KR101744430B1

KR101744430B1 - 바이러스 정제를 위한 연속 초원심분리용 당 용액의 제조

Info

Publication number: KR101744430B1
Application number: KR1020157017179A
Authority: KR
Inventors: 만프레트 라이터; 레오폴트 그릴베르게르; 볼프강 문트; 아르투르 미테레르; 호르스트 샤프하우제르
Original assignee: 백스터 인터내셔널 인코포레이티드; 박스터 헬쓰케어 에스에이
Priority date: 2007-05-04
Filing date: 2008-04-30
Publication date: 2017-06-20
Also published as: KR20100017594A; CL2008001294A1; KR101998537B1; JP2015061538A; US20160060603A1; JP5745717B2; KR20170065671A; MX2009011897A; KR20150082676A; HK1211320A1; AU2008248904A1; US9732327B2; US8969533B2; BRPI0811499B8; AU2008248904B2; HK1138318A1; RU2503719C2; IL201898A; CN101688187A; US20100239609A1

Abstract

본 발명은 바이러스 제조물을 제공하는 단계, 및 상이한 농도의 2개 이상의 완충 당 층을 첨가하여 확립된 당의 구배로 상기 바이러스 제조물을 원심분리하는 단계를 포함하는, 바이러스 또는 바이러스 항원의 정제방법을 제공한다. 상기 방법은 피크 풀의 부피를 증가시켜 바이러스 또는 바이러스 항원의 원하지 않는 응집을 감소시키고 수율을 증가시킨다.
[색인어]
완충 당 용액, 바이러스, 구배, 항원, 정제

Description

바이러스 정제를 위한 연속 초원심분리용 당 용액의 제조 {FORMULATION OF SUGAR SOLUTIONS FOR CONTINUOUS ULTRACENTRIFUGATION FOR VIRUS PURIFICATION}

본 출원은 내용이 전문에 참고로 도입된 2007년 5월 4일 제출된 미국 가출원 제60/927,692호를 우선권으로 주장한다.

본 발명은 바이러스 정제분야에 관한 것이다.

자연발생되는 바이러스, 또는 이의 재조합 버전은 백신접종용으로 및 유전자 치료분야에서 사용된다. 다수의 바이러스 또는 바이러스 유사 입자를 숙주 세포에서 안전하고 효과적으로 증식시키는 것이 가능하다. 다수의 문헌은 숙주 세포 용해물로부터 바이러스 정제를 위해 주로 특이적 크로마토그래피 매트릭스의 사용에 집중하는, 숙주 세포로부터 바이러스의 정제를 기술한다(예, 미국특허 6,008,036 참조). 예를 들어 미국특허 6,048,537에 기술된 다른 방법은 연속 자당 구배 원심분리를 사용하는데, 이는 적은 항원 순도를 갖는 생성물을 전달하고 원심분리에 의한 추가 정제단계를 필요로 한다. 이러한 방법은 또한 바이러스 항원의 손실을 초래하거나 바이러스 불활성화 단계를 억제할 수 있는, 항원 응집 문제가 있다.

본 발명은 바이러스 제조물을 제공하고, 완충액 성분 중 하나가 6.0 내지 9.4의 pKa를 갖는 완충액 성분인 수성 완충액 중 34% 내지 50%(w/w%)의 자당 당량의 농도의 제1 층 A 및 50% 내지 65%(w/w%)의 자당 당량의 농도의 제2 층 B로 확립된 당 구배에서 상기 바이러스 제조물을 원심분리하고, 원심분리물, 즉 원심분리공정의 생성물로부터 바이러스 또는 바이러스 항원을 수집하는 것을 포함하는 바이러스 또는 바이러스 항원의 정제방법을 제공한다.

본 발명의 일 면은 바이러스 또는 바이러스 항원의 정제방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 적어도 제1 완충 당 용액 및 적어도 제2 완충 당 용액을 원심분리하여 확립된 당 구배를 갖는 용액을 제공하는 것을 포함한다. 제1 완충 당 용액 중 당의 농도는 35% 내지 50%(w/w%)의 자당 당량 또는 일부 실시양태에서 34% 내지 46%(w/w%)의 자당 당량이다. 제2 완충 당 용액 중 당의 농도는 50% 내지 65%(w/w%)의 자당 당량 또는 일부 실시양태에서 50% 내지 60%(w/w%)의 자당 당량이다. 당 구배가 확립된 후, 바이러스 제조물이 당 구배에 첨가된다. 이어서, 바이러스 제조물 및 당 구배는 원심분리하여 피크 풀을 수득하고, 피크 풀을 추출하여 바이러스 또는 바이러스 항원을 수득한다.

도 1은 종래의 초원심분리 절차(도 1a) 및 본 발명의 초원심분리 절차(도 1b)로 정제된 PMVH의 현미경사진이다.

바이러스 또는 바이러스 항원의 정제 동안에, 바이러스 또는 바이러스 항원을 원심분리로 농축하여 세포 배양액 성분 및/또는 숙주 세포 및 숙주 세포 성분으로부터 분리한다. 본 발명의 방법은 정제의 원심분리 단계에서 바이러스 응집 및 바이러스 손실을 최소화한다.

본 발명의 방법에서, 생리 완충액 중 제1 당 용액은 연속 초원심분리 장치 내에 일반적으로 수직으로 도입되어 수평 당 용액 층 A를 형성하고, 이어서 동일 또는 상이한 생리 완충액 중 더 높은 농도의 제2 당 용액이 장치 내에 도입되어 수평 당 용액 층 B를 형성한다. 이어서, 장치가 활성화되어 장치 외벽에서 가장 농축되고 장치 중심쪽으로 덜 농축되는 당 구배를 생성한다. 이어서, 세포 배양액으로부터의 바이러스 함유 수확 용액을 장치 내에 도입되고, 바이러스 입자는 그 밀도가 구배의 밀도와 동일한 당 구배 중 한 지점으로 이동한다. 당이 자당일 경우, 이러한 평형이 이루어지는 전형적인 밀도 범위는 36% 내지 48%(w/w%) 자당이다. 장치가 정지하면, 구배는 수평 위치로 이동하고, 바이러스 입자를 함유하는 구배 부위(또는 "피크 풀")를 장치로부터 취출한다.

본 발명의 일 면은 2-층 용액법을 사용함으로써, 자당 구배를 형성하기 위해 단일 농도의 자당 수용액을 사용하는 종래의 방법에 비해서 피크 풀의 부피가 증가될 수 있다는 놀라운 발견이다. 이러한 놀라운 효과는 자당이 사용되고 구배 중 최대 자당 농도가 종래의 방법에서 사용된 농도와 동일할 경우에도 수득될 수 있다. 두 자당 용액 층 A 및 B의 농도 및 양을 최적화함으로써, 피크 풀 부피는 예를 들어 2배 증가될 수 있다. 이러한 증가된 피크 풀 부피는 전체 바이러스 입자 또는 항원의 응집을 각 농도를 감소시킴으로써 감소시킨다.

