CN106146679B - 一种纯化细菌荚膜多糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纯化细菌荚膜多糖的方法，所述纯化方法利用非离子表面活性剂，通过相分离法纯化细菌荚膜多糖。细菌荚膜多糖疫苗的制备过程中需要尽可能多地去除杂质蛋白和内毒素，以减少疫苗的副反应。目前使用的苯酚抽提法、柱层析法以及乙醇沉淀法，均存在诸多的缺陷。与苯酚相比，非离子表面活性剂具有无腐蚀性无致癌性等特点，并且不会对环境造成危害。与柱层析相比，本发明的方法处理量大、省时、经济、容易扩大生产规模，是一种安全、环保、高效的细菌荚膜多糖的纯化方法。

Description

一种纯化细菌荚膜多糖的方法
技术领域
本发明属于多糖纯化领域，特别涉及一种纯化细菌荚膜多糖的方法。
背景技术
细菌感染性疾病是对人群危害较大的疾病，目前临床上用于治疗细菌感染性疾病的药物主要是抗生素，但抗生素等抗菌药物的滥用导致耐药菌迅速增加，使其不能有效控制感染。细菌性疫苗能提高易感人群对细菌的抵抗力，降低病原菌感染的发生率，因此，细菌性疫苗在细菌感染性疾病的控制和预防中的作用不可小觑。目前已有多种细菌疫苗上市，主要分为灭活疫苗、减毒活疫苗、组分疫苗等。其中，细菌荚膜多糖疫苗是一类非常重要的组分疫苗。
细菌荚膜多糖疫苗的制备过程中需要尽可能多地去除杂质蛋白和内毒素， 以减少疫苗的副反应。现有的去除细菌荚膜多糖中杂质蛋白的方法有三种：首先，用苯酚抽提法去除杂蛋白，用超速离心去除内毒素，但苯酚具有很强的毒性，有强烈的腐蚀性，对工作人员的健康造成危害；苯酚对环境也具有严重的危害。其次，用柱层析法去除杂蛋白纯化荚膜多糖，但此方法处理量小，成本高，不同细菌荚膜多糖的所需要的纯化方法不同，还没有企业用于疫苗生产。最后，有关文献和专利报道用乙醇沉淀法去除蛋白，但此法需要用大量的乙醇，乙醇是易燃试剂，对厂房及设备要求比较高，工艺不容易放大，而且对不同的荚膜多糖纯化效果有很大的差别。
介于以上诸多缺点，因此，目前急需一种更加安全、环保，并能够大量获得细菌荚膜多糖的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种纯化细菌荚膜多糖的方法。本发明利用更加安全环保，且高通量的非离子表面活性剂，通过相分离法纯化细菌荚膜多糖，能够有效地去除细菌荚膜多糖中的内毒素及杂蛋白，从而建立了一种安全、环保、高效的细菌荚膜多糖的纯化方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种纯化细菌荚膜多糖的方法，所述纯化方法包括以下步骤：
（a）溶解多糖：用预冷的NaAC、NaCl混合溶解液，溶解含有细菌荚膜多糖的粗糖，得到混合液A；
（b）抽提纯化：向步骤（a）中得到的混合液中，加入非离子表面活性剂，冰浴5~15min，然后置于室温下放置20~40min，再进行固液分离，收集上清液；
（c）收集步骤（b）中得到的上清液，对于上清液，重复步骤（b）的处理3~5次，收集最后的上清液，即混合液B；
（d）向混合液B中加入无水乙醇至乙醇终浓度为70~90%，混合均匀，4℃静置40~60min，再进行固液分离，以去除非离子表面活性剂，收集沉淀物A；
（e）用CaCl2溶液溶解步骤（d）所述的沉淀物A，超滤后，收集上清液，向其中加入无水乙醇至终浓度70~90%，4℃静置40~60min，再进行固液分离，收集沉淀物B；
（f）用无水乙醇和丙酮清洗步骤（e）得到的沉淀物B，分别清洗1~3次，干燥后，即得到所述纯化后的细菌荚膜多糖。
进一步的，步骤（b）中所述的非离子表面活性剂为TritonX100、tritonX114和Tween-20中的一种。优选的，所述步骤（b）中所述的非离子表面活性剂为TritonX114，利用盐溶液溶解所述的TritonX114，使TritonX114的浓度达到0.5%~10%，优选的，所述TritonX114的浓度为2%。所述盐溶液为MgCl2、MgSO4、NaCl、CaCl2、KCl、NH4Cl、NaAC或（NH4）2SO4溶液。
