KR20170023191A

KR20170023191A - 변형된 수막구균 fhbp 폴리펩티드

Info

Publication number: KR20170023191A
Application number: KR1020177004243A
Authority: KR
Inventors: 매튜 보텀리; 베가 마시그나니
Original assignee: 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
Priority date: 2014-07-17
Filing date: 2015-07-16
Publication date: 2017-03-02
Also published as: TR201901062T4; JP2017522320A; US11066450B2; ES2722773T3; MX2017000776A; US20170226161A1; SG11201610945PA; EP3169357B1; WO2016008960A1; AU2015289192A1; US11939357B2; BE1022641B1; CA2954745A1; CN106795208A; US20220002355A1; BE1022641A1; EP3169357A1; IL249822A0; EA201692552A1; ZA201700170B

Abstract

본 발명자는 수막구균 fHbp의 변이체 2 및 변이체 3의 특성을 향상시키기 위해 변형될 수 있는 수막구균 fHbp의 변이체 2 및 변이체 3 내의 잔기를 확인하였다.

Description

변형된 수막구균 FHBP 폴리펩티드{MODIFIED MENINGOCOCCAL FHBP POLYPEPTIDES}

기술 분야

본 발명은 유용한 백신 면역원으로 공지된, 특히 수막구균 H 인자 결합 단백질(fHbp)에 관한 단백질 공학의 분야이다.

배경

네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)는 인구의 약 10%의 상부 기도에 집락화되는 그램 음성 캡슐화 박테리아이다. 컨쥬게이트 백신은 혈청군 A, C, W135 및 Y에 대해 이용가능하지만, 혈청군 B에 대해 보호하기 위해 이용되는 유일한 백신은 일반적으로 2013년에 승인된 BEXSERO™ 제품이다.

BEXSERO™의 보호성 면역원 중 하나는 fHbp이고, 이것은 단백질 '741'(참고문헌 1의 SEQ ID NO:2536; 본원에서 SEQ ID:1), 'NMB1870', 'GNA1870'[2-4, 'P2086', 'LP2086' 또는 'ORF2086'[5-7]로도 알려져 있다. 이러한 단백질의 3D 구조가 공지되어 있고 [8,9], 단백질은 짧은 링커에 의해 연결된 2개의 β-배럴을 갖는다. 다수의 간행물이 수막구균 백신에서 이러한 단백질의 보호 효능을 보고하였고, 예를 들어, 참고문헌 10-14를 참조한다. fHbp 지질단백질은 모든 혈청군에 걸쳐 다양한 균주에서 발현된다. fHbp 서열은 3개의 변이체로 그룹화되었고[2](본원에서 v1, v2 및 v3으로서 언급됨), 일반적으로 주어진 변이체에 대해 생성된 혈청은 그 변이체를 발현시키는 균주에 대해 살균성이나, 다른 2개의 변이체 중 하나를 발현시키는 균주에 대해서는 활성이 아님이 발견되었고, 즉, 변이체내 교차-보호는 존재하나, 변이체간 교차-보호는 존재하지 않는다(일부 v2 및 v3 교차-반응성은 예외임).

패밀리간 교차-반응성을 증가시키기 위해, fHbp 서열은 3개 모두의 변이체에 대해 특이성을 함유하도록 공학처리되었다[15]. 단백질 공학은 fHbp와 철결합체[16] 및 인간 H 인자[17-25]의 상호작용을 제거하는 데에도 이용되었다. fH와의 상호작용의 붕괴는 3개 모두의 변이체에 대해 보고되었고, 우수한 백신 면역원을 제공한다고 가정된다[22,26]. 그러나, v2 폴리펩티드의 경우, 참고문헌 23 및 24는 붕괴된 fH-결합을 지닌 돌연변이체에서 또한 보여진 고유의 불안정성을 보고한다. 불안정성은 N-말단 β-배럴 도메인에서 발생한 것으로 보이며, 참고문헌 23은 이러한 배럴에서의 임의의 치환이 불안정성을 촉진시킬 수 있다고 경고한다. v2 서열의 안정성을 개선시키는 것을 목적으로 하는 돌연변이가 참고문헌 27에 개시되어 있다.

본 발명의 목적은 향상된 특성을 갖는 fHbp v2 및 v3 돌연변이체를 제공하는 것이다.

발명의 개요

한 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:5와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공하며, 아미노산 서열은 SEQ ID NO:5에 비해 잔기 123 및 240에서 SEQ ID NO:5와 상이하고, 폴리펩티드는 인간으로의 투여 후 SEQ ID NO:4로 구성된 폴리펩티드를 인지할 수 있는 항체를 유도할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 SEQ ID NO:5와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, 아미노산 서열은 SEQ ID NO:5에 비해 잔기 32, 123 및 240에서 SEQ ID NO:5와 상이하고, 폴리펩티드는 인간으로의 투여 후 SEQ ID NO:4로 구성된 폴리펩티드를 인지할 수 있는 항체를 유도할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 SEQ ID NO:17과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, 아미노산 서열은 SEQ ID NO:17에 비해 잔기 126 및 243에서 SEQ ID NO:17과 상이하고, 폴리펩티드는 인간으로의 투여 후 SEQ ID NO:40으로 구성된 폴리펩티드를 인지할 수 있는 항체를 유도할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 SEQ ID NO:17과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, 아미노산 서열은 SEQ ID NO:17에 비해 잔기 32, 126 및 243에서 SEQ ID NO:17과 상이하고, 폴리펩티드는 인간으로의 투여 후 SEQ ID NO:40으로 구성된 폴리펩티드를 인지할 수 있는 항체를 유도할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 SEQ ID NO:47과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, SEQ ID NO:47에 비해 잔기 123은 류신이 아니고, 잔기 240은 글루타메이트가 아니고, 인간으로 투여되는 경우, 폴리펩티드는 v2 fHbp를 발현하는 수막구균에 대해 살균성인 항체 반응을 유도할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 SEQ ID NO:47과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, SEQ ID NO:47에 비해 잔기 32는 세린이 아니고, 잔기 123은 류신이 아니고, 잔기 240은 글루타메이트가 아니고, 인간으로 투여되는 경우, 폴리펩티드는 v2 fHbp를 발현하는 수막구균에 대해 살균성인 항체 반응을 유도할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 SEQ ID NO:48과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, SEQ ID NO:48에 비해 잔기 126은 류신이 아니고, 잔기 243은 글루타메이트가 아니고, 인간으로 투여되는 경우, 폴리펩티드는 v3 fHbp를 발현하는 수막구균에 대해 살균성인 항체 반응을 유도할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 SEQ ID NO:48과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, SEQ ID NO:48에 비해 잔기 32는 세린이 아니고, 잔기 126은 류신이 아니고, 잔기 243은 글루타메이트가 아니고, 인간으로 투여되는 경우, 폴리펩티드는 v3 fHbp를 발현하는 수막구균에 대해 살균성인 항체 반응을 유도할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 인간으로 투여되는 경우 v2 fHbp를 발현하는 수막구균 및 v3 fHbp를 발현하는 수막구균 둘 모두에 대해 살균성인 항체 반응을 유도하는 융합 폴리펩티드이다.

본 발명의 또 다른 양태는 약학적으로 허용되는 담체 및 본 발명의 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물이다.

본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 인간에게 투여하는 것을 포함하는 인간에서 항체 반응을 발생시키는 방법이다.

도면의 간단한 설명
도 1은 고정된 fH에 결합하는 야생형 v2 fHbp(상부 라인), v2의 E266 돌연변이체(하부 라인) 및 v2의 S58V/L149R 돌연변이체(중간 라인)에 대한 SPR 반응을 제시한다. y-축은 상대 단위를 제시하고, x-축은 시간(초, 0은 샘플 주입임)을 제시한다.
도 2는 야생형 및 S58V/L149R 돌연변이체 v2 fHbp에 대한 DSC 결과를 제시한다. C-말단 도메인은 돌연변이에 의해 영향을 받지 않았으나, N-말단 도메인의 Tm은 >20℃만큼 증가되었다(화살표로 표시됨). y-축은 Cp(kcal/mol/℃)를 제시하고, x-축은 온도(℃)를 제시한다.
도 3은 야생형 및 E266A 돌연변이체 v2 fHbp에 대한 DSC 결과를 제시한다. N-말단 전이는 돌연변이체에서 없어지나, C-말단 도메인의 Tm은 >16℃만큼 증가되었다.
도 4는 '야생형'(상부 라인, 점선) 및 'SNB 돌연변이체'(하부 라인, 실선) v2-v3-v1 fHbp 융합 폴리펩티드의 SPR 반응을 제시한다.
도 5는 (A) '야생형' 및 (B) 'SNB 돌연변이체' v2-v3-v1 fHbp 융합 폴리펩티드에 대한 DSC 결과를 제시한다.
도 6은 야생형(상부) 또는 다양한 돌연변이로서 v3 fHbp의 SPR 반응을 제시한다.
도 7은 S58 및 L149 돌연변이를 이용한 fHbp의 안정화 후 H 인자의 부재하에서 X-선 결정학에 의해 결정된 v2(도 7a) 및 v3(도 7b) fHbp의 구조를 제시한다.
도 8은 웨스턴 블롯에 의해 탐지된 E. 콜리 추출물에서의 안정화된 비-결합 융합체(SEQ ID NO:27)에 비한 '야생형' 융합체(SEQ ID NO:18)의 안정성을 비교한다. 도 8a는 안정화된 비-결합 융합체의 트렁케이션된 형태가 덜 우세한 것을 제시한다. 도 8b는 안정화된 비-결합 융합체가 '야생형' 융합체보다 키모트립신에 의한 분해 경향이 덜한 것을 입증한다.
도 9는 231 SNB 융합체의 개략도를 제공한다.

상세한 설명

v2의 균주 2996으로부터의 전장 fHbp는 하기 아미노산 서열(SEQ ID NO:2)을 갖는다:

성숙 지질단백질에는 SEQ ID NO:2의 처음 19개 아미노산이 결여되어 있다(밑줄표시; SEQ ID NO:4를 제공함, Cys-20으로 시작함). N-말단이 잔기 26까지 트렁케이션되어(즉, 폴리-글리신 스트레치(stretch)를 제거하고, 대신 Val-27로 시작함), 이에 따라 SEQ ID NO:5를 제공하는 fHbp의 'ΔG' 형태를 생성시키는 것이 또한 공지되어 있다.

v3의 균주 M1239으로부터의 전장 fHbp는 하기 아미노산 서열(SEQ ID NO:3)을 갖는다:

성숙 지질단백질에는 SEQ ID NO:3의 처음 19개 아미노산이 결여되어 있고(밑줄표시; SEQ ID NO:40을 제공함), SEQ ID NO:3의 ΔG 형태에는 처음 31개의 아미노산이 결여되어 있다(SEQ ID NO:17).

본 발명자는 v2 및 v3에서의 돌연변이의 2개의 상이한 유형을 연구하였다. 첫째로, 이들은 폴리펩티드의 안정성을 증가시키기 위해 변형될 수 있는 SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3 내의 잔기를 확인하였다. 둘째로, 이들은 인간 H 인자(fH)에 대한 결합을 감소시키는 잔기를 확인하였다. 본 발명은 둘 모두의 유형의 돌연변이를 포함하고, 이에 의해 fHbp 폴리펩티드에 향상된 특성을 제공하는 돌연변이체 fHbp 폴리펩티드에 관한 것이다. 특히, H 인자에 결합하지 않으나 면역원성을 보유한 fHbp 돌연변이체가 유리한데, 이는 결과로서 발생한 항체 반응이 fH-결합 부위 내 또는 근처의 에피토프에 대한 것이기 때문이다. 야생형 fHbp 백신 항원을 이용한 예방접종 후, 상기 에피토프는 H 인자 결합에 의해 가려질 수 있다.

가장 흥미로운 아미노산은 하기와 같으며, 이는 전장 서열(SEQ ID NO:1 & 3) 및 또한 ΔG 서열(SEQ ID NO:5 & 17)에 따라 넘버링된다.

돌연변이 v2 fHbp

따라서, 첫번째 양태에서, 본 발명은 돌연변이체 fHbp v2 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공하며, (a) 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO:5와 적어도 k%의 서열 동일성을 갖고/갖거나, SEQ ID NO:5의 단편을 포함하나, (b) 상기 아미노산 서열은 잔기 L123 및 E240(및, 임의로, 잔기 S32)(아미노산의 넘버링은 SEQ ID NO:5에 비함)에서 SEQ ID NO:5와 상이하다.

특징 (a)가 단편에 관한 것일 때, 단편은 (b)에 열거된 2개(또는 임의로 3개)의 잔기를 포함할 것이지만, 이들 잔기는 SEQ ID NO:5의 위치와 비교할 때 상이할 것이다. 돌연변이체 fHbp v2 아미노산 서열은 SEQ ID NO:5와 적어도 k%의 서열 동일성을 가질 수 있고, SEQ ID NO:5의 여러 단편을 포함할 수 있으며, 각각의 상기 단편은 적어도 7개의 아미노산 길이이다. 이들 단편은 통상적으로 SEQ ID NO:5로부터의 적어도 하나의 에피토프를 포함할 것이다. 에피토프 확인 및 맵핑은 fHbp에 대해 확립되어 있다[11; 28-31].

k의 값은 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 이상으로부터 선택될 수 있다. 이는 바람직하게는 90이고(즉, 돌연변이체 fHbp v2 아미노산 서열은 SEQ ID NO:5와 적어도 90%의 동일성을 가짐), 더욱 바람직하게는 95이다.

폴리펩티드는 적합한 숙주 동물(예를 들어, 마우스 또는 인간)로의 투여 후에 SEQ ID NO:4로 구성된 야생형 수막구균 폴리펩티드를 인지할 수 있는 항체를 유도할 수 있다. 이들 항체는, 비록 이들이 v1 및/또는 v3 폴리펩티드와 교차반응하는 일부 항체를 또한 포함할 수 있지만, v1 또는 v3 폴리펩티드를 인지하지 않는(예를 들어, SEQ ID NO:46으로 구성된 야생형 수막구균 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:40으로 구성된 야생형 수막구균 폴리펩티드를 인지하지 않을) 일부 항체를 포함할 것이다. 항체는 이상적으로는 v2 fHbp를 발현하는 수막구균 균주, 예를 들어, M2091 균주에 대해 살균성이다(하기 참조).

폴리펩티드는, 동일한 실험 조건 하에서, (b)의 서열 차이들이 없는 동일한 폴리펩티드보다 높은 안정성, 예를 들어, SEQ ID NO:4로 구성된 야생형 수막구균 폴리펩티드보다 높은 안정성을 갖는다. 안정성 향상은, 예를 들어, 참고문헌 33 & 34에 논의된 대로 시차주사열량측정법(DSC)을 이용하여 평가될 수 있다. DSC는 v2 fHbp의 안정성을 평가하기 위해 종래에 이용되어 왔다[24]. 안정성을 평가하기 위한 DSC에 적합한 조건은 100-200mM NaCl(예를 들어, 150mM)에 의해 pH가 6 내지 8(예를 들어, 7-7.5)인 완충된 용액(예를 들어, 25mM Tris)에서 20μM의 폴리펩티드를 이용할 수 있다.

안정성의 증가는 이상적으로는 적어도 5℃, 예를 들어, 적어도 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃ 이상이다. 이들 온도는 DSC에 의해 평가시 열전이 중간점(Tm)에서의 증가를 나타낸다. 야생형 fHbp는 언폴딩 동안 2개의 DSC 피크를 나타내며(N-말단 도메인에 대해 하나 및 C-말단 도메인에 대해 하나), 본 발명의 폴리펩티드가 둘 모두의 상기 도메인을 포함하는 경우, 상기 증가는 N-말단 도메인의 안정성을 나타내는데, 이는 야생형 v2 서열에 대해 40℃ 이하에서도 발생할 수 있다[24](반면 C-말단 도메인은 80℃ 이상의 Tm을 가질 수 있다). 따라서, 본 발명의 돌연변이체 fHbp v2 아미노산 서열은 바람직하게는 적어도 45℃, 예를 들어, ≥50℃, ≥55℃, ≥60℃, ≥65℃, ≥70℃, ≥75℃, 또는 심지어 ≥80℃의 Tm을 갖는 N-말단 도메인을 갖는다.

이러한 증가된 안정성에 더하여, 폴리펩티드는, 동일한 실험 조건하에서, (b)의 서열 차이들이 없는 동일한 폴리펩티드보다 인간 fH에 대한 낮은 친화성, 예를 들어, SEQ ID NO:4로 구성된 야생형 수막구균 폴리펩티드보다 낮은 친화성을 갖는다. 친화성 붕괴는, 예를 들어, 고정된 인간 fH를 이용하여 참고문헌 18 및 21-24에 개시된 바와 같이 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 이용하여 정량적으로 평가될 수 있다. 적어도 10배, 이상적으로는 적어도 100배의 친화성 감소(즉, 해리 상수, K_D에서의 증가)가 바람직하다.

일부 구체예에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:5에 비해 트렁케이션된다. 야생형 성숙 서열에 비해, SEQ ID NO:5는 폴리-글리신 서열까지 및 폴리-글리신 서열을 포함하여 N-말단에서 이미 트렁케이션되어 있으나(SEQ ID NO:4 및 5 비교), SEQ ID NO:5는 C-말단에서 트렁케이션될 수 있고/있거나 N-말단에서 추가로 트렁케이션될 수 있다.

돌연변이체 v3 fHbp

두번째 양태에서, 본 발명은 돌연변이체 fHbp v3 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공하며, (a) 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO:17과 적어도 j%의 서열 동일성을 갖고/갖거나, SEQ ID NO:17의 단편을 포함하나, (b) 상기 아미노산 서열은 잔기 L126 및 E243(및, 임의로, 잔기 S32)(아미노산의 넘버링은 SEQ ID NO:17에 비함)에서 SEQ ID NO:17과 상이하다.

특징 (a)가 단편에 관한 것일 때, 단편은 (b)에 열거된 2개(또는 임의로 3개)의 잔기를 포함할 것이지만, 이들 잔기는 SEQ ID NO:17의 위치와 비교할 때 상이할 것이다. 돌연변이 fHbp v3 아미노산 서열은 SEQ ID NO:17과 적어도 j% 서열 동일성을 가질 수 있고, SEQ ID NO:17의 여러 단편을 포함할 수 있으며, 각각의 상기 단편은 적어도 7개의 아미노산 길이이다. 이들 단편은 통상적으로 SEQ ID NO:17로부터의 적어도 하나의 에피토프를 포함할 것이다. 에피토프 확인 및 맵핑은 fHbp에 대해 확립된다[11; 28-32].

j의 값은 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 이상으로부터 선택될 수 있다. 이는 바람직하게는 90이고(즉, 돌연변이체 fHbp v3 아미노산 서열은 SEQ ID NO:17과 적어도 90%의 동일성을 가짐), 더욱 바람직하게는 95이다.

