BE1023903B1 - Nouveau procédé - Google Patents

Abstract

Procédé de purification d'un virus comprenant au moins les étapes suivantes : a) l'obtention d'un fluide contenant un virus, b) la fourniture d'un gradient de densité linéaire préformé d'une plage donnée X%-Y% (en masse/volume) (X étant la limite inférieure et Y étant la limite supérieure) dans un rotor centrifuge ayant une capacité d'au moins 4L, au moins 6L, au moins 8L, ou au moins 10L, c) l'addition du fluide au gradient de densité linéaire préformé, d) la centrifugation de façon à séparer le virus des impuretés contaminantes, et e) la collection des fractions comprenant le virus purifié, dans lequel la partie linéaire du gradient comprend le pourcentage de densité correspondant au pourcentage auquel le virus à purifier migrera.

Description

NOUVEAU PROCÉDÉ

DÉCLARATION CONCERNANT LA RECHERCHE SPONSORISÉE AU NIVEAU FÉDÉRAL

La présente invention a été réalisée avec le soutien du gouvernement des États-Unis sous le numéro de Contrat # HHS0100200600011C accordé par le Département de la Santé et des Services Humains ; le Gouvernement des États-Unis dispose de certains droits sur la présente invention.

DOMAINE TECHNIQUE

La présente invention concerne le domaine de la purification de virus.

ARRIÈRE-PLAN

Le développement de technologies à base de culture cellulaire en alternative aux systèmes de production à base d’œufs traditionnelles pour la fabrication de vaccins antiviraux semble la solution la plus rapide et la plus prometteuse pour surmonter les inconvénients et contraintes associées aux systèmes traditionnels à base d’œufs. Des productions commerciales de vaccins viraux nécessitent de grandes quantités de virus comme source d’antigène. Toutefois, le processus à base d’œufs est vulnérable du fait de la qualité biologique variable des œufs et il manque de flexibilité à cause de problèmes logistiques dus à la non-disponibilité de grandes quantités d’œufs adaptés.

Toutefois, après la production, qu’il soit produit sur des œufs ou sur une culture cellulaire, le virus produit doit être récupéré de la culture cellulaire et, lorsque c’est approprié, il doit être purifié. Des procédés de purification de virus sont connus dans la technique. Un procédé typique emploie une centrifugation en gradient de saccharose. Par exemple, WO 2009/007608, WO 2008/135229 et WO 2010/089339 décrivent la purification de virus par des centrifugations en gradient de saccharose utilisant un gradient auto-générateur.

Une production efficace de vaccin nécessite le développement de quantités à grande échelle de virus produit avec des rendements élevés à partir d’un système hôte. Les conditions de culture dans lesquelles un virus est développé sont extrêmement significatives relativement à l’obtention d’un rendement élevé acceptable du virus. Donc, afin d’optimiser le rendement du virus souhaité, le système et les conditions de culture doivent être adaptés spécifiquement pour fournir un environnement qui soit avantageux pour la production du virus souhaité, adapté pour une production sur grande échelle. Une façon consiste à améliorer la productivité spécifique de la cellule, par exemple, en améliorant le milieu de culture ou en augmentant la densité cellulaire et/ou en réduisant la perte de matériel du virus qui survient au fur et à mesure des différentes étapes de purification. Un niveau supplémentaire de complexité est introduit au niveau de la fabrication, lorsque des volumes ou quantités à grande échelle doivent être traités. Lors de l’accroissement d’échelle, le risque de perdre davantage en qualité de produit (par exemple pureté du produit) et/ou dans le rendement du produit est significatif. Une telle occurrence nécessite une optimisation supplémentaire d’un processus développé de manière satisfaisante sur une petite échelle. Par conséquent, il reste nécessaire de fournir des procédés de production et de purification de virus ayant un niveau de pureté adéquat et un bon rendement sur grande échelle.

RÉSUMÉ DE L’INVENTION

Dans un premier aspect de la présente invention, il est proposé un procédé pour purifier un virus comprenant au moins les étapes suivantes : a) l’obtention d’un fluide contenant un virus, b) la fourniture d’un gradient de densité linéaire préformé d’une plage donnée X%-Y% (v/w) (X étant la limite inférieure et Y étant la limite supérieure) dans un rotor centrifuge ayant une capacité d’au moins 4L, au moins 6L, au moins 8L, ou au moins 10L, c) l’addition du fluide au gradient de densité linéaire préformé, d) la centrifugation de façon à séparer le virus des impuretés contaminantes, et e) la collecte des fractions comprenant le virus purifié, dans lequel la partie linéaire du gradient comprend le pourcentage en densité correspondant au pourcentage auquel le virus purifié migrera.

Dans un second aspect de la présente invention, il est proposéun procédé pour la préparation d’un vaccin comprenant au moins l’étape consistant à purifier le virus à utiliser comme antigène dans le vaccin selon le procédé de l’invention et en formulant ledit virus purifié dans un vaccin.

Dans un troisième aspect de la présente invention, il est proposé un procédé pour préparer un vaccin comprenant au moins les étapes suivantes : A) l’obtention d’un fluide contenant un virus, B) la fourniture d’un gradient de densité linéaire préformé d’une plage donnée X%-Y% (v/w) (X étant la limite inférieure et Y étant la limite supérieure) dans un rotor centrifuge ayant une capacité d’au moins 4L, au moins 6L, au moins 8L, ou au moins 10L, dans lequel la partie linéaire du gradient comprend le pourcentage en densité correspondant au pourcentage auquel le virus purifié migrera, C) l’addition du fluide au gradient de densité linéaire préformé, D) la centrifugation de façon à séparer le virus des impuretés contaminantes, et E) la collecte des fractions comprenant le virus purifié, F) la formulation du virus purifié dans un vaccin.

DESCRIPTION DES DESSINS

Figure 1 : Forme d’un gradient de saccharose auto-générateur obtenu dans un rotor de 3,2L. Des fractions successives de 100 ml du gradient formé ont été collectées et analysées pour leur teneur en saccharose par réfractométrie.

Figure 2 : Forme du gradient de saccharose auto-générateur obtenu dans un rotor de 8L. Des fractions successives de 250 ml du gradient formé ont été collectées et analysées pour leur teneur en saccharose par réfractométrie.

Figure 3 : Forme d’un gradient de saccharose préformé obtenu dans un rotor de 8L. La Figure 3A montre un diagramme représentant la méthode de formation du gradient linéaire préformé - 3 récipients comprenant 4L de saccharose à 55% (Récipient 1) et 1L de PBS/Citrate (Récipients 2 et 3) sont successivement reliés les uns aux autres, le troisième récipient étant relié à un rotor de 8L. La Fig ure 3B montre la forme du saccharose préformé obtenu en suivant le procédé indiqué sur la Figure 3A. Des fractions successives de 250 ml du gradient formé ont été collectées et analysées pour leur teneur en saccharose par réfractométrie.

