng의 정량 하한선(LLQ)을 각 성분의 유리 형태에 대해 얻었다. 선형 응답을 각 성분의 선택된 총 질량에 대해 얻었다. 다당체 및 단백질의 경우, 선형 응답을 선택된 총 질량에 대해 각각 0.2mg∼2.6ng 및 0.6ng∼2.4ng으로 얻었으며, 모든 곡선에서 0.99의 측정 계수를 갖는다. CZE계 분석을 사용하여, 수막염균 다당체-파상풍 톡소이드 접합체를 분석하면 유리 다당체의 함량이 약 5% 미만이고, 유리 단백질의 함량이 약 2% 미만이라는 것을 알 수 있다.
실시예 16
면역화 및 면역 분석
16.1 3가 접합체 백신 제제
각각의 접합체 성분(A,B,C)을 수산화 알루미늄(Al(OH)3) 알히드로겔(덴마크에 소재하는 슈퍼포스)상에서 최종 알루미늄 농도가 3가 백신의 1mg/㎖가 되도록 흡착시켰다. 각 접합된 다당체의 사용량을 다양하게 하여 3가 백신을 배합하였다. 각 A, B, 및 C 접합된 다당체의 약 2㎍; 또는 A 접합된 다당체 약 2㎍, B 접합된 다당체 약 5㎍ 및 C 접합된 다당체 약 2㎍; 또는 2㎖의 PBS, 0.01% 티메로살의 사용당 각 A, B, 및 C 접합된 다당체 약 5㎍으로 배합하였다.
16.2 면역화
4 내지 6주된 암컷 Balb/c 마우스(찰스 리버 래보러터리즈)를 0일, 28일 및 42일에 복강내 주사하였다. 0일, 14일, 28일 및 42일에 채혈시키고, 마지막으로 52일에는 마우스를 방혈시켰다. 혈청 분석 전에 혈청을 -70℃에 저장하였다.
16.3 면역분석
ELISA:각각 A, N-프로피오닐화된 B 및 C 다당체에 대한 항체 역가를 코팅 항원으로서 해당 HSA 접합체를 사용하여 ELISA로 측정하였다(도 22, 23 및 24). 흡광도 대 흡광도 x 희석 인자의 선형 회귀 곡선의 x-축 교점을 항체 역가로 정의하였다.
살균 역가 분석:보체의 공급원으로 어린 토끼 혈청을 사용하여 살균 분석을 수행하였으며, 이 분석에서 엔.멘인기티디스 균주 에이치 44/76(혈청형 15), C11 및 A1을 B군 수막염균, C군 수막염균 및 A군 수막염균 유기체로 각각 사용하였다(도 25, 26 및 27). 살균 역가는 생균수의 50% 감소가 생기는 혈청 희석율로 정의하였다.
이제까지 본 발명을 완전히 기술하였지만, 당업자라면 본 발명의 범주 및 임의의 양태에 영향을 주지 않고 조건, 배합 및 기타 변수의 범위를 다양하게 하여 본 발명을 실시할 수 있다는 것을 알 수 있다. 본원에서 인용한 모든 특허 및 공보는 전체를 참고로 인용하였다.