연속 초원심분리 공정은 바이러스 제조물의 정제에 유용하다. 당(예, 자당 또는 소르비톨) 또는 염(예, CsCl₂ 또는 NaBr)의 고농축 용액을 사용하여 초원심분리로 구배를 생성할 수 있다. 그러나, 임의의 첨가제가 없는 당 용액은 낮은 전해질 농도를 갖고 완충성이 없다. 따라서, 본 발명의 일 면은 당 용액, 예를 들어 자당 용액 중 바이러스 제조물은 바이러스 입자의 농도에 따라 강한 응집체 형성 경향을 가져서 백신제조를 위한 추가 처리시 문제를 야기할 수 있다는 것의 인식이다. 본 발명의 방법은 구배내 생리 전해질 및 pH 조건을 달성하기 위해 생리 농도의 염(예를 들어, 약 4 내지 8 g/kg의 NaCl) 및 완충액(예를 들어, pH가 조정된 약 10 내지 20 mmol/kg의 Tris)을 추가한 당 용액(예를 들어, 55% w/w의 자당 용액)을 사용하여 문제를 효과적으로 최소화할 수 있다. 특정 실시양태에서, 초원심분리에서 구배를 구축하기 위해 상이한 당 용액을 적용할 수 있다. 일례로, 55% w/w 용액 200 mL 및 42% w/w 용액 800 mL를 초원심분리에 도입한다. 소량의 높은 농도 자당 용액은 초원심분리 말엽에 최대 자당 농도를 45% 초과로 유지시키고, 다량의 42% 자당 용액은 바이러스 피크 최대가 전형적으로 발생하는 약 40% 범위에서 더 점차적인 구배를 생성한다. 이로써, 피크 풀의 부피가 증가될 수 있으므로 바이러스 입자 현탁액은 희석되고 그 결과 응집이 억제된다. 또한, 이러한 자당 제형을 사용함으로써 초원심분리에 도입되는 상청액과 구배 사이의 분자 또는 입자의 확산이 변형된다.

예를 들어, 20 mmol/kg Tris 완충액 중 약 42% 및 55%(w/w%) 자당 용액을 사용하여 형성된 밀도 구배는 인플루엔자 바이러스에 특히 유용한 것으로 밝혀졌지만 다른 바이러스에 대해서도 쉽게 채용될 수 있다. Tris(트리스히드록시메틸아미노메탄)은 6.5 내지 9.7의 pH 범위에서 유용한 완충액이다. 본 발명의 한 실시양태의 특정 실시예에서 자당이 사용되지만, 구배 초원심분리에 적합한 다른 당이 사용될 수도 있다. 추가로, 다른 완충 화합물, 특히 유기 완충 화합물, 예를 들어 아민이 사용될 수 있다. 완충액은 바람직하게는 6, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.2, 7.4, 7.6, 또는 8.0 초과 및 9.4, 9.2, 9.0, 8.8, 8.6, 8.4, 또는 8.2 미만의 pKa를 갖는다. 적합한 완충액은 예를 들어 HEPES(4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), ACES(N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산), 비스-트리스-메탄 또는 -프로판, CAPS(N-시클로헥실-3-아미노프로판술폰산) 또는 CAPSO, PIPES(피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)), 포스페이트 완충액, 또는 생화학 분야에서 사용되는 임의의 다른 완충액을 포함한다. 완충액은 바람직하게는 생체분자에 대해 화학적으로 불활성이다.

원심분리 공정은 바이러스 입자가 전해질 및 pH 조건에 있어서 생리 조건하에 분산되어 있는 피크 풀 분획을 생성할 수 있다. 상이한 양의 고 및 저 농도 당 용액을 첨가하여 피크 풀 분획 중 전체 바이러스 항원의 농도를 변형하여 구배 및 따라서 피크 분획의 부피를 규정할 수 있다. 추가로, 염 및 적합한 완충액(예, Tris-완충 염수(TBS))을 단독으로 첨가하여 피크 분획의 부피를 증가시킴으로써 유의하게 높은 항원 및 단백질 수율을 달성할 수도 있다. 이러한 효과는 생리 농도의 염을 함유한 생리 pH의 당 구배 내로의 항원 및 단백질의 예기치 못한 향상된 이동도에 기인할 수 있다. 상이한 초원심분리 조건(예, 예비 정제기 및 상이한 중력의 존재 및 부재)은 명백히 자당 구배의 변형으로 수율이 유의하게 증가하고 바이러스 입자의 응집이 감소될 수 있음을 보여준다.

바람직하게는 전해질 첨가량은 50 mOsm/kg, 100 mOsm/kg, 150 mOsm/kg, 200 mOsm/kg 또는 250 mOsm/kg 초과 및 500 mOsm/kg, 450 mOsm/kg, 400 mOsm/kg 또는 350 mOsm/kg 미만, 바람직하게는 약 300 mOsm/kg이다. 전해질의 양은 반트호프 인자 보정 없이 수용액의 삼투몰농도와 등가인 것으로 계산됨을 주목해야 한다. 게다가, 구배 형성 물질(예, 자당)의 기여가 계산에 사용되지 않았다. 예를 들어, 전해질의 삼투몰농도는 다음과 같이 계산된다: 8g NaCl/kg/58.44 g/mol = 136.9 mmol/kg × 2(이온/mol) = 273.8 mOsm/kg + 20 mM/kg TRIS × 2 이온/mol = 40 mOsm/kg; 총 (NaCl + TRIS) 313.8 mOsm/kg. pH 값은 생리 범위, 바람직하게는 5.5 내지 9.5, 더 바람직하게는 5.5 내지 8.5, 특히 바람직하게는 5.5, 6, 6.5 또는 7 초과 및 9.5, 9.0, 8.5, 8 또는 7.5 미만, 특히 7.0 내지 7.5 또는 7.0 내지 7.4일 수 있다.

특히 바람직한 실시양태에서, 밀도 구배 생성에 사용된 당은 자당이다. 그러나, 본 발명은 또한 당알콜(비제한적 예, 소르비톨)을 비롯한 다른 당의 사용을 고려한다. 게다가, 당이 본원에서 특정된 밀도를 갖는 용액을 생성하기에 충분한 수용해도를 갖는 한, 본 발명은 수첨 당, 선형 당, 개질 당 또는 임의의 다른 당의 사용을 고려한다. 층을 구성하는 상응하는 당 용액이 본원에 특정된 밀도를 갖는 한, 동일한 층 또는 상이한 층에 당의 조합(즉, 2종 이상의 당)을 사용하여 본원에 기재된 구배를 생성할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 구배 형성 제조물의 부피는 샘플에 원심력을 인가하는 초원심분리 회전자 또는 장치의 유효 부피의 5% 내지 100%, 바람직하게는 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 32%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 초과 또는 100%, 90%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 48%, 45%, 40%, 35%, 30% 또는 25% 미만이다. 다른 실시양태에서, 구배 형성 제조물의 부피는 샘플에 원심력을 인가하는 초원심분리 회전자 또는 장치의 유효 부피의 1% 내지 75%이다.