进一步的，步骤（a）中所述NaAC、NaCl混合溶解液中，NaAC、NaCl的浓度分别为0.3M~0.4M，3.5%~10%，且所述混合溶解液的pH值为6.5~7.2。优选的，所述混合溶解液的浓度为0.4M NaAC/6% NaCl。
进一步的，步骤（e）中溶解沉淀物A的溶液为0.05M~0.1M的CaCl2溶液或0.5M~1M的NaCl溶液。
进一步的，所述含有细菌荚膜多糖的粗糖来自于脑膜炎球菌、b型流感嗜血杆菌（Hib）或肺炎球菌，所述脑膜炎球菌包括A群、C群、Y群及W135群。
进一步的，步骤（b）、步骤（d）、步骤（e）中所述的固液分离处理，均采用离心法，3次离心处理的条件分别为15000g，20℃离心30min；6500g，4℃离心30min；6500g，4℃离心30min。
本发明的另一目的是通过以下技术方案实现的：
一种利用上述方法制备得到的细菌荚膜多糖。
进一步的，当所述含有细菌荚膜多糖的粗糖为A群脑膜炎球菌多糖时，得到的纯化后的细菌荚膜多糖中，蛋白含量：0.26mg/g，核酸含量：2mg/g，磷含量：82.8mg/g，内毒素：0.87EU/ug<IT<1.74EU/ug，分子大小，即kd值：Kd值<0.16。
进一步的，当所述含有细菌荚膜多糖的粗糖为C群脑膜炎球菌粗糖时，得到的纯化后的细菌荚膜多糖中，蛋白含量：1.7mg/g，核酸含量：2.2mg/g，唾液酸含量：927mg/g，内毒素：4.3EU/ug<IT<8.6EU/ug，分子大小，即kd值：Kd值<0.14。
近年来，相分离法已经被用于生物制品如蛋白或病毒纯化及浓缩中。相分离法的基础是表面活性剂的重要特性——在一定条件下与水互溶形成一个均质的液相，当条件改变时，溶液变浑，表面活性剂形成的胶束聚集从水中析出，称之为“云点”。表面活性剂是一类同时具有亲水基团和疏水基团的双极性分子，在溶液中表面活性剂的存在形式与其浓度和环境温度有关，能够单体、晶体、胶束 3种形式存在。以胶束形式存在时，表面活性剂分子的亲水基团同水分子以氢键相互作用，疏水链因疏水作用而聚集，从而几个表面活性剂分子形成外部亲水，内部疏水的胶束结构溶于水中。相分离法即是表面活性剂在一定条件下与水互溶形成一个均质的液相，当条件改变（如溶液盐浓度、温度等）时，表面活性剂形成的胶束会聚集成肉眼可见的颗粒，经离心或自然沉降，从而与水溶液分成两个相：一个是表面活性剂相；一个是水相。疏水性物质由于溶于表面活性剂形成的胶束之中，分相后进入表面活性相 ，而亲水性物质则留于水相。
TritonX114是一种非离子表面活性剂，具有低“云点”（22℃）的特性，对于维持生物大分子的稳定性和生物活性非常有利。大量文献报道，通过溶液温度的升高，TritonX114可以有效地去除重组蛋白、病毒、DNA中的内毒素。在去除内毒素的过程中，内毒素通过类脂A的烃基与表面活性剂尾部基团聚集在胶束系统，从而从水相中分离出来。TritonX114可以溶解抽提膜蛋白，但到目前为止，没有检索到有文献报道TritonX114可以去除可溶性菌体蛋白。由于蛋白的盐析特性，在TritonX114水溶液中加入不同的盐离子，蛋白有可能进入表面活性剂相；同时细菌荚膜多糖不稳定，易降解，需要尽量在低温下操作。TritonX114的“云点”会随溶液中盐离子浓度的增加而降低，因此我们利用了TritonX114的盐溶液纯化细菌荚膜多糖。
TritonX114的盐溶液处理细菌粗糖，在低温时，tritonX114与糖溶液生成均匀的液相，在盐离子的影响下，当温度改变时，达到tritonx114“云点”时，溶液变浑，疏水性内毒素和蛋白等被TritonX114包被，通过离心，溶液分为：含有内毒素和蛋白等表面活性剂相和含有糖的水相。经过几次抽提，可有效去除内毒素和菌体蛋白。
本发明所述的纯化荚膜多糖的方法，相比现有技术的有益效果为：
1、本发明利用非离子表面活性剂纯化荚膜多糖，所述非离子表面活剂，与苯酚相比具有无腐蚀性无致癌性等特点并不会对环境造成危害；与柱层析相比，处理量大、省时、经济、容易扩大生产规模；
2、本发明采用Tritonx114盐溶液抽提多糖，能够有效的去除内毒素和蛋白，而且多糖的得率能达到50%以上；