폴리펩티드는 적합한 숙주 동물(예를 들어, 마우스 또는 인간)로의 투여 후에 SEQ ID NO:40으로 구성된 야생형 수막구균 폴리펩티드를 인지할 수 있는 항체를 유도할 수 있다. 이들 항체는, 비록 이들이 v1 및/또는 v2 폴리펩티드와 교차반응하는 일부 항체를 또한 포함할 수 있지만, v1 또는 v2 폴리펩티드를 인지하지 않는(예를 들어, SEQ ID NO:46으로 구성된 야생형 수막구균 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:4로 구성된 야생형 수막구균 폴리펩티드를 인지하지 않을) 일부 항체를 포함할 것이다. 항체는 이상적으로는 v3 fHbp를 발현하는 수막구균 균주, 예를 들어, M01-240355 균주에 대해 살균성이다(하기 참조).

폴리펩티드는, 동일한 실험 조건 하에서, (b)의 서열 차이들이 없는 동일한 폴리펩티드보다 높은 안정성, 예를 들어, SEQ ID NO:40으로 구성된 야생형 수막구균 폴리펩티드보다 높은 안정성을 갖는다. 안정성 향상은, 예를 들어, 참고문헌 33 & 34에 논의된 대로 시차주사열량측정법(DSC)을 이용하여 평가될 수 있으며, DSC는 v3 fHbp의 안정성을 평가하기 위해 종래에 사용되어 왔다[23]. 안정성을 평가하기 위한 DSC에 적합한 조건은 100-200mM NaCl(예를 들어, 150mM)에 의해 pH가 6 내지 8(예를 들어, 7-7.5)인 완충된 용액(예를 들어, 25mM Tris)에서 20μM의 폴리펩티드를 이용할 수 있다.

안정성의 증가는 이상적으로는 적어도 5℃, 예를 들어, 적어도 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃ 이상이다. 이들 온도는 DSC에 의해 평가시 열전이 중간점(Tm)에서의 증가를 나타낸다. 야생형 fHbp는 언폴딩 동안 2개의 DSC 피크를 나타내며(N-말단 도메인에 대해 하나 및 C-말단 도메인에 대해 하나), 본 발명의 폴리펩티드가 둘 모두의 상기 도메인을 포함하는 경우, 상기 증가는 N-말단 도메인의 안정성을 나타내는데, 이는 야생형 v3 서열에 대해 약 60℃ 이하에서 발생할 수 있다[24](반면 C-말단 도메인은 80℃ 이상의 Tm을 가질 수 있다). 따라서, 본 발명의 돌연변이체 fHbp v3 아미노산 서열은 바람직하게는 적어도 65℃, 예를 들어, ≥70℃, ≥75℃, 또는 심지어 ≥80℃의 Tm을 갖는 N-말단 도메인을 갖는다.

이러한 증가된 안정성에 더하여, 폴리펩티드는, 동일한 실험 조건하에서, (b)의 서열 차이들이 없는 동일한 폴리펩티드보다 인간 fH에 대한 낮은 친화성, 예를 들어, SEQ ID NO:40으로 구성된 야생형 수막구균 폴리펩티드보다 낮은 친화성을 갖는다. 친화성 붕괴는, 예를 들어, 고정된 인간 fH를 이용하여 참고문헌 18 및 21-24에 개시된 바와 같이 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 이용하여 정량적으로 평가될 수 있다. 적어도 10배, 이상적으로는 적어도 100배의 친화성 감소(즉, 해리 상수, K_D에서의 증가)가 바람직하다.

일부 구체예에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:17에 비해 트렁케이션된다. 야생형 성숙 서열에 비해, SEQ ID NO:17은 폴리-글리신 서열까지 및 폴리-글리신 서열을 포함하여 N-말단에서 이미 트렁케이션되어 있으나(SEQ ID NO:40 및 17 비교), SEQ ID NO:17은 C-말단에서 트렁케이션될 수 있고/있거나 N-말단에서 추가로 트렁케이션될 수 있다.

SEQ ID NO:5에 대한 돌연변이

본 발명의 첫번째 양태의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:5와 적어도 k%의 동일성을 갖고/갖거나, SEQ ID NO:5의 단편을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 그러나, SEQ ID NO:5와 비교하여, 이러한 아미노 서열은 적어도 아미노산 잔기 L123 및 E240(및 임의로 또한 잔기 S32)에서 변형을 갖는다. 이들 잔기는 SEQ ID NO:5에 따라 넘버링되며, 초기 야생형 서열(SEQ ID NO:2)과 일치시키기 위해, 넘버링은 +26을 변경시켜야 하고(즉, SEQ ID NO:5의 Ser-32는 SEQ ID NO:2의 Ser-58임), 성숙 야생형 서열(SEQ ID NO:4)과 일치시키기 위해, 넘버링은 +7을 변경시켜야 한다(이는 또한 참고문헌 25와의 용이한 비교를 가능케 한다).

3개의 특정된 잔기가 결실될 수 있으나, 바람직하게는 이들은 다양한 아미노산에 의해 치환된다. 예를 들어, Leu-123은 다른 19개의 자연 발생 아미노산 중 임의의 것에 의해 치환될 수 있다. 치환이 이루어지는 경우, 대체 아미노산은 일부 구체예에서 단순한 아미노산, 예를 들어, 글리신 또는 알라닌일 수 있다. 다른 예에서, 대체 아미노산은 보존성 치환이고, 예를 들어, 이는 (1) 산성, 즉, 아스파테이트, 글루타메이트; (2) 염기성, 즉, 리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비-극성, 즉, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 하전되지 않은 극성, 즉, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신의 4개의 그룹 내에서 이루어진다. 다른 구체예에서, 치환은 비-보존성 치환이다.

특정된 잔기에서의 바람직한 치환은 다음과 같다: S32V; L123R; 및 E240A.

안정성을 증가시키고, fH에 결합하는 폴리펩티드의 능력을 붕괴시키는 것을 목적으로 하는 상기 기재된 돌연변이(들)에 더하여, 폴리펩티드는, 예를 들어, 폴리펩티드의 철결합체와의 상호작용을 붕괴시키기 위한 하나 이상의 추가의 돌연변이(들)을 포함할 수 있다. 철결합체와 상호작용하는 잔기는, 예를 들어, 철결합체, 예를 들어, 카테콜레이트, 하이드록사메이트 또는 카르복실레이트와 상호작용할 수 있는 잔기를 확인하기 위해 본원의 SEQ ID NO:5와 참고문헌 16의 SEQ ID NO:4를 정렬시킴에 의해 참고문헌 16 및 35의 지침을 이용하여 돌연변이될 수 있다.

참고문헌 24는 v2에서의 특정 치환이 fH에 대한 친화성을 증가시킬 수 있고, 이에 따라 이들은 일반적으로, 예를 들어, SEQ ID NO:5의 E85(참고문헌 24에서 잔기 157)에서와 같이 회피되어야 하는 것을 보고한다.

야생형 서열(예를 들어, SEQ ID NO:4)에 비해, 폴리펩티드가 더 높은 안정성을 갖고, fH에 대한 더 낮은 친화성을 갖고, 적합한 포유동물에 투여되는 경우 수막구균에 대해 살균성인 항체 반응을 유도할 수 있는 것을 조건으로 하여 추가의 잔기가 또한 돌연변이될 수 있다.

첫번째 양태의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:47을 포함할 수 있다. SEQ ID NO:47에서, 잔기 32는 임의의 아미노산이고, 잔기 123은 류신이 아니고, 잔기 240은 글루타메이트가 아니다. 추가의 선택은 SEQ ID NO:39이며, 여기서 잔기 32는 세린이 아니고, 잔기 123은 류신이 아니고, 잔기 240은 글루타메이트가 아니다. SEQ ID NO:47의 바람직한 구체예에서, 잔기 32는 발린이고, 잔기 123은 아르기닌이고, 잔기 240은 알라닌이다(즉, SEQ ID NO:50). SEQ ID NO:47의 또 다른 바람직한 구체예에서, 잔기 32는 세린이고, 잔기 123은 아르기닌이고, 잔기 240은 알라닌이다(즉, SEQ ID NO:53).

첫번째 양태의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:31을 포함할 수 있다. SEQ ID NO:31에서, 잔기 32는 임의의 아미노산이고, 잔기 123은 류신이 아니다. 추가의 선택은 SEQ ID NO:37이며, 여기서 잔기 32는 세린이 아니고, 잔기 123은 류신이 아니다. SEQ ID NO:31의 바람직한 구체예에서, 잔기 32는 발린이고, 잔기 123은 아르기닌이다(즉, SEQ ID NO:45). SEQ ID NO:31의 또 다른 바람직한 구체예에서, 잔기 32는 세린이고, 잔기 123은 아르기닌이다(즉, SEQ ID NO:54).

v2 서열에서의 돌연변이에 대해 기재된 아미노산 잔기는 균주 2996으로부터 유래되는 SEQ ID NO:5에 비해 넘버링된다. 임의의 다른 균주로부터의 v2 fHbp에서 상응하는 아미노산 잔기는, 예를 들어, 쌍을 이룬 정렬 알고리즘(예를 들어, 하기에 상술되는 바와 같은 니들먼-분쉬(Needleman-Wunsch) 전체 정렬 알고리즘)을 이용하여 SEQ ID NO:5에 대해 정렬되는 경우 본원에 언급된 아미노산과 정렬되는 아미노산인 서열 정렬에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 종종, 아미노산은 SEQ ID NO:5에서 관찰되는 것과 동일할 것이나(예를 들어, 잔기 32는 세린일 것임), 그렇지 않은 경우 정렬은 용이하게 확인될 것이다.

SEQ ID NO:17에 대한 돌연변이

본 발명의 두번째 양태의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:17과 적어도 j%의 동일성을 갖고/갖거나, SEQ ID NO:17의 단편을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 그러나, SEQ ID NO:17과 비교하여, 이러한 아미노 서열은 적어도 아미노산 잔기 L126 및 E243(및 임의로 잔기 S32)에서 변형을 갖는다. 이들 잔기는 SEQ ID NO:17에 따라 넘버링되며, 초기 야생형 서열(SEQ ID NO:3)과 일치시키기 위해, 넘버링은 +31을 변경시켜야 하고(즉, SEQ ID NO:17의 Ser-32는 SEQ ID NO:3의 Ser-63임), 성숙 야생형 서열(SEQ ID NO:40)과 일치시키기 위해, 넘버링은 +12를 변경시켜야 한다.

2개(또는 3개)의 특정된 잔기가 결실될 수 있으나, 바람직하게는 이들은 다양한 아미노산에 의해 치환된다. 예를 들어, Leu-126은 다른 19개의 자연 발생 아미노산 중 임의의 것에 의해 치환될 수 있다. 치환이 이루어지는 경우, 대체 아미노산은 일부 구체예에서 단순한 아미노산, 예를 들어, 글리신 또는 알라닌일 수 있다. 다른 구체예에서, 대체 아미노산은 보존성 치환이고, 예를 들어, 이는 (1) 산성, 즉, 아스파테이트, 글루타메이트; (2) 염기성, 즉, 리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비-극성, 즉, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 하전되지 않은 극성, 즉, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신의 4개의 그룹 내에서 이루어진다. 다른 구체예에서, 치환은 비-보존성 치환이다.

특정된 잔기에서의 바람직한 치환은 다음과 같다: S32V; L126R; 및 E243A.

안정성을 증가시키고, fH에 결합하는 폴리펩티드의 능력을 붕괴시키는 것을 목적으로 하는 상기 기재된 돌연변이(들)에 더하여, 폴리펩티드는, 예를 들어, 폴리펩티드의 철결합체와의 상호작용을 붕괴시키기 위한 하나 이상의 추가의 돌연변이(들)을 포함할 수 있다. 철결합체와 상호작용하는 잔기는, 예를 들어, 철결합체, 예를 들어, 카테콜레이트, 하이드록사메이트 또는 카르복실레이트와 상호작용할 수 있는 잔기를 확인하기 위해 본원의 SEQ ID NO:17과 참고문헌 16의 SEQ ID NO:4를 정렬시킴에 의해 참고문헌 16 및 35의 지침을 이용하여 돌연변이될 수 있다.

참고문헌 24는 v3에서의 특정 치환이 fH에 대한 친화성을 증가시킬 수 있고, 이에 따라 이들은 일반적으로, 예를 들어, SEQ ID NO:17의 P44(참고문헌 24에서 잔기 106)에서와 같이 회피되어야 하는 것을 보고한다.

야생형 서열(예를 들어, SEQ ID NO:40)에 비해, 폴리펩티드가 더 높은 안정성을 갖고, fH에 대한 더 낮은 친화성을 갖고, 적합한 포유동물에 투여되는 경우 수막구균에 대해 살균성인 항체 반응을 유도할 수 있는 것을 조건으로 하여 추가의 잔기가 또한 돌연변이될 수 있다.

두번째 양태의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:48을 포함할 수 있다. SEQ ID NO:48에서, 잔기 32는 임의의 아미노산이고, 잔기 126은 류신이 아니고, 잔기 243은 글루타메이트가 아니다. 추가의 선택은 SEQ ID NO:57이며, 여기서 잔기 32는 세린이 아니고, 잔기 126은 류신이 아니고, 잔기 243은 글루타메이트가 아니다. SEQ ID NO:48의 바람직한 구체예에서, 잔기 32는 발린이고, 잔기 126은 아르기닌이고, 잔기 243은 알라닌이다(즉, SEQ ID NO:51). SEQ ID NO:48의 또 다른 바람직한 구체예에서, 잔기 32는 세린이고, 잔기 126은 아르기닌이고, 잔기 243은 알라닌이다(즉, SEQ ID NO:55).

두번째 양태의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:32를 포함할 수 있다. SEQ ID NO:32에서, 잔기 32는 임의의 아미노산이고, 잔기 126은 류신이 아니다. 추가의 선택은 SEQ ID NO:38이며, 여기서 잔기 32는 세린이 아니고, 잔기 126은 류신이 아니다. SEQ ID NO:32의 바람직한 구체예에서, 잔기 32는 발린이고, 잔기 126은 아르기닌이다(즉, SEQ ID NO:44). SEQ ID NO:32의 또 다른 바람직한 구체예에서, 잔기 32는 세린이고, 잔기 126은 아르기닌이다(즉, SEQ ID NO:56).

v3 서열에서의 돌연변이에 대해 기재된 아미노산 잔기는 균주 M1239로부터 유래되는 SEQ ID NO:17에 비해 넘버링된다. 임의의 다른 균주로부터의 v3 fHbp에서 상응하는 아미노산 잔기는, 예를 들어, 쌍을 이룬 정렬 알고리즘(예를 들어, 하기에 상술되는 바와 같은 니들먼-분쉬 전체 정렬 알고리즘)을 이용하여 SEQ ID NO:17에 대해 정렬되는 경우 본원에 언급된 아미노산과 정렬되는 아미노산인 서열 정렬에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 종종, 아미노산은 SEQ ID NO:17에서 관찰되는 것과 동일할 것이나(예를 들어, 잔기 32는 세린일 것임), 그렇지 않은 경우 정렬은 용이하게 확인될 것이다.

본 발명의 돌연변이체 서열

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 첫번째 양태의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:47 또는 SEQ ID NO:37을 포함할 수 있고, 두번째 양태의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:48 또는 SEQ ID NO:57을 포함할 수 있다.

첫번째 양태와 중첩되는 본 발명의 세번째 양태에서, 본 발명은 (i) 잔기 32가 임의의 아미노산이나, 일부 구체예에서 세린이 아니고, (ii) 잔기 123이 류신이 아니고, (iii) 잔기 240이 글루타메이트가 아니고, (iv) 야생형 서열, 예를 들어, SEQ ID NO:4에 비해, 폴리펩티드가 더 높은 안정성을 갖고, fH에 대한 더 낮은 친화성을 갖고, (v) 적합한 포유동물에 투여되는 경우 v2 fHbp를 발현하는 수막구균에 대해 살균성인 항체 반응을 유도할 수 있는 것을 조건으로 하여 SEQ ID NO:47과 적어도 v%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. (i) 내지 (iii)의 잔기 넘버링은 SEQ ID NO:47에 따른다.

v의 값은 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 이상으로부터 선택될 수 있다. 이는 바람직하게는 90이고(즉, 돌연변이체 fHbp v2 아미노산 서열은 SEQ ID NO:47과 적어도 90%의 동일성을 가짐), 더욱 바람직하게는 95이다.

두번째 양태와 중첩되는 본 발명의 네번째 양태에서, 본 발명은 (i) 잔기 32가 임의의 아미노산이나, 일부 구체예에서 세린이 아니고, (ii) 잔기 126이 류신이 아니고, (iii) 잔기 243이 글루타메이트가 아니고, (iv) 야생형 서열, 예를 들어, SEQ ID NO:40에 비해, 폴리펩티드가 더 높은 안정성을 갖고, fH에 대한 더 낮은 친화성을 갖고, (v) 적합한 포유동물에 투여되는 경우 v3 fHbp를 발현하는 수막구균에 대해 살균성인 항체 반응을 유도할 수 있는 것을 조건으로 하여 SEQ ID NO:48과 적어도 w%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. (i) 내지 (iii)의 잔기 넘버링은 SEQ ID NO:48에 따른다.

w의 값은 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 이상으로부터 선택될 수 있다. 이는 바람직하게는 90이고(즉, 돌연변이체 fHbp v3 아미노산 서열은 SEQ ID NO:48과 적어도 90%의 동일성을 가짐), 더욱 바람직하게는 95이다.

다섯번째 양태에서, 본 발명은 (i) 잔기 32가 임의의 아미노산이나, 일부 구체예에서 세린이 아니고, (ii) 잔기 123이 류신이 아니고, (iii) 잔기 240이 글루타메이트가 아니고, (iv) 야생형 서열, 예를 들어, SEQ ID NO:4에 비해, 폴리펩티드가 더 높은 안정성을 갖고, fH에 대한 더 낮은 친화성을 갖고, (v) 적합한 포유동물에 투여되는 경우 v2 fHbp를 발현하는 수막구균에 대해 살균성인 항체 반응을 유도할 수 있는 것을 조건으로 하여 5개 이하의 단일 아미노산 변화(즉, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 단일 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입)에 의해 변형된 아미노산 서열 SEQ ID NO:47을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.

여섯번째 양태에서, 본 발명은 (i) 잔기 32가 임의의 아미노산이나, 일부 구체예에서 세린이 아니고, (ii) 잔기 126이 류신이 아니고, (iii) 잔기 243이 글루타메이트가 아니고, (iv) 야생형 서열, 예를 들어, SEQ ID NO:40에 비해, 폴리펩티드가 더 높은 안정성을 갖고, fH에 대한 더 낮은 친화성을 갖고, (v) 적합한 포유동물에 투여되는 경우 v3 fHbp를 발현하는 수막구균에 대해 살균성인 항체 반응을 유도할 수 있는 것을 조건으로 하여 5개 이하의 단일 아미노산 변화(즉, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 단일 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입)에 의해 변형된 아미노산 서열 SEQ ID NO:48을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. (i) 내지 (iii)의 잔기 넘버링은 SEQ ID NO:48에 따른다.