바람직한 실시양태에서, 구배 형성 물질을 보유한 회전자의 도입은 연속적으로 또는 불연속적으로 반복되는 모드(즉, 연속 초원심분리 또는 회분식 초원심분리)에서 수행되고, 도입된 부피는 바람직하게는 회전자의 공극 부피(총 부피 - 구배 부피)보다 많으며, 바람직하게는 1x, 2x, 3x, 5x, 10x, 20x, 30x, 40x, 50x, 60x, 80x 초과 또는 300x, 250x, 200x, 150x, 120x, 100x, 80x 미만이다. 특히 바람직한 특정 실시양태에서, 연속 초원심분리가 사용된다.

특히 바람직한 실시양태에서, 도입된 부피는 약 20x 내지 80x 비율인 600 mL 내지 1000 mL 공극 부피(1600 mL 회전자 부피 - 600 mL 내지 1000 mL 공극 부피)당 20 L 내지 50 L이다. 다른 실시양태에서, 도입된 부피는 약 20x 내지 80x 비율인 1200 mL 내지 2000 mL 공극 부피(3200 mL 회전자 부피 - 1200 mL 내지 2000 mL 공극 부피)당 40 L 내지 100 L이다.

원심분리 동안에, 당의 연속 구배가 확립된다. 추가 실시양태에서, 24%(약 1.10 Kg/l와 등가임), 26%, 28%, 30%, 32%, 34%, 36%, 38%, 40%, 42%, 44% 또는 46% (w/w%) (약 1.22 Kg/l와 등가임) 초과 및 66%(약 1.32 Kg/l와 등가임), 63%, 60%, 58%, 56%, 54%, 52%, 50%, 48%, 46%, 44% 또는 42% (w/w%) (약 1.19 Kg/l와 등가임) 미만의 원심분리물 분획이 수집된다. 통상, 바이러스 생성물은 이 범위에서 축적된다. 바람직하게는 약 30% 내지 54%(w/w%), 더 바람직하게는 36% 내지 48%(w/w%) 자당 농도의 원심분리물 분획이 수집된다. 다른 당으로부터 형성된 구배로부터 수집된 분획은 상이한 농도(w/w%)를 갖지만 등가의 밀도를 가질 수 있다. 수집된 분획의 밀도는 1.10 Kg/l, 1.12 Kg/l, 1.14 Kg/l, 1.16 Kg/l, 1.18 Kg/l, 1.20 Kg/l 또는 1.22 Kg/l 초과 및 1.32 Kg/l, 1.30 Kg/l, 1.28 Kg/l, 1.26 Kg/l, 1.24 Kg/l, 1.22 Kg/l 또는 1.20 Kg/l 미만일 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 밀도는 1.13 Kg/l 내지 1.25 Kg/l, 더 바람직하게는 1.16 Kg/l 내지 1.22 Kg/l일 수 있다.

특정 실시양태에서, 완충액 또는 완충액 성분(예, TRIS 완충 염수)의 농도는 2 mmol/kg 내지 50 mmol/kg, 바람직하게는 5 mmol/kg 내지 40 mmol/kg, 10 mmol/kg 내지 40 mmol/kg, 더 바람직하게는 10 mmol/kg 내지 30 mmol/kg, 18 mmol/kg 내지 25 mmol/kg, 가장 바람직하게는 20 mmol/kg이다. 완충액은 바람직하게는 5% 미만의 수혼화성 유기 용매, 더 바람직하게는 2% 미만의 유기 용매를 함유한 수성이고, 가장 바람직하게는 유기 용매가 없는 수성이다. 완충액의 농도는 2 mmol/kg, 5 mmol/kg, 10 mmol/kg, 12 mmol/kg, 14 mmol/kg, 15 mmol/kg, 17 mmol/kg, 18 mmol/kg, 19 mmol/kg 또는 20 mmol/kg 초과 또는 50 mmol/kg, 40 mmol/kg, 35 mmol/kg, 30 mmol/kg, 25 mmol/kg, 23 mmol/kg 또는 21 mmol/kg 미만이다.

원심분리는 바람직하게는 20,000 g, 더 바람직하게는 30,000 g, 더 바람직하게는 50,000 g, 더 바람직하게는 70,000 g, 가장 바람직하게는 90,000 g 이상의 원심력으로 수행될 수 있고, 다른 바람직한 실시양태에서 원심력은 200,000 g, 150,000 g, 120,000 g, 100,000 g, 또는 90,000 g 미만이다.

바람직한 특정 실시양태에서, 초기 층 A 대 초기 층 B의 부피비(바이러스 제조물 적용전)는 20:1 내지 1:1, 바람직하게는 10:1 내지 1.5:1, 더 바람직하게는 8:1 내지 2:1, 더더욱 바람직하게는 6:1 내지 3:1, 가장 바람직하게는 4:1이다. 부피비는 20:1, 15:1, 10:1, 8:1, 5:1, 4:1 또는 3:1 미만 또는 1:2, 1:1, 1.5:1, 2:1, 3:1 또는 4:1 초과이다.

특히 바람직한 실시양태에서, 당 함유 원심분리액은 2층(즉, 원심분리에서 충전제 액체층 아래에, 바이러스 제조물 첨가전 상이한 농도의 당 층 A 및 B를 포함함)이다. 물론, 원심분리 동안 새로운 농도 구배 또는 밀도 구배가 형성될 수 있다. 그러나, 본 발명은 또한 2층 초과의 층을 갖는 원심분리액을 고려한다. 예를 들어, 비제한적 특정 실시양태에서 원심분리액은 3, 4, 5, 6, 7 또는 심지어 8개의 상이한 층으로 구성된다. 각 층은 다른 층과 동일한 완충액을 갖거나 각 측의 완충액은 독립적으로 선택될 수 있다.

특히 바람직한 실시양태에서, 제조방법은 예비정제 단계를 포함하지 않는다. 그러나, 목적하는 경우 초원심분리 장치의 예비정제 챔버에서 예비정제가 수행될 수 있다.

추가 실시양태에서, 층 A는 40% 내지 44% (w/w%) 자당, 바람직하게는 41% 내지 43% (w/w%) 자당을 포함한다. 자당 농도는 35%(약 1.15 Kg/l와 등가임), 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41% 또는 42% (w/w%) (약 1.19 Kg/l와 등가임) 초과 또는 50%(약 1.23 Kg/l와 등가임), 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43% 또는 42% (w/w%) (약 1.19 Kg/l와 등가임) 미만일 수 있다. 다른 당으로 형성된 층 A는 중량/중량 기준으로 상이한 농도를 갖지만 본원에서 특정된 밀도범위에 속하는 밀도를 갖는다.