3、采用本发明所述的纯化方法，分别抽提了A群脑膜炎球菌多糖和C群脑膜炎球菌多糖，所得多糖核酸、蛋白和内毒素含量明显降低，分子大小没有明显的变化，其他各项指标均能达到2010版《中华人民共和国药典》要求。
具体实施例
实施例1
一种纯化细菌荚膜多糖的方法，所述纯化方法包括以下步骤：
（a）溶解多糖：用预冷的NaAC、NaCl混合溶解液，溶解含有细菌荚膜多糖的粗糖，得到混合液A；
（b）抽提纯化：向步骤（a）中得到的混合液中，加入非离子表面活性剂，冰浴5~15min，然后置于室温下放置40~60min，再进行固液分离，收集上清液；
（c）收集步骤（b）中得到的上清液，对于上清液，重复步骤（b）的处理3~5次，收集最后的上清液，即得到混合液B；
（d）向混合液B中加入无水乙醇至终浓度70~90%，混合均匀，4℃静置20~40min，再进行固液分离，收集沉淀物A；
（e）用CaCl2溶液溶解步骤（d）所述的沉淀物A，超滤后，收集上清液，向其中加入无水乙醇至终浓度70~90%，4℃静置40~60min，再进行固液分离，收集沉淀物B；
（f）用无水乙醇和丙酮清洗步骤（e）得到的沉淀物B，分别清洗1~3次，干燥后，即得到所述纯化后的细菌荚膜多糖。所述干燥是通过真空干燥器来进行的。
进一步的，步骤（b）中所述的非离子表面活性剂为TritonX100、TritonX114和Tween-20中的一种。优选的，所述步骤（b）中所述的非离子表面活性剂为TritonX114，利用盐溶液溶解所述的TritonX114，使TritonX114的浓度达到0.5%~10%，优选的，所述TritonX114的浓度为2%。所述盐溶液为MgCl2、MgSO4、NaCl、CaCl2、KCl、NH4Cl、NaAC或（NH4）2SO4溶液。
进一步的，步骤（a）中所述NaAC、NaCl混合溶解液中，NaAC、NaCl的浓度分别为0.3M~0.4M，3.5%~10%，且所述混合溶解液的pH值为6.5~7.2。优选的，所述混合溶解液的浓度为0.4MNaAC/6%NaCl。
进一步的，步骤（e）中溶解沉淀物A的溶液为0.05M~0.1M的CaCl2溶液或0.5M~1M的NaCl溶液。
进一步的，所述含有细菌荚膜多糖的粗糖来自于脑膜炎球菌、Hib或肺炎球菌，所述脑膜炎球菌包括A群、C群、Y群及W135群。
所述粗糖的提取方法为：将已杀菌的培养液离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵解离；再加入乙醇至乙醇的最终浓度为25%，2-8摄氏度静置1--3h或过夜，离心收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷乙醇至乙醇的最终浓度为80%，充分振摇。离心收集沉淀，沉淀物用无水乙醇及丙酮分别洗涤，沉淀物即为含有细菌荚膜多糖的粗糖。
进一步的，步骤（b）、步骤（d）、步骤（e）中所述的固液分离处理，均采用离心法，3次离心处理的条件分别为15000g，20℃离心30min；6500g，4℃离心30min；6500g，4℃离心30min。
实施例2
本实施例选用TritonX114作为非离子表面活性剂，从A群脑膜炎球菌粗糖中提取纯化细菌荚膜多糖，具体的制备方法如下：
（a）溶解多糖：用400ml预冷的0.4MNaAC / 6%NaCl混合溶解液，溶解2.6g A群脑膜炎球菌粗糖，得到混合液A；
（b）抽提纯化：向步骤（a）中得到的混合液中，加入104ml TritonX114，冰浴10min，然后置于室温下放置30min，15000g、20℃离心30min，收集上清液；
（c）收集步骤（b）中得到的上清液，对于上清液，重复步骤（b）的处理3次，收集最后的上清液，即得到混合液B；
（d）向混合液B中加入无水乙醇至终浓度80%，混合均匀，4℃静置20~40min，6500g、4℃离心30min，收集沉淀物A；
（e）用0.1M CaCl2溶液溶解步骤（d）所述的沉淀物A，超滤后，收集上清液，向其中加入无水乙醇至终浓度80%，4℃静置30min，6500g、4℃离心30min，收集沉淀物B；
（f）用无水乙醇和丙酮清洗步骤（e）得到的沉淀物B，分别清洗2次，干燥后，即得到所述纯化后的细菌荚膜多糖，质量为1.67g。