이들 다양한 v2 및 v3 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드에서 조합될 수 있고, 이에 의해 단일 폴리펩티드를 갖는 둘 모두의 변이체에 대한 면역 반응을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일곱번째 양태는 (i) 본 발명의 첫번째, 세번째 또는 다섯번째 양태에 따라 정의된 폴리펩티드; 및 (ii) 본 발명의 두번째, 네번째 및 여섯번째 양태에 따라 정의된 폴리펩티드의 융합체를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 유리하게는, 상기 융합 폴리펩티드는 적합한 포유동물에 투여되는 경우 v2 fHbp를 발현하는 수막구균 및 v3 fHbp를 발현하는 수막구균 둘 모두에 대해 살균성인 항체 반응을 유도할 수 있다.

따라서, 일곱번째 양태 내에서, 융합 폴리펩티드는 하기를 포함한다:

(I) 하기로부터 선택된 첫번째 아미노산 서열:

● 돌연변이 fHbp v2 아미노산 서열로서, (a) 상기 아미노산 서열이 SEQ ID NO:5와 적어도 k%의 서열 동일성을 갖고/갖거나, SEQ ID NO:5의 단편을 포함하나, (b) 상기 아미노산 서열이 잔기 L123 및 E240(및, 임의로, 또한 잔기 S32)에서 SEQ ID NO:5와 상이한, 돌연변이 fHbp v2 아미노산 서열;

● (i) 잔기 32가 임의의 아미노산이나, 일부 구체예에서 세린이 아니고, (ii) 잔기 123이 류신이 아니고, (iii) 잔기 240이 글루타메이트가 아닌 것을 조건으로, SEQ ID NO:47과 적어도 v%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는

● (i) 잔기 32가 임의의 아미노산이나, 일부 구체예에서 세린이 아니고, (ii) 잔기 123이 류신이 아니고, (iii) 잔기 240이 글루타메이트가 아닌 것을 조건으로, 5개 이하의 단일 아미노산 변화(즉, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 단일 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입)에 의해 임의로 변형된 아미노산 서열 SEQ ID NO:47 또는 SEQ ID NO:50;

및 (II) 하기로부터 선택된 두번째 아미노산 서열:

● 돌연변이 fHbp v3 아미노산 서열로서, (a) 상기 아미노산 서열이 SEQ ID NO:17과 적어도 j%의 서열 동일성을 갖고/갖거나, SEQ ID NO:17의 단편을 포함하나, (b) 상기 아미노산 서열이 잔기 L126 및 E243(및, 일부 구체예에서, 또한 잔기 S32)에서 SEQ ID NO:17과 상이한, 돌연변이 fHbp v3 아미노산 서열;

● (i) 잔기 32가 임의의 아미노산이나, 일부 구체예에서 세린이 아니고, (ii) 잔기 126이 류신이 아니고, (iii) 잔기 243이 글루타메이트가 아닌 것을 조건으로, SEQ ID NO:48과 적어도 w%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는

● (i) 잔기 32가 임의의 아미노산이나, 일부 구체예에서 세린이 아니고, (ii) 잔기 126이 류신이 아니고, (iii) 잔기 243이 글루타메이트가 아닌 것을 조건으로, 5개 이하의 단일 아미노산 변화(즉, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 단일 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입)에 의해 임의로 변형된 아미노산 서열 SEQ ID NO:48 또는 SEQ ID NO:51;

여기서, 융합 폴리펩티드는 (a) 적합한 포유동물에 투여되는 경우 v2 fHbp를 발현하는 수막구균 및 v3 fHbp를 발현하는 수막구균 둘 모두에 대해 살균성인 항체 반응을 유도할 수 있고; (b) SEQ ID NO:4로 구성된 야생형 수막구균 fHbp보다 높은 안정성 및 fH에 대한 낮은 친화성을 갖고; (c) SEQ ID NO:40으로 구성된 야생형 수막구균 fHbp보다 높은 안정성 및 fH에 대한 낮은 친화성을 갖는다.

안정성의 증가는 이상적으로는 상기 논의된 바와 같이 적어도 5℃, 예를 들어, 적어도 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃ 이상이다. 더 낮은 친화성은 바람직하는 상기 논의된 바와 같이 적어도 10배, 이상적으로는 적어도 100배이다.

일곱번째 양태의 한 구체에에서, 본 발명은 첫번째 아미노산 서열 및 두번째 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공하며, 첫번째 아미노산 서열은 SEQ ID NO:47 또는 SEQ ID NO:39이고, 두번째 아미노산 서열은 SEQ ID NO:48 또는 SEQ ID NO:57이다.

첫번째 및 두번째 아미노산 서열은 N-말단으로부터 C-말단으로의 어느 한 순서로 존재할 수 있으나, 첫번째 서열이 두번째 서열의 업스트립에 존재하는 것이 바람직하다.

첫번째 및 두번째 아미노산 서열은 링커 서열에 의해 연결될 수 있다. 상기 링커 서열(들)은 통상적으로 짧을(예를 들어, 20개 이하의 아미노산, 즉, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개) 것이다. 예로는 클로닝을 촉진하는 짧은 펩티드 서열, 폴리-글리신 링커(즉, Gly_n, 여기서 n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상(SEQ ID NO:58)), 및 히스티딘 태그(즉, His_n, 여기서 n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상(SEQ ID NO:59))를 포함한다. 다른 적합한 링커 아미노산 서열은 당업자에게 명백할 것이다. 한 유용한 링커는 GSGGGG(SEQ ID NO:20)이며, Gly-Ser 디펩티드는 BamHI 제한 부위로부터 형성되어, 이에 따라 클로닝 및 조작을 돕는다. 또 다른 유용한 링커는 Gly-Ser 디펩티드(SEQ ID NO:22, BamHI로부터) 또는 Gly-Lys 디펩티드(SEQ ID NO:23, HindIII로부터)가 임의로 앞설 수 있는 SEQ ID NO:21이다.

융합 폴리펩티드는 또한 v1 fHbp 서열을 포함할 수 있고, 이에 의해 단일 폴리펩티드를 갖는 3개 모두의 fHbp 변이체에 대한 면역 반응을 제공할 수 있으며, 즉, 폴리펩티드는 적합한 포유동물에 투여되는 경우 v1 fHbp를 발현하는 수막구균, v2 fHbp를 발현하는 수막구균, 및 v3 fHbp를 발현하는 수막구균에 대해 살균성인 항체 반응을 유도할 수 있다. 따라서, 일곱번째 양태의 폴리펩티드는 또한 (i) SEQ ID NO:16과 적어도 i%의 서열 동일성을 갖고/갖거나, (ii) SEQ ID NO:16의 단편을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. i의 값은 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 이상으로부터 선택될 수 있다. 이는 바람직하게는 90이고(즉, 아미노산 서열은 SEQ ID NO:16과 적어도 90%의 동일성을 가짐), 더욱 바람직하게는 95이다. (ii)의 단편은 일반적으로 적어도 7개의 아미노산 길이, 예를 들어, SEQ ID NO:16으로부터의 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24, 26, 28, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80개 이상의 연속적 아미노산일 것이다. 상기 단편은 통상적으로 SEQ ID NO:16로부터의 적어도 하나의 에피토프를 포함할 것이다. SEQ ID NO:16과 적어도 30개의 연속적 아미노산을 공유하는 것이 통상적일 것이며, 일반적으로 v1 fHbp 아미노산 서열은 SEQ ID NO:16으로부터의 여러(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상) 단편을 포함할 것이다. 일반적으로, 일곱번째 양태와 함께 이용되는 v1 fHbp 서열은 SEQ ID NO:16과 적어도 i%의 서열 동일성을 가질 수 있고, SEQ ID NO:16의 여러 단편을 포함할 수 있다.

유리하게는, v1 fHbp 서열은 (b)의 서열 차이가 없는 동일한 폴리펩티드보다 인간 fH에 대해 낮은 친화성(상기 논의된 바와 같음), 예를 들어, SEQ ID NO:46으로 구성된 야생형 수막구균 폴리펩티드보다 낮은 친화성을 제공하는 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, SEQ ID NO:16의 아미노산 잔기 Arg-34(SEQ ID NO:1의 잔기 Arg-60, 및 SEQ ID NO:46의 Arg-41)는 fHbp/fH 상호작용을 붕괴시키기 위해 Ser으로 돌연변이될 수 있다[19,21]. 따라서, 본 발명과 함께 이용하기 위한 바람직한 v1 fHbp 서열은 SEQ ID NO:49를 포함하며, 여기서 잔기 34는 아르기닌이 아니다(예를 들어, SEQ ID NO:52, 여기서 잔기 34는 세린이다).

폴리펩티드가 v1, v2 및 v3 서열 각각을 포함하는 경우, 이들은 N-말단으로부터 C-말단으로 임의의 순서, 즉, v1-v2-v3, v1-v3-v2, v2-v1-v3, v2-v3-v1, v3-v1-v2, 또는 v3-v2-v1으로 제공될 수 있다. 가장 바람직한 순서는 v2-v3-v1이다.

일반적으로, 본 발명의 바람직한 fHbp 융합 폴리펩티드는 하기 식의 아미노산 서열을 갖는다:

NH₂―A-[-X-L-]₃-B―COOH

여기서, 각각의 X는 본원에 정의된 바와 같은 다양한 변이체 fHbp 서열이고, L은 임의의 링커 아미노산 서열이고, A는 임의의 N-말단 아미노산 서열이고, B는 임의의 C-말단 아미노산 서열이다.

3개의 X 모이어티는 본원에 논의된 바와 같은 v1, v2, 및 v3 서열이고, 따라서, 폴리펩티드는 적합한 포유동물에 투여되는 경우 v1 fHbp를 발현하는 수막구균, v2 fHbp를 발현하는 수막구균, 및 v3 fHbp를 발현하는 수막구균에 대해 살균성인 항체 반응을 유도할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 3개의 변이체는 바람직하게는 N-말단으로부터 C-말단으로 v2-v3-v1의 순서로 존재한다.

[-X-L-]의 각각의 예에 대해, 링커 아미노산 서열 -L-은 존재하거나 부재할 수 있다. 적합한 링커 서열은 상기 논의되어 있다.

-A-는 임의의 N-말단 아미노산 서열이다. 이는 통상적으로 짧을(예를 들어, 40개 이하의 아미노산, 즉, 39개, 38개, 37개, 36개, 35개, 34개, 33개, 32개, 31개, 30개, 29개, 28개, 27개, 26개, 25개, 24개, 23개, 22개, 21개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개) 것이다. 예로는 단백질 트래피킹(trafficking)을 유도하는 선도 서열을 포함한다. X₁이 그 자체의 N-말단 메티오닌을 결여한 경우, -A-는 번역된 폴리펩티드에서 상기 메티오닌 잔기를 제공할 수 있다(예를 들어, -A-는 단일한 Met 잔기이다). Met은 링커 서열, 예를 들어, SEQ ID NO:21의 N-말단에 대해 존재할 수 있거나(즉, SEQ ID: 24), 짧은 서열의 N-말단에 존재할 수 있다(예를 들어, SEQ ID NO:25).

-B-는 임의의 C-말단 아미노산 서열이다. 이는 통상적으로 짧을(예를 들어, 40개 이하의 아미노산, 즉, 39개, 38개, 37개, 36개, 35개, 34개, 33개, 32개, 31개, 30개, 29개, 28개, 27개, 26개, 25개, 24개, 23개, 22개, 21개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개) 것이다. 예로는 단백질 트래피킹을 유도하는 서열, 클로닝 또는 정제를 촉진하는 짧은 펩티드 서열(예를 들어, 히스티딘 태그, 즉, His_n을 포함함, 여기서 n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상(SEQ ID NO:59)), 또는 폴리펩티드 안정성을 향상시키는 서열을 포함한다. 다른 적합한 C-말단 아미노산 서열은 당업자에게 명백할 것이다. 하나의 적합한 -B- 모이어티는 SEQ ID NO:26이고, 여기서 히스티딘 태그의 Leu-Glu 업스트림은 XhoI 제한 부위로부터 발생한다.

따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. N-말단으로부터 C-말단으로, 이러한 서열은 하기 SEQ ID 아미노산 서열로부터 조립된다:

N-말단 -A- 모이어티로서 SEQ ID NO:24를 포함시킴으로써, 본 발명은 또한 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. N-말단으로부터 C-말단으로, 이러한 서열은 하기 SEQ ID 아미노산 서열로부터 조립된다:

N-말단 -A- 모이어티로서 SEQ ID NO:24를 포함시킴으로써, 본 발명은 또한 SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.

폴리펩티드

본 발명의 폴리펩티드는 다양한 수단에 의해, 예를 들어, 화학적 합성(적어도 부분적으로)에 의해, 프로테아제를 이용한 더 긴 폴리펩티드의 분해에 의해, RNA로부터의 번역에 의해, 세포 배양액(예를 들어, 재조합 발현 또는 N. 메닌지티디스 배양액으로부터)으로부터 정제 등에 의해 제조될 수 있다. E. 콜리 숙주에서의 이종 발현이 바람직한 발현 경로이다.

본 발명의 폴리펩티드는 이상적으로는 적어도 100개 아미노산 길이, 예를 들어, 150aa, 175aa, 200aa, 225aa, 또는 더 긴 길이이다. 이들은 돌연변이체 fHbp v2 및/또는 v3 아미노산 서열을 포함하고, 돌연변이체 fHbp v2 또는 v3 아미노산 서열은 유사하게 적어도 100개 아미노산 길이, 예를 들어, 150aa, 175aa, 200aa, 225aa, 또는 더 긴 길이여야 한다.

fHbp는 자연발생적인 N. 메닌지티디스의 지질단백질이다. 이는 천연 선도 서열 또는 이종 선도 서열에 의해 E. 콜리에서 발현되는 경우 지질화되는 것으로 또한 밝혀졌다. 본 발명의 폴리펩티드는, 예를 들어, 일반적으로 트리팔미토일-S-글리세릴-시스테인을 형성하는 팔미토일기를 포함하는, 지질화될 수 있는 N-말단 시스테인 잔기를 가질 수 있다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 지질화되지 않는다.

폴리펩티드는 바람직하게는 실질적으로 순수하거나 실질적으로 분리된 형태로 제조된다(즉, 실질적으로 다른 네이세리아 또는 숙주 세포 폴리펩티드가 없음). 일반적으로, 폴리펩티드는 비-자연 발생 환경으로 제공되며, 예를 들어, 이들은 이들의 자연 발생 환경으로부터 분리된다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 출발 물질에 비해 폴리펩티드에 대해 풍부화된 조성물로 존재한다. 따라서, 정제된 폴리펩티드가 제공되며, 이 때 정제된이라 함은 폴리펩티드가 다른 발현된 폴리펩티드가 실질적으로 없는 조성물에 존재함을 의미하고, 실질적으로 없다는 것은 조성물의 총 폴리펩티드 중 50% 초과(예를 들어, ≥75%, ≥80%, ≥90%, ≥95%, 또는 ≥99%)가 본 발명의 폴리펩티드임을 의미한다.

폴리펩티드는 다양한 형태를 취할 수 있다(예를 들어, 천연, 융합, 글리코실화, 비-글리코실화, 지질화, 디설파이드 브릿지 등).

SEQ ID NO 4, 5, 17 및 40은 N-말단 메티오닌을 포함하지 않는다. 본 발명의 폴리펩티드가 생물학적 숙주에서 번역에 의해 생성되는 경우, 대부분의 숙주에서 N-말단 메티오닌을 제공할 개시 코돈을 필요로 한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는, 적어도 신생 단계에서, 상기 SEQ ID NO 서열의 업스트림에 메티오닌 잔기를 포함할 것이다.

신생 서열의 절단은 돌연변이체 fHbp v2 또는 v3 아미노산 서열 자체가 폴리펩티드의 N-말단을 제공할 수 있음을 의미한다. 그러나, 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 돌연변이체 fHbp v2 또는 v3 아미노산 서열의 업스트림에 N-말단 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 N-말단의 단일 메티오닌 바로 다음에 돌연변이체 fHbp v2 또는 v3 아미노산 서열을 갖고; 다른 구체예에서, 더 긴 업스트림 서열이 이용될 수 있다. 이러한 업스트림 서열은 짧을(예를 들어, 40개 이하의 아미노산, 즉, 39개, 38개, 37개, 36개, 35개, 34개, 33개, 32개, 31개, 30개, 29개, 28개, 27개, 26개, 25개, 24개, 23개, 22개, 21개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개) 수 있다. 예로는 단백질 트래피킹을 유도하는 선도 서열, 또는 클로닝 또는 정제를 촉진하는 짧은 펩티드 서열(예를 들어, 히스티딘 태그, 즉, His_n, 여기서 n = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상(SEQ ID NO:60))을 포함한다. 다른 적합한 N-말단 아미노산 서열, 예를 들어, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3에 존재하는 천연 업스트림 서열이 당업자에게 명백할 것이다.

본 발명의 폴리펩티드는 또한 돌연변이체 fHbp v2 또는 v3 아미노산 서열의 최종 아미노산의 다운스트림에 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 C-말단 신장은 짧을(예를 들어, 40개 이하의 아미노산, 즉, 39개, 38개, 37개, 36개, 35개, 34개, 33개, 32개, 31개, 30개, 29개, 28개, 27개, 26개, 25개, 24개, 23개, 22개, 21개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개) 수 있다. 예로는 단백질 트래피킹을 유도하는 서열, 클로닝 또는 정제를 촉진하는 짧은 펩티드 서열(예를 들어, 히스티딘 태그, 즉, His_n을 포함함, 여기서 n = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상(SEQ ID NO:60)), 또는 폴리펩티드 안정성을 향상시키는 서열을 포함한다. 다른 적합한 C-말단 아미노산 서열은 당업자에게 명백할 것이다.

용어 "폴리펩티드"는 임의의 길이의 아미노산 중합체를 나타낸다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 이는 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어는 또한 천연적으로 또는 개입, 예를 들어, 이황화 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예를 들어, 표지 성분을 이용한 컨쥬게이션에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함함), 뿐만 아니라 당 분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 또한 정의 내에 포함된다. 폴리펩티드는 단일 사슬 또는 회합된 사슬로 발생할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 고체 지지체에 부착되거나 고정될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 검출가능한 표지, 예를 들어, 방사성 표지, 형광 표지, 또는 바이오틴 표지를 포함할 수 있다. 이는 면역검정 기술에 특히 유용하다.

참고문헌 162에 기재된 대로, fHbp는 A, B 및 C로 언급되는 3개의 도메인으로 분할될 수 있다. SEQ ID NO:1로 보면, 3개의 도메인은 (A) 1-119, (B) 120-183 및 (C) 184-274이다:

N-말단의 Cys 20으로부터 Lys 119까지, 도메인 'A'의 성숙 형태는 'A_성숙'으로 불린다.

