JP5745717B2 - ウイルス精製のための連続超遠心分離用の糖溶液の処方 - Google Patents

Description

本願は、２００７年５月４日に出願された米国仮特許出願第６０／９２７，６９２号に対する優先権の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／９２７，６９２号の内容は、その全体が、参考として援用される。

本発明は、ウイルス精製の分野に関する。

ウイルスは、天然に存在するものまたはそれらの組換え型のいずれもが、ワクチン接種のためにおよび遺伝子治療の分野において使用される。多くのウイルスまたはウイルス様粒子を、宿主細胞中で安全かつ効率的に増殖させることが可能である。いくつかの刊行物には、宿主細胞からのウイルスの精製について記載されているが、その大部分は、宿主細胞の可溶化液からウイルスを精製するための特異的なクロマトグラフィーのマトリックスの使用に集中している（例えば、米国特許第６，００８，０３６号を参照されたい）。記載されているその他の方法、例えば、米国特許第６，０４８，５３７号は、連続ショ糖密度勾配遠心法を利用しており、この方法によって得られる生成物は、抗原純度が低く、遠心分離によるさらなる精製のステップが必要である。そのような方法はまた、ウイルス抗原の損失に至る恐れまたはウイルス不活性化のステップを阻害する恐れがある、抗原の凝集にも悩まされる。

ウイルスの凝集はまた、長い時間および高いコストがかかり、大規模生産に対応するのが困難であるクロマトグラフィー工程の収率を損なう恐れもある。したがって、本発明の目標は、簡便ではあるが、にもかかわらず、ウイルス抗原の凝集が低下した、高い純度の、全ウイルス抗原の画分をもたらすことが可能である、ウイルスを、特に宿主細胞試料から精製するための方法の提供である。

本発明は、ウイルスまたはウイルス抗原を精製するための方法を提供し、この方法は、ウイルス調製物を提供し、１つの緩衝成分が、６．０と９．４との間のｐＫａ値を有する緩衝成分である水性緩衝液中において、３４％〜５０％（ｗ／ｗ％）のショ糖当量の濃度の糖からなる第１層Ａ、および５０％〜６５％（ｗ／ｗ％）ショ糖のショ糖当量の濃度の糖からなる第２層Ｂによって確立された、糖勾配中で、前記ウイルス調製物を遠心分離するステップと、遠心分離物から、前記ウイルスまたはウイルス抗原、すなわち、遠心分離工程の生成物を収集するステップとを含む。

本発明の１つの態様では、ウイルスまたはウイルス抗原を精製するための方法を提供する。この方法は、少なくとも第１の緩衝糖溶液および少なくとも第２の緩衝糖溶液を遠心分離することによって確立された糖勾配を含有する溶液を提供するステップを含む。第１の緩衝糖溶液中の糖濃度は、３５％〜５０％（ｗ／ｗ％）、または特定の実施形態では、３４％〜４６％（ｗ／ｗ％）のショ糖当量を有する。第２の緩衝糖溶液中の糖濃度は、５０％〜６５％（ｗ／ｗ％）、または特定の実施形態では、５０％〜６０％（ｗ／ｗ％）のショ糖当量を有する。糖勾配が確立されたら、ウイルス調製物を糖勾配に添加する。次いで、ウイルス調製物および糖勾配を遠心分離して、ピークプールを得、このピークプールを抽出して、ウイルスまたはウイルス抗原を得る。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
ウイルスまたはウイルス抗原を精製するための方法であって、
少なくとも第１の緩衝糖溶液および少なくとも第２の緩衝糖溶液を遠心分離することによって、糖勾配を含有する勾配形成溶液を得るステップであって、上記第１の緩衝糖溶液中の糖濃度が、３５％〜５０％（ｗ／ｗ％）の間のショ糖当量を有し、上記第２の緩衝糖溶液中の糖濃度が、５０％〜６５％（ｗ／ｗ％）の間のショ糖当量を有し、上記第２の緩衝糖溶液が、上記第１の緩衝糖溶液より高い密度を有するステップと、
ウイルス調製物を、上記糖勾配に添加するステップと、
上記ウイルス調製物および糖勾配を遠心分離して、ピークプールを得るステップと、
上記ピークプールを抽出して、上記ウイルスまたはウイルス抗原を得るステップと
を含む方法。
（項目２）
上記勾配形成溶液の容積が、超遠心分離用ローターの容積の５％〜１００％の間である、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記ピークプールが、１．１３ｋｇ／ｌ〜１．２５ｋｇ／ｌの間の密度を有する、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記ピークプールが、３０％と５４％（ｗ／ｗ％）の間のショ糖のショ糖当量を用いて収集される、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記緩衝液のうちの少なくとも１つが、５ｍＭ〜５０ｍＭの間の濃度を有する、項目１に記載の方法。
（項目６）
上記少なくとも１つの緩衝液が、１５ｍＭ〜３０ｍＭの間の濃度を有する、項目５に記載の方法。
（項目７）
上記少なくとも１つの緩衝液が、１８ｍＭ〜２５ｍＭの間の濃度を有する、項目６に記載の方法。
（項目８）
上記ウイルス調製物を遠心分離するステップが、少なくとも２０，０００ｇの相対遠心分離を用いて実施される、項目１に記載の方法。
（項目９）
相対遠心力が、少なくとも３０，０００ｇである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記相対遠心力が、少なくとも９０，０００ｇである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
上記第１の緩衝糖溶液の、上記少なくとも第２の緩衝糖溶液に対する上記容積の比が、２０：１〜１：１の間である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
上記容積比が１０：１〜１．５：１の間である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
上記容積比が８：１〜２：１の間である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
上記容積比が６：１〜３：１の間である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
糖勾配を含有する上記溶液が、二層を含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
上記調製が、プレクラリファイヤーを含まない、項目１に記載の方法。
（項目１７）
上記少なくとも第１の緩衝糖溶液が、糖を、４０％〜４４％（ｗ／ｗ％）のショ糖当量の濃度範囲において含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
上記少なくとも第１の緩衝糖溶液が、糖を、４１％〜４３％（ｗ／ｗ％）のショ糖当量の濃度範囲において含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
上記少なくとも第２の緩衝糖溶液が、糖を、５２％〜５８％（ｗ／ｗ％）のショ糖当量の濃度範囲において含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
上記少なくとも第２の緩衝糖溶液が、５４％〜５６％のショ糖当量の糖を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
上記ウイルスが、オルトミクソウイルスである、項目１に記載の方法。
（項目２２）
上記ウイルスが、インフルエンザウイルスである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
上記ウイルス調製物が、ウイルスを接種した細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目２４）
上記細胞が、動物の細胞培養物または細胞系である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
上記細胞が上皮細胞である、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
上記細胞が、腎臓上皮細胞である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
上記細胞がベロ細胞である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
上記ウイルスが不活性化されている、項目１に記載の方法。
（項目２９）
上記ウイルスが断片化されている、項目１に記載の方法。
（項目３０）
上記緩衝液の成分がアミンである、項目１に記載の方法。
（項目３１）
上記緩衝液の成分がＴＲＩＳである、項目３１に記載の方法。
（項目３２）
上記緩衝液がＴＲＩＳ緩衝食塩水である、項目１に記載の方法。
（項目３３）
ウイルスまたはウイルス抗原に対するワクチンを調製する方法であって、上記ウイルスまたはウイルス抗原が、項目１に記載の方法を使用して得られる方法。
（項目３４）
ウイルスまたはウイルス抗原を精製するための方法であって、
少なくとも第１の緩衝糖溶液および少なくとも第２の緩衝糖溶液を遠心分離することによって、糖勾配を含有する勾配形成溶液を得るステップであって、上記第１の緩衝糖溶液の密度が、１．１５ｋｇ／ｌ〜１．２３ｋｇ／ｌであり、上記第２の緩衝糖溶液の密度が、１．２３ｋｇ／ｌ〜１．３２ｋｇ／ｌであり、上記第２の緩衝糖溶液が、上記第１の緩衝糖溶液より高い密度を有するステップと、
ウイルス調製物を、上記糖勾配に添加するステップと、
上記ウイルス調製物および上記糖勾配を遠心分離して、ピークプールを得るステップと、
上記ピークプールを抽出して、上記ウイルスまたはウイルス抗原を得るステップと
を含む方法。

