TWI472620B - 供病毒純化的連續超高速離心用糖溶液之調配 - Google Patents
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Description
本申請案主張2007年5月4日申請之美國臨時申請案第60/927,692號的優先權益，將其內容全部以引用方式納入本文中。
本發明係關於病毒純化之領域。
病毒，在自然界出現的那些或其重組版本，均可用在接種疫苗和基因治療之領域中。許多病毒或類病毒顆粒有可能在宿主細胞中安全且有效地增殖。數個公開案已經描述了從宿主細胞中純化病毒，為了從宿主細胞溶胞產物中純化病毒，主要是使用特定的層析基質來濃縮(參見例如美國專利第6,008,036號)。如同在例如美國專利第6,048,537號中描述之使用連續蔗糖梯度離心的其他方法，其以較低的抗原純度遞送產物，並需要藉著離心進一步純化的步驟。這類方法亦受苦於抗原聚集，其可能導致病毒抗原的流失，或抑制病毒的失活步驟。
病毒聚集亦可能抑制層析製程的產量，其為時間和成本密集的，且不易應用在大規模生產上。因此，本發明的目標是提供純化病毒的方法，特別是從宿主細胞試樣中，該方法簡單但仍能夠以高純度提供完整病毒抗原部分，並
降低病毒抗原聚集。
本發明提供純化病毒或病毒抗原的方法，其包括提供病毒製劑，並在糖梯度中離心該病毒製劑，該糖梯度係藉著在水性緩衝溶液中，以相當於34%到50%(重量/重量%)之蔗糖濃度的第一層糖A和相當於50%到65%(重量/重量%)蔗糖之蔗糖濃度的第二層糖B建立，並帶有一個緩衝組份，為具有在6.0到9.4之間pKa值的緩衝組份，並從該離心物中收集該病毒或病毒抗原，即離心製程的產物。
本發明一方面提供純化病毒或病毒抗原的方法。該方法涉及提供含有糖梯度之溶液，該糖梯度係藉著離心至少一個第一個經緩衝之糖溶液和至少一個第二個經緩衝之糖溶液而建立。糖在第一個經緩衝之糖溶液中的濃度，具有相當於35%或50%(重量/重量%)的蔗糖，或在某些具體事實中，34%到46%(重量/重量%)。糖在第二個經緩衝之糖溶液中的濃度，具有相當於50%到65%(重量/重量%)的蔗糖，或在某些具體事實中，50%到60%(重量/重量%)。一旦建立起糖梯度，便將病毒製劑加至該糖梯度中。然後離心該病毒製劑和糖梯度，獲得高峰池，並萃取該高峰池，以獲得該病毒或病毒抗原。
在病毒或病毒抗原的純化期間，藉著離心濃縮該病毒或病毒抗原，允許從細胞培養基組份及/或宿主細胞和宿主細胞組份中分離。本發明之方法在純化的離心步驟處，可將病毒聚集和病毒流失減至最少。
在本發明之方法中，通常垂直地將第一個在生理緩衝溶液中的糖溶液裝入連續的超高速離心裝置內，形成水平的糖溶液層A，然後將在相同或不同生理緩衝溶液中的第二層較高濃度之糖溶液裝入該裝置內，形成水平的糖溶液層B。然後活化該裝置，產生糖梯度－其在該裝置外壁是最濃縮的，而在朝向該裝置中央處則較稀薄。然後將得自細胞培養物的含病毒之收穫溶液裝入該裝置中，且病毒顆粒移動至在該糖梯度中其等之密度相當於該梯度之密度的地方。當該糖為蔗糖時，在發生該平衡處的典型密度範圍為36%－48%(重量/重量%)蔗糖。一旦使該裝置停止，便將該梯度轉移成水平的位置，並從該裝置中取回含有病毒顆粒的梯度部分(或”高峰池”)。
本發明一方面意外地發現藉著使用兩－層溶液方法，與使用單一濃度在水中之蔗糖溶液形成蔗糖梯度的傳統方法相比較，可增加高峰池的體積。即使使用蔗糖且在該梯度中之最大蔗糖濃度與在傳統方法中所使用的相同，仍獲得該驚人的效果。藉著針對兩個蔗糖溶液層A和B的濃度和量最適化，可增加高峰池體積，例如兩倍。該經增加的高峰池體積藉著降低其等之個別濃度，降低了整體病毒顆粒
或抗原的聚集。
連續的超高速離心製程可用於純化病毒製劑。可使用高度濃縮的糖(例如蔗糖或山梨糖醇)或鹽(例如CsCl2
或NaBr)溶液，藉著超高速離心產生梯度。然而，沒有任何添加物的糖溶液具有低濃度的電解質，且沒有緩衝性能。因此，本發明一方面是察覺在糖溶液(如蔗糖溶液)中的病毒製劑，視病毒顆粒的濃度而定，有形成聚集體的強烈傾向，其可能在疫苗生產的進一步處理時引起問題。本發明之方法可使用添加生理學濃度的鹽(例如NaCl大約4－8克/公斤)和添加緩衝劑(例如Tris，大約10－20毫莫耳/公斤，接著調整pH值)的糖溶液(例如55重量/重量%的蔗糖溶液)，在梯度中達到生理學的電解質和pH條件，而有效地將該問題減至最少。在某些具體事實中，使用不同的糖濃度在超高速離心機中建立梯度。舉例來說，將200毫升55重量/重量%溶液和800毫升42重量/重量%溶液裝入超高速離心機內。少量的較高濃度之蔗糖溶液確保在超高速離心結束時，最大蔗糖濃度仍維持在45%以上，而較大量的42%蔗糖在典型地出現病毒最大高峰之大約40%的範圍內，產生較和緩的梯度。藉著本發明的這些方法，可增加高峰池體積，並因此稀釋病毒顆粒懸浮液，而導致較低的聚集。再者，藉著使用這類蔗糖調配物，修改分子或顆粒在裝入超高速離心機中之上清液和梯度之間的擴散。