다수의 fHbp 서열이 공지되어 있고, 이들은 표준 방법을 이용하여 용이하게 정렬될 수 있다. 이러한 정렬에 의해 당업자는 (a) MC58 서열에서 좌표를 비교함에 의해 임의의 주어진 fHbp 서열에서 도메인 'A'(및 'A_성숙'), 'B' 및 'C', 및 (b) 예를 들어, 치환들을 확인하기 위해, 다수의 fHbp 서열에서 단일 잔기를 확인할 수 있다. 그러나, 용이한 참조를 위해, 도메인들이 하기에 정의된다:

- 주어진 fHbp 서열에서 도메인 'A'는 쌍별 정렬 알고리즘을 이용하여 SEQ ID NO:1에 대해 정렬할 때, SEQ ID NO:1의 Met-1에 정렬된 아미노산에서 시작하여 SEQ ID NO:1의 Lys-119에 정렬된 아미노산에서 끝나는 서열의 단편이다.

- 주어진 fHbp 서열에서 도메인 'A_성숙'은 쌍별 정렬 알고리즘을 이용하여 SEQ ID NO:1에 대해 정렬할 때, SEQ ID NO:1의 Cys-20에 정렬된 아미노산에서 시작하여 SEQ ID NO:1의 Lys-119에 정렬된 아미노산에서 끝나는 서열의 단편이다.

- 주어진 fHbp 서열에서 도메인 'B'는 쌍별 정렬 알고리즘을 이용하여 SEQ ID NO:1에 대해 정렬할 때, SEQ ID NO:1의 Gln-120에 정렬된 아미노산에서 시작하여 SEQ ID NO:1의 Gly-183에 정렬된 아미노산에서 끝나는 서열의 단편이다.

- 주어진 fHbp 서열에서 도메인 'C'는 쌍별 정렬 알고리즘을 이용하여 SEQ ID NO:1에 대해 정렬할 때, SEQ ID NO:1의 Lys-184에 정렬된 아미노산에서 시작하여 SEQ ID NO:1의 Gln-274에 정렬된 아미노산에서 끝나는 서열의 단편이다.

도메인을 정의하기 위한 바람직한 쌍별 정렬 알고리즘은 디폴트 파라미터(예를 들어, 갭 개방 페널티 = 10.0, 및 갭 신장 페널티 = 0.5, EBLOSUM62 채점 매트릭스 이용)를 이용하는 니들먼-분쉬 전체 정렬 알고리즘이다[156]. 이러한 알고리즘은 EMBOSS 패키지의 니들 툴[157]에서 편리하게 수행된다.

일부 구체예에서, 본 발명의 돌연변이체 fHbp v2 또는 v3 아미노산 서열은 이의 도메인 A를 제거하기 위해 트렁케이션된다. 그러나, 일반적으로, 돌연변이체 fHbp v2 또는 v3 아미노산 서열은 N-말단 β-배럴 및 C-말단 β-배럴 둘 모두를 포함하는 것이 바람직하다.

일부 구체예에서, 폴리펩티드는 N-말단에서 10개 이하의 아미노산(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10) 및/또는 C-말단에서 10개 이하의 아미노산(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)이 결실된 것을 제외하고, 상기 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.

핵산

본 발명은 상기 정의된 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명의 핵산은 다수의 방법으로, 예를 들어, 전체적 또는 부분적인 화학적 합성(예를 들어, DNA의 포스포르아미다이트 합성)에 의해, 뉴클레아제(예를 들어, 제한 효소)를 이용한 더 긴 핵산의 분해에 의해, 보다 짧은 핵산 또는 뉴클레오타이드를 연결시킴에 의해(예를 들어, 리가제 또는 폴리머라제 이용), 유전체 또는 cDNA 라이브러리 등으로부터 제조될 수 있다.

본 발명의 핵산은 단일 가닥, 이중 가닥, 벡터, 프라이머, 프로브, 표지됨, 비표지됨 등과 같은 다양한 형태를 취할 수 있다.

본 발명의 핵산은 바람직하게는 분리된 또는 실질적으로 분리된 형태이다.

용어 "핵산"은 DNA 및 RNA, 및 또한 이들의 유사체, 예를 들어, 변형된 백본을 함유하는 것들, 및 또한 펩티드 핵산(PNA) 등을 포함한다.

본 발명에 따른 핵산은, 예를 들어, 방사성 또는 형광성 표지로 표지될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터(예를 들어, 플라스미드)(예를 들어, 클로닝 또는 발현 벡터, 예를 들어, 핵산 면역화에 적합한 것들) 및 그러한 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.

살균 반응

바람직한 본 발명의 폴리펩티드는 수막구균에 대해 살균성인 항체 반응을 유도할 수 있다. 살균 항체 반응은 마우스에서 편리하게 측정되며, 백신 효능의 표준 지시자이다(예를 들어, 참고문헌 36의 말미의 주 14; 또한 참고문헌 37을 참조하라). 따라서, 항체는 적합한 혈청 살균 검정(SBA)에서 시험 균주에 대해 살균성일 것이다.

본 발명의 첫 번째 양태의 폴리펩티드는 바람직하게는 v2 fHbp 서열을 발현시키는 N. 메닌지티디스 균주, 예를 들어, 균주 961-5945, 2996, 96217, 312294, 11327, a22, gb013(=M01-240013), e32, m1090, m4287, 860800, 599, 95N477, 90-18311, c11, m986, m2671, 1000, m1096, m3279, bz232, dk353, m3697, ngh38, 및/또는 L93/4286 중 하나 이상에 대해 살균성인 항체 반응을, 예를 들어, 마우스에서 유도할 수 있다. 살균 반응은, 예를 들어, var2 균주 M2091(ATCC 13091)에 대해 평가될 수 있다.

본 발명의 첫 번째 양태의 바람직한 폴리펩티드는 혈청 살균 검정에서 균주 M2091에 대해 살균성인 항체를 마우스에서 유도할 수 있다.

본 발명의 두 번째 양태의 폴리펩티드는 바람직하게는 v3 fHbp 서열을 발현시키는 N. 메닌지티디스 균주, 예를 들어, 균주 M1239, 16889, gb355(=M01-240355), m3369, m3813, ngp165 중 하나 이상에 대해 살균성인 항체 반응을, 예를 들어, 마우스에서 유도할 수 있다. 살균 반응은, 예를 들어, 완전히 시퀀싱된(EMBL ID CP002422[39]을 참조하라) 네이세리아 MLST 참조 균주(참고문헌 38의 id 19265)인 var3 균주 M01-240355에 대해 평가될 수 있다.

본 발명의 두 번째 양태의 바람직한 폴리펩티드는 혈청 살균 검정에서 균주 M01-240355에 대해 살균성인 항체를 마우스에서 유도할 수 있다.

예를 들어, 이들 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물은 Goldschneider 검정을 이용하여 인간 보체 이용시 ≥1:4의 혈청 살균 역가[40-42], 및/또는 토끼 새끼 보체 이용시 ≥1:128의 혈청 살균 역가를 제공할 수 있다.

면역화

본 발명의 폴리펩티드는 면역원성 조성물의 활성 성분으로 이용될 수 있고, 따라서 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 면역원성 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물, 예를 들어, 마우스 또는 인간에서 항체 반응을 발생시키는 방법을 제공한다. 항체 반응은 바람직하게는 보호 및/또는 살균 항체 반응이다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 면역원성 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 네이세리아(예를 들어, 수막구균) 감염에 대해 포유동물, 예를 들어, 마우스 또는 인간을 보호하는 방법을 제공한다.

본 발명은 약제(예를 들어, 면역원성 조성물 또는 백신으로서) 또는 진단 시약으로서 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드를 제공한다. 또한, 포유동물, 예를 들어, 마우스 또는 인간에서 네이세리아(예를 들어, 수막구균) 감염을 예방하기 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드의 용도를 제공한다.

포유동물은 바람직하게는 인간이다. 인간은 성인이거나, 바람직하게는, 소아일 수 있다. 백신이 예방용인 경우, 인간은 바람직하게는 소아이고(예를 들어, 영아 또는 유아); 백신이 치료용인 경우, 인간은 바람직하게는 성인이다. 아동에 대해 의도된 백신은 또한, 예를 들어, 안전성, 투여량, 면역원성 등을 평가하기 위해 성인에게 투여될 수 있다.

용도 및 방법은, 비제한적으로, 수막염(특히, 박테리아, 예를 들어, 수막구균, 수막염) 및 세균혈증을 포함하는 질병을 예방/치료하는데 특히 유용하다. 예를 들어, 이들은 N. 메닌지티디스(예를 들어, 혈청군 B)에 의해 야기된 침습성 수막구균 질병에 대한 개체의 능동 면역화에 적합하다.

치료적 치료의 효능은 본 발명의 조성물의 투여 후에 네이세리아 감염을 모니터함에 의해 시험될 수 있다. 예방적 치료의 효능은 본 조성물의 투여 후에 fHbp에 대한 면역 반응을 모니터함에 의해 시험될 수 있다. 본 발명의 조성물의 면역원성은 이들을 시험 대상체(예를 들어, 소아 12-16개월, 또는 동물 모델)에 투여한 다음 혈청 살균 항체(SBA) 및 ELISA 역가(GMT)를 포함하는 표준 파라미터를 측정함에 의해 결정될 수 있다. 이들 면역 반응은 일반적으로 본 조성물을 투여한 지 약 4주 후에 측정되고, 본 조성물의 투여 전에 측정된 값과 비교될 것이다. 적어도 4배 또는 8배의 SBA 증가가 바람직하다. 하나를 초과하는 본 조성물의 용량이 투여된 경우, 1회 초과의 투여-후 측정이 이루어질 수 있다.

본 발명의 바람직한 조성물은 허용되는 백분율의 인간 대상체에 대하여 각 항원성 성분에 대한 혈청보호를 위한 기준보다 우수한 항체 역가를 인간 환자에서 제공할 수 있다. 숙주가 항원에 대해 혈청전환된 것으로 간주되는 것 이상의 관련 항체 역가를 갖는 항원은 널리 알려져 있고, 이러한 역가는 WHO와 같은 기구에 의해 공개되어 있다. 바람직하게는 대상체의 통계적으로 유의한 샘플의 80% 초과, 보다 바람직하게는 90% 초과, 더 더욱 바람직하게는 93% 초과 및 가장 바람직하게는 96-100%가 혈청전환된다.

본 발명을 이용하여 전신 및/또는 점막 면역을 유도할 수 있다.

본 발명의 조성물은 일반적으로 인간 환자에 직접 투여될 것이다. 직접 전달은 비경구 주입(예를 들어, 피하, 복막내, 정맥내, 근내, 또는 조직의 사이질 공간으로), 또는 직장, 구강, 질, 국소, 경피, 비내, 안구, 귀, 폐 또는 다른 점막 투여에 의해 수행될 수 있다. 넙다리 또는 상지로의 근내 투여가 바람직하다. 주입은 바늘을 통해서일 수 있으나(예를 들어, 피부밑 바늘), 무침(needle-free) 주입이 대안적으로 이용될 수 있다. 통상적인 근내 용량은 약 0.5 ml(예를 들어, BEXSERO™ 제품에서 관찰되는 바와 같음)이다.

투여 치료는 단일 용량 스케줄 또는 다중 용량 스케줄일 수 있다. 다수 용량은 일차 면역화 스케줄 및/또는 부스터 면역화 스케줄에서 이용될 수 있다. 일차 용량 스케줄에 이어 부스터 용량 스케쥴이 올 수 있다. 프라이밍 용량 간의 적합한 타이밍(예를 들어, 4-16주), 및 프라이밍과 부스팅 간의 적합한 타이밍은 통상적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, BEXSERO™ 제품은 대상체(예를 들어, 유아 또는 다른 대상체)에 따라 1개월 이상 또는 2개월 이상 간격으로 2회 또는 3회 용량으로 제공되는 바와 같이 투여된다.

본 발명의 면역원성 조성물은 일반적으로 조성물을 수용한 환자에 유해한 항체의 생성을 자체적으로 유도하지 않고, 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 물질일 수 있는, 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 것이다. 약학적으로 허용되는 담체는 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 포함할 수 있다. 보조 물질, 예를 들어, 습윤제 또는 에멀젼화제, pH 완충 물질 등이 이러한 비히클에 또한 존재할 수 있다. 적합한 담체의 충분한 논의는 참고문헌 43에서 이용 가능하다. 예를 들어, BEXSERO™ 제품은 소듐 클로라이드, 히스티딘, 수크로스, 알루미늄 하이드록시드, 및 주사용수를 포함한다.

네이세리아 감염은 신체의 다양한 부위에 영향을 주므로 본 발명의 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서, 주입가능물질로 제조될 수 있다. 주입 전에 액체 비히클에 용해 또는 현탁하기 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 비경구 주입(예를 들어, 근육으로)에 적합한 조성물이 가장 바람직하다.

조성물은 바람직하게는 멸균 조성물이다. 이는 바람직하게는 무-발열원이다. 이는 바람직하게는, 예를 들어, pH 6 내지 pH 8, 일반적으로 약 pH 7로 완충된다. 조성물이 알루미늄 하이드록시드 염을 포함하는 경우, 히스티딘 완충제를 이용하는 것이 바람직하다[44]. 본 발명의 조성물은 인간에 관해 등장성일 수 있다.

면역원성 조성물은 면역학적 유효량의 면역원, 뿐만 아니라 필요에 따라 임의의 다른 다른 명시된 성분들을 포함한다. '면역학적 유효량'은 단일 용량으로 또는 일련의 일부로서 개체로의 상기량의 투여가 치료 또는 예방에 효과적인 것을 의미한다. 상기량은 치료되는 개체의 건강 및 신체 상태, 연령, 치료되는 개체의 분류학적 그룹(예를 들어, 비-인간 영장류, 영장류 등), 항체를 합성하는 개체의 면역 반응의 능력, 요망되는 보호의 정도, 백신의 제형, 의학적 상황의 치료 의사의 평가, 및 다른 관련 요인에 따라 다양하다. 상기량이 일상적인 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 광범위한 범위 내에 해당할 것이 예상된다. 투여 치료는 단일 용량 스케줄 또는 다중 용량 스케줄일 수 있다(예를 들어, 부스터 용량 포함). 조성물은 다른 면역조절제와 함께 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물에 이용될 수 있는 애쥬번트는, 비제한적으로, 불용성 금속염, 수중유 에멀젼(예를 들어, MF59 또는 AS03, 둘 모두는 스쿠알렌 함유), 사포닌, LPS의 무독성 유도체(예를 들어, 모노포스포릴 지질 A 또는 3-O-데아실화된 MPL), 면역자극성 올리고뉴클레오티드, 탈독화된 박테리아 ADP-리보실화 독소, 미세입자, 리포솜, 이미다조퀴놀론, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 면역자극제로서 작용하는 다른 물질은 참고문헌 45의 챕터 7에 기재되어 있다.

알루미늄 하이드록시드 및/또는 알루미늄 포스페이트 애쥬번트의 이용이 특히 바람직하고, 폴리펩티드는 일반적으로 이들 염에 흡착된다. 이들 염은 옥시하이드록시드 및 하이드록시포스페이트를 포함한다(예를 들어, 참고문헌 45의 챕터 8 & 9를 참조하라). 염은 임의의 적합한 형태를 취할 수 있다(예를 들어, 젤, 결정성, 무정형 등). Al⁺⁺⁺은 <1 mg/용량으로 제공되어야 한다.

가장 바람직한 애쥬번트는 BEXSERO™ 제품에서 사용되는 바와 같은 알루미늄 하이드록시드이다. 본 발명의 조성물 내의 폴리펩티드는 BEXSERO™ 제품에서 관찰되는 바와 같이 상기 애쥬번트에 흡착될 수 있다. 이는 약 1 mg/ml Al⁺⁺⁺(즉 0.5ml 용량 당 0.5mg)으로 포함될 수 있다.

추가의 항원성 성분

본 발명의 조성물은 돌연변이체 v2 및/또는 v3 fHbp 서열을 포함한다. 조성물이 항원의 복합체 또는 정의되지 않은 혼합물을 포함하지 않는 것이 유용하고, 예를 들어, 조성물에 외막 소체를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 이종 숙주에서 재조합에 의해 발현된 다음 정제된다.

본 발명의 조성물은 fHbp 폴리펩티드를 포함할 뿐만 아니라, 또한 박테리아 당 하나를 초과하는 면역원을 표적화하는 백신이 탈출 돌연변이체를 선택할 가능성을 감소시키기 때문에, 하나 이상의 추가 네이세리아 면역원(들)을 포함할 수 있다. 따라서, 조성물은 적합한 포유동물에 투여될 때, 수막구균에 대해 살균성인 항체 반응을 유도하는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 제2 폴리펩티드는 수막구균 fHbp일 수 있으나, 종종 fHbp가 아닐 수 있고, 예를 들어, 이것은 NHBA 서열, NadA 서열 등일 수 있다.

본 발명의 조성물은 NHBA 항원을 포함할 수 있다. NHBA 항원은 수막구균 혈청군 B 균주 MC58에 대한 공개된 유전체 서열에[46] 유전자 NMB2132(GenBank 수탁 번호 GI:7227388; 본원에서 SEQ ID NO:6)로서 포함되었다. 다수의 균주로부터의 NHBA 항원의 서열은 그 이후에 공개되었다. 예를 들어, NHBA의 대립유전자 형태는 참고문헌 47의 도 5 및 15, 및 참고문헌 1의 실시예 13 및 도 21(그 안의 SEQ ID 3179 내지 3184)에서 볼 수 있다. NHBA 항원의 다양한 면역원성 단편이 또한 보고되었다. 본 발명과 함께 이용하기에 바람직한 287 항원은 (a) SEQ ID NO:6과 50% 이상의 동일성(예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 초과)을 갖고/갖거나; (b) 'n'이 7 또는 그 초과(예를 들어, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 또는 그 초과)인 SEQ ID NO:6의 적어도 'n'개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. (b)의 바람직한 단편은 SEQ ID NO:6로부터의 에피토프를 포함한다. 본 발명의 가장 유용한 NHBA 항원은 대상체로의 투여 후에, 아미노산 서열 SEQ ID NO:6으로 구성된 수막구균 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 유도할 수 있다. 본 발명과 함께 사용하기 유리한 NHBA 항원은 대상체로의 투여 후에 살균성 항-수막구균 항체를 유도할 수 있다.