従来（図１ａ）および本発明（図ｌｂ）の超遠心分離の手順を用いて精製したＰＭＶＨの顕微鏡写真である。

ウイルスまたはウイルス抗原の精製の間に、ウイルスまたはウイルス抗原が遠心分離によって濃縮され、細胞培養の培地の成分、ならびに／または宿主細胞および宿主細胞の成分からの分離が可能となる。本発明の方法は、精製の遠心分離のステップにおけるウイルスの凝集およびウイルスの損失を最小限に留めることができる。

本発明の方法においては、生理的緩衝液中の第１の糖溶液を一般に、連続超遠心分離機中に垂直に充填して、水平な糖溶液層Ａを形成し、次いで、同一または異なる生理的緩衝液中の第２のより高い濃度の糖溶液を連続超遠心分離機中に充填して、水平な糖溶液層Ｂを形成する。次いで、連続超遠心分離機を作動して、連続超遠心分離機の外壁上で濃縮程度が最も高く、連続超遠心分離機の中心に向かって濃縮程度が低下している糖勾配を生み出す。次いで、細胞培養物からのウイルスを含有する採集溶液を連続超遠心分離機中に充填し、ウイルス粒子を、ウイルス粒子の密度が勾配の密度と同等である、糖勾配中の場所に移動させる。糖がショ糖である場合には、この平衡が生じる典型的な密度の範囲は、３６％〜４８％（ｗ／ｗ％）のショ糖である。連続超遠心分離機が停止すると、勾配は、水平な位置にシフトし、連続超遠心分離機から、ウイルス粒子（または「ピークプール」）を含有する勾配の部分を取り出す。

本発明の１つの態様は、二層性溶液のアプローチを活用することにより、単一の濃度のショ糖水溶液を、ショ糖勾配を形成するために活用する従来の方法と比較して、ピークプールの容積を増加させることができるという驚くべき発見である。この驚くべき効果は、ショ糖を使用し、勾配中の最大ショ糖濃度が、従来の方法において使用される濃度と同一である場合であっても得られる。２つのショ糖溶液の層ＡおよびＢの濃度および量を最適化することによって、ピークプールの容積を、例えば、２倍相当増加させることができる。このピークプールの容積の増加は、全ウイルス粒子または抗原の凝集を、それらのそれぞれの濃度を減少させることによって低下させる。

連続超遠心分離工程は、ウイルス調製物の精製のために有用である。糖（例えば、ショ糖もしくはソルビトール）または塩（例えば、ＣｓＣｌ_２もしくはＮａＢｒ）の高度に濃縮された溶液を使用して、超遠心分離によって勾配を作り出すことができる。しかし、いずれの添加剤も有しない糖溶液は、電解質の濃度が低く、緩衝能を有しない。したがって、本発明の１つの態様は、ショ糖溶液等の糖溶液中のウイルス調製物は、ウイルス粒子の濃度に依存して凝集物を形成する傾向が強く、これは、ワクチン生産のためのその後の処理において問題を引き起こす恐れがあることの認識である。本発明の方法は、糖溶液（例えば、５５％ｗ／ｗのショ糖溶液）を使用し、勾配中で電解質およびｐＨの生理的な条件を達成するために、生理的な濃度の塩（例えば、約４〜８ｇ／ｋｇのＮａＣｌ）および緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ、約１０〜２０ミリモル／ｋｇ、さらにｐＨを加減する）を添加して、これらの問題を最小限に留める効果をもたらすことができる。特定の実施形態では、異なる糖溶液を適用して、超遠心分離機中で勾配を作る。例として、２００ｍＬの５５％ｗ／ｗ溶液および８００ｍＬの４２％ｗ／ｗ溶液を、超遠心分離機に充填する。より高い濃度のショ糖溶液のより少ない量によって、超遠心分離の終わりには、最大ショ糖濃度が約４５％超に留まることが確実になり、４２％ショ糖のより多い量によって、ウイルスのピークの最大が典型的に生じる、４０％前後の領域においてより緩やかな勾配が得られる。本発明のこれらの方法によって、ピークプールの容積を増加させることができ、したがって、ウイルス粒子の懸濁液が希釈され、その結果、凝集が低下する。また、超遠心分離機に充填する上清の間における分子または粒子の拡散、および勾配も、そのようなショ糖の処方を使用することによって改変される。

例として、２０ミリモル／ｋｇのＴｒｉｓ緩衝液中の約４２％および５５％（ｗ／ｗ％）のショ糖溶液を使用して形成した密度勾配が、インフルエンザウイルスについて特に有用であることが見い出されたが、これはまた、その他のウイルスについても容易に適合することができる。Ｔｒｉｓ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）は、６．５と９．７との間のｐＨ範囲についての有用な緩衝液である。ショ糖を、本発明の実施形態のこの特定の実施例において使用するが、勾配遠心分法に適したその他の糖を使用することができる。さらに、その他の緩衝化合物、特に、アミン等の有機の緩衝化合物を使用することができる。好ましくは、緩衝液は、６超、６．２超、６．４超、６．６超、６．８超、７．２超、７．４超、７．６超、７．８超または８．０超、かつ９．４未満、９．２未満、９．０未満、８．８未満、８．６未満、８．４未満または８．２未満であるｐＫａ値を有する。適切な緩衝液は、例えば、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸）、ビス−トリス−メタンもしくは−プロパン、ＣＡＰＳ（Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸）、またはＣＡＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸））、リン酸緩衝液、あるいは生化学分野で使用される任意のその他の緩衝液を含む。緩衝液は、好ましくは、生体分子に対して化学的に不活性である。