Figure 4 : Forme d’un gradient de saccharose préformé obtenu dans un rotor de 8L. La Figure 4A montre un diagramme représentant le procédé de formation du gradient linéaire préformé - 2 récipients comprenant 4L de saccharose à 55% (Récipient 1) et 1L de PBS/Citrate (Récipient 2) sont successivement reliés les uns aux autres, le second étant relié à un rotor de 8L. La Figure 3B montre la forme du saccharose préformé obtenu en suivant le procédé indiqué sur la Figure 3A. Des fractions successives de 250 ml du gradient formé ont été collectées et analysées pour leur teneur en saccharose par réfractométrie.

DESCRIPTION DÉTAILLÉE

La présente invention concerne un procédé amélioré pour purifier des virus, qu’ils soient produits dans des œufs ou dans des cultures cellulaires, ce qui est particulièrement utile pour une production sur grande échelle. Une étape typique utilisée pendant la purification de virus est une étape d’ultracentrifugation en gradient de densité, comme un gradient de saccharose par exemple. L’ultracentrifugation en gradient de densité est une technique communément utilisée pour purifier les virus, en particulier les virus enveloppés. Elle est particulièrement utilisée dans le domaine de la fabrication des vaccins. Généralement, la séparation de particules, tels qu’un virus et les impuretés contaminantes possibles, par ultracentrifugation en gradient de densité peut être effectuée par zone, à savoir qu’elle s’appuie sur les différences de taille de particules, ou elle peut être isopycnique, à savoir qu’elle s’appuie sur les différences de densité de particules, ou elle peut s’appuyer sur une combinaison des deux. Pour atteindre une séparation par zone, la densité des particules à séparer doit être supérieure à la densité du gradient dans n’importe quelle position du gradient. Dans les méthodes isopycniques, le gradient de densité comprend l’ensemble de la plage de densités des particules à séparer. En fonction de leur densité et de la plage de gradient de densité, après centrifugation, les particules migrent vers une position dans le gradient où la densité est égale à la densité de particules (les particules flottent dans cette position et y restent), ou les particules sont mises en pastilles dans le fond du gradient. Après centrifugation, seules les fractions de gradient contenant le virus seront collectées. Le gradient linéaire préformé de l’invention peut être convenablement utilisé pour une séparation par zone ou pour une séparation isopycnique. Dans un mode de réalisation, la séparation du virus des impuretés contaminantes dans le procédé de purification d’un virus selon l’invention est isopycnique. Généralement, un gradient de densité peut être linéaire ou discontinu. Un gradient linéaire offre en particulier les avantages de permettre une meilleure séparation entre les particules virales et les impuretés contaminantes résiduelles provenant de l’hôte utilisé pour produire les particules virales et l’obtention d’un virus purifié qui est concentré dans un petit volume. Lors de l’augmentation d’échelle du procédé de production d’un virus, et en particulier, lorsque l’on envisage l’utilisation d’un rotor ayant une capacité élevée afin d’enregistrer un nombre de centrifugeuses requis pour traiter de grands volumes, les inventeurs ont observé que le procédé connu qu’ils utilisaient pour de petits rotors, constitués de la création d’un gradient auto-générateur à partir d’une solution mère simple ne fournissait pas de gradient linéaire. Afin d’obtenir un gradient linéaire dans des rotors ayant une capacité élevée, les inventeurs ont observé que le gradient devait être préformé comme linéaire, à savoir formé avant de débuter la centrifugation.

Par « préformé », on entend, dans le cadre de la présente invention, que le gradient est créé, et donc formé dans le rotor, avant de débuter la centrifugation, par opposition à un gradient autogénérateur.

Par « auto-générateur », on entend dans le cadre de la présente invention que le gradient est créé, et donc formé, pendant la centrifugation.

Par « linéaire », on entend dans le cadre de la présente invention, un gradient de densité dans lequel un tracé de concentration contre volume du gradient donne une ligne sensiblement droite, par opposition à un gradient « discontinu » ou par étape, qui est composé de couches, avec des changements soudains de concentration d’une couche à l’autre.

Par « plateau », on entend dans le cadre de la présente invention une zone à gradient significatif, à savoir une part significative du volume de gradient, sur laquelle la valeur de concentration, ou pourcentage, reste approximativement constante. Par exemple, un plateau peut présenter 5%, 10%, 15%, ou 20%, ou plus du volume de gradient total. Les plateaux peuvent être présents, en particulier, aux extrémités du gradient.

Par « une valeur approximativement constante », on entend, dans le cadre de la présente invention, relativement à une valeur donnée, des valeurs présentant une variation de 5% ou moins.

Pour plus de clarté et de simplicité, le gradient linéaire préformé mis en application dans le procédé de l’invention sera décrit ci-dessous relativement à un gradient de sucre. Toutefois, un tel gradient linéaire préformé n’est pas limité à des gradients de sucre. Toute la divulgation détaillée ci-après est applicable à d’autres types de gradients.

Les inventeurs ont observé qu’en cas de chargement sur le rotor d’un total de 4 et jusqu’à 7 couches différentes de sucre avec une densité accrue, ils pouvaient obtenir un gradient avec une linéarité acceptable après centrifugation. En variante, afin d’éviter de changer manuellement le flacon de sucre pour chaque nouvelle couche de sucre à charger, les inventeurs ont développé un procédé automatique de formation d’un gradient linéaire préformé à grande échelle basé sur une dilution progressive.

Par « dilution », on entend qu’une solution mère formant un gradient à un pourcentage approprié (en masse/volume) est diluée dans une solution de dilution unique, ou dans des solutions de dilution successives, avant d’être injectée dans le rotor. Comme décrit plus en détails ci-dessous, l’ampleur de la dilution, le pourcentage de la solution mère, le volume de la solution mère, et le volume de la (des) solutions) de dilution peuvent varier en fonction, par exemple, de la plage ciblée et/ou de l’inclinaison ciblée du gradient linéaire à préformer.

Par « dilution progressive », on entend un système de goutte-à-goutte dans lequel chaque goutte d’une solution concentrée est diluée dans une solution de dilution. Par exemple, la solution concentrée peut être la solution mère, ou la solution mère diluée à diluer ultérieurement, lorsque plus d’une dilution est envisagée comme décrit ci-dessous.

Par un « rotor grande capacité », on entend un rotor ayant une capacité d’au moins 4L, convenablement au moins 6L, convenablement au moins 8L, plus convenablement au moins 10L ou plus.