본 발명의 조성물은 NadA 항원을 포함할 수 있다. NadA 항원은 수막구균 혈청군 B 균주 MC58에 대한 공개된 유전제 서열에[46] 유전자 NMB1994(GenBank 수탁 번호 GI:7227256; 본원에서 SEQ ID NO:7)로서 포함되었다. 다수의 균주로부터의 NadA 항원의 서열은 그 이후에 공개되었고, 네이세리아 부착소로서 단백질의 활성은 잘 문서화되어 있다. NadA의 다양한 면역원성 단편이 또한 보고되었다. 본 발명과 함께 이용하기에 바람직한 NadA 항원은 (a) SEQ ID NO:7과 50% 이상의 동일성(예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 초과)을 갖고/갖거나; (b) 'n'이 7 또는 그 초과(예를 들어, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 또는 그 초과)인 SEQ ID NO:7의 적어도 'n'개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. (b)의 바람직한 단편은 SEQ ID NO:7로부터의 에피토프를 포함한다. 본 발명의 가장 유용한 NadA 항원은 대상체로의 투여 후에, 아미노산 서열 SEQ ID NO:7로 구성된 수막구균 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 유도할 수 있다. 본 발명과 함께 사용하기 유리한 NadA 항원은 대상체로의 투여 후에 살균성 항-수막구균 항체를 유도할 수 있다. SEQ ID NO:15가 하나의 그러한 단편이다.

본 발명의 조성물은 NspA 항원을 포함할 수 있다. NspA 항원은 수막구균 혈청군 B 균주 MC58에 대한 공개된 유전체 서열에[46] 유전자 NMB0663(GenBank 수탁 번호 GI:7225888; 본원에서 SEQ ID NO:8)으로서 포함되었다. 이 항원은 참고문헌 48 & 49로부터 사전에 공지되었다. 다수의 균주로부터의 NspA 항원의 서열은 그 이후에 공개되었다. NspA의 다양한 면역원성 단편이 또한 보고되었다. 본 발명과 함께 이용하기에 바람직한 NspA 항원은 (a) SEQ ID NO:8과 50% 이상의 동일성(예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 초과)을 갖고/갖거나; (b) 'n'이 7 또는 그 초과(예를 들어, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 또는 그 초과)인 SEQ ID NO:8의 적어도 'n'개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. (b)의 바람직한 단편은 SEQ ID NO:8로부터의 에피토프를 포함한다. 본 발명의 가장 유용한 NspA 항원은 대상체로의 투여 후에, 아미노산 서열 SEQ ID NO:8로 구성된 수막구균 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 유도할 수 있다. 본 발명과 함께 사용하기 유리한 NspA 항원은 대상체로의 투여 후에 살균성 항-수막구균 항체를 유도할 수 있다.

본 발명의 조성물은 수막구균 HmbR 항원을 포함할 수 있다. 전장 HmbR 서열은 수막구균 혈청군 B 균주 MC58에 대한 공개된 유전체 서열에[46] 유전자 NMB1668(본원에서 SEQ ID NO:9)로서 포함되었다. 본 발명은 전장 HmbR 서열을 포함하는 폴리펩티드를 이용할 수 있으나, 종종 부분적 HmbR 서열을 포함하는 폴리펩티드를 이용할 것이다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명에 따라 이용되는 HmbR 서열은 SEQ ID NO:9와 적어도 i%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 이 때 i의 값은 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 이상이다. 다른 구체예에서, 본 발명에 따라 이용되는 HmbR 서열은 SEQ ID NO:9로부터의 적어도 j개 연속 아미노산의 단편을 포함할 수 있고, 이 때 j의 값은 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 이상이다. 다른 구체예에서, 본 발명에 따라 이용되는 HmbR 서열은 (i) SEQ ID NO:9와 적어도 i%의 서열 동일성을 갖고/거나 (ii) SEQ ID NO:9로부터의 적어도 j개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. j개 아미노산의 바람직한 단편은 SEQ ID NO:9로부터의 에피토프를 포함한다. 그러한 에피토프는 일반적으로 HmbR의 표면에 위치한 아미노산을 포함할 것이다. 유용한 에피토프는 이들 에피토프에 결합하는 항체가 숙주 헤모글로빈에 결합하는 박테리아의 능력을 차단할 수 있으므로, 헤모글로빈에 대한 HmbR의 결합에 관여하는 아미노산을 지니는 것들을 포함한다. HmbR의 토폴로지, 및 이의 중요 기능성 잔기는 참고문헌 50에서 조사되었다. 본 발명의 가장 유용한 HmbR 항원은 대상체로의 투여 후에, 아미노산 서열 SEQ ID NO:9로 구성된 수막구균 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 유도할 수 있다. 본 발명과 함께 사용하기 유리한 HmbR 항원은 대상체로의 투여 후에 살균성 항-수막구균 항체를 유도할 수 있다.

본 발명의 조성물은 NhhA 항원을 포함할 수 있다. NhhA 항원은 수막구균 혈청군 B 균주 MC58에 대한 공개된 유전체 서열에[46] 유전자 NMB0992(GenBank 수탁 번호 GI:7226232; 본원에서 SEQ ID NO:10)로서 포함되었다. 다수의 균주로부터의 NhhA 항원의 서열은, 예를 들어, 참고문헌 47 & 51, 및 NhhA의 다양한 면역원성 단편이 보고된 이래 공개되었다. 이것은 Hsf로도 공지되어 있다. 본 발명과 함께 이용하기에 바람직한 NhhA 항원은 (a) SEQ ID NO:10과 50% 이상의 동일성(예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 초과)을 갖고/갖거나; (b) 'n'이 7 또는 그 초과(예를 들어, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 또는 그 초과)인 SEQ ID NO:10의 적어도 'n'개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. (b)의 바람직한 단편은 SEQ ID NO:10로부터의 에피토프를 포함한다. 본 발명의 가장 유용한 NhhA 항원은 대상체로의 투여 후에, 아미노산 서열 SEQ ID NO:10으로 구성된 수막구균 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 유도할 수 있다. 본 발명과 함께 사용하기 유리한 NhhA 항원은 대상체로의 투여 후에 살균성 항-수막구균 항체를 유도할 수 있다.

본 발명의 조성물은 App 항원을 포함할 수 있다. App 항원은 수막구균 혈청군 B 균주 MC58에 대한 공개된 유전체 서열에[46] 유전자 NMB1985(GenBank 수탁 번호 GI:7227246; 본원에서 SEQ ID NO:11)로서 포함되었다. 다수의 균주로부터의 App 항원의 서열은 그 이후에 공개되었다. App의 다양한 면역원성 단편이 또한 보고되었다. 본 발명과 함께 이용하기에 바람직한 App 항원은 (a) SEQ ID NO:11과 50% 이상의 동일성(예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 초과)을 갖고/갖거나; (b) 'n'이 7 또는 그 초과(예를 들어, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 또는 그 초과)인 SEQ ID NO:11의 적어도 'n'개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. (b)의 바람직한 단편은 SEQ ID NO:11로부터의 에피토프를 포함한다. 본 발명의 가장 유용한 App 항원은 대상체로의 투여 후에, 아미노산 서열 SEQ ID NO:11로 구성된 수막구균 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 유도할 수 있다. 본 발명과 함께 사용하기 유리한 App 항원은 대상체로의 투여 후에 살균성 항-수막구균 항체를 유도할 수 있다.

본 발명의 조성물은 Omp85 항원을 포함할 수 있다. Omp85 항원은 수막구균 혈청군 B 균주 MC58에 대한 공개된 유전체 서열에[46] 유전자 NMB0182(GenBank 수탁 번호 GI:7225401; 본원에서 SEQ ID NO:12)로서 포함되었다. 다수의 균주로부터의 Omp85 항원의 서열은 그 이후에 공개되었다. Omp85에 대한 추가 정보는 참고문헌 52 및 53에서 찾아볼 수 있다. Omp85의 다양한 면역원성 단편이 또한 보고되었다. 본 발명과 함께 이용하기에 바람직한 Omp85 항원은 (a) SEQ ID NO:12와 50% 이상의 동일성(예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 초과)을 갖고/갖거나; (b) 'n'이 7 또는 그 초과(예를 들어, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 또는 그 초과)인 SEQ ID NO:12의 적어도 'n'개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. (b)의 바람직한 단편은 SEQ ID NO:12로부터의 에피토프를 포함한다. 본 발명의 가장 유용한 Omp85 항원은 대상체로의 투여 후에, 아미노산 서열 SEQ ID NO:12로 구성된 수막구균 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 유도할 수 있다. 본 발명과 함께 사용하기 유리한 Omp85 항원은 대상체로의 투여 후에 살균성 항-수막구균 항체를 유도할 수 있다.

본 발명의 조성물은 936 항원을 포함할 수 있다. 936 항원은 수막구균 혈청군 B 균주 MC58에 대한 공개된 유전체 서열에[46] 유전자 NMB2091(본원에서 SEQ ID NO:13)로서 포함되었다. 본 발명과 함께 이용하기에 바람직한 936 항원은 (a) SEQ ID NO:13과 50% 이상의 동일성(예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 초과)을 갖고/갖거나; (b) 'n'이 7 또는 그 초과(예를 들어, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 또는 그 초과)인 SEQ ID NO:13의 적어도 'n'개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. (b)의 바람직한 단편은 SEQ ID NO:13으로부터의 에피토프를 포함한다. 본 발명의 가장 유용한 936 항원은 대상체로의 투여 후에, 아미노산 서열 SEQ ID NO:13으로 구성된 수막구균 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 유도할 수 있다. 936 항원은 fHbp에 대한 양호한 융합 파트너이다(예를 들어, 참고문헌 54 & 55를 참조하라).

조성물은 SEQ ID NO:14를 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:15를 포함하는 폴리펩티드; 및 돌연변이체 fHbp v2 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:13을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 포함할 수 있다(cf. 참고문헌 54 & 55).

조성물은 SEQ ID NO:14를 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:15를 포함하는 폴리펩티드; 및 돌연변이체 fHbp v3 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:13을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 포함할 수 있다(cf. 참고문헌 54 & 55).

일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 추가 수막구균 fHbp 서열과 조합된다. 특히, v2 폴리펩티드는 균주 적용범위의 스펙트럼을 증가시키기 위해 v1 및/또는 v3 폴리펩티드와 조합될 수 있다[160]. 따라서, 조성물은 (i) 돌연변이체 fHbp v2 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드; 및 (ii) v1 fHbp 폴리펩티드 및/또는 v3 fHbp 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 (i) 돌연변이체 fHbp v2 아미노산 서열 및 (ii) v1 fHbp 아미노산 서열 및/또는 v3 fHbp 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 따라서, v1 및/또는 v3 서열은 조성물의 분리된 실체로서(또는 상기 논의된 바와 같이 융합 폴리펩티드 내에서) 돌연변이체 v2 서열과 조합될 수 있다.

유사하게, v3 폴리펩티드는 균주 적용범위의 스펙트럼을 증가시키기 위해 v1 및/또는 v2 폴리펩티드와 조합될 수 있다[160]. 따라서, 조성물은 (i) 돌연변이체 fHbp v3 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드; 및 (ii) v1 fHbp 폴리펩티드 및/또는 v2 fHbp 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 (i) 돌연변이체 fHbp v3 아미노산 서열 및 (ii) v1 fHbp 아미노산 서열 및/또는 v2 fHbp 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 따라서, v1 및/또는 v2 서열은 조성물의 분리된 실체로서(또는 상기 논의된 바와 같이 융합 폴리펩티드 내에서) 돌연변이체 v3 서열과 조합될 수 있다.

게다가, 돌연변이체 v2 및 v3 폴리펩티드는 균주 적용범위를 증가시키기 위해 서로 조합될 수 있다. 따라서, 조성물은 (i) 돌연변이체 fHbp v2 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드; (ii) 돌연변이체 fHbp v3 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드; 및 (iii) fHbp v1 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 (i) 돌연변이체 fHbp v2 아미노산 서열 (ii) 돌연변이체 v3 fHbp 아미노산 서열 및 (iii) fHbp v1 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 돌연변이체 v2 및 v3 서열은 조성물의 분리된 실체로서(또는 상기 논의된 바와 같이 융합 폴리펩티드 내에서) v1 서열과 조합될 수 있다. v1 서열은 야생형 서열 또는 돌연변이체 서열일 수 있다.

v1 fHbp는 (a) SEQ ID NO:16과 적어도 k%의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및/또는 (b) SEQ ID NO:16의 단편을 포함할 수 있다. 'k' 및 단편에 대한 정보는 상기에 제공된다. 단편은 통상적으로 SEQ ID NO:16으로부터의 적어도 하나의 에피토프를 포함할 것이고, v1 fHbp 폴리펩티드는 본 발명의 v2 또는 v3 아미노산 서열에는 존재하지 않는 적어도 하나의 에피토프를 포함할 것이며, 이에 의해 v1 fHbp에 의해 유도된 항체는 v1 균주를 인지할 수 있다. 이상적으로는, v1 fHbp는 v1 균주, 예를 들어, 균주 MC58(ATCC로부터 'BAA-335'로서 이용가능함)에 대해 살균성인 항체를 유도할 수 있다. v1 fHbp는 fH에 결합하는 이의 능력을 붕괴시키는 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.

v2 fHbp는 (a) SEQ ID NO:5와 적어도 k%의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및/또는 (b) SEQ ID NO:5의 단편을 포함할 수 있다. 'k' 및 단편에 대한 정보는 상기에 제공된다. 단편은 통상적으로 SEQ ID NO:5로부터의 적어도 하나의 에피토프를 포함할 것이고, v2 fHbp 폴리펩티드는 본 발명의 v3 아미노산 서열에는 존재하지 않는 적어도 하나의 에피토프를 포함할 것이며, 이에 의해 v2 fHbp에 의해 유도된 항체는 v2 균주를 인지할 수 있다. 이상적으로는, v2 fHbp는 v2 균주, 예를 들어, 균주 M2091(ATCC 13091)에 대해 살균성인 항체를 유도할 수 있다. v2 fHbp는 본 발명의 첫번째 양태의 폴리펩티드일 수 있다.

v3 fHbp는 (a) SEQ ID NO:17과 적어도 k%의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및/또는 (b) SEQ ID NO:17의 단편을 포함할 수 있다. 'k' 및 단편에 대한 정보는 상기에 제공된다. 단편은 통상적으로 SEQ ID NO:17로부터의 적어도 하나의 에피토프를 포함할 것이고, v3 fHbp 폴리펩티드는 본 발명의 v2 아미노산 서열에는 존재하지 않는 적어도 하나의 에피토프를 포함할 것이며, 이에 의해 v3 fHbp에 의해 유도된 항체는 v3 균주를 인지할 수 있다. 이상적으로는, v3 fHbp는 v3 균주, 예를 들어, 균주 M01-240355에 대해 살균성인 항체를 유도할 수 있다. v3 fHbp는 본 발명의 두번째 양태의 폴리펩티드일 수 있다.

본 조성물은 네이세리아 폴리펩티드 항원 외에, 다른 질병 또는 감염에 대한 면역화를 위한 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 조성물은 하기 추가 항원 중 하나 이상을 포함할 수 있다:

- N. 메닌지티디스 혈청군 A, C, W135 및/또는 Y로부터의 당류 항원, 예를 들어, 혈청군 C로부터 참고문헌 56(또한 참고문헌 57을 참조하라) 또는 참고문헌 58에 기재된 당류.

- 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)로부터의 당류 항원[예를 들어, 59, 60, 61].

- A형 간염 바이러스, 예를 들어, 불활성화된 바이러스로부터의 항원[예를 들어, 62, 63].

- B형 간염 바이러스로부터의 항원, 예를 들어, 표면 및/또는 코어 항원[예를 들어, 63, 64].

- 디프테리아 항원, 예를 들어, 디프테리아 톡소이드[예를 들어, 참고문헌 65의 챕터 3], 예를 들어, CRM₁₉₇ 돌연변이체[예를 들어, 66].

- 파상풍 항원, 예를 들어, 파상풍 톡소이드(예를 들어, 참고문헌 65의 챕터 4).

- 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)로부터의 항원, 예를 들어, 임의로 또한 퍼탁틴 및/또는 아글루티노겐 2 및 3과 함께, B. 퍼투시스로부터의 백일해 홀로톡신(PT) 및 실모양 헤마글루티닌(FHA)(예를 들어, 참고문헌 67 & 68).

- 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) B로부터의 당류 항원[예를 들어, 57].

- 소아마비 항원(들)[예를 들어, 69, 70], 예를 들어, IPV.

- 홍역, 볼거리 및/또는 풍진 항원(예를 들어, 참고문헌 65의 챕터 9, 10 & 11).

- 인플루엔자 항원(들)(예를 들어, 참고문헌 65의 챕터 19), 예를 들어, 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 표면 단백질.

- 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis)로부터의 항원[예를 들어, 71].

- 스트렙토코커스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae)(B그룹 스트렙토코커스)로부터의 단백질 항원[예를 들어, 72, 73].

- 스트렙토코커스 아갈락티아(B그룹 스트렙토코커스)로부터의 당류 항원.

- 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)(A그룹 스트렙토코커스)로부터의 항원[예를 들어, 73, 74, 75].

- 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 항원[예를 들어, 76].

본 조성물은 이들 추가 항원 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

독성 단백질 항원은 필요한 경우 탈독화될 수 있다(예를 들어, 화학적 및/또는 유전적 수단에 의한 백일해 독소의 탈독화[68]).

디프테리아 항원이 조성물에 포함되는 경우, 파상풍 항원 및 백일해 항원을 포함하는 것이 또한 바람직하다. 유사하게, 파상풍 항원이 포함되는 경우, 디프테리아 및 백일해 항원을 포함하는 것이 또한 바람직하다. 유사하게, 백일해 항원이 포함되는 경우, 디프테리아 및 파상풍 항원을 포함하는 것이 또한 바람직하다. 따라서 DTP 조합물이 바람직하다.

당류 항원은 바람직하게는 컨쥬게이트의 형태이다. 컨쥬게이트를 위한 담체 단백질은 하기에서 보다 자세하게 논의된다.

조성물 중 항원은 통상적으로 각각 적어도 1μg/ml의 농도로 존재할 것이다. 일반적으로, 임의의 주어진 항원의 농도는 그 항원에 대한 면역 반응을 유도하기에 충분할 것이다.

본 발명의 면역원성 조성물은 치료적으로(즉, 기존 감염을 치료하기 위해) 또는 예방적으로(즉, 앞으로의 감염을 예방하기 위해) 이용될 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물에 단백질 항원을 이용하는 것의 대안으로서, 항원을 인코딩하는 핵산(RNA, 예를 들어, 자기-복제 RNA, 또는 DNA, 예를 들어, 플라스미드일 수 있음)이 이용될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 fHbp 서열 외에, 수막구균 혈청군 A, C, W135 및 Y 중 1, 2, 3 또는 4개로부터의 컨쥬게이션된 캡슐 당류 항원을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 fHbp 서열 외에, 적어도 하나의 컨쥬게이션된 폐렴구균 캡슐 당류 항원을 포함한다.