遠心分離工程によって、ウイルス粒子が、電解質およびｐＨの状態に関して生理的な条件下で分散しているピークプール画分を得ることができる。ピークプール画分中の全ウイルス抗原の濃度を、高い濃度の糖溶液および低い濃度の糖溶液の異なる量を添加して、勾配、したがって、ピーク画分の容積を規定することによって改変することができる。さらに、ピーク画分の容積はまた、塩および適切な緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ））の添加のみによっても増加するので、抗原およびタンパク質の顕著により高い収率が得られる。この効果は、タンパク質およびウイルス抗原の、生理的濃度の塩および生理的ｐＨを含有する糖勾配への移動性の予想外の改善に起因し得るであろう。異なる超遠心分離機の条件（例えば、プレクラリファイヤーの有無および異なる重力）から、顕著な収率の増加およびウイルス粒子の凝集の低下を、ショ糖勾配のこれらの改変によって達成することができることが明らかに示された。

好ましくは、電解質の添加は、５０ｍＯｓｎ／ｋｇ超、１００ｍＯｓｎ／ｋｇ超、１５０ｍＯｓｎ／ｋｇ超、２００ｍＯｓｎ／ｋｇ超または２５０ｍＯｓｎ／ｋｇ超、かつ５００ｍＯｓｎ／ｋｇ未満、４５０ｍＯｓｎ／ｋｇ未満、４００ｍＯｓｎ／ｋｇ未満または３５０ｍＯｓｎ／ｋｇ未満であり、好ましくは、約３００ｍＯｓｎ／ｋｇである。電解質の量は、ファントホッフ係数を補正しない水溶液の重量モル浸透圧濃度に相当するものとして計算されることに留意されたい。さらに、勾配形成物質（例えば、ショ糖）の寄与も、計算には使用されない。例えば、電解質による重量モル浸透圧濃度は、以下のように計算される：８ｇ ＮａＣｌ／ｋｇ／５８．４４ｇ／モル＝１３６．９ミリモル／ｋｇ×２（イオン／モル）＝２７３．８ｍＯｓｍ／ｋｇ＋２０ｍＭ／ｋｇ ＴＲＩＳ×２イオン／モル＝４０ｍＯｓｍ／ｋｇ；全（ＮａＣｌ＋ＴＲＩＳ）３１３．８ｍＯｓｍ／ｋｇ）。ｐＨの値は、生理的な範囲、好ましくは、５．５と９．５との間、より好ましくは、５．５と８．５との間、特に好ましいのは、５．５超、６超、６．５超または７超、かつ９．５未満、９．０未満、８．５未満、８未満または７．５未満であり、とりわけ、７．０と７．５との間または７．０と７．４との間であってよい。

特に好ましい実施形態では、密度勾配を生み出すために使用する糖は、ショ糖である。しかし、本発明はまた、その他の糖の使用も企図し、その他の糖には、糖アルコールが含まれ、その非限定的な例として、ソルビトールが挙げられる。さらに、本発明は、水素添加糖、直鎖の糖、改変された糖または任意のその他の糖が、本明細書に特定する密度を有する溶液をもたらすのに十分な、水に対する溶解性を有するならば、そうした糖の使用も企図する。また、糖の組合せ（すなわち、２つ以上の糖）も、同一の層中または異なる層中のいずれであっても、それらの層を構成する対応する糖溶液が本明細書に特定する密度を有するならば、本明細書に記載する勾配を作り出すために使用することができる。

好ましい実施形態では、勾配形成調製液の容積は、試料に遠心力を掛ける超遠心分離用ローターまたは装置の有効容積の５％〜１００％、好ましくは、５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３２％超、３５％超、４０％超、４５％超もしくは５０％超、または１００％未満、９０％未満、８０％未満；７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４８％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満もしくは２５％未満である。その他の実施形態では、勾配形成調製液の容積は、試料に遠心力を掛ける超遠心分離用ローターまたは装置の有効容積の１％〜７５％である。

好ましい実施形態では、勾配形成物質を含有するローターの装填は、連続モードまたは不連続反復モード（すなわち、連続超遠心分離またはバッチ超遠心分離のいずれか）で実施し、この場合、充填する容積は、好ましくは、ローターの空隙容積（全容積マイナス勾配の容積）を上回る、好ましくは、１×、２×、３×、５×、１０×、２０×、３０×、４０×、５０×、６０×、８０×を超え、または３００×、２５０×、２００×、１５０×、１２０×、１００×、８０×に満たない。特定の特に好ましい実施形態では、連続超遠心分離を使用する。

特に好ましい実施形態では、充填する容積は、６００ｍＬ〜１０００ｍＬの空隙容積当たり２０Ｌ〜５０Ｌ（１６００ｍＬのローター容積マイナス６００ｍＬ〜１０００ｍＬの空隙容積）であり、これは、約２０×〜８０×の割合である。別の実施形態では、充填する容積は、１２００ｍＬ〜２０００ｍＬの空隙容積当たり４０Ｌ〜１００Ｌである（３２００ｍＬのローター容積マイナス１２００ｍＬ〜２０００ｍＬの空隙容積、これは、約２０×〜８０×の割合である）。

遠心分離の間に、糖の連続的な勾配が確立される。さらなる実施形態では、ショ糖濃度が、２４％（約１．１０ｋｇ／ｌに相当する）超、２６％超、２８％超、３０％超、３２％超、３４％超、３６％超、３８％超、４０％超、４２％超、４４％超または４６％（ｗ／ｗ％）（約１．２２ｋｇ／ｌに相当する）超、かつ６６％（約１．３２ｋｇ／ｌに相当する）未満、６３％未満、６０％未満、５８％未満、５６％未満、５４％未満、５２％未満、５０％未満、４８％未満、４６％未満、４４％未満または４２％（ｗ／ｗ％）（約１．１９ｋｇ／ｌに相当する）未満である、遠心分離物の画分を収集する。通常、ウイルス生成物は、この範囲において蓄積する。好ましくは、遠心分離物の画分を、ショ糖濃度が約３０％と５４％（ｗ／ｗ％）との間で、より好ましいのは、ショ糖が３６％と４８％（ｗ／ｗ％）との間で収集する。その他の糖によって形成された勾配から収集した画分は、異なる濃度（ｗ／ｗ％）を有する場合があろうが、同等の密度を有する。収集した画分の密度は、１．１０ｋｇ／ｌ超、１．１２ｋｇ／ｌ超、１．１４ｋｇ／ｌ超、１．１６ｋｇ／ｌ超または１．１８ｋｇ／ｌ超、１．２０ｋｇ／ｌ超、１．２２ｋｇ／ｌ超、かつ１．３２ｋｇ／ｌ未満、１．３０ｋｇ／ｌ未満、１．２８ｋｇ／ｌ未満、１．２６ｋｇ／ｌ未満、１．２４ｋｇ／ｌ未満、１．２２ｋｇ／ｌ未満または１．２０ｋｇ／ｌ未満であってよい。特に好ましい実施形態では、密度は、１．１３と１．２５ｋｇ／ｌとの間、より好ましいのは、１．１６と１．２２ｋｇ／ｌとの間であってよい。