특정 실시양태에서, 층 B는 50% 내지 65% (w/w%), 바람직하게는 52% 내지 58% (w/w%), 더 바람직하게는 54% 내지 56% (w/w%)의 농도를 갖는 자당 용액을 포함한다. 자당 농도(w/w%)는 50%(약 1.23 Kg/l와 등가임), 51%, 52%, 53%, 54% 또는 55% (w/w%) (약 1.26 Kg/l와 등가임) 초과 또는 66%(약 1.32 Kg/l와 등가임), 64%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56% 또는 55% (w/w%) (약 1.26 Kg/l와 등가임) 미만일 수 있다. 다른 당으로 형성된 층 B는 중량/중량 기준으로 상이한 농도를 갖지만 본원에서 특정된 밀도범위에 속하는 밀도를 갖는다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 바이러스는 오르쏘믹소바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스, 바람직하게는 인플루엔자 A 및 B이다. 본 발명에서 고려하는 다른 바이러스의 비제한적 예는 레오비리대(Reoviridae), 피코르나비르대(Picornaviridae), 칼리시비리대(Caliciviridae), 토가비리대(Togaviridae), 아레나비리대(Arenaviridae), 레트로비리대(Retroviridae), 플라비비리대(Flaviviridae), 오르쏘믹소비리대(Orthomyxoviridae), 파라믹소비리대(Paramyxoviridae), 분야비리대(Bunyaviridae), 랍도비리대(Rhabdoviridae), 필로비리대(Filoviridae), 코로나비리대(Coronaviridae), 아스트로비리대(Astroviridae), 보르나비리대(Bornaviridae)와 같은 RNA 바이러스 계열, 및 아데노비리대(Adenoviridae), 파포바비리대(Papovaviridae), 파르보비리대(Parvoviridae), 헤르페스비리대(Herpesviridae), 폭스비리대(Poxviridae), 헤파드나비리대(Hepadnaviridae)와 같은 DNA 바이러스 계열의 군에서 선택된 바이러스를 포함한다. 바람직한 특정 실시양태에서, 바이러스는 인플루엔자 A/Panama/2007/99, A/New Caledonia/20/99, 및 B/Shangdong/7/97로 이루어진 군에서 선택된다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 바이러스 수확물은 바이러스로 접종된 세포로부터 제조된다. 바이러스 제조에 적합한 임의의 세포에서 바이러스를 제조할 수 있다. 바람직하게는, 세포는 동물 세포 배양액 또는 세포주이다. 이러한 세포는 특정 조직 또는 배아 난자와 같은 배아 세포로부터 유래될 수 있다. 동물은 바람직하게는 포유동물 또는 조류이다. 본 발명의 각종 실시양태에서, 세포는 새, 개, 설치류, 또는 영장류 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 상피세포, 특히 바람직하게는 신장 상피세포, 예를 들어 아프리카 녹색 원숭이의 베로(Vero) 세포이다.

초원심분리 장치에 적용된 바이러스 수확물은 전체 세포 배양액이거나 세포 배양액으로부터 세포 및/또는 이의 일부를 분리한 후 수득된 세포 배양액 상청액일 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 세포 배양액내 세포를 배양액 용기에서 침전시킨 후에 세포 배양액 상청액을 배출한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 세포는 화학적 또는 기계적 방법으로 용해되고, 비제한적 예는 저장성 또는 고장성 용해, 세제 처리, 초음파 처리, 및 기계적 파괴를 포함한다.

바람직하게는, 원심분리 전 또는 후에 바이러스를 불활성화 또는 파편화(예, WO 05/11800에 기재됨) 시킨다. 추가로, 당업계에서 공지된 방법으로 바이러스 백신을 제조한다. 백신은 동물, 예를 들어 인간과 같은 포유류 또는 조류의 면역에 사용되는, 항원성 물질, 즉 (비-감염) 바이러스, 이의 외피, 입자 또는 이의 항원의 면역성 조성물이다.

본 발명은 하기 비제한적 실시예로 추가 설명된다.

[ 실시예 ]

인플루엔자 바이러스 항원 정제 동안에, 일가 수확물(monovalent harvest, MVH)을 초원심분리로 농축한다. 50% (w/w%) 자당 수용액을 사용하여 형성된 자당 구배를 기반으로 베로 세포 배양액 성장 바이러스 백신의 제조를 위해서 연속 유동 원심분리 절차를 적용할 수 있다. 사용된 원심분리 회전자 모델에는 예비정제기가 설비된다. 인플루엔자 바이러스 복제의 조기 단계에서 승온 조건이나 대두 가수분해물 보충에 의한 베로 세포 배양액의 변화와 같은 다수의 발효 최적화 방법은 증가된 항원 수율 및 견실한 공정을 초래하였다. 그러므로, 50% (w/w%) 자당/물 구배는 항원 결합성에서 제한으로 인하여 목적하는 회수율을 달성하지 못함이 입증되었다. 추가로 바이러스 균주 New Caledonia, Panama 및 Sangdong의 PMVH(정제된 MVH)는 특정 제조단계에서 예기치 못한 항원 응집을 나타내었다. 바이러스 응집 및 원심분리 단계에서 바이러스 손실을 최소화하기 위한 몇 가지 시도가 행해졌다. 물 대신에 TRIS 완충 염수를 사용하여 구배 물질의 자당을 용해시켰다. 또한, 상이한 밀도를 갖는 두 가지 구배 형성 용액을 사용하는 변형을 도입하여 피크 풀 부피를 증가시켰다. 추가로, 예비정제기 없이 증가된 g-힘을 사용한 초원심분리는 수율 향상에 가치있는 도구인 것으로 입증되었다. 이 개념을 증명하기 위해서, 표준 조건(물 중의 50% 자당, 20,000rpm=90,000g, 예비정제기 포함) 및 새로운 조건(42% 및 55% 자당 (w/w%), 20 mmol/kg TRIS, 8g/kg NaCl, 35,000rpm=90,000g, 예비정제기 없음, 48% 내지 36% 자당 분획으로부터 PMVH 수확물)의 결과를 평가하였다.

실시예 1: 물질 및 방법

C40CTS 회전자(회전자 부피 1,600 mL)를 갖는 연속 유동 원심분리기 CC40S 또는 상응하는 회전자를 갖는 알파 와세르만(Alfa Wassermann) 원심분리기 RK6를 사용하였다. 자당 구배 용액을 회전자에 도입하고 이어서 20,000 내지 35,000 rpm의 회전속도로 가속시켰다. 불활성화된 수확물을 연속 도입한 후에 회전자를 완충액으로 플러슁하여 잔류 단백질을 제거하고, 이는 구배에 도입되지 않았다. 플러슁 이후에, 회전자를 감속시키고 초원심분리를 중단하고, 구배를 방사상 방향에서 회전자의 축 방향으로 이동시켰다. 자당 농도에 따라 용리 및 분획화를 수행하였다. 코리올리 유형 밀도 검출 장치 및 UV 254 nm 검출 장치를 사용하여 자당 및 단백질 농도를 모니터링하였다.