수막구균 혈청군 Y, W135, C 및 A

현행 혈청군 C 백신(MENJUGATE™[56,57], MENINGITEC™ 및 NEISVAC-C™)은 컨쥬게이션된 당류를 포함한다. Menjugate™ 및 Meningitec™은 CRM₁₉₇ 담체에 컨쥬게이션된 올리고당류 항원을 갖는 반면, NEISVAC-C™은 파상풍 톡소이드 담체에 컨쥬게이션된 완전한 다당류(데-O-아세틸화됨)를 이용한다. MENACTRA™ 백신은 혈청군 Y, W135, C 및 A의 각각으로부터의 컨쥬게이션된 캡슐 당류 항원을 함유한다.

본 발명의 조성물은 수막구균 혈청군 Y, W135, C 및 A 중 하나 이상으로부터의 캡슐 당류 항원을 포함할 수 있고, 항원은 담체 단백질(들)에 컨쥬게이션되고/거나 올리고당류이다. 예를 들어, 조성물은 혈청군 C; 혈청군 A 및 C; 혈청군 A, C 및 W135; 혈청군 A, C 및 Y; 혈청군 C, W135 및 Y로부터; 또는 4개 모두의 혈청군 A, C, W135 및 Y로부터의 캡슐 당류 항원을 포함할 수 있다.

용량 당 각각의 수막구균 당류 항원의 통상적인 양은 1μg 내지 20μg, 예를 들어, 약 1μg, 약 2.5μg, 약 4μg, 약 5μg, 또는 약 10μg이다(당류로서 표시됨).

혼합물이 혈청군 A 및 C 둘 모두로부터의 캡슐 당류를 포함하는 경우, MenA 당류:MenC 당류의 비율(w/w)은 1 초과일 수 있다(예를 들어, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 또는 초과). 혼합물이 혈청군 Y 및 혈청군 C 및 W135 중 하나 또는 둘 모두로부터의 캡슐 당류를 포함하는 경우, MenY 당류:MenW135 당류의 비율(w/w)은 1 초과일 수 있고/거나(예를 들어, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 또는 초과), MenY 당류:MenC 당류의 비율(w/w)은 1 미만일 수 있다(예를 들어, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 또는 미만). 혈청군 A:C:W135:Y로부터의 당류에 대한 바람직한 비율(w/w)은 1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2; 및 2:2:2:1이다. 혈청군 C:W135:Y로부터의 당류에 대한 바람직한 비율(w/w)은 1:1:1; 1:1:2; 1:1:1; 2:1:1; 4:2:1; 2:1:2; 4:1:2; 2:2:1; 및 2:1:1이다. 실질적으로 동등한 질량의 각 당류를 이용하는 것이 바람직하다.

캡슐 당류는 올리고당류의 형태로 이용될 수 있다. 이들은 정제된 캡슐 다당류의 단편화에 의해 편리하게 형성되고(예를 들어, 가수분해에 의해), 그 다음에 요망되는 크기의 단편의 정제가 일반적으로 이어질 것이다.

다당류의 단편화는 바람직하게는 30 미만(예를 들어, 혈청군 A에 대해 10 내지 20, 바람직하게는 약 10; 혈청군 W135 및 Y에 대해 15 내지 25, 바람직하게는 약 15-20; 혈청군 C에 대해 12 내지 22; 등등)의 올리고당류에서의 최종 평균 중합반응 정도(DP)를 제공하도록 수행된다. DP는 이온 교환 크로마토그래피 또는 비색 검정에 의해 편리하게 측정될 수 있다[78].

가수분해가 수행되면, 가수분해물은 일반적으로 짧은 길이 올리고당류를 제거하기 위해 크기조정될 것이다[57]. 이는 초미세여과 다음에 이온 교환 크로마토그래피와 같은, 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 약 6 이하의 중합반응 정도를 갖는 올리고당류가 바람직하게는 혈청군 A에 대해 제거되고, 약 4 미만인 것들이 바람직하게는 혈청군 W135 및 Y에 대해 제거된다.

바람직한 MenC 당류 항원은 MENJUGATE™에서 이용된 바와 같이, 참고문헌 77에 기재되어 있다.

당류 항원은 화학적으로 변형될 수 있다. 이것은 혈청군 A에 대한 가수분해를 감소시키는데 특히 유용하다[79]. 수막구균 당류의 데-O-아세틸화가 수행될 수 있다. 올리고당류의 경우, 변형은 탈중합반응 전 또는 후에 일어날 수 있다.

본 발명의 조성물이 MenA 당류 항원을 포함하는 경우, 항원은 바람직하게는 천연 당류 상의 하이드록실기 중 하나 이상이 차단기에 의해 대체된 변형된 당류이다[79]. 이러한 변형은 가수분해에 대한 내성을 개선시킨다.

공유 컨쥬게이션

본 발명의 조성물의 캡슐 당류는 일반적으로 담체 단백질(들)에 컨쥬게이션될 것이다. 일반적으로, 컨쥬게이션은 이것이 T-독립적 항원으로부터 T-의존성 항원으로 당류를 전환시켜, 면역학적 기억에 대한 프라이밍을 허용함에 따라, 당류의 면역원성을 향상시킨다. 컨쥬게이션은 소아과 백신에 특히 유용하며 널리 알려진 기술이다.

통상적인 담체 단백질은 박테리아 독소, 예를 들어, 디프테리아 또는 파상풍 독소, 또는 이의 톡소이드 또는 돌연변이체이다. CRM₁₉₇ 디프테리아 독소 돌연변이체[80]가 유용하며, PREVNAR™ 제품의 담체이다. 다른 적합한 담체 단백질은 N. 메닌지티디스 외막 단백질 복합체[81], 합성 펩티드[82,83], 열 충격 단백질[84,85], 백일해 단백질[86,87], 사이토카인[88], 림포카인[88], 호르몬[88], 성장 인자[88], 다양한 병원체-유래 항원으로부터의 다수의 인간 CD4⁺ T 세포 에피토프를 포함하는 인공 단백질[89], 예를 들어, N19[91], H. 인플루엔자로부터의 단백질 D[91-93], 뉴몰리신[94] 또는 이의 무독성 유도체[95], 폐렴구균 표면 단백질 PspA[96], 철-흡수 단백질[97], C. 디피실레(C.difficile)로부터의 독소 A 또는 B[98], 재조합 P. 아에루기노사(P. aeruginosa) 엑소단백질 A(rEPA)[99] 등을 포함한다.

필요에 따라 임의의 적합한 링커를 이용하여, 임의의 적합한 컨쥬게이션 반응이 이용될 수 있다.

당류는 통상적으로 컨쥬게이션 전에 활성화되거나 작용기화될 것이다. 활성화는, 예를 들어, 시아닐화 시약, 예를 들어, CDAP(예를 들어, 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트[100, 101, 등])를 수반할 수 있다. 다른 적합한 기술은 카르보디이미드, 하이드라지드, 활성 에스테르, 노르보란, p-니트로벤조산, N-하이드록시석신이미드, S-NHS, EDC, TSTU 등을 이용한다.

링커기를 통한 연결은 임의의 공지된 절차, 예를 들어, 참고문헌 102 및 103에 기재된 절차를 이용하여 이루어질 수 있다. 한 유형의 연결은 다당류의 환원성 아민화, 생성된 아미노기와 아디프산 링커기의 한 말단의 커플링, 및 이어서 아디프산 링커기의 다른 말단에 단백질 커플링을 포함한다[104,105]. 다른 링커는 B-프로피온아미도[106], 니트로페닐-에틸아민[107], 할로아실 할라이드[108], 글리코시드 연결[109], 6-아미노카프로산[110], ADH[111], C₄ 내지 C₁₂ 모이어티[112] 등을 포함한다. 링커를 이용하는 것에 대한 대안으로서, 직접 연결이 이용될 수 있다. 단백질로의 직접 연결은, 예를 들어, 참고문헌 113 및 114에 기재된 대로, 다당류의 산화 이후에 단백질에 의한 환원성 아민화를 포함할 수 있다.

아미노기를 당류에 도입시킨 다음(예를 들어, 말단 =O 기를 -NH₂로 대체함에 의해) 아디프산 디에스테르(예를 들어, 아디프산 N-하이드록시석신이미도 디에스테르)에 의한 유도체화 및 담체 단백질과의 반응을 포함하는 공정이 바람직하다. 또 다른 바람직한 반응은, 예를 들어, MenA 또는 MenC의 경우 단백질 D 담체에 의한 CDAP 활성화를 이용한다.

외막 소체(OMV)

본 발명의 조성물이 OMV의 전형적인 특징인 항원의 복합체 또는 정의되지 않은 혼합물을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명은 OMV와 함께 이용될 수 있는데, 그 이유는 fHbp가 OMV 제조에 사용된 균주에서 본 발명의 폴리펩티드를 단순히 혼합하거나 과발현시킴에 의해, 이들의 효능을 향상시킴이 발견되었기 때문이다[4].

이러한 접근법은 N. 메닌지티디스 혈청군 B 미세소체[115], '천연 OMV'[116], 수포 또는 외막 소체(예를 들어, 참고문헌 117 내지 123 등)의 제조를 개선시키기 위해 일반적으로 이용될 수 있다.

통상적인 외막 소체는 박테리아로부터 인공적으로 제조되며, 세제 처리(예를 들어, 데옥시콜레이트 이용)를 이용하거나 비-세제 수단에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 참고문헌 127 참조). OMV를 형성시키기 위한 기술은 세제를 침전시키지 않는 충분히 높은 pH에서 박테리아를 담즙산 염 세제(예를 들어, 리토콜산, 케노데옥시콜산, 우르소데옥시콜산, 데옥시콜산, 콜산, 우르소콜산 등의 염, 소듐 데옥시콜레이트[124 & 125]이 네이세리아를 치료하는데 바람직함)로 처리하는 것을 포함한다[126]. 다른 기술은 초음파처리, 균질화, 미세유동화, 공동화, 삼투압 충격, 분쇄, 프렌치 가압, 블렌딩 등과 같은 기술을 이용하여 실질적으로 세제의 부재하에서 수행될 수 있다[127, 128]. 세제를 이용하지 않거나, 세제를 적게 이용하는 방법은 유용한 항원, 예를 들어, NspA 및 fHbp를 유지시킬 수 있다[127]. 따라서, 본 발명과 함께 이용되는 OMV는 약 0.5%의 데옥시콜레이트 또는 그 미만, 예를 들어, 약 0.2%, 약 0.1%, <0.05% 또는 심지어 0의 데옥시콜레이트를 갖는 OMV 추출 완충액을 이용하여 제조될 수 있다.

MV(막 소체) 및 NOMV(천연 외막 소체)로 공지된 소체는 박테리아 성장 동안 자연적으로 형성되고, 배양 배지로 방출되는 천연 발생 막 소체이다. MV는 브로쓰 배양 배지에서 네이세리아를 배양하고, 브로쓰 배양 배지에서 더 작은 MV로부터 전체 세포를 분리(예를 들어, 세포만 펠렛화시키고 더 작은 소체는 펠렛화시키지 않기 위해 여과 또는 저속 원심분리에 의함)시키고, 이후 세포 고갈 배지로부터 MV를 수거(예를 들어, MV의 여과, 차별적 침전 또는 응집, MV를 펠렛화시키기 위한 고속 원심분리에 의함)함으로써 획득될 수 있다. MV의 생성에서 사용하기 위한 균주는 일반적으로 배양 중에 생성된 MV의 양을 기초로 하여 선택될 수 있으며, 예를 들어, 참고문헌 135 & 136은 높은 MV 생성을 갖는 네이세리아를 기재한다.

예를 들어, 면역원성을 증가시키고(예를 들어, 초-발현 면역원), 독성을 감소시키고, 캡슐 다당류 합성을 억제하고, PorA 발현을 하향 조절하는 것 등을 위해 유전공학적으로 조작된 박테리아로부터 소체가 제조될 수 있다[129-132]. 이들은 과수포발생 균주로부터 제조될 수 있다[133-136]. 상이한 클래스 I 외막 단백질 서브타입을 갖는 박테리아로부터의 소체, 예를 들어, 각각 3개의 서브타입을 나타내는 2개의 상이한 유전공학 처리된 소체 집단을 이용한 6개의 상이한 서브타입[137, 138], 또는 각각 3개의 서브타입을 나타내는 3개의 상이한 유전공학 처리된 소체 집단 등을 이용한 9개의 상이한 서브타입 등이 이용될 수 있다. 유용한 서브타입은 P1.7,16; P1.5-1,2-2; P1.19,15-1; P1.5-2,10; P1.12-1,13; P1.7-2,4; P1.22,14; P1.7-1,1; P1.18-1,3,6을 포함한다. 그러나, 일반적으로, 본 발명은 야생형 수막구균 균주로부터 OMV를 제조하는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명과 함께 이용하기 위한 소체는 임의의 야생형 수막구균 균주로부터 제조될 수 있다. 소체는 일반적으로 혈청군 B 균주로부터의 소체일 것이나, 이들을 B가 아닌 혈청군(예를 들어, 참고문헌 126은 혈청군 A를 위한 방법을 기재함), 예를 들어, A, C, W135 또는 Y로부터 제조하는 것이 가능하다. 균주는 임의의 혈청형(예를 들어, 1, 2a, 2b, 4, 14, 15, 16 등), 임의의 혈청아형(예를 들어, P1.4), 및 임의의 면역형(예를 들어, L1; L2; L3; L3,7; L3,7,9; L10 등)의 균주일 수 있다. 수막구균은 임의의 적합한 계통, 예를 들어, 과침습성 및 과병독성 계통, 예를 들어, 서브그룹 I; 서브그룹 III; 서브그룹 IV-1; ET-5 복합체; ET-37 복합체; A4 클러스터; 계통 3의 7개의 과병독성 계통 중 어느 하나의 수막구균일 수 있다. 가장 바람직하게는, OMV는 균주 NZ98/254, 또는 P1.4 PorA 혈청아형을 갖는 또 다른 균주로부터 제조된다. 본 발명은 유리하게는 균주 NZ98/254로부터 제조된, BEXSERO™ 및 MENZB™ 제품에서 사용되는 것과 동일한 OMV를 이용한다.

소체는 일반적으로 수막구균 지질올리고당류(LOS, LPS로도 공지됨, 지질다당류)를 포함할 것이나, OMV에서의 LOS의 발열 효과는 동일량의 정제된 LOS로 관찰되는 것보다 훨씬 적고, 알루미늄 하이드록시드로의 OMV의 흡착은 발열원성을 추가로 감소시킨다. LOS 수준은 내독소의 국제 단위(IU)로 표현되고, LAL 검정(리물러스 유주세포 용해질)에 의해 시험될 수 있다. 바람직하게는, LOS는 OMV 단백질의 μg 당 2000 IU 미만으로 존재한다.

LOS가 소체 내에 존재하는 경우, 이의 LOS와 단백질 성분을 연결시키기 위해 소체를 처리하는 것이 가능하다("수포내" 컨쥬게이션[139]).

OMV 정제를 위한 유용한 방법은 참고문헌 140에 기재되어 있고, 고속 원심분리 대신 미정제 OMV에 대한 초여과를 수반한다. 상기 방법은 초여과가 발생한 후에 초원심분리 단계를 수반할 수 있다. 상기 방법은 초여과가 발생한 후에 초원심분리 단계를 수반할 수 있다. OMV는 또한 참고문헌 152에 기재된 2 단계 크기 여과 방법을 이용하여 정제될 수 있다.

OMV는 이들이 제조된 후에 수크로스 용액 중에 유용하게 현탁될 수 있다.

숙주 세포

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키는 박테리아를 제공한다. 박테리아는 수막구균 또는 E. 콜리일 수 있다. 박테리아는 항시적으로 폴리펩티드를 발현시킬 수 있으나, 일부 구체예에서, 발현은 유도성 프로모터의 조절 하에 있을 수 있다. 박테리아는 폴리펩티드를 과발현시킬 수 있다(cf. 참고문헌 141). 폴리펩티드의 발현은 이상적으로는 상 가변적이지 않다.

본 발명은 또한 본 발명의 박테리아로부터(특히 수막구균으로부터) 제조된 외막 소체를 제공한다. 이는 또한 본 발명의 박테리아로부터 소체를 생성하는 공정을 제공한다. 이들 균주로부터 제조된 소체는 바람직하게는 소체에서 면역접근적 형태로 존재하여야 하는 본 발명의 폴리펩티드를 포함하고, 즉, 정제된 본 발명의 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체는 또한 소체에 존재하는 폴리펩티드에도 결합할 수 있어야 한다.

본 발명의 박테리아는 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 것 외에, 하나 이상의 추가 변형을 지닐 수 있다. 예를 들어, 이들은 변형된 fur 유전자를 지닐 수 있다[142]. nspA 발현의 발현은 동시적 porA 및 cps 녹아웃으로 상향조절될 수 있다. OMV 생성을 위한 N. 메닌지티디스의 추가 녹아웃 돌연변이체는, 예를 들어, 참고문헌 139에 기재되어 있다. 참고문헌 143은 6개의 상이한 PorA 아형을 발현시키도록 변형된 균주로부터 소체의 작제를 기재한다. LPS 생합성에 관여하는 효소의 녹아웃에 의해 달성된, 낮은 내독소 수준을 지니는 돌연변이체 네이세리아가 또한 이용될 수 있다[144,145]. LPS의 지질 A 부분이 독성이 되게 하는데 관여하는 적어도 하나의 유전자, 특히 lpxl1 유전자의 발현을 감소시키거나 스위치 오프(switch off)하도록 공학처리된 돌연변이체 네이세리아가 본 발명에 이용될 수 있다[146]. 유사하게, 캡슐 다당류 합성 또는 외수송에 관여하는 적어도 하나의 유전자, 특히 synX 및/또는 ctrA 유전자의 발현을 감소시키거나 스위치 오프하도록 공학처리된 돌연변이체 네이세리아가 본 발명에 이용될 수 있다. 상기 또는 다른 돌연변이체가 모두 본 발명에 이용될 수 있다.

일부 구체에에서, 균주는 PorA 발현에 대해 하향조절되었을 수 있고, 예를 들어, PorA의 양은 야생형 수준(예를 들어, 균주 H44/76에 비해)에 비해 적어도 20%(예를 들어, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90%, ≥95% 등)만큼 감소되었거나, 심지어 녹아웃되었다.

일부 구체예에서, 균주는(상응하는 야생형 균주에 비해) 특정 단백질을 과발현시킬 수 있다. 예를 들어, 균주는 NspA, 단백질 287[117], fHbp[141](본 발명의 fHbp 포함), TbpA 및/또는 TbpB[147], Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤타제, HmbR 등을 과발현시킬 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자는 박테리아 염색체에 통합될 수 있거나, 예를 들어, 플라스미드 내에 에피솜 형태로 존재할 수 있다.