Par « capacité du rotor », on entend le volume maximum de liquide qu’un rotor peut transporter.

Par « capacité de charge », on entend la quantité de fluide contenant un virus qui est chargée par litre de rotor.

Le procédé selon la présente invention est particulièrement avantageux lorsqu’il est nécessaire de purifier un virus produit sur grande échelle. Par exemple, le procédé selon l’invention est convenablement utilisé lorsque 1L, 50L, 100L, 200L, 500L, 1000L, ou des volumes supérieurs de fluides contenant un virus doivent être traités et purifiés.

Le procédé selon la présente invention est applicable à la purification de tout type de virus et est indépendant des types de substrat hôte utilisé pour produire des virus. Par exemple, le procédé selon l’invention est applicable aux virus produits sur des cultures cellulaires ou des œufs.

Le procédé de l’invention est susceptible d’être utilisé dans une vaste gamme de virus, n’importe quel virus qui est généralement purifié par une ultracentrifugation en gradient de densité. À titre d’exemple, le procédé de l’invention envisage la purification de virus enveloppés, en particulier d’hépadnavirus, de virus de l’herpès, d’orthomyxovirus, comme par exemple le virus de la grippe, de paramyxovirus comme le virus de de la rougeole, des togavirus comme par exemple le virus de la rubéole, des rhabdovirus tels que par exemple le virus de la rage, des poxvirus et des rétrovirus. Dans un mode de réalisation, les virus purifiés et produits par le procédé de l’invention appartiennent à la famille des Orthomyxovirus, en particulier le virus de la grippe.

La présente invention ne s’appuie pas sur l’utilisation d’un type de gradient de densité spécifique et peut donc s’appliquer à n’importe quel type de gradient de densité. Le choix du milieu de gradient de densité dépend du virus qui doit être purifié et de l’application qui est prévue pour le virus purifié obtenu. Par exemple, des virus à enveloppe sont moins denses que des virus sans enveloppe. Cela est connu dans la technique. Spécifiquement, en fonction de l’objectif pour lequel le virus produit selon le procédé est préparé, un milieu qui n’affecte pas l’intégrité du virus ou son activité biologique sera utilisé. Par exemple, lorsque le virus préparé selon le procédé de l’invention est destiné à la vaccination, le milieu est choisi de façon à maintenir l’immunogénicité dudit virus, ou de l’antigène viral correspondant. Des solutions de sucre, en particulier de saccharose, peuvent être utilisées pour générer des gradients de densité à utiliser dans le procédé selon l’invention. Le saccharose est particulièrement utile pour purifier des virus à enveloppe, tels que, mais sans y être limités, les virus de la grippe. C’est également un sucre fréquemment utilisé dans le domaine de la fabrication de vaccins.

Dans un mode de réalisation, le sucre utilisé pour créer un gradient de densité linéaire préformé selon le procédé de la présente invention est le saccharose. Cela est avantageux pour la purification de produits à usage humain lorsqu’il faut tenir compte de considérations en matière de sécurité. Toutefois, l’invention envisage également l’utilisation d’autres sucres, y compris des sucres d’alcool, tels que, par exemple, le sorbitol ou des sucres hydrogénés, des sucres linéaires et des sucres modifiés ou tout autre sucre à condition que ledit sucre ait une solubilité dans l’eau suffisante pour produire des solutions ayant des densités spécifiées selon le type de virus à purifier.

Des gradients de densité linéaire préformés utilisés dans le procédé de la présente invention ne sont pas limités aux gradients de sucre. La présente invention envisage également, comme autres exemples illustratifs, l’utilisation de gradients de sels, tels que, par exemple, le chlorure de césium, qui est adapté pour la purification des virus à enveloppe et des virus sans enveloppe. En variante, le gradient peut également être préparé avec du tartrate de potassium, qui présente l’avantage d’atteindre un gradient ayant une densité supérieure, par rapport au gradient de saccharose. Par conséquent, des gradients de tartrate de potassium sont, en particulier, employés de façon adaptée pour purifier les virus sans enveloppe.

Le gradient linéaire préformé à fournir dans un rotor ayant une capacité élevée selon le procédé de l’invention peut être formé par dilution progressive d’une solution mère dans une (des) solutions) de dilution avant l’injection dans le rotor.

Linéarité

La linéarité du gradient préformé utilisé dans le procédé de l’invention peut varier de deux façons. D’une part, la pente qui définit l’inclinaison du gradient peut varier. L’inclinaison appropriée peut être choisie, par exemple, en fonction du niveau souhaité de purification de virus et du nombre souhaité de fractions de gradient d’où le virus purifié est tiré, à savoir de la concentration du fluide du virus après purification sur une ultracentrifugation en gradient de densité. Généralement, plus le gradient linéaire est incliné, plus le virus purifié sera concentré, car il sera présent dans un nombre de fractions de gradient correspondant à un volume plus petit. Inversement, plus un gradient linéaire est progressif, moins le virus concentré sera concentré, car cela sera présent dans un certain nombre de fractions de gradients correspondant à un volume supérieur. De même, l’inclinaison du gradient linéaire impactera la capacité à séparer le virus des impuretés contaminantes résiduelles. Il incombe à l’homme de l’art de déterminer la pente appropriée du gradient linéaire, si nécessaire, en tenant compte des deux éléments ci-dessus, à savoir la concentration du virus et la qualité de séparation du virus des impuretés contaminantes résiduelles. D’autre part, l’ampleur de la linéarité, à savoir le volume de gradient sur lequel ledit gradient est linéaire, peut varier. La condition requise minimale est que le gradient linéaire préformé utilisé dans le procédé de l’invention soit linéaire sur la plage de densité du gradient comprenant le pourcentage de densité correspondant au pourcentage auquel le virus à purifier migrera. Convenablement, le gradient linéaire préformé utilisé dans le procédé de l’invention est linéaire sur au moins 30%, convenablement au moins 50%, convenablement au moins 60%, convenablement au moins 70%, convenablement au moins 80%, convenablement au moins 90% de son volume total ou le gradient est convenablement linéaire sur l’intégralité de son volume. Dans des modes de réalisation particuliers, le gradient de densité linéaire préformé utilisé dans le procédé de l’invention est linéaire sur 50% à 90%, sur 60% à 80% de son volume total. Dans des modes de réalisation particuliers ultérieurs, le gradient de densité linéaire préformé utilisé dans le procédé de l’invention est linéaire sur au moins 70%. Par conséquent, le gradient linéaire préformé à utiliser dans le procédé de l’invention peut présenter des plateaux aux extrémités du gradient, que ce soit à une extrémité seulement, ou aux deux extrémités. Toutefois, le volume ajouté correspondant aux plateaux, si plusieurs plateaux sont présents, ne dépasse pas convenablement 70%, convenablement 50%, convenablement 40%, convenablement 30%, convenablement 20%, convenablement 10%, ou 5% du volume total du gradient.