표준 절차에 따라 ELISA에 의해 정제된 불활성화 수확물 샘플의 총 단백질 농도, HA-SRD 및 베로 항원을 측정하여 초원심분리 실험으로부터 수율 및 순도를 정량하였다.

실시예 2: TBS-자당 구배를 사용한 초기 실험

A/Panama/2007/99 일가 바이러스 수확물을 사용한 다수의 소규모 정제 실험은 50% w/w 자당과 50% w/w Tris 완충 염수(20 mmol/kg TRIS, 8 g/kg NaCl)의 혼합물로부터 제조된 자당 구배를 사용하는 것이 표준 자당/물 시스템에 비해 다수의 장점이 있음을 보여준다. 실험실 초원심분리기 모델 RK-6를 사용하여 상이한 조건 하에서 25 리터 및 50 리터 MVH 분획을 정제하였다. 파라미터 설정 및 자당/물 및 자당/TBS 시스템을 사용한 정제 실험 결과가 표 1에 제시된다.

<표 1>: 인플루엔자 A/Panama/2007/99 항원 수율 및 PMVH 외양의 비교(30,000g에서 예비정제기를 사용한 초원심분리 실험으로부터의 자당 구배 정제 바이러스)

정제 실험	조건/설정	MVH 도입 (리터)	HA-SRD/단백질 비율 (mg/mg)	피크 풀 부피 (ml)	항원 수율 (mg 항원/L 수확물)	PMVH (외양)
1	자당/물 800 ml	25	0.51	333	1.2	응집
2	자당/TBS 800 ml	25	0.34	440	2.0	응집 감소
3	자당/TBS 800 ml	50	0.26	492	1.4	응집 감소

표 1로부터, TBS 중의 자당 구배는 자당/물 시스템 중의 표준 구배에 비해 몇가지 이점을 갖는다고 결론지을 수 있다. 정제 실험 1의 경우, 1.2 mg 항원/L 수확물의 수율이 달성될 수 있었고, 항원 분획 (PMVH)은 예기치 못한 바이러스 응집을 나타냈다. TBS 중의 자당을 사용한 정제 실험 (실험 2)은 참조 실험 1에 비해 항원 수율이 증가하였다. TBS 제조물의 경우, 응집체 분획의 유의한 감소가 관찰될 수 있었다. TBS 자당 구배는 표준 시스템 (자당/물)에 비해 몇가지 이점을 갖지만, 보다 많은 (25 리터와 비교해서, 50 리터) 구배의 도입 (실험 3)으로 항원 수율의 감소가 관찰되었다.

물 대신 TBS를 사용하는 2가지 경우 모두 피크 풀 부피가 증가하였다 (이는 완충액 물질 및 기타 전해질을 함유하는 구배와 도입된 수확물 사이의 확산이 증가됨을 가리킴).

실시예 3: 2-단계 자당/TBS 구배의 전개

본 실시예는, 자당 구배가 분획화를 위한 제한들을 변화시키지 않고 피크 풀 분획의 부피를 증가시키도록 변형된 예시적 실시양태를 보여준다. 42% (w/w%)의 감소된 농도를 갖는 자당 구배를 사용하여, 초원심분리로부터 용리된 덜 경사진 자당 구배를 생성하였다. 구배 중의 자당 농도가 충분히 높도록, 고농축 자당/TBS 용액 (50% (w/w%))을 후속적으로 42% (w/w%) 용액에 도입하여, 고농도 용액으로서 회전자 벽 상에 항원이 침강되는 것을 방지하는 "쿠션"을 형성하였다. 표 2는, 여러 부피 (즉, 600, 800 및 1000 mL)로 적용된, 50% 자당/TBS 용액 만으로 형성된 구배를 사용하는 정제 실험과 비교한, 저농축 자당/TBS 용액 (42% w/w 자당, 11.7 mmol/kg TRIS, 4.7 g/kg NaCl) 900 mL 및 고농축 자당/TBS 용액 (50% w/w, 10 mmol/kg TRIS, 4 g/kg NaCl) 100 mL를 사용한 2-단계 구배를 사용한 정제 실험을 보여준다. 상기 시험은 예비정제기 존재 하에 20,000 rpm (RCF 약 30,000 g)으로 수행하였다.

여러가지 양 및 농도의 자당/TBS 용액을 적용하는 것은 수율 및 물질의 순도에 유의하게 영향을 미치지 않았다. 그러나, 42%/50% (w/w%) 자당/TBS의 혼합물로 구축된 2-단계 구배를 사용하면 피크 풀 부피가 유의하게 증가하여, 피크 풀 분획의 오버로딩을 피하기 위해 항원 농도를 감소시킴으로써 정제 조건이 향상된다.

<표 2>: 여러 양의 자당/TBS 50% (w/w%) 및 2-단계 자당/TBS 구배 (50%/42% (w/w%))를 사용한 초원심분리에 의해 정제된 A/Panama/2007/99의 불활성화 수확물의 항원 순도 및 생성물 수율의 비교

정제 실험	조건/설정	HA-SRD/단백질 비율 (mg/mg)	항원 수율 (mg 항원/L 수확물)	피크 풀 부피 (ml)
1	자당/TBS 50% 600 ml	0.58	1.3	346
2	자당/TBS 50% 800 ml	0.58	1.3	325
3	자당/TBS 50% 1000 ml	0.45	1.1	338
4	자당/TBS 42% 900 ml + 자당/TBS 50% 100 ml	0.53	1.5	713

실시예 4: 예비정제기 없이 보다 높은 상대 원심력의 적용

초원심분리를 위한 큰 상대 원심력은 항원 수율을 증가시키는 것으로 조사되었지만, 이러한 조건 하에서는 예비정제기 중의 물질의 손실을 감수하여야 한다. 초원심분리 회전자는 예비정제기를 사용하거나 사용하지 않고 가동될 수 있으므로, 예비정제기 하의 20,000 rpm (약 30,000 g)와, 2-단계 자당/TBS 구배 (50% w/w 자당 10O mL, 최종 농도 10 mmol/kg TRIS, 4 g/kg NaCl 및 39% w/w 자당 900 mL, 최종 농도 12.2 mmol/kg TRIS, 4.9 g/kg NaCl)에서 35,000 rpm (appr. 90,000 g)을 비교하였다. 항원의 잠재적 손실을 평가하기 위해, 예비정제기 및 회전자 벽을 완충액으로 닦고, 항원 손실을 분석하였다. 상기 실험 결과를 표 3에 나타내었다. 항원 수율이 1.7 mg HA-SRD/L 수확물에서 2.8 mg HA-SRD/L 수확물로 60% 넘게 증가될 수 있었다. 손실된 항원의 다량이 예비정제기로부터 제거될 수 있는 반면, 단지 약 5%의 항원만이 초원심분리의 회전자 벽 상에서 손실되었다. 수확물을 자당/TBS 구배 상에 도입하기 전의 예비정제를 생략함으로써 SRD/단백질 비율은 단지 약간 감소되었다.