检测所述细菌荚膜多糖中的蛋白、核酸、内毒素、分子大小（Kd值）等指标，结果如下：
蛋白含量：0.26mg/g；
核酸含量：2mg/g；
磷含量：82.8mg/g；
内毒素： <1.74EU/μg；
分子大小(kd值): Kd值<0.16 回收率96%；
TritonX114残留量：低于检测下限无法检出，小于0.01%；
多糖得率为：64.2%。
实施例3
本实施例选用TritonX114作为非离子表面活性剂，从C群脑膜炎球菌粗糖中提取纯化细菌荚膜多糖，具体的制备方法如下：
（a）溶解多糖：用400ml预冷的0.4MNaAC / 6%NaCl混合溶解液，溶解2.6g C群脑膜炎球菌粗糖，得到混合液A；
（b）抽提纯化：向步骤（a）中得到的混合液中，加入104ml TritonX114，冰浴10min，然后置于室温下放置30min，15000g、20℃离心30min，收集上清液；
（c）收集步骤（b）中得到的上清液，对于上清液，重复步骤（b）的处理3~5次，收集最后的上清液，即得到混合液B；
（d）向混合液B中加入无水乙醇至终浓度80%，混合均匀，4℃静置20~40min，6500g、4℃离心30min，收集沉淀物A；
（e）用0.1M CaCl2溶液溶解步骤（d）所述的沉淀物A，超滤后，收集上清液，向其中加入无水乙醇至终浓度80%，4℃静置30min，6500g、4℃离心30min，收集沉淀物B；
（f）用无水乙醇和丙酮清洗步骤（e）得到的沉淀物B，分别清洗2次，干燥后，即得到所述纯化后的细菌荚膜多糖，质量为1.67g。
检测所述细菌荚膜多糖中的蛋白、核酸、内毒素、分子大小（Kd值）等指标，结果如下：
蛋白含量：1.7mg/g；
核酸含量：2.2mg/g；
唾液酸含量：927mg/g；
内毒素： <8.6EU/μg；
分子大小(kd值): Kd值<0.14 回收率96%；
TritonX114残留量：低于检测下限无法检出，小于0.01%；
多糖得率为：67.5%。

Claims (4)

1.一种纯化细菌荚膜多糖的方法，其特征在于，所述纯化方法包括以下步骤：
（a）溶解多糖：用预冷的NaAc、NaCl混合溶解液，溶解含有细菌荚膜多糖的粗糖，得到混合液A；
（b）抽提纯化：向步骤（a）中得到的混合液中，加入非离子表面活性剂，冰浴5~15min，然后置于室温下放置20~40min，再进行固液分离，收集上清液；
（c）收集步骤（b）中得到的上清液，对于上清液，重复步骤（b）的处理3~5次，最终得到上清液即混合液B；
（d）向混合液B中加入无水乙醇至乙醇终浓度为70~90%，混合均匀，4℃静置40~60min，再进行固液分离，以去除非离子表面活性剂，收集沉淀物A；
（e）用CaCl2溶液溶解步骤（d）所述的沉淀物A，超滤后，收集回流管中的回流液，向其中加入无水乙醇至乙醇终浓度为70~90%，4℃静置40~60min，再进行固液分离，收集沉淀物B；
（f）用无水乙醇和丙酮清洗步骤（e）得到的沉淀物B，分别清洗1~3次，干燥后，即得到所述纯化后的细菌荚膜多糖；
所述含有细菌荚膜多糖的粗糖来自于脑膜炎球菌或肺炎球菌；
所述步骤（b）中所述的非离子表面活性剂为TritonX114，利用盐溶液溶解所述的TritonX114，使TritonX114的浓度达到0.5%~10%，所述盐溶液为MgCl2、MgSO4、NaCl、KCl、NH4Cl或NaAc溶液。
2.根据权利要求1所述的纯化细菌荚膜多糖的方法，其特征在于，步骤（a）中所述NaAc、NaCl混合溶解液中，NaAc、NaCl的浓度分别为0.3M~0.4M，3.5%~10%。
3.根据权利要求1所述的纯化细菌荚膜多糖的方法，其特征在于，步骤（e）中溶解沉淀物A的溶液为0.05M~0.1M的CaCl2溶液。
4.根据权利要求1所述的纯化细菌荚膜多糖的方法，其特征在于，步骤（b）、步骤（d）、步骤（e）中所述的固液分离处理，均采用离心法，3次离心处理的条件分别为15000g，20℃离心30min；6500g，4℃离心30min；6500g，4℃离心30min。
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