B군 수막염균 접합체 백신(N-Pr GBMP-단백질)의 ELISA 역가와 살균 역가
백신 보조제 ELISA 역가 살균 역가
N-Pr GBMP-TT 염수 5,400 0
Al(OH)3 13,000 0
ST1 17,000 0
CFA2 40,000 800
N-Pr GBMP-PP 염수 20,000 500
염수 22,000 150
염수 39,000 960
Al(OH)3 93,000 200
Al(OH)3 166,000 ＞3,200
Al(OH)3 130,000 1,200
ST 53,000 1,000
ST 29,000 1,700
ST 72,000 1,500
N-Pr GBMP 염수 ＞100 0
Al(OH)3 ＞100 0
ST ＞100 0
PP 염수 ＞100 0
Al(OH)3 ＞100 0
ST 660 0
1ST = 스테아릴 티로신2CFA = 완전 프로인트 보조제
효모(피치아) 세포의 형질전환 효율
작제물 분석된 형질전환체의 수 MB3 발현된 형질전환체
양성 반응 수 전체에 대한 %
pHIL-D2/MB3 32 9 28
pHIL-S1/MB3 23 8 35
pPIC9/MB3 16 4 25
pPIC9K/MB3 16 5 31
재조합 피치아 파스토리스를 사용한 MB3 포린 단백질의 발현
코드AMVAX 클론 벡터 발현양 분비
mg/g mg/L
pnv311 S1/MB3/3/s pHIL-S1 ND 20-30 0
pnv312 S1/MB3/5/s pHIL-S1 ND 30-40 0
pnv313 S1/MB3/7/s pHIL-S1 ND 30-40 0
pnv314 S1/MB3/12/s pHIL-S1 ND 20-30 5-10
pnv315 S1/MB3/15/s pHIL-S1 ND 20-30 0
pnv316 S1/MB3/18/s pHIL-S1 ND 80-100 5-10
pnv317 S1/MB3/22/s pHIL-S1 ND 50-60 5-10
pnv318 S1/MB3/23/s pHIL-S1 ND 300-400 5-10
pnv321 D2/MB3/1-7/s pHIL-D2 2.4 480 0
pnv322 D2/MB3/2-1/s pHIL-D2 3.0 600 0
pnv323 D2/MB3/2-6/s pHIL-D2 1.7 340 0
pnv324 D2/MB3/2-8/s pHIL-D2 1.6 320 0
pnv325 D2/MB3/4-1/s pHIL-D2 1.7 340 0
pnv326 D2/MB3/4-3/s pHIL-D2 2.4 480 0
pnv327 D2/MB3/4-4/s pHIL-D2 2.4 480 0
pnv328 D2/MB3/4-5/s pHIL-D2 2.4 480 0
pnv329 D2/MB3/4-26/s pHIL-D2 2.4 480 0
pnv341 P9/MB3/1-46/s pPIC-9 ND 10-20 0
pnv342 P9/MB3/1-261/s pPIC-9 ND 80-100 0
pnv343 P9/MB3/1-263/s pPIC-9 ND 20-30 0
pnv344 P9/MB3/1-268/s pPIC-9 ND 20-30 0
코드AMVAX 클론 벡터 발현양 분비
mg/g mg/ℓ
pnv345 9K/MB3/Tr/3-4/s pPIC-9K ND 150-200 5
pnv346 9K/MB3/Tr/3-5/s pPIC-9K ND 100-150 0
pnv347 9K/MB3/Tr/3-6/s pPIC-9K ND 100-150 0
pnv348 9K/MB3/Tr/3-8/s pPIC-9K ND 80-100 0
pnv349 9K/MB3/Tr/3-9/s pPIC-9K ND 80-100 0
pnv350 9K/MB3/6-1/s pPIC-9K ND 150-200 0
pnv351 9K/MB3/6-2/s pPIC-9K ND 100-150 0
pnv352 9K/MB3/6-3/s pPIC-9K ND 100-150 0
pnv353 9K/MB3/6-5/s pPIC-9K ND 80-100 0
pnv354 9K/MB3/6-9/s pPIC-9K ND 80-100 0
pnv355 9K/MB3/8-22/s pPIC-9K ND 150-200 0
pnv356 9K/MB3/9-5/s pPIC-9K ND 80-100 0
pnv357 9K/MB3/10-20/s pPIC-9K ND 80-100 0
pnv358 9K/MB3/10-33/s pPIC-9K ND 80-100 0
pnv359 9K/MB3/Tr/11- pPIC-9K ND 150-200 0
pnv360 9K/MB3/Tr/11- pPIC-9K ND 150-200 0
pnv361 9K/MB3/Tr/11- pPIC-9K ND 80-100 0
pnv362 9K/MB3/Tr/11- pPIC-9K ND 80-100 0
상이한 발현 카세트를 갖는 재조합 클론에 의한 MB3의 발현. 우수한 클론의 주요 특성
코드 pnv318s1/MB3/23/s pnv322D1/MB3/2-1/s pnv3459K/MB3/Tr/3-4/s pnv3509K/MB3/6-1/s
특성 pHIL-S1 pHIL-D2 pPIC 9K pPIC 9K
발현 벡터
융합된 리더 펩티드 PHO1(2.5kDa) 없음 α-인자(10kDa) α-인자(10kDa)
MB3을 위한 프로모터 AOX1 AOX1 AOX1 AOX1
발현 단백질(들)의 크기 34.0;37.5kDa 34.0kDa 43kDa 44kDa
절단(프로세싱) 절단(40%∼50%) 없음 없음 없음
분비 약함, <10% 없음 없음 없음
MB3 분해 <10% <10% <10% <10%