特定の実施形態では、緩衝液または緩衝液の成分（例えば、ＴＲＩＳ緩衝食塩水）の濃度は、２ミリモル／ｋｇ〜５０ミリモル／ｋｇ、好ましくは、５ミリモル／ｋｇ〜４０ミリモル／ｋｇ、１０ミリモル／ｋｇ〜４０ミリモル／ｋｇ、より好ましくは、１０ミリモル／ｋｇ〜３０ミリモル／ｋｇ、より好ましくは、１８ミリモル／ｋｇ〜２５ミリモル／ｋｇ、最も好ましいのは、２０ミリモル／ｋｇである。緩衝液は、好ましくは、５％未満の水混和性の有機溶媒を有する水性緩衝液、より好ましくは、２％未満の有機溶媒を有する水性緩衝液であり、最も好ましくは、有機溶媒を有さない水性緩衝液である。緩衝液は、２ミリモル／ｋｇ超、５ミリモル／ｋｇ超、１０ミリモル／ｋｇ超、１２ミリモル／ｋｇ超、１４ミリモル／ｋｇ超、１５ミリモル／ｋｇ超、１７ミリモル／ｋｇ超、１８ミリモル／ｋｇ超、１９ミリモル／ｋｇ超もしくは２０ミリモル／ｋｇ超、または５０ミリモル／ｋｇ未満、４０ミリモル／ｋｇ未満、３５ミリモル／ｋｇ未満、３０ミリモル／ｋｇ未満、２５ミリモル／ｋｇ未満、２３ミリモル／ｋｇ未満もしくは２１ミリモル／ｋｇ未満の濃度を有する。

遠心分離を、好ましくは、少なくとも２０，０００ｇ、より好ましくは、３０，０００ｇ、より好ましくは、５０，０００ｇ、より好ましくは、７０，０００ｇ、最も好ましくは、９０，０００ｇの遠心力を用いて実施することができるが、その他の実施形態では、遠心力は、２００，０００ｇ未満、１５０，０００ｇ未満、１２０，０００ｇ未満、１００，０００ｇ未満、または９０，０００ｇ未満である。

特に好ましい実施形態では、最初のＡ層の、最初のＢ層に対する容積の比（すなわち、ウイルス調製物を適用する前の比）は、２０：１〜１：１、好ましくは、１０：１〜１．５：１、より好ましくは、８：１〜２：１、さらにより好ましくは、６：１〜３：１、最も好ましくは、４：１である。この比は、２０：１未満、１５：１未満、１０：１未満、８：１未満、５：１未満、４：１未満、３：１未満、または１：２超、１：１超、１．５：１超、２：１超、３：１超または４：１超であってよい。

特に好ましい実施形態では、糖含有遠心分離液は、二層性である（すなわち、超遠心分離機中では、充填液層の下に、ウイルス調製物の添加前には異なる濃度の糖の層ＡおよびＢを含む）。もちろん、遠心分離の間に、新しい濃度勾配または密度勾配を形成することができる。しかし、本発明はまた、三層以上を有する遠心分離液も企図する。例えば、特定の非限定的な実施形態では、遠心分離液は、３、４、５、６、７または８つもの異なる層から構成される。各層は、その他の層と同一の緩衝液を有してもよく、または各層の緩衝液を独立に選んでもよい。

特に好ましい実施形態では、調製方法は、前清澄化のステップを含まない。しかし、所望により、前清澄化を、超遠心分離機の前清澄化用チャンバー中で実施することができる。

さらなる実施形態では、層Ａは、４０％〜４４％（ｗ／ｗ％）のショ糖、好ましくは、４１％〜４３％（ｗ／ｗ％）のショ糖を含む。ショ糖濃度は、３５％（約１．１５ｋｇ／ｌに相当する）超、３６％超、３７％超、３８％超、３９％超、４０％超、４１％超もしくは４２％（ｗ／ｗ％）（約１．１９ｋｇ／ｌに相当する）超、または５０％（約１．２３ｋｇ／ｌに相当する）未満、４９％未満、４８％未満、４７％未満、４６％未満、４５％未満、４４％未満、４３％未満もしくは４２％（ｗ／ｗ％）（約１．１９ｋｇ／ｌに相当する）未満であってよい。別の糖から形成した層Ａは、重量／重量に基づいた異なる濃度を有する場合があろうが、本明細書に特定する密度の範囲内に属する密度を有する。

特定の実施形態では、層Ｂは、５０％〜６５％（ｗ／ｗ％）、好ましくは、５２％〜５８％（ｗ／ｗ％）、より好ましくは、５４％〜５６％（ｗ／ｗ％）の濃度を有するショ糖溶液を含む。ショ糖濃度（ｗ／ｗ％）は、５０％（約１．２３ｋｇ／ｌに相当する）超、５１％超、５２％超、５３％超、５４％超もしくは５５％（約１．２６ｋｇ／ｌに相当する）超、または６６％（約１．３２ｋｇ／ｌに相当する）未満、６４％未満、６２％未満、６１％未満、６０％未満、５９％未満、５８％未満、５７％未満、５６％未満もしくは５５％（約１．２６ｋｇ／ｌに相当する）未満であってよい。その他の糖から形成した層Ｂは、重量／重量に基づいた異なる濃度を有する場合があろうが、本明細書に特定する密度の範囲内に属する密度を有する。

本発明の好ましい実施形態では、ウイルスは、オルソミクソウイルス、特にインフルエンザウイルスであり、好ましくは、インフルエンザＡおよびＢから選択される。本発明が企図するその他のウイルスの非限定的な例として、レオウイルス科、ピコルナウイルス科、カリシウイルス科、トガウイルス科、アレナウイルス科、レトロウイルス科、フラビウイルス科、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、コロナウイルス科、アストロウイルス科、ボルナウイルス科等のＲＮＡウイルスファミリー、およびアデノウイルス科、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、ヘパドナウイルス科等のＤＮＡウイルスファミリーからなる群から選択されるウイルスが挙げられる。特定の好ましい実施形態では、ウイルスは、インフルエンザＡ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９、インフルエンザＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９、およびインフルエンザＢ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／７／９７からなる群から選択される。

本発明のいくつかの実施形態では、ウイルス採集物を、ウイルスを接種した細胞から調製する。ウイルスは、ウイルスの産生に適した任意の細胞中で産生することができる。好ましくは、細胞は、動物の細胞培養または細胞系の細胞である。そのような細胞は、特異的な組織、または胚性卵等の胚性細胞に由来することができる。動物は、好ましくは、哺乳動物またはトリである。本発明の種々の実施形態では、細胞は、トリ、イヌ、げっ歯類または霊長類の細胞である。特異的な実施形態では、細胞は、上皮細胞、特に好ましいのは、アフリカミドリザルのベロ細胞等の腎臓上皮細胞である。