舉例來說，發現使用在20毫莫耳/公斤Tris－緩衝溶液中之大約42%和55%(重量/重量%)蔗糖溶液形成的密度梯
度，對於流感病毒是特別有用的，但亦可輕易地改裝以適合其他的病毒。Tris(三羥甲基胺基甲烷)為適合pH值範圍在6.5到9.7之間的有用緩衝劑。雖然在本發明之具體事實的該特殊實例中使用蔗糖，但亦可使用適合梯度離心的其他糖類。此外，亦可使用其他的緩衝化合物，特別是有機緩衝化合物，如胺類。較佳的是該緩衝劑具有在6、6.2、6.4、6.6、6.8、7.2、7.4、7.6、7.8或8.0以上，並在9.4、9.2、9.0、8.8、8.6、8.4或8.2以下的pK值。適當的緩衝劑包括例如HEPES(4－(2－羥乙基)－1－六氫吡乙烷磺酸)、ACES(N－(2－乙醯胺基)－2－胺基乙烷磺酸)、雙－三－甲烷或－丙烷、CAPS(N－環己基－3－胺基丙烷磺酸)或CAPSO、PIPES(六氫吡－N,N’－雙(2－乙烷磺酸))、磷酸鹽緩衝劑或任何用在生化領域中的其他緩衝劑。該緩衝劑較佳的是在化學上對生物分子為惰性的。
離心製程可產生高峰池部分，病毒顆粒在電解質和pH條件相關的生理條件下分散於其中。可藉著加入不同量的高和低濃度糖溶液，修改完整病毒抗原在高峰池部分中的濃度，以界定梯度並因此界定高峰部分的體積。此外，亦藉著單獨加入鹽和適當的緩衝劑(例如經Tris緩衝的生理鹽水(TBS))增加高峰部分的體積，導致明顯較高的抗原和蛋白質產量。該影響可歸因於意外改良了蛋白質和病毒抗原在含有生理學濃度之鹽和生理學pH值的糖梯度內的流動性。不同的超高速離心條件(例如有或沒有前澄清器和不同重力)清楚地顯示可藉著蔗糖梯度的這些修改，達到明顯
的產量增加，並降低病毒顆粒的聚集。
較佳的是加入超過50mOsm/公斤、100mOsm/公斤150mOsm/公斤、200mOsm/公斤或250mOsm/公斤，並低於500mOsm/公斤、450mOsm/公斤、400mOsm/公斤或350mOsm/公斤的電解質，較佳的是大約300mOsm/公斤。應注意到計算電解質的量，使其等於沒有范托夫(van’t Hoffs)因子校正之水溶液的滲透壓。此外，不使用形成梯度之物質(例如蔗糖)的貢獻來計算。例如，如下計算來自電解質的滲透壓：8克NaCl/公斤/58.44克/莫耳＝136.9毫莫耳/公斤x2(離子/莫耳)＝273.8mOsm/公斤＋20mM/公斤TRISx2離子/莫耳＝40mOsm/公斤；總計(NaCl＋TRIS)313.8mOsm/公斤)。pH值可以是在生理學範圍內的，較佳的是在5.5到9.5之間，更佳的是在5.5到8.5之間，特佳的是在5.5、6、6.5或7以上，並在9.5、9.0、8.5、8或7.5以下，特別是在7.0到7.5之間或在7.0到7.4之間。
在特佳的具體事實中，用以產生密度梯度的糖是蔗糖。然而，本發明亦考慮使用其他的糖，包括糖醇類，其非限制性實例為山梨糖醇。而且，本發明亦考慮使用氫化糖、直線糖、經修飾之糖或任何其他的糖，只要該糖在水中具有的溶解度足以產生本文指定之密度的溶液即可。亦可使用糖(即二或多個糖)的組合，在相同或不同的層中，以產生本文描述之梯度，只要構成那些層的相對應糖溶液具有本文指定之密度即可。
在較佳的具體事實中，形成梯度之製劑的體積是在超高速離心轉鼓或對試樣施加離心力之裝置的有效體積的5%到100%之間，較佳的是5%、10%、15%、20%、25%、30%、32%、35%、40%、45%或50%以上，或100%、90%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、48%、45%、40%、35%、30%或25%以下。在其他的具體事實中，形成梯度之製劑的體積是在超高速離心轉鼓或對試樣施加離心力之裝置的有效體積的1%到75%之間。
在較佳的具體事實中，以連續或間斷重複之模式(即連續的超高速離心或分批超高速離心)，將含有形成梯度之材料裝入轉鼓中，其中裝載體積較佳的是比轉鼓之空隙體積(總體積減梯度體積)高，較佳的是1x、2x、3x、5x、10x、20x、30x、40x、50x、60x、80x以上，或300x、250x、200x、150x、120x、100x、80x以下。在某些特佳的具體事實中，使用連續的超高速離心。