발현양(mg/g) 2.0 3.0 2.0 1.5
발현양(mg/L) 300.0 600.0 150.0 150.0
시토졸편재성 60%∼70% 5%∼10% 50% 50%
막 결합성 30%∼40% 90%∼95% 50% 50%
용해도 부분적으로 용해 불용성 부분적으로 용해 부분적으로 용해

Claims (33)

  1. (a) (i) 성숙 포린 단백질,
    (ii)성숙 포린 단백질을 효모 분비 시그널 펩티드에 융합시킨 융합 단백질로 구성된 군에서 선택된 단백질을 암호하는 유전자를, 선택성 표지를 갖는 플라스미드내로 결찰시키며, 이때 상기 유전자가 효모 프로모터에 작동가능하게 결합되는 단계;
    (b) 상기 유전자를 함유하는 플라스미드로 효모 균주를 형질전환시키는 단계;
    (c) 상기 형질전환된 효모를 선택할 수 있는 배양 배지에서 효모를 증식시켜 형질전환된 효모를 선택하는 단계;
    (d) 형질전환된 효모를 증식시키는 단계; 및
    (e) 상기 단백질의 발현을 유도하여 단백질을 함유하는 효모를 제공하는 단계를 포함하며, 이렇게 발현된 단백질이 상기 효모에서 발현되는 총 단백질의 약 2% 이상인 것이 특징인, 외막 수막염균(meningococcus) B군 포린 단백질 또는 이의 융합 단백질을 효모중에서 다량 발현시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 발현된 단백질이 효모에서 발현되는 총 단백질의 약 3%∼5% 인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 성숙 포린 단백질이 혈청군 B의 나이세리아 멘인기티디스(Neisseria meningitidis)성숙 외막 클래스 3 단백질인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 효모 프로모터가 AOX1 프로모터인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 효모 분비 시그널 펩티드가 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) α-접합 인자 프리프로(prepro)-펩티드의 분비 시그널과 피. 파스토리스(P. pastoris) 산 포스파타제 유전자의 분비 시그널로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 플라스미드가 pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC9 및 pPIC9K로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 유전자가 효모 코돈용으로 최적화된 코돈을 병입시킨 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 효모 코돈용으로 최적화된 코돈이 유전자의 5' 영역에 존재하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 유전자의 5' 영역이 하기의 뉴클레오티드 서열인 방법:
  10. 제8항에 있어서, 효모가 피.파스토리스(P. pastoris)인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 효모가 증식 배지내로 단백질 또는 융합 단백질을 분비하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 플라스미드가 pHIL-S1, pPIC9 및 pPIC9K로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  13. (a) 제1항에 기재된 단계 (d)에서 얻은 효모를 용균시켜 불용성 막 결합 분획물로서 수막염균 B군의 외막 포린 단백질 또는 이의 융합 단백질을 방출시키는 단계;
    (b) 단계(a)에서 얻은 불용성 막 결합 분획물을 완충액으로 세척하여 오염성 효모 세포 단백질을 제거하는 단계;
    (c) 단계(b)에서 얻은 불용성 막 결합 분획물을 변성제 수용액에 현탁 및 용해시키는 단계;
    (d) 단계(c)에서 얻은 용액을 세정제로 희석시키는 단계; 및
    (e) 상기 단백질 또는 융합 단백질을 겔 여과 및 이온 교환 크로마토그래피로 정제시키는 단계를 포함하여, 제1항에 기재된 방법에 따라 얻은 수막염균 B군의 외막 포린 단백질 또는 이의 융합 단백질을 정제하는 방법.
  14. (a) 수막염균 B군의 외막 포린 단백질이나 이의 융합 단백질이 발현된 제11항에 기재된 효모의 배양액을 원심분리하여 가용성 분비 물질로서 상기 단백질을 분리하는 단계;
    (b) 단계(a)에서 얻은 가용성 분비 물질로부터 오염성 효모 배양 불순물을 약 20% 에탄올로 침전·제거하여, 가용성 분비 물질을 가용성 분획물에 잔존시키는 단계;
    (c) 단계(b)의 가용성 분획물로부터 분비 물질을 약 80% 에탄올로 침전시키는 단계;
    (d) 단계(c)에서 얻은 침전 물질을 완충액으로 세척하여 오염성 효모 분비 단백질을 제거하는 단계;
    (e) 단계(d)에서 얻은 침전 물질을 세정제 수용액에 현탁 및 용해시키는 단계; 및
    (f) 이온 교환 크로마토그래피로 단백질을 정제시키는 단계를 포함하여, 제11항에 기재된 방법에 따라 얻은 수막염균 B군의 외막 포린 단백질 또는 이의 융합 단백질을 정제하는 방법.