超遠心分離機に掛けるウイルス採集物は、全細胞培養もしくは細胞を分離した後に得た細胞培養の上清、および／または細胞培養からのそれらの一部であってよい。本発明のいくつかの実施形態では、細胞培養物中の細胞を、培養容器中で落ち着かせてから、細胞培養の上清を取り出す。本発明のその他の実施形態では、細胞を、化学的または機械的な方法によって溶解させることができる。これらの非限定的な例として、低浸透圧または高浸透圧による溶解、洗剤による処理、超音波処理および機械的な破壊が挙げられる。

好ましくは、ウイルスを、（例えば、ＷＯ０５／１１８００に記載されているように）遠心分離の前または後に、不活性化または断片化する。さらに、ウイルスのワクチンを、当技術分野で既知の方法によって調製することもできる。ワクチンは、抗原性物質、すなわち、（非感染性の）ウイルス、その殻、粒子またはその抗原からなる免疫原性組成物であり、これを使用して、動物、例えば、ヒト等の哺乳動物、またはトリを免疫化することができる。

本発明を、以下の実施例によってさらに例証するが、これらの実施例に限定されない。

インフルエンザウイルス抗原の精製の間に、単価採集物（ＭＶＨ）を超遠心分離によって濃縮する。５０％（ｗ／ｗ％）ショ糖水溶液を使用して形成したショ糖勾配に基づいて、連続流遠心分離の手順を適用して、ベロ細胞培養により増殖させたウイルスワクチンを製造することができる。使用した遠心分離機のローターのモデルには、プレクラリファイヤーが装備されていた。ダイズ加水分解産物を補うことによってベロ細胞培養の培地を変化させる、またはインフルエンザウイルス複製の早期においてより高い温度条件を与える等のいくつかの発酵の最適化アプローチによって、よりロバストな工程が得られ、抗原収率も増加した。その結果、５０％（ｗ／ｗ％）のショ糖／水の勾配では、抗原結合能力の制約により、所望の回収率を達成できないことが判明した。さらに、ウイルスのＮｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ株、Ｐａｎａｍａ株およびＳｈａｎｇｄｏｎｇ株のＰＭＶＨ（精製ＭＶＨ）は、この特定の生産ステップにおいては、予想外の抗原凝集を示した。遠心分離のステップにおけるウイルスの凝集およびウイルスの損失を最小限に留めるためのいくつかの方策を試みた。水の代わりにＴＲＩＳ緩衝食塩水を使用してショ糖を溶解させて、勾配物質を得た。さらに、異なる密度を有する２つの勾配形成溶液を使用するという改変を導入して、ピークプール容積を増加させた。さらに、プレクラリファイヤーは用いないが、重力を増加させた超遠心分離が、収率の改善のための貴重なツールであることも判明した。この概念を証明するために、標準的な条件（水中の５０％ショ糖、プレクラリファイヤーを用いる、２０，０００ｒｐｍ＝９０，０００ｇ）を用いた以前の精製からの結果、および新規な条件（４２％および５５％のショ糖（ｗ／ｗ％）、２０ミリモル／ｋｇのＴＲＩＳ、８ｇ／ｋｇのＮａＣｌ、プレクラリファイヤーを用いない、３５，０００ｒｐｍ＝９０，０００ｇ、４８％〜３６％のショ糖画分からのＰＭＶＨ採集物を用いる）からの結果を評価した。

（実施例１）
材料および方法
Ｃ４０ＣＴＳローター（１，６００ｍＬのローター容積）を有する連続流超遠心分離機ＣＣ４０Ｓ、または同等のローターを有するＡｌｆａ Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎ超遠心分離機ＲＫ６を使用した。ショ糖勾配溶液を、ローターに充填し、次いで、２０，０００〜３５，０００ｒｐｍの回転速度まで加速した。不活性化採集物を連続して充填した後、ローターを、緩衝液を用いて洗い流して、勾配中にまだ入っていなかった残余のタンパク質を取り除いた。洗い流した後、ローターを減速し、超遠心分離を止め、勾配をローターの半径方向から軸方向へシフトさせた。溶出および分別を、ショ糖濃度に従って実施した。コリオリ型の密度検出ユニットおよびＵＶ２５４ｎｍにおける検出ユニットを使用して、ショ糖濃度およびタンパク質濃度をモニターした。

精製した不活性化採集物の試料を、全タンパク質濃度、ＨＡ−ＳＲＤおよびベロ抗原について、ＥＬＩＳＡによって、標準的な手順に従って測定して、超遠心分離実験からの収率および純度を定量化した。

（実施例２）
ＴＢＳ−ショ糖の勾配を用いた最初の実験
Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９の単価ウイルス採集物を用いたいくつかの小規模精製試験から、５０％ｗ／ｗのショ糖と５０％ｗ／ｗのＴｒｉｓ緩衝食塩水（２０ミリモル／ｋｇのＴＲＩＳ、８ｇ／ｋｇのＮａＣｌ）との混合液（１０ミリモル／ｋｇのＴＲＩＳ、４ｇ／ｋｇのＮａＣｌの最終濃度）から得たショ糖勾配の使用には、標準的なショ糖／水の系を上回る、いくつかの利点があることが示された。実験室用超遠心分離機モデルＲＫ−６を使用して、２５リットルおよび５０リットルのＭＶＨの一定分量を異なる条件下で精製した。ショ糖／水の系およびショ糖／ＴＢＳの系を用いた精製の試験についてのパラメータの設定および結果の概要を、表１に示す。

表１から、ＴＢＳ中のショ糖勾配には、ショ糖／水の系中の標準的な勾配を上回る、いくつかの利点があると結論付けることができる。第１の試験の精製では、採集物１Ｌ当たり抗原１．２ｍｇの収率を達成することができたが、抗原画分（ＰＭＶＨ）は、予想外のウイルスの凝集を示した。ＴＢＳ中のショ糖を用いた精製実験（第２の試験）では、参照の第１の試験と比較して、抗原収率が増加した。ＴＢＳ調製液については、凝集物画分の顕著な低下を観察することができた。ＴＢＳショ糖勾配には、標準的な系（ショ糖／水）を上回る、いくつかの利点があるが、抗原収率の損失が、より多くの充填量の勾配（第３の試験）において観察された（５０リットルと２５リットルとの比較）。

水の代わりにＴＢＳを使用した両方の場合、ピークプールの容積が増加し、このことから、充填した採集物と、緩衝物質およびその他の電解質を含有する勾配との間における拡散の増加が示されている。