La linéarité, ainsi que l’ampleur de la linéarité, d’un gradient de densité, peut être vérifiée en utilisant n’importe quel procédé connu dans la technique permettant de tracer le pourcentage du gradient contre le volume du gradient. La linéarité, telle que définie ci-dessus, est établie lorsqu’un tel tracé donne une ligne sensiblement droite. De même, à partir d’un tel tracé, la pente peut être calculée, à savoir l’inclinaison peut être surveillée et adaptée, le cas échéant. Par exemple, lorsque le sucre est le milieu utilisé pour le gradient de densité, une analyse par réfractométrie telle qu’une analyse de Brix, qui est bien connue dans la technique, peut être utilisée pour mesurer le pourcentage de sucre (exprimé en grammes pour 100 ml) dans des fractions successives d’un volume donné du gradient.

Plage de concentration de gradient

La présente invention n’est pas limitée à une plage de pourcentage particulière de gradients de densité. Ladite plage devrait être déterminée en fonction du virus à purifier, en particulier, en fonction de la densité du virus, des densités des impuretés contaminantes résiduelles prévues et du type de séparation à utiliser, qu’elle soit isopycnique ou par zone. L’homme de l’art saura comment associer à un virus donné (ayant une densité donnée) la plage de pourcentage appropriée d’un gradient de densité, assurant que la partie linéaire du gradient préformé comprend le pourcentage de densité correspondant au pourcentage auquel le virus à purifier migrera. La présence d’un virus spécifique ou d’un antigène viral correspondant, à une certaine plage dans un gradient peut être surveillée par des techniques standard de détection de protéine, telles que l’analyse Western-blot utilisant un anticorps spécifique pour l’antigène viral. Dans le cas particulier du virus de la grippe, le contenu de l’un de ses antigènes de surface, l’antigène HA (Hémagglutinine) peut être surveillé par le test SRID (Single Radial Immuno Diffusion - Immunodiffusion radiale) qui est une technique connue de l’homme de l’art (J.M. Wood et al.: An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency détermination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247; J. M. Wood et al.: International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus. J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330). Pour une plage de pourcentage donnée, l’homme de l’art déterminera la dilution appropriée d’une solution mère d’un pourcentage approprié (en masse/volume) nécessaire afin de créer un gradient linéaire préformé avec une linéarité appropriée à utiliser dans le procédé de la présente invention. Une plage de gradient typique pour purifier les virus est de 0-55% (en masse/volume). Dans un mode de réalisation, le gradient de densité linéaire préformé à utiliser dans le procédé selon l’invention, tel que le gradient de saccharose, a une plage de pourcentage de 0-55% (en masse/volume).

Les solutions mères et la (les) solutions) de dilution peuvent être préparées dans l’eau ou ajoutées avec un sel à des concentrations physiologiques {par exemple NaCI) et avec un tampon (par exemple Tris ou phosphate de sodium). Des solutions mères et des solutions de dilution peuvent être convenablement préparées dans une solution tamponnée comprenant un sel à une concentration physiologique, telle que le TBS ou le PBS. Dans un mode de réalisation de l’invention, des solutions mères, telles que, par exemple, des solutions mères de sucre, en particulier du saccharose, et des solutions de dilution sont préparées dans une solution saline de tampon de phosphate (PBS) contenant du citrate, car ce type de solution empêche avantageusement l’agrégation du virus pendant la centrifugation.

Solution mère

Par « solution mère », on entend la solution formant le gradient qui sera diluée afin de fournir un gradient de densité linéaire préformé dans un rotor à haute capacité selon le procédé de l’invention. La solution mère formant le gradient à utiliser afin de préparer un gradient linéaire préformé d’une plage donnée X%-Y% (en masse/volume) (X étant la limite inférieure et Y étant la limite supérieure), comme un gradient de sucre, est convenablement un pourcentage qui équivaut à Y, ou est supérieur. Une plage de gradient de sucre typique non limitative pour purifier les virus est de 0-55% (en masse/volume). Par exemple, si un gradient de sucre de 0-55% (en masse/volume) est ciblé, la solution mère de sucre peut convenablement être une solution de sucre à 55% (en masse/volume) ou plus.

Le volume de la solution mère est choisi de façon à obtenir un gradient linéaire préformé atteignant la limite supérieure de la plage prévue. Pour une plage donnée X%-Y% (X étant la limite inférieure et Y étant la limite supérieure) (en masse/volume), le volume de la solution mère est choisi de façon à obtenir un gradient linéaire préformé atteignant la limite supérieure Y% de la plage. Les inventeurs ont observé que le rapport « volume de la solution mère/volume de la solution de dilution » est un facteur à prendre en compte. La solution mère a convenablement un volume supérieur à la solution de dilution. Par exemple, un tel rapport est convenablement de 2:1,3:1,4:1, 5:1 ou de 6:1.

Le volume de la solution mère est également choisi conformément à la capacité du rotor. Convenablement, le volume de la solution mère ne dépasse pas la capacité du rotor. Dans certains modes de réalisation, dans lesquels une centrifugation est effectuée par lot, le volume de la solution mère est identique à la capacité du rotor. Lorsque la centrifugation est effectuée en mode continu, le volume de la solution mère peut avoir un volume de 90% de la capacité du rotor ou moins, convenablement 80% ou moins. Dans des modes de réalisation, dans lesquels la centrifugation est effectuée en mode continu, le volume de la solution mère formant le gradient est comprise entre 40% et 80% de la capacité du rotor, entre 50% et 60% de la capacité du rotor, ou représente 50% de la capacité du rotor. Dans des modes de réalisation particuliers, dans lesquels le rotor est un rotor de 8L, la solution mère formant le gradient a un volume compris entre 3,2L et 6,4L, ou entre 4L et 4,8L. Dans un mode de réalisation particulier ultérieur, dans lequel le rotor est un rotor de 8L, la solution mère formant le gradient a un volume de 4L.

Solutions de dilution

La solution de dilution peut ne pas comprendre de sucre du tout. En variante, elle peut également comprendre un peu de sucre, généralement à un pourcentage inférieur au pourcentage de la solution mère. Généralement, une solution mère d’un pourcentage donné est diluée dans une (des) solution(s) de dilution avant d’être injectée dans un rotor d’une capacité donnée. L’inclinaison du gradient linéaire préformé à utiliser dans le procédé selon l’invention peut être ajustée en adaptant le taux de dilution. Généralement, plus un gradient est incliné, plus il est probablement d’observer la présence de plateaux aux extrémités du gradient.