<표 3>: 예비정제기를 사용하거나 사용하지 않고 여러 상대 원심력을 사용한 A/Panama/2007/99의 불활성화 수확물의 초원심분리에 의한 항원 순도 및 생성물 수율 및 손실의 비교

정제 실험	조건/설정	HA-SRD/단백질 비율 (mg/mg)	항원 수율 (mg 항원/L 수확물)	회전자 벽 손실 [mg SRD/L 수확물]	예비정제기 중의 손실 [mg SRD/L 수확물]
1	20,000 rpm w/예비정제기	0.63	1.7	0.1	1.4
2	35,000 rpm w/o 예비정제기	0.52	2.8	0.1	측정 불가

실시예 5: 자당 구배 중의 TRIS 및 NaCl 농도의 변경

50% (중량) 자당을 50% (중량) TBS 완충액 (20 mmol/kg TRIS, 8 g/kg NaCl)에 혼합하여 lO mmol/kg TRIS 및 4 g/kg NaCl의 최종 농도가 되도록 하는 50% w/w 자당/TBS 구배를 제조함으로써 초기 제조를 수행하였다. 이어서, 보다 다량의 TBS를 사용하여 저농축 제형 42%-39% 자당/TBS 용액을 제조하여, 자당 농도는 낮지만 이에 상응하게 TRIS 및 NaCl 농도는 더 컸다 (이전 실시예 참조). 따라서, 예를 들어 TBS 중의 55% (w/w) 자당처럼 더 농축된 용액은 TRIS 및 NaCl 농도가 더 낮았다.

상기 제조물 중의 TRIS 및 NaCl의 농도를 표준화하기 위해 새로운 제형을 설계하였고, 거기서 42%-55% 중량의 자당을 혼합 용기에 첨가하고, 20 mmol/kg (2.42 g/kg) TRIS 및 8 g/kg NaCl을 첨가하고 물로 충전하여 100% 중량이 되도록 하였다. 이러한 제조물는 이전 실시예에서 사용된 제형에 비해 TRIS 및 NaCl의 농도가 유의하게 (약 2x) 더 높았다. 또한, 보다 적은 양의 물 (대신에 최종 중량 100%로 충전하기 전 TRIS 및 NaCl을 첨가함)로 인해, 상기 제형의 굴절률을 측정한 결과 굴절률이 약 2° (l°-3°) 브릭스 더 높았다.

실험에서, 2가지 상이한 2-단계 자당/TBS 구배 방식을 비교하였다. 구배는 42% 자당/TBS 800 mL를 도입한 후 고농축 자당/TBS 용액 200 mL를 첨가하여, 구배 중의 보다 견실한 고밀도 자당 쿠션을 생성시킴으로써 구배를 구축하였다.

초원심분리 실험에서의 여러 자당/TBS 제조물의 결과를 표 4에 나타내었다. 상이한 TRIS 및 NaCl 농도가 사용될 경우 수율 또는 순도의 유의한 차이를 관찰할 수 없었다.

<표 4>: 상이한 TRIS 및 NaCl 농도를 갖는 여러가지 자당/TBS 제조물을 사용한 A/Panama/2007/99의 불활성화 수확물의 초원심분리에 의한 항원 순도 및 생성물 수율의 비교.

정제 실험	조건/설정	HA-SRD/단백질 비율 (mg/mg)	항원 수율 (mg 항원/L 수확물)
1	TBS 중의 42% 자당 (12.2 mmol/kg TRIS/4.9 g/kg NaCl) TBS 중의 55% 자당 (8.9 mmol/kg TRIS/3.6 g/kg NaCl)	0.42	5.0
2	TBS 중의 42% 자당 (20 mmol/kg TRIS/8 g/kg NaCl) TBS 중의 55% 자당 (20 mmol/kg TRIS/8 g/kg NaCl)	0.39	4.8

실시예 6: 회전자의 도입 용량 및 도입 유량의 조사

3가지 상이한 균주의 여러 수확물 부피를 조사하여, 보다 큰 수확물 부피가 초원심분리 절차에 적용되어야 하는 경우, 최적화된 초원심분리 절차의 용량을 평가하고 제조시 잠재적 스케일-업(scale-up) 문제를 조사하였다. 불활성화 수확물을 1600 mL 회전자 상에 15 - 17 L 및 45 - 51 L 도입하였다.

본 실험에서, 상기 실시예 5와 같이 동일한 2-단계 자당/TBS 구배 변형 방식을 적용하였다. 먼저, 고밀도 용액의 농도를 55% w/w로 증가시키고, 42% 자당/TBS 800 mL를 도입한 후 보다 큰 부피 200 mL를 사용하여, 구배 중에 보다 견실한 고밀도 자당 쿠션을 생성하였다. 상기 두 자당/TBS 용액 모두에서 구배 중의 최종 TRIS 농도를 20 mmol/kg으로 증가시키고, 최종 NaCl 농도를 8 g/kg으로 증가시켰다. 초원심분리 조건은 예비정제기를 사용하지 않고 35,000 rpm (90,000 g)이었고, 분획화를 48% 내지 36% 자당에서 수행하였다.

도입 용량 실험의 결과를 표 5에 나타내었다.

본 발명의 구배와 예비정제기 없이 보다 큰 원심력을 사용하면 여러 수확물 도입 부피에서 단지 약 3% 내지 6%의 작은 수율 차이만을 관찰할 수 있었다. 이는, 실시예 2/표 1 (균주 A/Panama/2007/99의 경우 25 리터 내지 50 리터의 수확물 부피의 증가로 수율이 약 30% 감소함)에서 입증된 제한된 도입 용량과는 대조적이었다. 이러한 개선된 수율은 2-단계 자당/TBS 구배로 인한 구배 프로파일 및 피크 풀 부피의 개선 및 상대 원심력의 증가의 조합에 의해 설명될 수 있다.

<표 5>: 도입 부피가 상이한 초원심분리에 의한 생성물 수율 및 항원 순도의 비교.

정제 실험	균주/도입된 수확물 부피	HA-SRD/단백질 비율 (mg/mg)	항원 수율 (mg 항원/L 수확물)
1	A/New Caledonia/20/99 45 리터	0.37	1.6
2	A/New Caledonia/20/99 15 리터	0.45	1.7
3	A/Panama/2007/99 51 리터	0.36	1.9
4	A/Panama/2007/99 17 리터	0.44	2.0
5	B/Shangdong/7/97 45 리터	0.44	6.0
6	B/Shangdong/7/97 15 리터	0.51	6.2

실시예 7: 본 발명 및 기존의 초원심분리 절차의 비교

a) 예비정제기 없이 90,000 g (35,000 rpm) (예비정제기 하의 30,000 g (20,000 rpm) 대신에)

b) 최종 농도가 20 mmol/kg TRIS 및 8 g/kg NaCl인, TBS 중의 자당 구배 (물 중의 자당 대신에)

c) 2가지 상이한 자당 농도 (200 mL 55% + 800 mL 42%)를 갖는 구배를 형성하여 피크 풀 분획 부피의 증가 (50% 자당 800 mL 대신에)

를 조합 사용한 것을 기존의 초원심분리 절차와 비교하였다 (표 6).