在特佳的具體事實中，裝載體積為每600毫升到1000毫升空隙體積(1600毫升轉鼓體積減600毫升到1000毫升空隙體積)在20公升到50公升之間，其為大約20x到80x之比例。在另一具體事實中，裝載體積為每1200毫升到2000毫升空隙體積(3200毫升轉鼓體積減1200毫升到2000毫升空隙體積)在40公升到100公升之間，其為大約20x到80x之比例。
在離心期間，建立糖的連續梯度。在更進一步的具體事實中，收集在24%(相當於大約1.10公斤/公升)、26%、
28%、30%、32%、34%、36%、38%、40%、42%、44%或46%(重量/重量%)(相當於大約1.22公斤/公升)以上，且在66%(相當於大約1.32公斤/公升)、63%、60%、58%、56%、54%、52%、50%、48%、46%、44%或42%(重量/重量%)(相當於大約1.19公斤/公升)以下蔗糖濃度之離心物的部分。病毒產物通常堆積在該範圍內。較佳的是，在大約30%到54%(重量/重量%)之間的蔗糖濃度，更佳的是在36%到48%(重量/重量%)蔗糖之間，收集離心物的部分。從由其他糖類形成之梯度中收集到的部分，可能具有不同的濃度(重量/重量%)，但相等的密度。所收集之部分的密度，可以是在1.10公斤/公升、1.12公斤/公升、1.14公斤/公升、1.16公斤/公升或1.18公斤/公升、1.20公斤/公升、1.22公斤/公升以上，並在1.32公斤/公升、1.30公斤/公升、1.28公斤/公升、1.26公斤/公升、1.24公斤/公升、1.22公斤/公升或1.20公斤/公升以下。在特佳的具體事實中，該密度是在1.13到1.25公斤/公升之間，更佳的是在1.16到1.22公斤/公升之間。
在某些具體事實中，緩衝劑或緩衝組份(例如經TRIS緩衝之生理鹽水)的濃度是在2毫莫耳/公斤到50毫莫耳/公斤之間，較佳的是5毫莫耳/公斤到40毫莫耳/公斤、10毫莫耳/公斤到40毫莫耳/公斤，更佳的是在10毫莫耳/公斤到30毫莫耳/公斤之間，再更佳的是在18毫莫耳/公斤到25毫莫耳/公斤之間，而最佳的是20毫莫耳/公斤。該緩衝劑較佳的是水性的，具有低於5%的水－可混溶之有機
溶劑，更佳的是低於2%有機溶劑，而最佳的是不含有機溶劑。該緩衝劑具有2毫莫耳/公斤、5毫莫耳/公斤、10毫莫耳/公斤、12毫莫耳/公斤、14毫莫耳/公斤、15毫莫耳/公斤、17毫莫耳/公斤、18毫莫耳/公斤、19毫莫耳/公斥或20毫莫耳/公斤以上，或50毫莫耳/公斤、40毫莫耳/公斤、35毫莫耳/公斤、30毫莫耳/公斤、25毫莫耳/公斤、23毫莫耳/公斤或21毫莫耳/公斤以下的濃度。
較佳的是，以至少20,000g之離心力來進行離心，更佳的是30,000g、更佳的是50,000g、更佳的是70,000g，最佳的是90,000g，但在其他具體事實中，該離心力低於200,000g、低於150,000g、低於120,000g、低於100,000g或低於90,000g。
在特佳的具體事實中，最初A層對最初B層的體積比(即在施用病毒製劑之前)，是在20：1到1：1之間，較佳的是在10：1到1.5：1之間，更佳的是在8：1到2：1之間，再更佳的是6：1到3：1之間，而最佳的是4：1。該比例可低於20：1、15：1、10：1、8：1、5：1、4：1、3：1，或大於1：2、1：1、1.5：1、2：1、3：1或4：1。
在特佳的具體事實中，含糖的離心液是兩層的(即在加入病毒製劑之前，包括具有不同濃度的糖層A和B，在超高速離心機中的液體填料層之下)。當然在離心期間，可能形成新的濃度梯度或密度梯度。然而，本發明亦考慮到有兩層以上的離心液。例如，在某些非－限制性具體事實中，離心液包括3、4、5、6、7或甚至8層不同的層。每層均
可具有與其他層相同的緩衝劑，或分別替每層選擇緩衝劑。
在特佳的具體事實中，製備方法不包括前澄清步驟。然而，若需要，可在超高速離心裝置的前澄清室中進行前澄清。
在更進一步的具體事實中，層A包括在40%到44%(重量/重量%)之間的蔗糖，較佳的是從41%到43%(重量/重量%)的蔗糖。蔗糖濃度可以是在35%(相當於大約1.15公斤/公升)、36%、37%、38%、39%、40%、41%或42%(重量/重量%)(相當於大約1.19公斤/公升)以上，或在50%(相當於大約1.23公斤/公升)、49%、48%、47%、46%、45%、44%、43%或42%(重量/重量%)(相當於大約1.19公斤/公升)以下。由其他糖形成的層A，可能基於重量/重量而具有不同的濃度，但仍有落在本文指定之密度範圍內的密度。