（実施例３）
二段階ショ糖／ＴＢＳ勾配の開発
この実施例は、ショ糖勾配を改変して、分別の限度を変化させずに、ピークプール画分の容積を増加させた、例示的な実施形態を示す。４２％（ｗ／ｗ％）に濃度を下げたショ糖勾配を使用した結果、超遠心分離機から溶出されるショ糖勾配が緩やかになった。勾配中に十分に高いショ糖濃度を確実に得るために、４２％（ｗ／ｗ％）溶液に続いて、５０％（ｗ／ｗ％）の濃縮程度のより高いショ糖／ＴＢＳの溶液を充填し、これは、より高い濃度の溶液として、「クッション」を形成して、抗原がローターの壁上に沈降するのを阻止した。表２に、９００ｍＬの濃縮程度のより低いショ糖／ＴＢＳの溶液（４２％ｗ／ｗショ糖、１１．７ミリモル／ｋｇのＴＲＩＳ、４．７ｇ／ｋｇのＮａＣｌ）および１００ｍＬの濃縮程度のより高いショ糖／ＴＢＳの溶液（５０％ｗ／ｗ、１０ミリモル／ｋｇのＴＲＩＳ、４ｇ／ｋｇのＮａＣｌ）を用いた、そのような二段階勾配を使用した精製試験を、５０％のショ糖／ＴＢＳの溶液のみを用い、異なる容積（つまり、６００、８００および１０００ｍＬ）に適用して形成した勾配を使用した精製試験と比較して示す。テストは、プレクラリファイヤーを用いて、２０，０００ｒｐｍ（約３０，０００ｇのＲＣＦ）において実施した。

ショ糖／ＴＢＳ溶液の異なる量および濃度を適用することによって、該物質の収率および純度が顕著な影響を受けることはなかった。しかし、４２％／５０％（ｗ／ｗ％）のショ糖／ＴＢＳ混合液によって作られた二段階勾配の使用によって、ピークプール容積の顕著な増加が生じたが、これは、抗原濃度を減少させて、ピークプール画分の過負荷を回避することによって、より良好な精製条件をもたらす。

（実施例４）
プレクラリファイヤーを用いない、より大きな相対遠心力の実施
超遠心分離のためのより大きな相対遠心力を、抗原収率を増加させるために調査したが、そのような条件下では、プレクラリファイヤー中で該物質が損失することを予想しなければならなかった。超遠心分離用ローターは、プレクラリファイヤーがあってもまたはなくても運転することができ、したがって、二段階ショ糖／ＴＢＳ勾配（１００ｍＬの５０％ｗ／ｗショ糖；１０ミリモル／ｋｇのＴＲＩＳ、４ｇ／ｋｇのＮａＣｌの最終濃度、および９００ｍＬの３９％ｗ／ｗショ糖；１２．２ミリモル／ｋｇのＴＲＩＳ、４．９ｇ／ｋｇのＮａＣｌの最終濃度）中において、プレクラリファイヤーを用いる、２０，０００ｒｐｍ（約３０，０００ｇ）の場合と、３５，０００ｒｐｍ（約９０，０００ｇ）の場合とを比較した。潜在的な抗原の損失を評価するために、プレクラリファイヤーおよびローターの壁を、緩衝液を用いて拭き取り、抗原の損失について分析した。この実験の結果を、表３に示す。抗原収率を、採集物１Ｌ当たり１．７ｍｇのＨＡ−ＳＲＤから採集物１Ｌ当たり２．８のｍｇのＨＡ−ＳＲＤまで、６０％超増加させることができた。失われた抗原の主要な部分は、プレクラリファイヤーから拭き取ることができ、一方、わずか約５％の抗原が、超遠心分離機のローターの壁上から失われたに過ぎない。ＳＲＤ／タンパク質比は、採集物をショ糖／ＴＢＳの勾配上に充填する前の前清澄化を除くことによってわずかに減少したに過ぎなかった。

（実施例５）
ショ糖勾配中におけるＴＲＩＳおよびＮａＣｌの濃度の改変
最初の処方を、５０％（重量）のショ糖と５０％（重量）のＴＢＳ緩衝液（２０ミリモル／ｋｇのＴＲＩＳ、８ｇ／ｋｇのＮａＣｌ）とを混合して、１０ミリモル／ｋｇのＴＲＩＳおよび４ｇ／ｋｇのＮａＣｌの最終濃度を得ることにより、５０％ｗ／ｗのショ糖／ＴＢＳの勾配を調製することによって実施した。それに続いて、濃縮程度がより低い処方である４２％〜３９％のショ糖／ＴＢＳの溶液を、より多くの量のＴＢＳを用いて調製し、その結果、ショ糖濃度はより低いが、それに対応して、ＴＲＩＳおよびＮａＣｌの濃度はより高い状態を得た（先の実施例を参照されたい）。したがって、濃縮程度がより高い溶液、例えば、ＴＢＳ中の５５％（ｗ／ｗ／）ショ糖等は、ＴＲＩＳおよびＮａＣｌの濃度はより低かった。

そのような調製液中のＴＲＩＳおよびＮａＣｌの濃度を標準化するために、新しい処方を設計した。この場合、４２重量％〜５５重量％のショ糖を、混合用容器に添加し、２０ミリモル／ｋｇ（２．４２ｇ／ｋｇ）のＴＲＩＳおよび８ｇ／ｋｇのＮａＣｌを添加し、水を１００重量％まで満たした。この場合、そのような調製液は、先の実施例で使用した処方と比較して、顕著に高い（約２×）濃度のＴＲＩＳおよびＮａＣｌを有した。また、そのような処方の屈折率を測定すると、約２°（１°〜３°）ブリックスだけ高い屈折率の結果を得た。これは、１００％の最終重量まで満たす前に、ＴＲＩＳおよびＮａＣｌの添加によって置き換えられた、水の量の減少分に起因した。

実験では、異なる２種の二段階ショ糖／ＴＢＳ勾配を比較した。８００ｍＬの４２％のショ糖／ＴＢＳを充填した後、２００ｍＬの濃縮程度のより高いショ糖／ＴＢＳの溶液を添加することによって勾配をもたらし、勾配中によりロバストな、高い密度のショ糖のクッションを生み出した。

超遠心分離機実験における異なるショ糖／ＴＢＳの調製液の結果を、表４に示す。異なるＴＲＩＳおよびＮａＣｌの濃度を使用した場合、収率および純度に関しては顕著な差は観察することができなかった。

（実施例６）
ローターの充填能力および充填流速の調査
異なる３株の異なる採集物容積を調査することにより、最適化した超遠心分離操作の能力を評価し、採集物容積を増やして超遠心分離操作に適用しなければならない場合の、製造時の潜在的スケールアップ問題を調査した。１５〜１７Ｌおよび４５〜５１Ｌの不活性化採集物を、１６００ｍＬのローター上に充填した。

この実験では、先の実施例５の場合と同じ変更種の二段階ショ糖／ＴＢＳ勾配を適用した。最初に、８００ｍＬの４２％のショ糖／ＴＢＳを充填した後、より高い密度の溶液の濃度を５５％ｗ／ｗまで増加させ、２００ｍＬのより大きな容積を使用して、勾配中によりロバストな、高い密度のショ糖のクッションを生み出した。両方のショ糖／ＴＢＳの溶液において、勾配中の最終ＴＲＩＳ濃度を２０ミリモル／ｋｇまで増加させ、最終ＮａＣｌ濃度を８ｇ／ｋｇまで増加させた。超遠心分離の条件は、プレクラリファイヤーを用いない３５，０００ｒｐｍ（９０，０００ｇ）であり、分別を４８％〜３６％のショ糖の間で実施した。