La diminution du taux de dilution aide à réduire les plateaux aux extrémités du gradient, à augmenter l’ampleur de la linéarité, à savoir à augmenter le volume du gradient sur lequel le gradient est linéaire et à rendre le gradient linéaire plus progressif, à savoir avec une pente plus douce. La diminution du taux de dilution peut être obtenue par exemple, en ajoutant du sucre ou en augmentant son pourcentage dans la solution de dilution. Une option alternative à la diminution du taux de dilution consiste à procéder à une dilution multiple.

Par « dilution multiple », on entend des dilutions successives. Par exemple, la solution mère formant le gradient peut être progressivement diluée deux fois ou plus, à savoir diluée dans une première solution de dilution, ladite solution mère diluée étant à son tour progressivement diluée dans une seconde solution de dilution, et ainsi de suite avant d’être injectée dans le rotor. Dans un mode de réalisation, le gradient linéaire préformé est formé en diluant progressivement une solution mère donnée deux fois, à savoir diluée dans une première solution de dilution donnée, ladite solution mère diluée étant progressivement diluée dans une seconde solution de dilution donnée avant d’être injectée dans le rotor. Dans des modes de réalisation particuliers, où de telles dilutions multiples sont effectuées, les solutions de dilution ne comprennent aucun sucre et ont éventuellement le même volume.

Le volume des solutions de dilution utilisées pour créer un gradient linéaire préformé à utiliser dans le procédé selon l’invention peut varier. En particulier, le volume dépend du volume de la solution mère formant un gradient, et du taux de dilution ciblé, à savoir de l’inclinaison prévue du gradient linéaire préformé. Par exemple, une solution de dilution donnée peut convenablement avoir un volume d’au moins 10%, au moins 15%, au moins 20%, au moins 25%, au moins 30%, ou au moins 50% de la solution mère.

Dans un mode de réalisation, pour un gradient attendu d’une plage X%-Y% (en masse/volume) (X étant la limite inférieure et Y étant la limite supérieure), une solution mère ayant un pourcentage Y% est tout d’abord progressivement diluée dans une solution de dilution ayant un volume de 25% du volume de la solution mère, ladite solution mère diluée étant progressivement diluée dans une seconde solution de dilution ayant un volume de 25% du volume de la solution mère. Généralement, les différents récipients comprenant chacun la solution mère formant un gradient et la (les) solutions) de dilution et le rotor qui recevra le gradient linéaire préformé sont reliés avec succès les uns aux autres, le dernier récipient étant relié au rotor au moyen d’une pompe. Ladite pompe, une fois activée, crée un vide provoquant l’aspiration de la solution mère dans la première solution de dilution, qui est à son tour aspirée, et donc progressivement diluée dans la solution de dilution suivante, en fonction du nombre de solutions de dilution utilisées, avant que la solution diluée finale ne soit injectée dans le rotor. Le débit de la pompe est choisi dans une plage appropriée afin de ne pas perturber le gradient obtenu et formé par une dilution progressive. Un exemple non-limitatif de débit de pompe à utiliser convenablement dans le procédé selon l’invention est compris entre 100 et 200 ml/min, et est convenablement de 160 ml/min.

Centrifugation

Les conditions de centrifugation sont des conditions standards. Il incombe à l’homme de l’art de déterminer les conditions appropriées telles que, par exemple, la force centrifuge, le temps de fonctionnement, le débit, ou le temps de cerclage, le cas échéant. La détermination desdites conditions devra tenir compte du type de fluide contenant le virus à purifier, du type de virus, du type d’impuretés contaminantes, du mode de centrifugation, par lot ou en continu, du type de séparation, par zone ou isopycnique. En particulier, des informations fournies dans les instructions du fabricant sur la façon d’utiliser les rotors et centrifugeuses peuvent guider l’homme de l’art dans la sélection de conditions de centrifugation appropriées. Comme décrit plus haut, l’homme de l’art peut utiliser n’importe quelle technique standard de détection de protéine, telles qu’une analyse Western-blot utilisant un anticorps spécifique pour un antigène viral, ou dans le cas particulier du virus de la grippe, le test SRID afin de détecter la présence du virus et/ou surveiller si l’on obtient un rendement de virus et/ou une pureté de virus acceptables après la centrifugation sur un gradient de densité linéaire préformé de l’invention.

La centrifugation peut être effectuée en mode continu, en mode semi-continu ou par lots successifs. Dans un mode de réalisation, la centrifugation pendant le procédé de purification d’un virus selon l’invention est effectuée en mode continu. La centrifugation en mode continu est avantageusement utilisée sur grande échelle, lorsque de grands volumes de fluides contenant des virus doivent être traités et purifiés.

Selon que la centrifugation est effectuée par lots ou en mode continu, le chargement du gradient linéaire préformé peut varier. En mode par lots, le gradient linéaire préformé peut être chargé dans un rotor vide au repos. Dans ces modes de réalisation, le volume chargé peut être identique à la capacité du rotor. En variante, lorsque la centrifugation est effectuée en mode continu, le rotor peut être prérempli d’une solution tampon appropriée au repos, et pendant l’injection du gradient linéaire préformé dans le rotor toujours au repos, ladite solution tampon est progressivement remplacée par le gradient linéaire préformé. Un tel remplissage préalable présente l’avantage d’éviter la formation de bulles. Dans certains modes de réalisation, dans lesquels la centrifugation est effectuée en mode continu, le volume du gradient linéaire préformé qui est injecté dans le rotor correspond au volume de la solution mère formant le gradient, à savoir l’injection est arrêtée quand le récipient comprenant la solution mère est vide.

Une fois le gradient linéaire préformé chargé dans le rotor, le fluide contenant le virus peut être chargé sur le gradient au repos, et la centrifugation démarre après que le fluide contenant le virus a été chargé sur le gradient. Ces modes de réalisation sont convenablement réalisés quand la centrifugation est effectuée par lot. En variante, la centrifugation peut être débutée après que le gradient linéaire préformé est chargé dans le rotor, et une fois que la force centrifuge appropriée est atteinte, le fluide contenant le virus peut être chargé sur le gradient. De tels modes de réalisation alternatifs sont convenablement mis en application lorsque la centrifugation est effectuée en mode continu.

La force centrifuge appropriée peut être choisie par l’homme de l’art et peut dépendre du type de rotor et de centrifugeuse utilisé. À titre d’exemples non limitatifs, une force centrifuge comprise entre au moins 20 000 g et 200 000 g, comprise convenablement entre 90 000 g et 150 000 g, comprise convenablement entre 100 000 g et 120 000 g, est appliquée au rotor dans la centrifugeuse. Une fois que tout le fluide contenant le virus a été traité, et après un temps de fonctionnement adéquat, la centrifugation est arrêtée et les fractions de gradient contenant le virus sont collectées.