在某些具體事實中，層B包括具有濃度在50%到65%(重量/重量%)之間的蔗糖溶液，較佳的是在52%到58%(重量/重量%)之間，而更佳的是在54%到56%(重量/重量%)之間。蔗糖濃度(重量/重量%)可以是在50%(相當於大約1.23公斤/公升)、51%、52%、53%、54%或55%(相當於大約1.26公斤/公升)以上，或在66%(相當於大約1.32公斤/公升)、64%、62%、61%、60%、59%、58%、57%、56%或55%(相當於大約1.26公斤/公升)以下。由其他糖類形成的層B，可能基於重量/重量而具有不同的濃度。但仍有落在本文指定之密度範圍內的密度。
在本發明較佳的具體事實中，該病毒為正黏液病毒(Orthomyxovirus)，特別是流感病毒，較佳的是選自A型和B型流感。本發明考慮到其他病毒的非限制性實例，包括選自RNA病毒科，如呼腸孤病毒科(Reoviridae)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、杯狀病毒科(Caliciviridae)、披蓋病毒科(Togaviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、逆轉錄病毒科(Retroviridae)、黃病毒科(Flaviviridae)、正黏液病毒科、副黏液病毒科(Paramyxoviridae)、布尼亞病毒科(Bunyaviridae)、桿狀病毒科(Rhabdoviridae)、絲狀病毒科(Filoviridae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、星狀病毒科(Astroviridae)或玻那病毒科(Bornaviridae)，以及DNA病毒科，如腺病毒科(Adenoviridae)、乳頭狀多瘤空泡化病毒科(Papovaviridae)、細小病毒科(Parvoviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、肝病毒科(Hepadnaviridae)之群組的病毒。在某些較佳的具體事實中，該病毒係選自由流感A/巴拿馬/2007/99、A/新喀里多尼亞(New Caledonia)/20/99和B/山東(Shangdong)/7/97所組成之群組。
在本發明一些較佳的具體事實中，從以該病毒接種的細胞來製備病毒收穫物。可在任何適用於生產病毒的細胞中生產該病毒。較佳的是，該細胞是屬於動物細胞培養物或細胞株。這類細胞可得自特定的組織或胚胎細胞，如胚胎卵。較佳的是，該動物為哺乳動物或鳥類。在本發明的各種具體事實中，該細胞為鳥類、犬科、囓齒動物或靈長
類細胞。在特定的具體事實中，該細胞為上皮細胞，特佳的是腎臟上皮細胞，如非洲綠猴的Vero細胞。
施用在超高速離心裝置上的病毒收穫物可以是整個細胞培養物，或在從細胞培養物中分離細胞及/或其一部分之後所獲得的細胞培養物上清液。在本發明的某些具體事實中，在抽出細胞培養物上清液之前，允許在細胞培養物中的細胞沉降在培養容器中。在本發明其他的具體事實中，可藉著化學或機械方法溶解細胞，該方法之非限制性實例包括低或高張溶解、去垢劑處理、超聲波震盪和機械破裂。
較佳的是，在離心之前或之後，該病毒為失活或破碎的(例如，如同在WO 05/11800中描述的)。此外，可藉著在技術領域中已知的方法製備該病毒的疫苗。疫苗為抗原性物質的免疫原組合物，即可用來免疫動物(例如哺乳動物，如人類或鳥類)的(非－傳染性)病毒、其被覆物、顆粒或其抗原。
藉著下列的實施例進一步解釋本發明，無意對其加以限制。
在純化流感病毒抗原的期間，藉著超高速離心濃縮單價收穫物(MVH)。為了製造在Vero細胞培養物上生長的病毒疫苗，基於使用50%(重量/重量%)在水中之蔗糖溶液形成的蔗糖梯度，可使用連續流離心程序。使用裝有前澄清器的離心轉鼓模式。許多發酵最適化方法，像藉著補充大