유리하게는 소체 생성을 위해, 수막구균은 폴리펩티드의 발현이 상 변동되지 않음을 확실히 하도록 유전적으로 공학처리될 수 있다. 수막구균에서 유전자 발현의 상 가변성을 감소시키거나 제거하기 위한 방법은 참고문헌 148에 기재되어 있다. 예를 들어, 유전자는 항시적 또는 유도성 프로모터의 제어 하에 놓일 수 있거나, 상 가변성의 원인인 DNA 모티프를 제거하거나 대체할 수 있다.

일부 구체예에서, 균주는 참고문헌 122, 129, 133, 및 139에 기재된 녹아웃 및/또는 과발현 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 4개 문서의 지침 및 명명법에 따라, 하향조절 및/또는 녹아웃에 유용한 유전자는 (a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, 및/또는 TbpB; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, 및/또는 TbpB; (c) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, 및/또는 TbpB; 또는 (d) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorB, SiaD, SynA, SynB, SynX 및/또는 SynC를 포함한다.

돌연변이체 균주체가 이용되는 경우, 일부 구체예에서 이것은 하기 특징 중 하나 이상, 또는 전부를 지닐 수 있다: (i) 수막구균 LOS를 트렁케이션하기 위해 하향조절되거나 녹아웃된 LgtB 및/또는 GalE; (ii) 상향조절된 TbpA; (iii) 상향조절된 NhhA; (iv) 상향조절된 Omp85; (v) 상향조절된 LbpA; (vi) 상향조절된 NspA; (vii) 녹아웃된 PorA; (viii) 하향조절되거나 녹아웃된 FrpB; (ix) 하향조절되거나 녹아웃된 Opa; (x) 하향조절되거나 녹아웃된 Opc; (xii) 결실된 cps 유전자 복합체. 트렁케이션된 LOS는 시알릴-락토-N-네오테트라오스 에피토프를 포함하지 않는 것일 수 있고, 예를 들어, 이것은 갈락토스-결핍 LOS일 수 있다. LOS는 α 사슬을 갖지 않을 수 있다.

소체를 제조하는데 이용되는 수막구균 균주에 따라, 소체는 균주의 천연 fHbp 항원을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다[149].

한 바람직한 구체예에서, 수막구균은 기능성 MltA 단백질을 발현시키지 않는다. 참고문헌 150 & 151에서 논의된 대로, 수막구균에서 MltA(막-결합된 용해 트랜스글리코실라제, GNA33으로도 공지됨)의 녹아웃은 다량의 막 소체를 배양 배지로 자발적으로 방출시키는 박테리아를 제공하고, 이들은 여기에서 용이하게 정제될 수 있다. 예를 들어, 소체는 (i) 소체를 이들의 상이한 크기에 기반하여 박테리아로부터 분리하는 제1 여과 단계로서, 소체가 여과액으로 통과하는 단계; 및 (ii) 소체를 잔류물에 유지시키는 제2 여과 단계를 포함하는, 참고문헌 152의 2단계 크기 여과 공정을 이용하여 정제될 수 있다. MltA 돌연변이(하향조절 또는 녹아웃)는 'GMMA' 백신에 이용되어 왔고[153], 특히 LPS의 지질 A 부분이 독성이 되게 하는데 관여하는 적어도 하나의 유전자, 특히 lpxl1 및/또는 캡슐 다당류 합성 또는 외수송에 관여하는 적어도 하나의 유전자, 특히 synX 및/또는 ctrA 유전자의 추가 하향조절 또는 녹아웃과 편리하게 조합될 수 있다.

'GMMA'(막 항원에 대한 일반화된 모듈) 백신에 대한 바람직한 수막구균 균주는 이러한 접근법을 이용하여 본 발명의 첫번째, 세번째 또는 다섯번째 양태의 돌연변이체 v2 fHbp 및/또는 두번째, 네번째 또는 여섯번째 양태의 돌연변이체 v3 fHbp를 발현시키고, 발현은 강력한 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 이러한 균주에 의해 방출된 소체는 면역원성 형태의 돌연변이체 v2 및/또는 v3 fHbp 단백질을 포함하고, 소체의 투여는 참고문헌 153에서 논의된 대로 살균 항체 반응을 제공할 수 있다. 상기 균주는 또한 v1 fHbp를 발현할 수 있거나, v1 fHbp는 가용성 형태의 분리된 재조합 단백질로서 대신 제공될 수 있다(그리고 v1 fHbp는 야생형이거나, 예를 들어, 상기 논의된 대로, fH에 결합하는 이의 능력을 붕괴시키도록 돌연변이된 돌연변이체 서열일 수 있다). 본 발명은 그러한 균주를 제공하고, 예를 들어, 균주의 성장 후에 배양 배지로부터 정제된 형태로서, 이러한 균주가 방출하는 소체를 또한 제공한다. 이들 균주에서 발현에 바람직한 v2 돌연변이체는 본원에 논의된 대로 L123 및 E240(및 임의로 S32)에 돌연변이를 지니고, 이러한 균주에서 발현에 바람직한 v3 돌연변이체는 본원에 논의된 대로 L126 및 E243(및 임의로 S32)에 돌연변이를 지닌다. 따라서, 이들 v2 및 v3 돌연변이체 fHbp 서열을 발현시키는 수막구균으로부터 제조된 소체는 본 발명의 백신에 사용하기 특히 바람직한 면역원이다. 이러한 방식의 돌연변이유발에 유용한 야생형 v2 서열은 SEQ ID NO:35 또는 SEQ ID NO:33(ΔG 형태 SEQ ID NO:34 포함)를 포함하고, 이러한 방식의 돌연변이유발에 유용한 야생형 v3 서열은 SEQ ID NO:36을 포함한다.

그러한 균주에 사용하기 유용한 프로모터는 참고문헌 154 및 155에 기재된 것들을 포함한다. 예를 들어, 프로모터는 (a) 포린 유전자로부터의 프로모터, 바람직하게는 특히 N. 메닌지티디스로부터의 porA 또는 porB; 또는 (b) 특히 N. 메닌지티디스로부터의 rRNA 유전자 프로모터(예를 들어, 16S rRNA 유전자)일 수 있다. 수막구균 포린 프로모터가 이용되는 경우, 이는 바람직하게는 porA, 심지어 더 특히 수막구균 porA 유전자 프로모터로부터의 -10 영역, 및/또는 수막구균 porA 유전자 프로모터로부터의 -35 영역(바람직하게는 -10 영역 및 -35 영역이 12-20개 뉴클레오타이드의 개입 서열에 의해 분리되고, 개입 서열은 폴리-G 서열을 함유하지 않거나 8개 이하의 연속 G 뉴클레오타이드를 갖는 폴리-G 서열을 포함함)으로부터 비롯된다. rRNA 유전자 프로모터가 이용되는 경우, 이것은 보다 특히 (i) 수막구균 rRNA 유전자 프로모터로부터의 -10 영역 및/또는 (ii) 수막구균 rRNA 유전자 프로모터로부터의 -35 영역을 포함할 수 있다. (a) 및 (b)의 하이브리드를 이용하고, 예를 들어 porA 프로모터로부터의 -10 영역 및 rRNA 프로모터로부터의 -35 영역(컨센서스 -35 영역일 수 있다)을 갖는 것이 또한 가능하다. 따라서, 유용한 프로모터는 (i) (특히 수막구균) rRNA 유전자로부터의 -10 영역 및 (특히 수막구균) porA 유전자로부터의 -35 영역, 또는 (ii) (특히 수막구균) porA 유전자로부터의 -10 영역 및 (특히 수막구균) rRNA 유전자로부터의 -35 영역을 포함하는 프로모터일 수 있다.

총론

용어 "포함하는"은 "포함하는" 뿐만 아니라 "구성되는"을 포함하며, 예를 들어, X를 "포함하는" 조성물은 X만으로 구성될 수 있거나, 예를 들어, X + Y와 같이 추가적인 것을 포함할 수 있다. "포함하는"(또는 "포함하다" 등)에 대한 언급은 임의로 "구성된"(또는 "구성되다" 등)의 언급으로 대체될 수 있다.

숫자값 x와 관련된 용어 "약"은 임의적인 것이며, 예를 들어, x±10%를 의미한다.

용어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않으며, 예를 들어, Y를 "실질적으로 함유하지 않는" 조성물은 Y를 완전히 함유하지 않을 수 있다. 필요한 경우, 용어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.

"서열 동일성"은 바람직하게는 디폴트 파라미터(예를 들어, EBLOSUM62 스코어링 매트릭스를 이용하여 갭 오픈 페널티 = 10.0, 및 갭 신장 페널티 = 0.5)를 이용하는 니들먼-분쉬 전체 정렬 알고리즘[156]에 의해 결정된다. 이러한 알고리즘은 EMBOSS 패키지의 니들 툴[157]에서 편리하게 수행된다. 적용이 특정 SEQ ID에 대한 서열 동일성을 의미하는 경우, 동일성은 그 SEQ ID의 전체 길이에 걸쳐 계산되어야 한다.

혈청군 다음에, 수막구균 분류는 혈청형, 혈청아형 및 이어서 면역형을 포함하고, 표준 명명법은 각각이 B:4:P1.15:L3,7,9와 같이 콜론에 의해 분리된, 혈청군, 혈청형, 혈청아형, 및 면역형을 열거한다. 혈청군 B 내에서, 일부 계통은 종종 질병을 초래하고(과침습성), 일부 계통은 다른 것보다 더욱 심각한 형태의 질병을 초래하며(과병독성), 다른 것들은 질병을 거의 초래하지 않는다. 7개의 과병독성 계통이 인지되며, 즉 서브그룹 I, III 및 IV-1, ET-5 복합체, ET-37 복합체, A4 클러스터 및 계통 3이다. 이들은 다중좌(multilocus) 효소 전기영동(MLEE)에 의해 정의되었으나, 다중좌 서열 형결정(MLST)이 또한 수막구균을 분류하는데 이용되어 왔다. 4개의 주요 과병독성 클러스터는 ST32, ST44, ST8 및 ST11 복합체이다.

일반적으로, 본 발명은 참고문헌 2, 3, 5, 6, 7, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 및 165에 구체적으로 기재된 다양한 fHbp 서열을 포함하지 않는다.

실시예

실시예 1: fH 결합을 위한 돌연변이유발

야생형 v2 단백질(SEQ ID NO:2)은 고정된 인간 fH를 이용한 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 평가시 fH에 대한 강한 결합을 나타낸다(도 1, 상부 라인). fH에 결합하는 fHbp의 능력을 붕괴시키기 위해, v2의 Glu-266(SEQ ID NO:5에서 E240; 참고문헌 19 & 25에서 E248에 해당함) 및 v3의 Glu-274(SEQ ID NO:17에서 E243)를 Ala로 돌연변이시켰다. v2에서의 E266A 돌연변이는 fH 결합을 강하게 감소시켰다(도 1, 하부 라인).

유사하게, v1 fHbp의 공지된 'R41S' 돌연변이를 도입시켰다(SEQ ID NO:52).

실시예 2: 안정성 증가를 위한 돌연변이유발

v2 및 v3 fHbp 둘 모두가 특히 이들의 N-말단 도메인에서 v1보다 유의하게 덜 안정적이며, v2는 3개의 변이체 중 가장 덜 안정적이다. v2에서의 안정성을 개선시키기 위해, 2개의 잔기를 돌연변이시켰다: SEQ ID NO:2의 Ser-58(SEQ ID NO:5에서 S32) 및 SEQ ID NO:2의 Leu-149(SEQ ID NO:5에서 L123)를 각각 Val 및 Arg로 돌연변이시켰다. 돌연변이체 v2 단백질(SEQ ID NO:19)을 DSC에 의해 분석하고, 야생형 서열 SEQ ID NO:2와 비교하였고, C-말단 도메인의 T_m은 돌연변이에 의해 영향을 받지 않았다. N-말단 도메인의 T_m은 >20℃ 더 높다(도 2, 증가는 화살표로 표시됨). 동등한 돌연변이를 또한 v3에 도입시켰다(SEQ ID NO:44).

놀랍게도, 안정성을 개선시키기 위해 S58V 및 L149R 돌연변이를 도입시켰고, 이러한 목적을 확실히 달성하였으나, 도 1(중간 라인)은 돌연변이체 폴리펩티드(SEQ ID NO:19)(E266A 돌연변이가 없음)가 또한 fH에 대한 훨씬 감소된 결합을 나타낸 것을 제시한다. 더욱이, 혈청 살균 검정에서, 이러한 v2 돌연변이체는 SEQ ID NO:18에 대해 발생된 인간 항체로의 결합에 대해 결쟁할 수 있었다:

v2에서의 S58V/L149R 안정화 돌연변이는 fH 결합에 대해 놀라운 영향을 가졌고, 따라서 안정성에 대한 E266A의 효과를 또한 연구하였다. 예기치 않게, 이러한 돌연변이는 N-말단 도메인의 안정성을 감소시켰으나, C-말단 도메인의 안정성을 >15℃ 만큼 증가시켰고(야생형에 비해 도 3에 제시된 바와 같이 83℃로부터 99℃까지), 따라서 이는 베타 배럴의 잠재적 안정화를 암시한다.

fH 결합에 대한 개별적 S58V 및 L149R 돌연변이의 효과를 v3에서 연구하였다. 따라서, SEQ ID NO:17에 따라 넘버링된 돌연변이 S32V 또는 L126R을 v3 서열에 도입시켰다. 이들 2개의 돌연변이체를 2개의 상이한 야생형 v3 서열, 및 또한 v3에서 fH 결합을 붕괴시키는 것으로 공지된 'E313A' 돌연변이체와 비교하였다[23].

도 6에 제시된 바와 같이, 둘 모두의 야생형 v3은 fH에 결합한다(상부 2개의 라인). 안정성을 개선시키도록 설계된 S58V 돌연변이는 SPR 피크를 약 2배만큼 감소시켰다. 가장 놀랍게는, L149R 돌연변이(또한, 안정성을 개선시키도록 설계됨)는 fH 친화성을 공지된 E313A 돌연변이체와 유사한 수준으로 감소시켰다(하부 2개의 라인).

v3에서의 S58V 및 L149R 돌연변이를 또한 DSC에 의해 연구하였고, N-말단 T_m을 5.5℃(S58V) 또는 6.7℃(L149R)만큼 증가시키는 것을 발견하였다. 각각의 돌연변이체의 T_m은 v2 S58V/L149R 이중 돌연변이체에서 관찰된 것보다 높았다. L149R v3 돌연변이체는 또한 이의 C-말단 도메인에 대해 더 높은 T_m 값을 나타낸 반면, S58V v3 돌연변이체에 대해서는 거의 변동이 없었다.

실시예 3: 융합 폴리펩티드

안정성 및 fHbp 결합에 대한 돌연변이를 v2(SEQ ID NO:50) 및 v3(SEQ ID NO:51)의 돌연변이체 형태로 조합시켰다. 이들을 v2-v3-v1 순서로 돌연변이체 v1 서열(SEQ ID NO:52)과 융합시키고, 링커를 이용하여 연결시켜 SEQ ID NO:27('SNB')을 생성시켰다. 따라서, 3개의 야생형 서열에 비해, 이러한 융합 폴리펩티드는 전체 7개의 점 돌연변이를 포함한다(도 9). SNB 융합체를 이들 점 돌연변이가 없는 '야생형' 융합 폴리펩티드와 비교하였다(SEQ ID NO:18; 참고문헌 163으로부터의 SEQ ID NO:36). 둘 모두의 형태의 단백질을 발현하는 E. 콜리 추출물을 웨스턴 블롯에 의해 탐지하였고, 안정화된 비-결합 형태의 융합체를 이용하여 단백질의 분해 형태는 훨씬 덜 보였다(SEQ ID NO:27)(도 8).

fH로의 SNB 융합체의 결합을 SPR에 의해 연구하였고, '야생형' 융합체와 비교하였다. 도 4는 '야생형' 융합체가 fH에 대한 강한 결합을 나타내는 반면(상부 라인), SNB 돌연변이체는 fH와 유의하게 상호작용하지 않는 것을 제시한다(하부 라인).

2개의 융합 폴리펩티드의 안정성을 DSC를 이용하여 연구하였다(도 5). '야생형' 융합체의 써모그램(도 5a)은 v3에 기인될 수 있는 임의의 N-말단 전이를 포함하지 않았고, 이는 이러한 도메인이 정확하게 폴딩되지 않은 것을 암시한다. 대조적으로, 'SNB' 돌연변이체를 이용하여, 써모그램은 6개 모두의 도메인(N-말단 및 C-말단에 대해 각각 3개)에 대해 전이를 나타내었고, 이는 이들이 모두 정확하게 폴딩된 것을 나타낸다(도 5b).

개별적으로, v2(SEQ ID NO:45) 및 v3(SEQ ID NO:44)에서의 안정성에 대해 돌연변이를 v2-v3-v1의 순서로 'R41S' 돌연변이체 v1 서열(SEQ ID NO:52)과 융합시키고, 링커를 이용하여 연결시켜 SEQ ID NO:29를 생성시켰다. 따라서, 3개의 야생형 서열에 비해, 이러한 융합 폴리펩티드는 전체 5개의 점 돌연변이를 포함한다.

SBA 역가를 유도하는 fHbp의 비-fH 결합 형태의 능력을 트랜스제닉(Tg) 마우스에서 시험하였다:

이들 데이터는 fHbp의 비-결합 형태가 더욱 면역원성일 수 있음을 나타낸다.

실시예 4: 3D 구조

이전에, fHbp var.3 구조는 fH와의 복합체에서만 결정되었다. v2 fHbp-fH 복합체에 대해, 이전 연구에서 fHbp의 C-말단 도메인에서만 검출 가능하였다.

V2 및 V3 fHbp 돌연변이체의 결정을 다음과 같이 제조하였다: 결정화 실험을 Gryphon 결정화 로봇(Art Robbins Instruments)을 이용하여 수행하였다. X-선 회절 데이터를 Pilatus 2M 검출기 상의 Swiss Light Source(Paul Scherrer Institute, Villigen, Switzerland) 빔라인(beamline) X06DA에서 수거하거나, European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), Grenoble, France의 빔라인 BM30A에서 수거하였다. 모든 회절 데이터를 iMosflm로 처리하고, Aimless로 스케일링시키고, 결정 조작을 CCP4 패키지를 이용하여 수행하였다.

안정화 돌연변이는 var.2 Nterminus의 구조 결정을 가능하게 하며, fHbp var.3 S58V의 X-선 구조는 fH의 부재하에서 결정되었다. fHbp var.2 및 var.3는 var.1과 비교하여 덜 안정한 폴딩을 특징으로 한다. 이러한 관찰과 일치하게, fHbp var2 및 var3의 전장 구조는 결정하기에 어려웠다. 단백질의 안정화는 (미세)환경과의 더 나은 열역학적 평형의 확립과 커플링된, 구조 및 기능 둘 모두의 보존으로 환언된다. 결과로서, 단백질 안정화는 종종 구조 결정에 적합한 결정의 획득을 발생시킨다. S58V 및 L149R 안정화 치환은 전체 fHbp var.3 결정 구조의 결정 및 fhbp var.2의 세그먼트 81-254의 분석을 가능케 하였다. 안정화 돌연변이를 도입시킴으로써, N-말단의 거의 완전한 구조가 fH의 부재하에서 획득되었다(도 7).