充填能力実験の結果を、表５に示す。

本発明の勾配およびプレクラリファイヤーを用いない、より大きな遠心力を用いた場合、採集物の充填容積が異なる場合でも、約３％〜６％の収率のごくわずかな差を観察することができたに過ぎない。このことは、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９株について、採集物の容積を２５リットルから５０リットルに増加させたところ、収率が約３０％減少してしまった、実施例２／表１において実証された、制限された充填能力とは対照的である。この改善された収率は、相対遠心力の増加と、二段階ショ糖／ＴＢＳ勾配に起因する勾配プロファイルおよびピークプールの容積の改善との組合せによって説明することができる。

（実施例７）
本発明の超遠心分離の手順と従来の超遠心分離の手順との比較
ａ）（プレクラリファイヤーを用いる、３０，０００ｇ（２０，０００ｒｐｍ）に代わる）プレクラリファイヤーを用いない、９０，０００ｇ（３５，０００ｒｐｍ）と、
ｂ）（水中のショ糖に代わる）２０ミリモル／ｋｇのＴＲＩＳおよび８ｇ／ｋｇのＮａＣｌの最終濃度を有する、ＴＢＳ中のショ糖の勾配と、
ｃ）（８００ｍＬの５０％ショ糖に代わり）ピークプール画分の容積を増加させるために、２つの異なるショ糖濃度（２００ｍＬの５５％＋８００ｍＬの４２％）を用いて、そのような勾配を形成することと
を組み合せて使用して、
以前の従来法超遠心分離手順と比較した（表６）。

３つの比較実験を、２００２／２００３株（つまり、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９、Ａ／Ｐａｎｍａ／２００７／９９およびＢ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／７／９７）を用いて実施した。これらの試験について、ピークプールの分別限度を、４８％〜３６％（ｗ／ｗ％）のショ糖を用いて規定した。結果を、実施例８〜実施例９に示す。

標準的な条件（５０％ショ糖／水）および改変した条件（ショ糖／ＴＢＳの勾配）の下における、Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａインフルエンザ、ＰａｎａｍａインフルエンザおよびＳｈａｎｇｄｏｎｇインフルエンザを用いた精製の試験からの結果を、収率および生成物の品質のパラメータに基づいて比較した。

（実施例８）
インフルエンザ株Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９の精製
表６による標準的な手順および新規な、ショ糖／ＴＢＳの勾配のパラメータに従った条件を用いた精製実験を、Ｎｅｗ ＣａｌｅｄｏｎｉａのＭＶＨを用いて実施した。表７に、精製の試験からの結果の比較を示す。

表７中のデータから、インフルエンザ株Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９については、新規な、ショ糖／ＴＢＳの勾配の精製条件を用いて、顕著な工程改良が達成されたと結論付けることができる。この特定の株については、ウイルスの収率が、ＭＶＨ１リットル当たり抗原２．７ｍｇから３．４ｍｇへと顕著に増加することが実証された。ＨＡ／全タンパク質比およびベロタンパク質／ＨＡ比として測定したウイルス抗原の品質からは、この１リットル当たりの用量の増加によって、抗原の品質が損なわれなかったことが示されている。ＨＡ／全タンパク質の０．４１から０．６０へのわずかな増加が、新規なショ糖勾配の条件によって達成された。宿主細胞タンパク質／ＨＡ比については、顕著な差を検出することができなかった。ＰＭＶＨ生産のためのショ糖／ＴＢＳの勾配の条件下では、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９株の凝集が、わずかに低下した。この効果は、顕微鏡観察によって確認することができた（例えば、図１Ａおよび図１Ｂを参照されたい）。倍率４００倍では、先のショ糖／水勾配種を適用した場合、凝集物のより強力な形成が明らかに目に見える（図１Ａ）が、収率の増加にもかかわらず、最適化した超遠心分離の手順から得たピークプール画分は、顕著により均一であるように見える（図１Ｂ）。

（実施例９）
インフルエンザ株Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９の精製
表６による標準的な手順および新規なショ糖／ＴＢＳの勾配のパラメータに従った条件を用いた精製実験を、ＰａｎａｍａのＭＶＨを用いて実施した。表８に、精製の試験からの結果の比較を示す。

表８中のデータから、インフルエンザ株Ｐａｎａｍａについては、新規な、ショ糖／ＴＢＳの勾配の精製条件を用いて、顕著な工程改良が達成されたと結論付けることができる。この特定の株については、ウイルスの収率が、新規な、ショ糖／ＴＢＳの勾配の条件の適用によって、ＭＶＨ１リットル当たり抗原２．０ｍｇから５．５ｍｇへと顕著に増加することが実証された。０．７７のＨＡ／全タンパク質比が達成され、一方、標準的な条件下で得られたＰＭＶＨについては、計算された比は１．４７であった。両方の手順を用いて得られたＰＭＶＨのベロタンパク質／ＨＡ比については、顕著な差を見い出すことができないという事実により、（ＰａｎａｍａのＰＭＶＨの顕微鏡写真の比較に見られる（表示せず）ような）Ｐａｎａｍａ抗原の凝集が、１．４７という異常なＨＡ／全タンパク質比についての原因であり得ると想定されている。両精製操作とも、ＨＡ／全タンパク質比およびベロタンパク質／ＨＡ比として測定したウイルス抗原の品質は、許容できるものである。しかし、ＰＭＶＨ生産のためのＴＢＳショ糖の勾配の条件下では、Ｐａｎａｍａ株の凝集を、ショ糖／ＴＢＳの勾配を使用して顕著に低下させることができた。

（実施例１０）
株Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／７／９７の精製
表６による標準的な手順および新規なショ糖／ＴＢＳの勾配のパラメータに従った条件を用いた精製実験を、ＳｈａｎｇｄｏｎｇのＭＶＨを用いて実施した。表９に、精製の試験からの結果の比較を示す。

表９中のデータから、インフルエンザ株Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／７／９７については、本発明の、ショ糖／ＴＢＳの勾配の精製条件を用いて、顕著な工程改良が達成されたと結論付けることができる。この特定の株については、ウイルスの収率が、ＭＶＨ１リットル当たり抗原２．２ｍｇから５．１ｍｇへと顕著に増加することが実証された。ショ糖／ＴＢＳにより精製したＭＶＨについての０．３４という減少したＨＡ／全タンパク質比は、インフルエンザのＰＭＶＨの仕様の範囲内に属する。トリプシン投与量プロファイルを変化させることによるＢ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／７／９７ウイルスの複製期のさらなる改善によって、より一貫した生産工程の確立が可能となった。標準的な条件とＴＢＳの条件を比較した、精製したＳｈａｎｇｄｏｎｇのＰＭＶＨの顕微鏡写真（表示せず）によって確認されるように、ＰＭＶＨ生産のためのＴＢＳショ糖の勾配の条件下では、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／７／９７株の凝集が顕著に減少した。