豆水解產物來改變Vero細胞培養基，或在流感病毒複製的早期升高溫度條件，結果產生更穩健的製程，並增加抗原產量。因此，結果竟然是50%(重量/重量%)蔗糖/水梯度不允許達成想要的回收，歸因於在抗原結合能力上的限制。此外，病毒品系新喀里多尼亞、巴拿馬和山東的PMVHs(經純化之MVH)在其特定的生產步驟中，顯示出意外的抗原聚集。進行數個嘗試以將在離心步驟中的病毒聚集和病毒流失減至最少。使用經TRIS緩衝之生理鹽水來代替水，以溶解梯度材料的蔗糖。而且，導入使用兩種形成梯度之溶液(具有不同密度)的修改，以增加高峰池體積。此外，沒有前澄清器但增加g－力的超高速離心，結果竟然成為產量改良的有價值工具。欲證實該概念，評估來自先前利用標準條件(50%在水中之蔗糖，有前澄清器，以20,000rpm＝90,000g)和新條件(42%和55%蔗糖(重量/重量%)、20毫莫耳/公斤TRIS，8克/公斤NaCl，無前澄清器，以35,000rpm＝90,000g，從48%－36%蔗糖部分收穫PMVH)之純化的結果。
使用具有C40CTS轉鼓(轉鼓體積1,600毫升)的連續流超高速離心機CC40S，或具有相等轉鼓的Alfa Wassermann超高速離心機RK6。將蔗糖梯度溶液裝入轉鼓中，然後加速至20,000到35,000rpm的旋轉速度。在連續裝入經失活的收穫物之後，以緩衝溶液沖刷轉鼓，以移除沒有進入梯
度的殘餘蛋白質。在沖刷之後，使轉鼓減速，並停止超高速離心，允許梯度從轉鼓的放射方向轉變為軸向。根據蔗糖濃度進行沖提和分級分離。使用科里奧利(Coriolis)型密度檢測設備和UV254奈米檢測設備，監視蔗糖和蛋白質濃度。
藉著ELISA，根據定量來自超高速離心實驗之產量和純度的標準化程序，針對總蛋白質濃度、HA－SRD和Vero抗原，測量經純化失活之收穫物的試樣。
利用A/巴拿馬/2007/99單價病毒收穫物進行一些小規模的純化行程，指出使用由50重量/重量%蔗糖與50重量/重量%經Tris緩衝之生理鹽水(20毫莫耳/公斤TRIS、8克/公斤NaCl)之混合物產生的蔗糖梯度(終濃度10毫莫耳/公斤TRIS、4克/公斤NaCl)有數個勝過標準蔗糖/水系統的優點。使用實驗室的超高速離心機RK－6型，在不同的條件下純化25公升和50公升的MVH等分。在表1中提供參數計畫的總論，和利用蔗糖/水和蔗糖/TBS系統之純化行程的結果。
從表1中，可推論在TBS中的蔗糖梯度具有數個勝過在蔗糖/水系統中之標準梯度的優點。關於純化行程1，可獲得1.2毫克抗原/公升收穫物的產量，抗原部分(PMVH)顯示意外的病毒聚集。利用在TBS中之蔗糖的純化實驗(行程2)，與參考行程1相比較，得到增加的抗原產量。關於TBS製劑，可觀察到在聚集體部分的顯著減少。雖然TBS蔗糖梯度具有數個勝過標準系統(蔗糖/水)的優點，但在梯度的較高裝載時(比較50公升和25公升)觀察到抗原產量的流失。
在使用TBS代替水的兩種情況下，增加了高峰池體積，其代表在所裝載之收穫物與含有緩衝物質和其他電解質之梯度之間的更多擴散。
本實施例顯示其中修改蔗糖梯度以增加高峰池部分之體積，但不改變分級分離之限制的代表性具體事實。使用
具有降低濃度42%(重量/重量%)的蔗糖梯度，其結果為從超高速離心機中沖提出較不急劇升降的蔗糖梯度。為了確保在梯度中有足夠高的蔗糖濃度，裝入較濃縮的50%(重量/重量%)蔗糖/TBS溶液，接著裝入42%(重量/重量%)溶液，其作為較高濃度的溶液，形成”緩衝墊”(cushion)，以防止抗原沉降在轉鼓的壁上。表2顯示使用900毫升較稀薄之蔗糖/TBS溶液(42重量/重量%蔗糖、11.7毫莫耳/公斤TRIS、4.7克/公斤NaCl)和100毫升較濃縮之蔗糖/TBS溶液(50重量/重量%、10毫莫耳/公斤TRIS、4克/公斤NaCl)的二－步驟梯度的純化行程，與使用僅以50%蔗糖/TBS溶液形成之梯度的純化行程相比較，施用不同的體積(即600、800和1000毫升)。利用前澄清器，以25,000rpm(RCF大約30,000g)進行測試。
藉著施用不同量和濃度的蔗糖/TBS溶液，對材料的產量和純度沒有顯著的影響。然而，使用藉著42%/50%(重量/重量%)蔗糖/TBS之混合物建立的二－步驟梯度，結果使高峰池的體積顯著增加，其藉著降低抗原濃度以避免高峰池部分的過度裝載，而導致較佳的純化條件。
調查較高相對離心力的超高速離心，以增加抗原產量，然而在這類條件下必須預期材料在前澄清器中的流失。可在有或無前澄清器下，運轉超高速離心轉鼓，因此進行利用前澄清器之20,000rpm(大約30,000g)，和在二步驟蔗糖/TBS梯度(100毫升50重量/重量%蔗糖，終濃度10毫莫耳/公斤TRIS，4克/公斤NaCl和900毫升39重量/重量%蔗糖，終濃度12.2毫莫耳/公斤TRIS，4.9克/公斤NaCl)中之35,000rpm(大約90,000g)的比較。為了評估抗原的潛在流失，以緩衝劑擦拭前澄清器和轉鼓壁，並分析抗原流失。在表3中出示該實驗之結果。抗原產量可從1.7毫克HA－SRD/公升收穫物到2.8毫克HA－SRD/公升收穫物，增加超60%。可從前澄清器擦拭到失去抗原的主要部分，然