실시예 5: 표면 플라즈몬 공명( SPR ) 분석

SPR을 이용하여 fH 단백질로의 231 키메라 단백질의 결합을 분석하였다. 모든 SPR 실험을 25℃에서 Biacore T200 기계(GE Healthcare)를 이용하여 수행하였다. 요컨대, 231 단백질의 유사한 밀도(∼400-500 반응 단위(RU))가 아민 커플링에 의해 고정된 카르복시메틸화 덱스트란 센서 칩(CM-5; GE Healthcare)을 제조하였다. 고정된 단백질은 다음과 같았다:

- 플로우 셀 2에 고정된 231 wt(SEQ ID NO:18) 정제 MenB 547(0.26 mg/ml)

- 플로우 셀 3에 고정된 v2 및 v3, (SEQ ID NO:29) 정제 MenB 532(0.68 mg/ml)에 대한 R41S, S58V 및 L149를 포함하는 231 S

- 플로우 셀 4에 고정된 v2 및 v3, E252A 및 E255A(SEQ ID NO:27) 정제 MenB 512(0.78 mg/ml) 둘 모두에 대한 R41S, S58V 및 L149를 포함하는 231 SNB

이들 단백질을 아세테이트 pH 5.5 중에 5ug/ml로 희석시키고, 표준 아민 커플링 프로토콜을 후속시켜 표적 밀도에 도달시켰다. 다른 Fc와 같으나 단백질이 이용되지 않은 플로우 셀 1을 제조하였다. 이후, 플로우 셀 1을 참조 셀로 이용하였고, 생성된 신호를 다른 플로우 셀로부터 발생하는 신호로부터 공제하였다. 런닝(running) 완충액은 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0.05%(vol/vol) P20 계면활성제, pH 7.4(HBS-P- GE-Healthcare)를 함유하였다. 이후, fH 단백질을 결합 실험을 위해 2배 희석으로 증가하는 분석물 농도의 5개의 주입의 범위(62.5 nM 내지 1 mM)로 주입하였다. 다음과 같은 fH 작제물을 시험하였다: H 인자 전장(Calbiochem) 및 C. Tang에 의해 제공된 도메인 6-7만 포함하는 H 인자(Schneider et al., Nature 458, 890-893).

각각의 주입 후, 표면을 이후 20초의 10 mM 글리신 pH 1.7의 주입으로 재생시켰다. 완충액 단독의 블랭크 주입을 각각의 곡선으로부터 공제하였고, 참조 센서그램을 실험 센서그램으로부터 공제하여, 특정 결합을 나타내는 곡선을 발생시켰다. 제시된 데이터는 2개의 독립적 실험의 대표이다. SPR 데이터를 Biacore T200 평가 소프트웨어(GE Healthcare)를 이용하여 분석하였다. 생성된 센서그램을 잠재적 물질 전달을 설명하기 위한 용어를 포함하는 1:1 랑무이(Langmuir) 결합 모델로 적합화시켜 개별적 kon 및 koff 반응속도 상수를 획득하고; 이후 개별적 값을 조합시켜 보고된 단일 평균 KD 값(KD = koff/kon)을 유도하였다. 항정-상태 분석을 또한 이용하여 pH 7.4에서 열역학 해리 상수(KD)를 획득하였다. fH 도메인 6-7의 주입을 이용한 적정의 결과는 하기 제시된다:

결합 시험으로부터, 231 wt에 비해 231 S 단백질에 대해 fH에 대한 결합의 적어도 90%의 강한 감소, 및 231 wt에 비해 231 SNB 단백질에 대해 적어도 98%의 강한 감소가 관찰되었다.

전장 fH를 이용한 적정의 결과가 하기에 제공된다:

둘 모두의 결합 시험으로부터, 본 발명자는 231 wt에 비해 231 S 단백질에 대해 fH에 대한 결합의 적어도 90%의 강한 감소, 및 231 wt에 비해 231 SNB 단백질에 대해 98%의 강한 감소를 관찰하였다.

본 발명은 단지 예시에 의해 상기와 같이 기재되었으며, 본 발명의 범위 및 사상 내에서 유지되면서 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다.

참고문헌

서열 목록

> SEQ ID NO: 1 [MC58, v1]

> SEQ ID NO: 2 [2996, v2]

> SEQ ID NO: 3 [M1239, v3]

> SEQ ID NO: 4 [2996 성숙]

> SEQ ID NO: 5 [2996 ΔG ]

> SEQ ID NO: 6 [ NHBA ]

> SEQ ID NO: 7 [ NadA ]

> SEQ ID NO: 8 [ NspA ]

> SEQ ID NO: 9 [ HmbR ]

> SEQ ID NO: 10 [ NhhA ]

> SEQ ID NO: 11 [ App ]

> SEQ ID NO: 12 [ Omp85 ]

> SEQ ID NO: 13 [ NMB2091 ]

> SEQ ID NO: 14 [ NHBA 융합체 ]

> SEQ ID NO: 15 [ NadA 단편]

> SEQ ID NO: 16 [MC58, ΔG ]

> SEQ ID NO: 17 [M1239, ΔG ]

> SEQ ID NO: 18 ['야생형' 융합체 ]

> SEQ ID NO: 19 [ S58V / L149R 돌연변이체 v2]

> SEQ ID NO: 20 [링커]

> SEQ ID NO: 21 [링커]

> SEQ ID NO: 22 [링커]

> SEQ ID NO: 23 [링커]

> SEQ ID NO: 24 [N-말단 서열]

> SEQ ID NO: 25 [N-말단 서열]

> SEQ ID NO: 26 [링커]

> SEQ ID NO: 27 [돌연변이체 2-3-1 서열, A]

> SEQ ID NO: 28 [돌연변이체 2-3-1 서열, A, 선도 서열 없음]

> SEQ ID NO: 29 [돌연변이체 2-3-1 서열, B]

> SEQ ID NO: 30 [돌연변이체 2-3-1 서열, B, 선도 서열 없음]

> SEQ ID NO: 31 [돌연변이체 v2, Xaa 32는 임의의 아미노산이고, Xaa 123은 L이 아님]

> SEQ ID NO: 32 [돌연변이체 v3, Xaa 32는 임의의 아미노산이고, Xaa 126은 L이 아님]

> SEQ ID NO: 33 [v2, 8047 균주, 야생형]

> SEQ ID NO: 34 [v2, 8047 균주, ΔG ]

> SEQ ID NO: 35 [돌연변이유발, 예를 들어, GMMA 접근법을 위한 야생형 v2]

> SEQ ID NO: 36 [돌연변이유발, 예를 들어, GMMA 접근법을 위한 야생형 v3]

> SEQ ID NO:37 : 잔기 32가 S가 아니고, 잔기 126이 L이 아닌 N. 메닌지티디 스로부터의 변이체 fHbp v3

> SEQ ID NO:38 : 잔기 32가 S가 아니고, 잔기 123이 L이 아니고, 잔기 240이 E가 아닌 N. 메닌지티디스로부터의 fHbp v3

> SEQ ID NO: 39 [ 잔기 32가 S가 아니고, 잔기 123이 L이 아니고, 잔기 240이 E가 아닌 fHbp 변이체 v2]

> SEQ ID NO: 40 [M1239, 성숙]

> SEQ ID NO: 41 [M1239, E243A , ΔG ]

> SEQ ID NO: 42 [M1239, S32V + E243A , ΔG ]

> SEQ ID NO: 43 [M1239, S32V + L126R + E243A , ΔG ]

> SEQ ID NO: 44 [M1239, S32V + L126R , ΔG ]

> SEQ ID NO: 45 [v2 돌연변이체 #3, ΔG ]

> SEQ ID NO: 46 [MC58, v1, 성숙]

> SEQ ID NO: 47 [돌연변이체 v2, Xaa 32는 임의의 아미노산이고, 123은 L이 아니고, 240은 E가 아님]

> SEQ ID NO: 48 [돌연변이체 v3, Xaa 32는 임의의 아미노산이고, 126은 L아 아니고, 243은 E가 아님]

> SEQ ID NO: 49 [돌연변이체 v1, Xaa 34는 R이 아님]

> SEQ ID NO: 50 [돌연변이체 v2]

> SEQ ID NO: 51 [돌연변이체 v3]

> SEQ ID NO: 52 [ R41S 돌연변이체 v1]

> SEQ ID NO: 53 [돌연변이체 v2]

> SEQ ID NO: 54 [돌연변이체 v2]

> SEQ ID NO: 55 [돌연변이체 v3]

> SEQ ID NO: 56 [돌연변이체 v3]

> SEQ ID NO: 57 [ 잔기 32가 S를 제외한 임의의 아미노산이고, 잔기 126이 L이 아니고, 잔기 243이 E가 아닌 돌연변이체 v3]

SEQUENCE LISTING <110> GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS S.A. <120> MODIFIED MENINGOCOCCAL FHBP POLYPEPTIDES <130> VN56307 WO <140> <141> <150> EP 14177564.3 <151> 2014-07-17 <160> 60 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 274 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 1 Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Thr Ala Leu Ile 1 5 10 15 Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly 20 25 30 Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys 35 40 45 Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys 50 55 60 Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp 65 70 75 80 Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp 85 90 95 Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser 100 105 110 Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe 115 120 125 Gln Thr Glu Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala 130 135 140 Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser 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annotations for variant positions" <400> 60 His His His His His His His His His His 1 5 10

Claims

SEQ ID NO:5와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, (a) 아미노산 서열이 SEQ ID NO:5에 비해 잔기 123 및 240에서 SEQ ID NO:5와 상이하고; (b) 폴리펩티드가 인간으로의 투여 후에 SEQ ID NO:4로 구성된 폴리펩티드를 인지할 수 있는 항체를 유도할 수 있고; (c) 폴리펩티드가 SEQ ID NO:4로 구성된 폴리펩티드보다 더 높은 안정성을 갖고; (d) 폴리펩티드가 SEQ ID NO:4로 구성된 폴리펩티드보다 인간 fH에 대해 더 낮은 친화성을 갖는, 폴리펩티드.
제 1항에 있어서, 아미노산 서열이 SEQ ID NO:5에 비해 잔기 32에서도 SEQ ID NO:5와 상이하고; 예를 들어, 아미노산 서열 SEQ ID NO:47을 포함하는 폴리펩티드.
제 2항에 있어서, SEQ ID NO:5에 비해 치환 S32V, L123R, 및 E240A를 갖고, 예를 들어, SEQ ID NO:50을 갖는 폴리펩티드.
SEQ ID NO:17과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, (a) 아미노산 서열이 SEQ ID NO:17에 비해 잔기 126 및 243에서 SEQ ID NO:17과 상이하고; (b) 폴리펩티드가 인간으로의 투여 후에 SEQ ID NO:40으로 구성된 폴리펩티드를 인지할 수 있는 항체를 유도할 수 있고; (c) 폴리펩티드가 SEQ ID NO:40으로 구성된 폴리펩티드보다 더 높은 안정성을 갖고; (e) 폴리펩티드가 SEQ ID NO:40으로 구성된 폴리펩티드보다 인간 fH에 대해 더 낮은 친화성을 갖는, 폴리펩티드.
제 4항에 있어서, 아미노산 서열이 SEQ ID NO:17에 비해 잔기 32에서도 SEQ ID NO:17과 상이하고; 예를 들어, 아미노산 서열 SEQ ID NO:48을 포함하는 폴리펩티드.
제 4항 또는 제 5항에 있어서, SEQ ID NO:17에 비해 치환 S32V, L126R, 및 E243A를 갖고, 예를 들어, SEQ ID NO:51을 갖는 폴리펩티드.
폴리펩티드로서,
SEQ ID NO:47과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, SEQ ID NO:47에 비해 잔기 123이 류신이 아니고, 잔기 240이 글루타메이트가 아니고; (i) SEQ ID NO:4에 비해 폴리펩티드가 더 높은 안정성 및 fH에 대해 더 낮은 친화성을 갖고; (ii) 인간으로 투여되는 경우, 폴리펩티드가 v2 fHbp를 발현하는 수막구균에 대해 살균성인 항체 반응을 유도할 수 있는 아미노산 서열; 또는
5개 이하의 단일 아미노산 치환에 의해 변형된 아미노산 서열 SEQ ID NO:47로서, (i) 잔기 123이 류신이 아니고, (ii) 잔기 240이 글루타메이트가 아니고, (iii) 야생형 서열, 예를 들어, SEQ ID NO:4에 비해 폴리펩티드가 더 높은 안정성 및 fH에 대해 더 낮은 친화성을 갖고, (iv) 인간으로 투여되는 경우, 폴리펩티드가 v2 fHbp를 발현하는 수막구균에 대해 살균성인 항체 반응을 유도할 수 있는 것을 조건으로 하는 아미노산 서열 SEQ ID NO:47을 포함하는,
폴리펩티드.
제 7항에 있어서, SEQ ID NO:47에 비해 잔기 32가 세린이 아닌 폴리펩티드.
폴리펩티드로서,
SEQ ID NO:48과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, SEQ ID NO:48에 비해 잔기 126이 류신이 아니고, 잔기 243이 글루타메이트가 아니고; (i) SEQ ID NO:40에 비해 폴리펩티드가 더 높은 안정성 및 fH에 대해 더 낮은 친화성을 갖고; (ii) 인간으로 투여되는 경우, 폴리펩티드가 v3 fHbp를 발현하는 수막구균에 대해 살균성인 항체 반응을 유도할 수 있는 아미노산 서열; 또는
5개 이하의 단일 아미노산 치환에 의해 변형된 아미노산 서열 SEQ ID NO:48로서, (i) 잔기 126이 류신이 아니고, (ii) 잔기 243이 글루타메이트가 아니고, (iii) 야생형 서열, 예를 들어, SEQ ID NO:40에 비해 폴리펩티드가 더 높은 안정성 및 fH에 대해 더 낮은 친화성을 갖고, (iv) 인간으로 투여되는 경우, 폴리펩티드가 v3 fHbp를 발현하는 수막구균에 대해 살균성인 항체 반응을 유도할 수 있는 것을 조건으로 하는 아미노산 서열 SEQ ID NO:48을 포함하는,
폴리펩티드.
제 9항에 있어서, SEQ ID NO:48에 비해 잔기 32가 세린이 아닌 폴리펩티드.
(i) 제 1항 내지 제 3항, 제 7항, 또는 제 8항 중 어느 한 항에 정의된 폴리펩티드; 및 (ii) 제 4항 내지 제 6항, 제 9항, 또는 제 10항 중 어느 한 항에 정의된 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드.
인간에게 투여되는 경우 v2 fHbp를 발현하는 수막구균 및 v3 fHbp를 발현하는 수막구균 둘 모두에 대해 살균성인 항체 반응을 유도할 수 있고; (b) SEQ ID NO:4로 구성된 폴리펩티드보다 더 높은 안정성 및 인간 fH에 대해 더 낮은 친화성을 갖고; (c) SEQ ID NO:40으로 구성된 폴리펩티드보다 더 높은 안정성 및 인간 fH에 대해 더 낮은 친화성을 갖는 융합 폴리펩티드로서,
상기 폴리펩티드가,
(I) (a) SEQ ID NO:5와 적어도 k%의 서열 동일성을 갖고/갖거나 SEQ ID NO:5의 단편을 포함하는 아미노산 서열(여기서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO:5에 비해 잔기 L123 및 E240(및 임의로 S32)에서 SEQ ID NO:5와 상이함); (b) SEQ ID NO:47과 적어도 v%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열(여기서, SEQ ID NO:47에 비해 (i) 잔기 123은 류신이 아니고, (ii) 잔기 240은 글루타메이트가 아니고, (iii) 임의로, 잔기 32는 세린이 아님); 및 5개 이하의 단일 아미노산 변화(즉, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 단일 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입)에 의해 임의로 변형된 아미노산 서열 SEQ ID NO:47 또는 SEQ ID NO:50(여기서, (i) 잔기 32는 임의로 세린이 아니고, (ii) 잔기 123은 류신이 아니고, 및 (iii) 잔기 240은 글루타메이트가 아님)으로부터 선택된 첫번째 아미노산 서열; 및
(II) (a) SEQ ID NO:17과 적어도 j%의 서열 동일성을 갖고/갖거나 SEQ ID NO:17의 단편을 포함하는 아미노산 서열(여기서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO:17에 비해 잔기 L126 및 E243(및 임의로 S32)에서 SEQ ID NO:17와 상이함); (b) SEQ ID NO:48과 적어도 w%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열(여기서, (i) 잔기 126은 류신이 아니고, (ii) 잔기 243은 글루타메이트가 아니고, (iii) 임의로, 잔기 32는 세린이 아님); 또는 5개 이하의 단일 아미노산 변화(즉, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 단일 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입)에 의해 임의로 변형된 아미노산 서열 SEQ ID NO:48 또는 SEQ ID NO:51(여기서, (i) 잔기 32는 임의로 세린이 아닌 임의의 아미노산이고, (ii) 잔기 126은 류신이 아니고, 및 (iii) 잔기 243은 글루타메이트가 아님)로부터 선택된 두번째 아미노산 서열을 포함하는,
융합 폴리펩티드.
제 12항에 있어서, (A) 첫번째 아미노산 서열이 SEQ ID NO:47(예를 들어, SEQ ID NO:50)이고, 두번째 아미노산 서열이 SEQ ID NO:48(예를 들어, SEQ ID NO:51)이거나, (B) 첫번째 아미노산 서열이 SEQ ID NO:31(예를 들어, SEQ ID NO:45)이고, 두번째 아미노산 서열이 SEQ ID NO:32(예를 들어, SEQ ID NO:44)인 융합 폴리펩티드.
제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, v1 fHbp 서열을 또한 포함하고, 폴리펩티드가 인간으로 투여되는 경우 v1 fHbp를 발현하는 수막구균, v2 fHbp를 발현하는 수막구균, 및 v3 fHbp를 발현하는 수막구균에 대해 살균성인 항체 반응을 유도할 수 있고; 임의로, v1 fHbp 서열이 SEQ ID NO:46으로 구성된 수막구균 폴리펩티드보다 인간 fH에 대해 더 낮은 친화성을 제공하는 돌연변이를 포함하고, 예를 들어, v1 fHbp 서열이 아미노산 서열 SEQ ID NO:49 또는 52를 갖는, 융합 폴리펩티드.
제 14항에 있어서, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, 또는 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드.
제 1항 내지 제 10항에 따른 폴리펩티드 및 제 11항 내지 제 15항에 따른 융합 폴리펩티드로부터 선택된 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
제 16항에 있어서, 애쥬번트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
제 16항에 따른 면역원성 조성물을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 항체 반응을 발생시키는 방법.