Fluide contenant le virus

Le fluide contenant le virus à purifier dans le cadre de l’invention n’est pas limité aux fluides bruts, mais envisage également des fluides qui comprennent des virus partiellement purifiés. Par exemple, la purification peut inclure un certain nombre d’étapes différentes de filtration, concentration et/ou autre séparation telles que l’ultrafiltration, la centrifugation, la chromatographie (comme une chromatographie par échange d’ions) et l’adsorption dans une variété de combinaisons. Une étape de clarification peut être requise afin de séparer le virus du contaminant matériel cellulaire, en particulier, les cellules flottantes ou débris de cellules, ou des contaminants tirés des œufs provenant des fluides allantoïques.

Le terme « brut » dans le cadre de la présente invention signifie qu’aucune purification n’a été effectuée sur le fluide contenant le virus après sa collecte, et donc qu’il peut contenir toute sorte de contaminants dans des ampleurs variables. À titre d’exemple non limitatif, lorsque le virus a été produit en inoculant des cellules avec ledit virus et lorsque, après l’infection, des virus nouvellement formés sont libérés dans le milieu de culture cellulaire ou surnageant, alors ledit milieu de culture, qui comprend le virus, désigne un exemple d’un fluide brut. Un autre exemple d’un fluide brut qui peut être cité est le fluide allantoïque récolté après inoculation du virus sur des œufs embryonnés et culture du virus. Par conséquent, les termes « partiellement purifiés » comprennent tout état de purification intermédiaire, à savoir un fluide qui a fait l’objet d’une étape quelconque de purification, par exemple, l’une quelconque des étapes mentionnées ci-dessus, individuellement, ou selon n’importe quelle combinaison.

Dans un mode de réalisation, le fluide contenant le virus selon l’invention est le milieu de culture collecté après l’infection des cellules avec le virus présentant un intérêt, comme un virus de la grippe par exemple, et sa libération dans le milieu de culture. Dans un autre mode de réalisation, le fluide contenant le virus selon l’invention est le fluide allantoïque collecté après l’inoculation des œufs avec un virus présentant un intérêt, comme le virus de la grippe.

Dans un autre mode de réalisation adapté, le fluide contenant le virus selon l’invention a été clarifié avant d’être ajouté à un gradient de densité linéaire préformé selon l’invention. Cette clarification peut être effectuée par filtration. En variante, la centrifugation et/ou la filtration peuvent être combinées ensemble, dans n’importe quel ordre, pour atteindre le niveau de clarification souhaité de la préparation de virus. Bien que cela ne soit pas requis, un procédé de filtration multiple peut être effectué, comme un procédé en deux ou trois phases constitué, par exemple, de la suppression séquentielle et progressive d’impuretés selon leur taille, en utilisant des filtres ayant une taille de pores nominale appropriée, en particulier, des filtres ayant une taille de pore nominale décroissante, permettant de commencer à enlever de grands précipités et débris cellulaires. En outre, des opérations uniques employant un filtre relativement étroit ou une centrifugation peuvent également être utilisées pour la clarification. Plus généralement, n’importe quelle approche de clarification, y compris, sans y être limités, la filtration frontale, la filtration en profondeur, la micro-filtration ou la centrifugation, qui fournissent un filtrat de clarté adaptée pour ne pas salir la membrane et/ou les résines dans des étapes successives, sera acceptable pour une utilisation dans l’étape de clarification de la présente invention.

Bien que cela ne soit pas requis, il peut être convenable de concentrer le fluide contenant le virus avant de le charger sur le gradient de densité linéaire préformé selon l’invention, afin de réduire le volume de fluide à charger. Par conséquent, la présente invention envisage également un fluide contenant un virus qui a été concentré, avant le chargement sur le gradient de densité. Donc, le fluide contenant le virus peut être soumis à une ultrafiltration (parfois appelée diafiltration lorsqu’elle est utilisée pour l’échange de tampon), par exemple sur une membrane à 750 kD, pour concentrer le virus et/ou l’échange de tampon. Cette étape est particulièrement avantageuse quand le virus à purifier est dilué, comme c’est le cas lors du regroupement des récoltes virales collectées par perfusion sur quelques jours après l’inoculation. Le procédé utilisé pour concentrer le virus peut inclure n’importe quel procédé de filtration lorsque la concentration du virus est accrue en forçant le diluant à passer à travers un filtre de sorte que le diluant soit éliminé de la suspension de virus tandis que le virus est incapable de passer à travers le filtre et reste ainsi sous forme concentrée dans la préparation de virus. L’ultrafiltration peut comprendre la diafiltration qui est une façon idéale de supprimer et d’échanger des sels, sucres, solvants non aqueux, de supprimer des matériaux à faible masse moléculaire, de rapide changement d’environnements ioniques et/ou de pH. Des microsolutés sont enlevés de manière plus efficace en ajoutant du solvant à la solution ultrafiltrée à une vitesse égale à la vitesse d’ultrafiltration. Cela permet de laver les micro-espèces de la solution à un volume constant, en isolant le virus retenu. La diafiltration est particulièrement avantageuse lorsqu’une étape en aval nécessite qu’un tampon spécifique soit utilisé afin d’obtenir une réaction optimale. La concentration et la diafiltration peuvent être mises en application à n’importe quelle étape adaptée du processus de purification, lorsque l’on veut enlever les composés indésirables, comme le saccharose, après une ultracentrifugation en gradient de saccharose, ou comme un formaldéhyde, après une étape d’inactivation du virus avec du formaldéhyde. Le système est composé de trois courants de processus distincts : la solution d’alimentation (comprenant le virus), le perméat et le rétentat. En fonction de l’application, des filtres avec des tailles de pores différentes peuvent être utilisés. La composition de filtre peut être, sans y être limitée, de la cellulose régénérée, de la polyéthersulfone, de la polysulfone ou des dérivés correspondants. Les membranes peuvent être des feuilles plates (également appelées écrans plats) ou des fibres creuses.

Dans un mode de réalisation, le fluide contenant le virus a été concentré par ultrafiltration/diafiltration avant de le charger sur le gradient de densité linéaire préformé utilisé dans le procédé de la présente invention.

Le procédé de purification selon la présente invention peut inclure des étapes supplémentaires, en plus de l’étape d’ultracentrifugation de gradient de densité telle que revendiquée ici. Ces étapes peuvent être mises en application avant ou après l’étape d’ultracentrifugation en gradient de densité. Spécifiquement, la préparation de virus obtenue après avoir utilisé l’étape d’ultracentrifugation en gradient de densité selon la présente invention peut être ultérieurement purifiée, en mettant en application l’une quelconque des techniques de purification de virus précédemment citées, telles que la filtration, l’ultracentrifugation (y compris l’ultracentrifugation en gradient), la chromatographie (comme la chromatographie par échange d’ions) et l’adsorption dans une variété de combinaisons.