<표 6>: 소규모 (1:2 스케일-다운 방식) 및 제조 조건 및 설정

표준 조건 (물 중의 50% 자당) 및 신규 조건에서의 정제 장치 작동

방법	구배	자당	바이러스 도입 (l/시간)	RPM	분획화
표준	자당/물	800 ml 50%	12.5	20.000	UV 신호에 따름 (최대 50%-34%)
신규	자당/TBS 20 mM	800 ml 42% 200 ml 55%	12.5	35.000^*	48%-36%

^* 예비정제기를 사용하지 않음

2002/2003 균주 (즉, A/New Caledonia/20/99, A/Panama/2007/99 및 B/Shangdong/7/97)를 사용하여 3가지 비교 실험을 수행하였다. 이러한 실험을 위한 피크 풀 분획화 한계를 48% 내지 36% (w/w%) 자당으로 규정하였다. 그 결과를 실시예 8 내지 실시예 10에 나타내었다.

표준 조건 (50% 자당/물) 및 변형 조건 (자당/TBS 구배) 하에 인플루엔자 New Caledonia, Panama 및 Shangdong를 사용한 정제 실험으로부터의 결과를 수율 및 생성물 품질 파라미터에 기초하여 비교하였다.

실시예 8: 인플루엔자 균주 A/New Caledonia/20/99의 정제

표 6에 따라 표준 절차 및 신규 자당/TBS 구배 파라미터에 따른 조건을 사용하는 정제 실험을 New Caledonia MVH를 사용하여 수행하였다. 표 7에, 정제 실험으로부터의 결과를 비교하였다.

<표 7>: A/New Caledonia/20/99 항원 수율, HA/단백질 비율 및 Vero-단백질 불순물의 비교 (기존의 2001/2002 방법과 변형 TBS 구배를 사용한 자당 구배 정제 바이러스)

정제 실험	항원 수율 (mg 항원/L 수확물)	HA/총 단백질 비율	Vero-단백질/HA 비율
표준	2.7	0.41	0.06
신규 (TBS 구배)	3.4	0.60	0.07

표 7의 데이타로부터, 인플루엔자 균주 A/New Caledonia/20/99의 경우 신규한 자당/TBS 구배 정제 조건을 사용하여 공정이 유의하게 개선되었다고 결론지을 수 있다. 상기 특정 균주의 경우, MVH 1 리터 당 2.7에서 3.4 mg 항원으로 바이러스 수율이 유의하게 증가되었음이 입증되었다. HA/총 단백질 비율 및 Vero-단백질/HA 비율로 측정된 바이러스 항원 품질로부터, 1 리터 당 용량의 증가가 항원 품질을 보장하지 못함을 알 수 있다. 새로운 자당 구배 조건을 사용하여 HA/총 단백질이 0.41에서 0.60으로 약간 증가하였다. 숙주 세포 단백질/HA 비율의 경우 유의한 차이가 없었다. PMVH 생성용 자당/TBS 구배 조건 하에, 균주 A/New Caledonia/20/99의 응집이 약간 감소되었다. 이러한 효과는 현미경 관찰로 확인할 수 있었다 (예를 들어 도 IA 및 도 IB 참조). 40Ox 배율에서, 상기 자당/물 구배 방식을 적용하는 경우 더 강한 응집체 형성이 뚜렷하게 명백한 반면 (도 IA), 수율 증가에도 불구하고, 최적화된 초원심분리 절차로부터 유도된 피크 풀 분획은 상당히 더 균질한 것으로 보였다 (도 IB).

실시예 9: 인플루엔자 균주 A/Panama/2007/99의 정제

표 6에 따라 표준 절차 및 신규 자당/TBS 구배 파라미터에 따른 조건을 사용한 정제 실험을 Panama MVH를 사용하여 수행하였다. 표 8에, 정제 실험으로부터의 결과를 비교하였다.

<표 8>: A/Panama/2007/99 항원 수율, HA/단백질 비율 및 Vero-단백질 불순물의 비교 (표준 방법과 본 발명의 TBS 구배 방법을 사용한 자당 구배 정제 바이러스)

정제 실험	항원 수율 (mg 항원/L 수확물)	HA/총 단백질 비율	Vero-단백질/HA 비율
표준	2.0	1.47	0.06
신규 (TBS 구배)	5.5	0.77	0.07

표 8의 데이타로부터, 인플루엔자 균주 Panama의 경우 신규한 자당/TBS 구배 정제 조건을 사용하여 공정이 유의하게 개선되었다고 결론지을 수 있다. 상기 특정 균주의 경우, 새로운 자당/TBS 구배 조건을 적용함으로써 MVH 1 리터 당 2.0에서 5.5 mg 항원으로 바이러스 수율이 유의하게 증가되었음이 입증되었다. HA/총 단백질 비율이 0.77인 반면, 표준 조건 하에 생성된 PMVH의 경우 산정 비율이 1.47이었다. 두 절차로 생성된 PMVH의 Vero-단백질/HA 비율의 유의한 차이를 발견할 수 없다는 사실에 의해, Panama 항원의 응집 (Panama PMVH의 현미경사진 비교 (도시하지 않음)로부터 알 수 있음)은 비정상적인 HA/총 단백질 비율 (1.47)이 원인일 수 있다고 추측된다. 두 정제 절차 모두의 경우, HA/총 단백질 비율 및 Vero-단백질/HA 비율로 측정된 바이러스 항원 품질이 허용가능하였다. 그러나, PMVH 생성용 TBS 자당 구배 조건 하에 자당/TBS 구배를 사용하여 균주 Panama의 응집을 유의하게 감소시킬 수 있었다.

실시예 10: 균주 B/Shangdong/7/97의 정제

표 6에 따라 표준 절차 및 신규 자당/TBS 구배 파라미터에 따른 조건을 사용한 정제 실험을 Shangdong MVH를 사용하여 수행하였다. 표 9에, 정제 실험으로부터의 결과를 비교하였다.