  15. (a) 성숙 포린 단백질 및
    (b) 성숙 포린 단백질을 효모 분비 시그널 펩티드에 융합시킨 융합 단백질로 구성된 군에서 선택된 단백질을 암호하는 유전자를 포함하는 효모 숙주 세포.
  16. 제15항에 있어서, 효모가 유전자의 하나 이상의 복사를 포함하는 효모 숙주 세포.
  17. 제15항에 있어서, 성숙 포린 단백질이 혈청군 B의 나이세리아 멘인기티디스(Neisseria meningitidis)성숙 외막 클래스 3 단백질인 효모 숙주 세포.
  18. 제17항에 있어서, 플라스미드가 pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC9, pPIC9K 및 pAO815로 구성된 군에서 선택되는 효모 숙주 세포.
  19. 제15항에 있어서, 효모가 피. 파스토리스(P. pastoris)인 효모 숙주 세포.
  20. 제15항에 있어서, 단백질을 암호하는 유전자의 5' 영역이 하기의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호되는 효모 숙주 세포:
  21. 하나 이상의 코돈이 변경되어 효모 코돈용으로 최적화된, 수막염균 B군의 외막 포린 단백질을 암호하는 뉴클레오티드 서열.
  22. 제21항에 있어서, 포린 단백질이 혈청군 B의 성숙 외막 클래스 3 단백질이고, 코돈 변경이 (자연 서열의 위치 4∼6에서 GTT를 GTC로), (자연 서열의 위치 7∼9에서 ACC를 ACT로), (자연 서열의 위치 10∼12에서 CTG를 TTG로), (자연 서열의 위치 16∼18에서 GGC를 GGT로), (자연 서열의 위치 19∼21에서 ACC를 ACT로), (자연 서열의 위치 22∼24에서 ATC를 ATT로), (자연 서열의 위치 25∼27에서 AAA를 AAG로), (자연 서열의 위치 28∼30에서 GCC를 GCT로), (자연 서열의 위치 31∼33에서 GGC를 GGT로), (자연 서열의 위치 34∼36에서 GTA를 GTT로), (자연 서열의 위치 37∼39에서 GAA를 GAG로)의 변경으로 구성된 군에서 선택되며, 여기서 각 위치는 단백질을 암호하는 자연 뉴클레오티드 서열의 제1 뉴클레오티드로부터 번호매긴 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
  23. A군 수막염균 다당체(GAMP), B군 수막염균 다당체(GBMP) 및 C군 수막염균 다당체(GCMP) 항원과 함께 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 백신.
  24. 제23항에 있어서, A군 수막염균 다당체(GAMP), B군 수막염균 다당체(GBMP) 및 C군 수막염균 다당체(GCMP) 항원이 각각 단백질 캐리어에 접합된 백신.
  25. 제24항에 있어서, GBMP 항원이 접합된 단백질 캐리어가 클래스 3 엔.멘인기티디스(N. meningitidis)포린 단백질(PorB)인 백신.
  26. 제24항에 있어서, GAMP 항원 및 GCMP 항원이 접합된 단백질 캐리어가 파상풍톡소이드인 백신.
  27. 제25항에 있어서, GBMP 항원이 PorB에 접합되기 전에 N-프로피오닐화되는 것을 특징으로 하는 백신.
  28. 제24항에 있어서, 백신이 약 2㎍의 GAMP, GCMP 및 GBMP 다당체 항원 접합체를 포함하는 백신.
  29. 제24항에 있어서, 백신이 약 5㎍의 GAMP, GCMP 및 GBMP 다당체 항원 접합체를 포함하는 백신.
  30. 제24항에 있어서, 백신이 약 2㎍의 GAMP 및 GCMP 다당체 항원 접합체와, 약 5㎍의 GBMP 다당체 항원 접합체를 포함하는 백신.
  31. A군 수막염균 다당체(GAMP), B군 수막염균 다당체(GBMP) 및 C군 수막염균 다당체(GCMP) 항원과 함께, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 백신을, 포유동물에게 면역 응답을 유도하기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함하여, 포유 동물에서 면역 응답을 유도하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, A군 수막염균 다당체(GAMP), B군 수막염균 다당체(GBMP) 및 C군 수막염균 다당체(GCMP) 항원이 각각 단백질 캐리어에 접합된 것임을 특징으로 하는 방법.
  33. 제31항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
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