Dans un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend en outre au moins une étape choisie dans le groupe constitué de : la filtration, I’uItrafiItration/diafiItratiοn, l’ultracentrifugation et la chromatographie, ou toute combinaison correspondante. En fonction du niveau de pureté souhaité, les étapes ci-dessus peuvent être combinées de n’importe quelle façon.

En variante, il est également possible de purifier ultérieurement des virus par chromatographie, y compris par chromatographie par échange d’ions, anionique ou cationique, par chromatographie par exclusion de taille, comme une filtration de gel ou une perméation de gel, une chromatographie par interaction hydrophobe, une hydroxyapatite ou toute combinaison correspondante. Comme mentionné ci-dessus, les étapes de chromatographie peuvent être mises en application en combinaison avec d’autres étapes de purification, comme une ultracentrifugation en gradient de densité. Œufs

Des fluides contenant un virus, comme le virus de la grippe, selon l’invention peuvent être tirés du procédé conventionnel des œufs embryonnés, en développant un virus de la grippe dans des œufs et en purifiant le fluide allantoïque récolté.

Cellules

Le virus à purifier selon le procédé de l’invention peut être produit sur une culture cellulaire. Le procédé selon la présente invention est applicable à n’importe quel type de cellules, qu’il s’agisse de cellules adhérentes développées sur des micro-supports ou de cellules de suspension.

Les cellules peuvent être développées de différentes façons, comme par exemple, en utilisant des systèmes par lot, par lot d’alimentation ou continus, comme des systèmes de perfusion. Une perfusion est particulièrement avantageuse lorsqu’une densité cellulaire élevée est souhaitée. Une densité cellulaire élevée peut être particulièrement avantageuse pour optimiser la quantité de virus qui peut être produite à partir d’un type de cellule donné.

Les cellules utilisées pour produire un fluide contenant un virus à purifier selon le procédé de l’invention peuvent en principe être n’importe quel type souhaité de cellules animales qui peuvent être cultivées dans la culture cellulaire et peuvent soutenir une réplication de virus. Il peut s’agir soit de cellules primaires ou de lignées cellulaires continues. Des lignées cellulaires génétiquement stables sont préférées. Des cellules mammifères sont particulièrement adaptées, par exemple, des cellules humaines, de hamster, de bétail, de singe ou de chien. En variante, des cellules d’insectes sont également adaptées, comme par exemple des cellules SF9 ou des cellules Hi-5.

Un certain nombre de lignées cellulaires mammifères sont connues dans la technique et comprennent les cellules PER.C6, HEK, les cellules rénales embryonnaires humaines (cellules 293), les cellules HeLa, les cellules CHO, les cellules Vero et les cellules MDCK.

Des cellules de singe adaptées sont, par exemple, les cellules de singe vert africain, comme les cellules rénales comme dans la lignée cellulaire Vero. Des cellules de chien adaptées sont, par exemple, les cellules rénales comme dans la lignée cellulaire MDCK.

Des lignées cellulaires mammifères pour développer un virus de la grippe comprennent les cellules MDCK, les cellules Vero ou les cellules PER.C6. Ces lignées cellulaires sont toutes largement disponibles, par exemple, auprès de la banque de culture cellulaire « American Type Cell Culture » (ATCC).

En variante, des lignées cellulaires pour utilisation dans l’invention peuvent être tirées de sources aviaires, telles que les poulets, les canards, les oies, les cailles ou les faisans. Les lignées cellulaires aviaires peuvent être tirées d’une variété de phases de développement comprenant des embryons, des jeunes et des adultes. En particulier, les lignées cellulaires peuvent être tirées des cellules embryonnaires, comme les fibroblastes embryonnaires, des cellules germinales, ou d’organes individuels, y compris les tissus neuronaux, le cerveau, la rétine, les reins, le foie, le cœur, les muscles ou les tissus extra-embryonnaires et les membranes protégeant l’embryon. Des fibroblastes embryonnaires de poulets (CEF) peuvent être utilisés. Des exemples de lignées cellulaires aviaires comprennent les cellules souches embryonnaires aviaires (WO01/85938) et des cellules de la rétine du canard (WO05/042728). En particulier, la lignée cellulaire EB66® tirée des cellules souches embryonnaires du canard est envisagée dans la présente invention. D’autres cellules souches embryonnaires aviaires adaptées comprennent la lignée cellulaire EBx® tirée des cellules souches embryonnaires du poulet, EB45, EB14 et EB14-074 (W02006/108846). Cette lignée cellulaire EBx présente l’avantage d’être une lignée cellulaire stable dont l’établissement a été produit naturellement et n’a pas nécessité de modification génétique, chimique ou virale. Ces cellules aviaires sont particulièrement adaptées pour le développement de virus de la grippe.

Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de l’invention, lorsque le virus à purifier est produit sur une culture cellulaire, utilise des cellules EB66®.

Les conditions de culture cellulaire (température, densité cellulaire, valeur de pH, etc.) sont variables sur une très vaste gamme due à l’adaptabilité des cellules utilisées et elles peuvent être adaptées aux conditions requises des conditions particulières pour le développement d’un virus en particulier. Il incombe à l’homme de l’art de déterminer les conditions de culture appropriées, car la culture cellulaire est largement documentée dans la technique (voir par exemple Tissue Culture, Academie Press, Kruse and Paterson, editors (1973), and R.l. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth édition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9).

Avant la récolte, une infection cellulaire peut durer de 2 à 10 jours. La durée optimale avant la récolte du virus produit par la cellule est habituellement basée sur la détermination du pic d’infection. Par exemple, le CEP (Effet CytoPathique) est mesuré en surveillant les changements morphologiques survenant dans les cellules hôtes après l’inoculation du virus, y compris l’arrondissement cellulaire, la désorientation, le gonflement ou le rétrécissement, la mort, le détachement de la surface. La détection d’un antigène viral spécifique peut également être surveillée par des techniques standards de détection de protéine, comme l’analyse Western-blot. La récolte peut alors être effectuée lorsque le niveau de détection souhaité est atteint. Dans le cas particulier du virus de la grippe, la teneur en HA peut être surveillée à tout moment après l’inoculation des cellules avec le virus, par l’analyse SRD (Wood, JM, et al. (1977). J. Biol. Standard. 5, 237-247), qui est une technique connue de l’homme de l’art. En outre, le test SRD peut également être utilisé pour déterminer la plage de densité cellulaire optimale requise pour obtenir un rendement de virus optimisé.