<표 9>: B/Shangdong/7/97 항원 수율, HA/단백질 비율 및 Vero-단백질 불순물의 비교 (표준 방법과 신규한 TBS 구배 방법을 사용한 자당 구배 정제 바이러스)

정제 실험	항원 수율 (mg 항원/L 수확물)	HA/총 단백질 비율	Vero-단백질/HA 비율
표준	2.2	0.55	0.10
신규 (TBS 구배)	5.1	0.34	0.20

표 9의 데이타로부터, 인플루엔자 균주 B/Shangdong/7/97의 경우 본 발명의 자당/TBS 구배 정제 조건을 사용하여 공정이 유의하게 개선되었다고 결론지을 수 있다. 상기 특정 균주의 경우 MVH 1 리터 당 2.2에서 5.1 mg 항원으로 , 바이러스 수율이 유의하게 증가되었음이 입증되었다. 자당/TBS 정제 MVH의 경우, 감소된 HA/총 단백질 비율 0.34는 인플루엔자 PMVH 사양 범위 내에 존재한다. B/Shangdong/7/97 바이러스 복제 단계의 추가 개선으로, 트립신 투여 프로파일을 변화시킴으로써 보다 일관된 생성 공정을 확립할 수 있었다. PMVH 생성용 TBS 자당 구배 조건 하에, B/Shangdong/7/97 균주의 응집은, 표준 및 TBS-조건을 사용하여 정제된 Shangdong PMVH의 현미경사진 (도시하지 않음)으로 확인된 바와 같이 상당히 감소하였다.

본원에 제공된 예시적 대규모 및 소규모 실험에서, 본 발명의 자당 구배로 일가 수확물을 효율적으로 도입할 수 있음이 입증되었다. 본원에 기재된 본 발명의 방법을 사용하면 다음과 같은 많은 이점이 있다: 1) 증가된 바이러스 수율 (25% 이상), 2) 0.34 내지 0.77의 균주 의존 HA/총 단백질 비율, 3) 2% 내지 7%의 균주 의존 숙주 세포 단백질 함량, 및 4) 자당 피크 풀 (PMVH) 중의 바이러스 응집 최소화.

Claims

(i) 제1 생리 완충액을 포함하는 제1 완충 당 용액 및 (ⅱ) 제1 완충 당 용액보다 더 높은 밀도를 가지고 제1 생리 완충액과 동일하거나 상이한 제2 생리 완충액을 포함하는 제2 완충 당 용액을 제공하는 단계,
바이러스 제조물을 제공하는 단계,
상기 바이러스 제조물 및 완충 당 용액 (i) 및 (ii)를 초원심분리 회전자를 포함하는 초원심분리로 원심분리하여 피크 풀을 수득하는 단계, 및
상기 피크 풀을 추출하여 바이러스를 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서, 상기 제1 완충 당 용액 중의 당의 농도는 35% 내지 50%(w/w%)의 자당 당량이고 상기 제2 완충 당 용액 중의 당의 농도는 50% 내지 65%(w/w%)의 자당 당량이며, 상기 제1 완충 당 용액 대 상기 제2 완충 당 용액의 부피 비율이 20:1 내지 3:1인,
바이러스를 정제하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 완충 당 용액 (i) 및 (ii)의 부피가 상기 초원심분리 회전자 부피의 5% 내지 100%인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 피크 풀은 30% 내지 54% (w/w%) 자당의 자당 당량으로 수집되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 생리 완충액 중 하나 이상이 상기 완충 당 용액 중에서 5 mM 내지 50 mM의 농도를 갖는 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 하나 이상의 생리 완충액이 상기 완충 당 용액 중에서 15 mM 내지 30 mM의 농도를 갖는 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 생리 완충액이 상기 완충 당 용액 중에서 18 mM 내지 25 mM의 농도를 갖는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 바이러스 제조물 및 완충 당 용액들을 원심분리하는 단계를 20,000 g 내지 200,000 g의 상대 원심력으로 수행하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 상대 원심력이 30,000 g 내지 200,000 g인 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 상대 원심력이 90,000 g 내지 200,000 g인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제조물이 예비정제기 없이 원심분리되어 수득되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 완충 당 용액이 당을 40% 내지 44% (w/w%) 의 자당 당량의 농도 범위로 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 제1 완충 당 용액이 당을 41% 내지 43% (w/w%)의 자당 당량의 농도 범위로 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제2 완충 당 용액이 당을 52% 내지 58% (w/w%)의 자당 당량의 농도 범위로 포함하는 것인 방법.
제13항에 있어서, 상기 제2 완충 당 용액이 당을 54% 내지 56% 자당 당량으로 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 바이러스가 오르쏘믹소바이러스인 방법.
제15항에 있어서, 상기 바이러스가 인플루엔자 바이러스인 방법.
제1항에 있어서, 상기 바이러스 제조물이 바이러스가 접종된 세포를 포함하는 것인 방법.
제17항에 있어서, 상기 세포가 동물 세포 배양액 또는 동물 세포주의 세포인 방법.
제17항에 있어서, 상기 세포가 상피세포인 방법.
제19항에 있어서, 상기 세포가 신장 상피세포인 방법.
제20항에 있어서, 상기 세포가 베로(Vero) 세포인 방법.
제1항에 있어서, 상기 바이러스가 불활성화된 것인 방법.
(i) 1.15 Kg/l 내지 1.23 Kg/l의 밀도를 가지는 제1 완충 당 용액 및 (ⅱ) 1.23 Kg/l 내지 1.32 Kg/l의 밀도를 가지며 상기 제1 완충 당 용액보다 밀도가 더 높은 제2 완충 당 용액을 제공하는 단계,
바이러스 제조물을 제공하는 단계,
상기 바이러스 제조물 및 완충 당 용액 (i) 및 (ii)를 초원심분리 회전자를 포함하는 초원심분리로 원심분리하여 피크풀을 수득하는 단계, 및
상기 피크 풀을 추출하여 상기 바이러스를 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서, 상기 제1 완충 당 용액 대 상기 제2 완충 당 용액의 부피 비율이 20:1 내지 3:1인,
바이러스의 정제방법.
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제3항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 완충 당 용액의 부피는 상기 초원심분리 회전자의 부피의 5% 내지 100%인 것인 방법.
제25항에 있어서, 상기 제1 및 제2 완충 당 용액의 부피는 상기 초원심분리 회전자의 부피의 5% 내지 90%인 것인 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 완충 당 용액의 부피는 상기 초원심분리 회전자의 부피의 50% 내지 100%인 것인 방법.
삭제
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부피 비율이 10:1 미만인 방법.
제29항에 있어서, 상기 부피 비율이 8:1 미만인 방법.
제30항에 있어서, 상기 부피 비율이 6:1 내지 3:1인 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피크 풀의 밀도가 1.13 kg/l 내지 1.25 kg/l인 것인 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피크 풀의 밀도가 1.20 kg/l 내지 1.24 kg/l인 것인 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생리 완충액들 중 하나 이상이 아민 완충액인 방법.
제34항에 있어서, 상기 생리 완충액들 중 하나 이상이 TRIS 완충액인 방법.
제35항에 있어서, 상기 생리 완충액이 TRIS-완충 염수(TBS)인 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 바이러스를 예비정제하는 것을 포함하는 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 바이러스를 수득하는 것을 포함하는, 바이러스에 대한 백신을 제조하는 방법.