而僅有大約5%抗原流失在超高速離心機的轉鼓壁上。藉著在將收穫物裝入蔗糖/TBS梯度之前，省略前澄清作用，僅稍微降低SRD/蛋白質比例。
藉著混合50%(重量/重量)蔗糖與50%(重量/重量)TBS緩衝溶液(20毫莫耳/公斤TRIS、8克/公斤NaCl)來製備50重量/重量%蔗糖/TBS梯度，結果產生10毫莫耳/公斤TRIS和4克/公斤NaCl之終濃度，進行初步調配。隨後，以較高量的TBS製備較稀薄的調配物42%－39%蔗糖/TBS溶液，結果產生較低濃度的蔗糖，但相對較高濃度的TRIS和NaCl(參見先前實施例)。因此，較濃縮的溶液，像例如在TBS中的55%(重量/重量%)蔗糖具有較低濃度的TRIS和NaCl。
為了在這類製劑中，將TRIS和NaCl的濃度標準化，
設計新的調配物，其中將42－55重量/重量%的蔗糖加至混合容器中，加入20毫莫耳/公斤(2.42克/公斤)TRIS和8克/公斤NaCl，並以水填滿至100重量/重量%。然後，與在先前實施例中使用之調配物相比較，這類製劑具有明顯較高(大約2x)的TRIS和NaCl濃度。這類調配物的折射測量結果也產生高大約2O
(1－3O
)白利(Brix)的折射結果，歸因於較少量的水，其在填滿至100%終重量/重量之前，藉著加入TRIS和NaCl來代替。
在實驗中，比較兩個不同版本的二－步驟蔗糖/TBS梯度。藉著加入200毫升高度濃縮的蔗糖/TBS溶液建立梯度，在裝入800毫升42%蔗糖/TBS之後，在梯度中產生較濃稠、高密度的蔗糖墊。
在表4中出示在超高速離心實驗中，不同蔗糖/TBS製劑的結果。當使用不同的TRIS和NaCl濃度時，對於產量或純度沒有觀察到顯著差異。
調查三種不同品系的不同收穫物體積，以評估最適合超高速離心程序的容量，並調查在製造時可能的遞增結果，此時必須對超高速離心程序施用較高的收穫物體積。以15－17公升和45－51公升，將經失活之收穫物裝入1600毫升的轉鼓中。
在本實驗中，使用與在先前之實施例5中相同的二－步驟蔗糖/TBS梯度之經修改版本。首先將較高密度溶液之濃度增加至55重量/重量%，並使用200毫升的較高體積，在裝入800毫升42%蔗糖/TBS之後，在梯度中產生較濃稠高密度的蔗糖墊。在兩種蔗糖/TBS溶液中，使在梯度中之終TRIS濃度增加至20毫莫耳/公斤，並使終NaCl濃度增
加至8克/公斤。超高速離心條件為35,000rpm(90,000g)無前澄清器，並在48%到36%蔗糖之間進行分級分離。
在表5中出示裝載容量實驗的結果。
利用本發明之梯度和較高的離心力，沒有前澄清器，在不同的收穫物裝載體積方面，僅可觀察到大約3%到6%的最小產量差異。這與在實施例2/表1中證實的限制裝載容量相反，其中對於品系A/巴拿馬/2007/99，將收穫物體積從25公升增加到50公升，結果降低產量大約30%。可藉著增加相對離心力和起因於二－步驟蔗糖/TBS梯度而改良梯度型態和高峰池體積的組合，來解釋該經改良之產量。
混合使用：a)90,000g(35,000rpm)，無前澄清器(代替有前澄清器的30,000g(20,000rpm))
b)在具有20毫莫耳/公斤TRIS和8克/公斤NaCl之終濃度的TBS中之蔗糖梯度(代替在水中之蔗糖)
c)利用兩種不同的蔗糖濃度形成這類梯度(200毫升55%＋800毫升42%)，以增加高峰池部分體積(代替800毫升50%蔗糖)
與先前傳統的超高速離心程序作比較(表6)。
以2002/2003品系(即A/新喀里多尼亞/20/99、A/巴拿馬/2007/99和B/山東/7/97)進行三個比較實驗。以48%到36%(重量/重量%)蔗糖界定這些行程的高峰池分級分離限制。在實施例8到實施例10中出示結果。
以產量和產物品質參數為基礎，比較在標準(50%蔗糖/
水)和經修改條件(蔗糖/TBS梯度)下，得自利用流感新喀里多尼亞、巴拿馬和山東進行純化的結果。
利用根據標準程序和根據表6之新的蔗糖/TBS梯度參數的條件，以新喀里多尼亞MVH進行純化實驗。在表7中提供得自純化行程之結果的比較。