本明細書に提供した例示的な大規模および小規模な実験において、本発明のショ糖勾配によって、単価採集物を効率的に充填することが可能となることが実証された。１）ウイルスの収率の少なくとも２５％の増加、２）０．３４〜０．７７の株依存性ＨＡ／全タンパク質比、３）２％〜７％の株依存性の宿主細胞タンパク質含有量、および４）ショ糖ピークプール（ＰＭＶＨ）中の最小限のウイルス凝集を含めて、本明細書に記載する本発明の方法を使用する多くの利点がある。

Claims (31)

1. 不活性化全ウイルスを精製するための方法であって、
   少なくとも（ｉ）第１の生理的緩衝液を含む第１の緩衝糖溶液と、（ｉｉ）前記第１の緩衝糖溶液より高い密度を有し、前記第１の生理的緩衝液と同一または異なる第２の生理的緩衝液を含む少なくとも第２の緩衝糖溶液とを、超遠心分離機用ローターを含む連続超遠心分離機中で遠心分離することによって、糖勾配を含有する勾配形成溶液を得る第１のステップであって、
   前記第１の緩衝糖溶液中の糖濃度が、３５％〜５０％（ｗ／ｗ％）の間のショ糖当量を有し、前記第２の緩衝糖溶液中の糖濃度が、５０％〜６５％（ｗ／ｗ％）の間のショ糖当量を有し、前記第１の緩衝糖溶液の前記第２の緩衝糖溶液に対する容積比は３：１に等しいか、または前記第２の緩衝糖溶液に対して、３：１の容積比よりも前記第１の緩衝糖溶液が多い、第１のステップと、
   次いで、不活性化全ウイルス調製物を、前記糖勾配に添加する第２のステップと、
   前記不活性化全ウイルス調製物および糖勾配を遠心分離する第３のステップと、
   前記ピークプールを抽出して、前記不活性化全ウイルスを得る第４のステップと
   を含む方法。
2. 前記勾配形成溶液の容積が、前記超遠心分離用ローターの容積の５％〜１００％の間である、請求項１に記載の方法。
3. 前記ピークプールが、１．１３ｋｇ／ｌ〜１．２５ｋｇ／ｌの間の密度を有する、請求項１に記載の方法。
4. 前記緩衝液のうちの少なくとも１つが、５ｍＭ〜５０ｍＭの間の濃度を有する、請求項１に記載の方法。
5. 前記少なくとも１つの緩衝液が、１５ｍＭ〜３０ｍＭの間の濃度を有する、請求項４に記載の方法。
6. 前記少なくとも１つの緩衝液が、１８ｍＭ〜２５ｍＭの間の濃度を有する、請求項５に記載の方法。
7. 前記ウイルス調製物を遠心分離するステップが、少なくとも２０，０００ｇの相対遠心分離を用いて実施される、請求項１に記載の方法。
8. 相対遠心力が、少なくとも３０，０００ｇである、請求項７に記載の方法。
9. 前記相対遠心力が、少なくとも９０，０００ｇである、請求項８に記載の方法。
10. 前記第１の緩衝糖溶液の、前記少なくとも第２の緩衝糖溶液に対する前記容積の比が、２０：１未満である、請求項１に記載の方法。
11. 前記容積比が１０：１未満である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記容積比が８：１未満である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記容積比が６：１〜３：１の間である、請求項１２に記載の方法。
14. 糖勾配を含有する前記溶液が、二層を含む、請求項１に記載の方法。
15. 前記不活性化全ウイルス調製物が、プレクラリファイヤーを含まない、請求項１に記載の方法。
16. 前記少なくとも第１の緩衝糖溶液が、糖を、４０％〜４４％（ｗ／ｗ％）のショ糖当量の濃度範囲において含む、請求項１に記載の方法。
17. 前記少なくとも第１の緩衝糖溶液が、糖を、４１％〜４３％（ｗ／ｗ％）のショ糖当量の濃度範囲において含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記少なくとも第２の緩衝糖溶液が、糖を、５２％〜５８％（ｗ／ｗ％）のショ糖当量の濃度範囲において含む、請求項１に記載の方法。
19. 前記少なくとも第２の緩衝糖溶液が、５４％〜５６％のショ糖当量の糖を含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記不活性化全ウイルスが、オルトミクソウイルスである、請求項１に記載の方法。
21. 前記不活性化全ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項２０に記載の方法。
22. 少なくとも１つの前記生理的緩衝液がアミン緩衝液である、請求項１に記載の方法。
23. 少なくとも１つの前記生理的緩衝液がＴＲＩＳ緩衝液である、請求項２２に記載の方法。
24. 前記生理的緩衝液がＴＲＩＳ緩衝食塩水である、請求項１に記載の方法。
25. 不活性化全ウイルスを精製するための方法であって、
    （ｉ）１．１５ｋｇ／ｌ〜１．２３ｋｇ／ｌの密度を有する少なくとも第１の緩衝糖溶液および（ｉｉ）１．２３ｋｇ／ｌ〜１．３２ｋｇ／ｌの、前記第１の緩衝糖溶液より高い密度を有する少なくとも第２の緩衝糖溶液を、超遠心分離機用ローターを含む連続超遠心分離機中で遠心分離することによって、糖勾配を含有する勾配形成溶液を得る第１のステップであって、前記第１の緩衝糖溶液の前記第２の緩衝糖溶液に対する容積比は３：１に等しいか、または前記第２の緩衝糖溶液に対して、３：１の容積比よりも前記第１の緩衝糖溶液が多い、第１のステップと、
    次いで、不活性化全ウイルス調製物を、前記糖勾配に添加する第２のステップと、
    前記不活性化全ウイルス調製物および前記糖勾配を遠心分離して、ピークプールを得る第３のステップと、
    前記ピークプールを抽出して、前記不活性化全ウイルスを得る第４のステップと
    を含む方法。
26. 前記勾配形成溶液の容積は、前記超遠心分離機用ローターの容積の１００％未満である、請求項１に記載の方法。
27. 前記勾配形成溶液の容積は、前記超遠心分離機用ローターの容積の９０％未満である、請求項２６に記載の方法。
28. 前記勾配形成溶液の容積は、前記超遠心分離機用ローターの容積の５０％超または５０％に等しい、請求項１に記載の方法。
29. 前記勾配形成溶液の容積は、前記超遠心分離機用ローターの容積の１００％未満である、請求項２５に記載の方法。
30. 前記勾配形成溶液の容積は、前記超遠心分離機用ローターの容積の９０％未満である、請求項２９に記載の方法。
31. 前記勾配形成溶液の容積は、前記超遠心分離機用ローターの容積の５０％超または５０％に等しい、請求項２５に記載の方法。

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