從在表7中的數據，可推論對流感品系A/新喀里多尼亞/20/99，利用新的蔗糖/TBS梯度純化條件，獲得明顯的製程改良。對於該特殊品系，證實病毒產量有每公升MVH從2.7到3.4毫克抗原的明顯增加。以HA/總蛋白質比例和Vero－蛋白質/HA比例測量的病毒抗原品質，顯示該每公升劑量上的增加，不會危害抗原品質。隨著使用新的蔗糖梯度條件，獲得從0.41到0.60之HA/總蛋白質上的稍微增加。至於宿主細胞蛋白質/HA比例，沒有可檢測到的顯著差異。在PMVH生產的蔗糖/TBS梯度條件下，稍微
降低了品系A/新喀里多尼亞的聚集。可藉著顯微鏡觀察(參見例如圖1A和圖1B)證實該影響。在400x放大率下，在使用先前的蔗糖/水梯度版本時，清楚地看見較強的聚集體形成(圖1A)，然而不管增加的產量，衍生自經最適化之超高速離心程序的高峰池部分，似乎是明顯較均勻的(圖1B)。
利用根據標準程序和根據表6之新的蔗糖/TBS梯度參數的條件，以巴拿馬MVH進行純化實驗。在表8中提供得自純化行程之結果的比較。
從在表8中的數據，可推論對流感品系巴拿馬，利用新的蔗糖/TBS梯度純化條件，獲得明顯的製程改良。對於該特殊品系，藉著使用新的蔗糖/TBS梯度條件，證實病毒產量有每公升MVH從2.0到5.5毫克抗原的明顯增加。獲得0.77的HA/總蛋白質比例，然而在標準條件下產生的
PMVH，其計算比例為1.47。因為在利用兩種程序產生之PMVHs的Vero－蛋白質/HA比例中沒有看到顯著差異的事實，故假定巴拿馬抗原的聚集(如在巴拿馬PMVHs之顯微照片比較時所見(未顯示))可能是1.47之罕見HA/總蛋白質比例的原因。對兩種純化程序而言，以HA/總蛋白質比例和Vero－蛋白質/HA比例測量的病毒抗原品質是可接受的。但在PMVH生產的TBS蔗糖梯度條件下，可使用蔗糖/TBS梯度顯著地降低品系巴拿馬的聚集。
利用根據標準程序和根據表6之新的蔗糖/TBS梯度參數的條件，以山東MVH進行純化實驗。在表9中提供得自純化行程之結果的比較。
從在表9中的數據，可推論對流感品系B/山東/7/97，利用本發明之蔗糖/TBS梯度純化條件，獲得明顯的製程改良。對於該特殊品系，證實病毒產量有每公升MVH從2.2
到5.1毫克抗原的明顯增加。關於蔗糖/TBS純化之MVH，有0.34之降低的HA/總蛋白質比例，仍落在流感PMVHs的說明範圍內。B/山東/7/97病毒複製階段的進一步改良，允許藉著改變胰蛋白酶劑量型態，建立更一致的生產製程。在PMVH生產的TBS蔗糖梯度條件下，藉著以標準對TBS－條件純化之山東PMVHs的顯微照片(未顯示)，證實明顯地降低了B/山東/7/97品系的聚集。
在本文提供之代表性的大和小規模實驗中，證實本發明之蔗糖梯度允許有效地裝載單價收穫物。使用在本文中描述的本發明方法有許多優點，包括1)增加病毒產量至少25%，2)從0.34到0.77的品系依賴性之HA/總蛋白質比例，3)從2%到7%的品系依賴性之宿主細胞蛋白質含量，以及4)在蔗糖高峰池(PMVH)中使病毒聚集減至最少。
圖1：利用傳統(圖1a)和本發明之(圖1b)超高速離心程序純化之PMVHs的顯微照片。
Claims (32)
- 一種純化失活的完整病毒的方法，其包括藉著在包含超高速離心轉鼓的連續超高速離心機中離心至少(i)一個包含第一生理緩衝溶液的第一種經緩衝之糖溶液和(ii)至少一個密度高於第一種經緩衝之糖溶液的第二種經緩衝之糖溶液，且其包含第二生理緩衝溶液，其與該第一生理緩衝溶液是相同或不同的；以提供含有糖梯度之形成梯度的溶液，其中在該第一種經緩衝之糖溶液中的糖濃度具有相當於在35%到50%(重量/重量%)之間的蔗糖，而在該第二種經緩衝之糖溶液中的糖濃度具有相當於在50%到65%(重量/重量%)之間的蔗糖，且該第一種經緩衝之糖溶液與第二種經緩衝之糖溶液之體積比大於或等於3：1；將失活的完整病毒製劑加至該糖梯度中，離心失活的完整病毒製劑和糖梯度，以獲得高峰池，並萃取該高峰池，而獲得該失活的完整病毒。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該形成梯度之溶液的體積是在該超高速離心轉鼓之體積的5%到100%之間。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該高峰池具有在1.13公斤/公升到1.25公斤/公升之間的密度。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中利用相當於在 30%到54%(重量/重量%)蔗糖之間的蔗糖收集該高峰池。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該緩衝溶液中至少有一個具有在5mM到50mM之間的濃度。
- 如申請專利範圍第5項之方法，其中該至少一個緩衝溶液具有在15mM到30mM之間的濃度。
- 如申請專利範圍第6項之方法，其中該至少一個緩衝溶液具有在18mM到25mM之間的濃度。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中離心該病毒製劑的步驟是利用至少20,000g之相對離心來執行。
- 如申請專利範圍第8項之方法，其中該相對離心力為至少30,000g。
- 如申請專利範圍第9項之方法，其中該相對離心力為至少90,000g。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該第一種經緩衝之糖溶液對該至少一個第二種經緩衝之糖溶液的體積比小於20：1。
- 如申請專利範圍第11項之方法，其中該體積比小於10：1。
- 如申請專利範圍第12項之方法，其中該體積比小於8：1。
- 如申請專利範圍第13項之方法，其中該體積比是在6：1到3：1之間。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該含有糖梯度之溶液包括兩層。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該失活的完整病毒製劑不包括前澄清器。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該至少一個第一種經緩衝之糖溶液包括在相當於從40%到44%(重量/重量%)蔗糖之濃度範圍內的糖。
- 如申請專利範圍第17項之方法，其中該至少一個第一種經緩衝之糖溶液包括在相當於41%到43%(重量/重量%)蔗糖之濃度範圍內的糖。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該至少一個第二種經緩衝之糖溶液包括在相當於52%到58%(重量/重量%)蔗糖之濃度範圍內的糖。
- 如申請專利範圍第19項之方法，其中該至少一個第二種經緩衝之糖溶液包括相當於從54%到56%蔗糖的糖。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該失活的完整病毒為正黏液病毒。
- 如申請專利範圍第21項之方法，其中該失活的完整病毒為流感病毒。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該生理緩衝溶液中至少一者為胺緩衝溶液。
- 如申請專利範圍第23項之方法，其中該生理緩衝溶液中至少一者為TRIS緩衝溶液。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該生理緩衝溶液為經TRIS緩衝之生理鹽水。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該形成梯度的 溶液之體積小於該超高速離心轉鼓體積的100%。
- 如申請專利範圍第26項之方法，其中該形成梯度的溶液之體積小於該超高速離心轉鼓體積的90%。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該形成梯度的溶液之體積大於或等於該超高速離心轉鼓體積的50%。
- 如申請專利範圍第28項之方法，其中該形成梯度的溶液之體積小於該超高速離心轉鼓體積的90%。
- 一種純化失活的完整病毒之方法，其包括藉著在包含超高速離心轉鼓的連續超高速離心機中離心(i)至少一個密度為1.15公斤/公升到1.23公斤/公升之第一種經緩衝之糖溶液和(ii)至少一個密度為1.23公斤/公升到1.32公斤/公升之第二種經緩衝之糖溶液且其密度高於第一種經緩衝之糖溶液之密度，以提供含有糖梯度之形成梯度的溶液，其中該第一種經緩衝之糖溶液與該第二種經緩衝之糖溶液之體積比大於或等於3：1；將失活的完整病毒製劑加至該糖梯度中，離心該失活的完整病毒製劑和糖梯度，以獲得高峰池，並萃取該高峰池而獲得該失活的完整病毒。
- 如申請專利範圍第30項之方法，其中該形成梯度的溶液之體積小於該超高速離心轉鼓體積的100%。
- 如申請專利範圍第30項之方法，其中該形成梯度的溶液之體積大於或等於該超高速離心轉鼓體積的50%。
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