Compositions immunogènes À la fin de la purification, la préparation de virus obtenue selon le procédé de la présente invention peut être convenablement soumise à une filtration stérile, comme cela se fait communément dans les processus pour des matériaux de qualité pharmaceutique, tels que des compositions immunogènes ou des vaccins, et connue de l’homme de l’art. Cette filtration stérile peut, par exemple, être convenablement effectuée en filtrant la préparation à travers un filtre de 0,22 pm. Après la préparation, le virus ou les antigènes viraux sont prêts pour utilisation clinique, si on le souhaite. Le virus purifié selon le procédé de l’invention peut être convenablement formulé pour être inclus dans une composition immunogène, comme dans un vaccin. Par conséquent, un procédé pour la préparation d’un vaccin, comme un vaccin du virus de la grippe, comprenant au moins l’étape consistant à purifier un virus à utiliser comme antigène dans le vaccin selon le procédé de l’invention et à formuler ledit virus purifié dans un vaccin, est également envisagé dans la présente invention.

Les compositions immunogènes, en particulier les vaccins, peuvent généralement être formulées sous une forme de sous-virion, par exemple sous la forme d’un virus à virion fragmenté, où l’enveloppe lipidique a été dissoute ou interrompue, ou sous la forme d’une ou plusieurs protéines virales purifiées (vaccin sous-unitaire). En variante, les compositions immunogènes peuvent inclure un virus complet, par exemple un virus entier atténué vivant ou un virus entier inactivé virus.

Les procédés de fragmentation des virus, comme les virus de la grippe, sont bien connus dans la technique (WO02/28422). La fragmentation du virus est effectuée en interrompant ou en fragmentant le virus entier qu’il soit infectieux (de type sauvage ou atténué) ou non-infectieux (inactivé) avec une concentration d’interruption d’un agent de fragmentation. Les agents de fragmentation comprennent généralement des agents capables de rompre et de dissoudre les membranes lipidiques. Traditionnellement, un virus de la grippe à virion fragmenté a été produit en utilisant un traitement par solvant/détergent, comme le tri-n-butyl phosphate, ou le diéthyléther en combinaison avec du Tween™ (connu sous le nom de fragmentation « Tween-éther ») et ce procédé est encore utilisé dans certaines installations de production. D’autres agents de fragmentation maintenant utilisés comprennent des détergents ou enzymes protéolytiques ou sels biliaires, par exemple le désoxycholate de sodium. Des détergents qui peuvent être utilisés comme agents de fragmentation comprennent des détergents cationiques, par exemple le bromure de cétyl-triméthyl-ammonium (CTAB), d’autres détergents ioniques, par exemple le laurylsulfate de sodium (SLS), la taurodésoxycholate, ou des détergents non-ioniques, comme le Tween ou Triton X-100, ou une combinaison de n’importe lequel de deux des détergents ou plus.

Le processus de fragmentation peut être effectué sous la forme d’un processus par lot, continu ou semi-continu. Lorsqu’il est mis en application par lot, le virus fractionné peut nécessiter une étape supplémentaire de purification, comme une étape de chromatographie. Il n’est pas nécessaire de mettre en application une étape de fractionnement comme telle, car il n’est pas possible d’effectuer le fractionnement simultanément à une étape de purification. Par exemple, un détergent peut être ajouté au gradient linéaire préformé visant à purifier les protéines virales par ultracentrifugation, comme décrit ci-dessus. Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention comprend en outre une étape de fragmentation réalisée par lot avec un détergent, en particulier, le Triton X-100.

En variante, la fragmentation peut avoir lieu avant ou après l’étape de centrifugation en gradient de densité telle que revendiquée ici.

Pour la sécurité des vaccins, il peut s’avérer nécessaire de réduire l’infectivité de la suspension virale sur différentes étapes du processus de purification. L’infectivité d’un virus est déterminée par sa capacité à se répliquer sur une lignée cellulaire. Par conséquent, le procédé selon la présente invention comprend éventuellement au moins une étape d’inactivation du virus. L’inactivation peut être effectuée en utilisant, par exemple, de la bêta-propiolactone (BPL), du formaldéhyde, ou des UV, ou toute combinaison correspondante qui peut avoir lieu soit avant, soit après l’étape de centrifugation de gradient de densité de l’invention. Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention comprend en outre une étape d’inactivation, réalisée avec du BPL par exemple, ladite étape ayant convenablement lieu après la centrifugation en gradient de densité de l’invention. Les conditions d’inactivation virale peuvent varier et seront déterminées, en particulier, en évaluant l’infectivité en mesurant la dose Infectieuse de Culture Tissulaire (TCIDso/ml).

Des compositions immunogènes de la présente invention, y compris des vaccins, peuvent éventuellement contenir les additifs habituels pour les vaccins, en particulier des substances qui augmentent la réponse immunitaire provoquée chez un patient qui reçoit la composition, à savoir qu’on appelle les adjuvants.

Dans un mode de réalisation, des compositions immunogènes sont envisagées, qui comprennent un virus ou un antigène viral de la présente invention mélangé avec un excipient pharmaceutique adapté. Dans un mode de réalisation spécifique, elles comprennent un adjuvant.

Virus de la grippe

Les virus ou antigènes viraux peuvent être tirés d’un Orthomyxovirus, comme le virus de la grippe. Les antigènes d’orthomyxovirus peuvent être sélectionnés à partir d’une ou plusieurs des protéines virales, y compris l’hémagglutinine (HA), la neuraminidase (NA), la nucléoprotéine (NP), la protéine matrice (M1), la protéine membranaire (M2), une ou plusieurs des transcriptases (PB1, PB2 et PA). Des antigènes particulièrement adaptés comprennent les HA et NA, les deux glycoprotéines de surface qui déterminent la spécificité antigénique des sous-types de la grippe.

Le virus de la grippe peut être sélectionné dans le groupe du virus de la grippe humaine, du virus de la grippe aviaire, du virus de la grippe équine, du virus de la grippe porcine, du virus de la grippe féline. Le virus de la grippe est plus particulièrement sélectionné dans les souches A, B et C, de préférence à partir des souches A et B.

Les antigènes de la grippe peuvent être tirés de souches de la grippe inter-pandémiques (annuelle ou saisonnière). En variante, des antigènes de la grippe peuvent être tirés de souches ayant le potentiel de provoquer un foyer pandémique (à savoir des souches de la grippe avec une nouvelle hémagglutinine par rapport à l’hémagglutinine dans des souches circulant actuellement, ou des souches de la grippe qui sont pathogènes pour les sujets aviaires et ont le potentiel d’être transmis horizontalement dans la population humaine, ou des souches de la grippe qui sont pathogènes pour les humains). En fonction de la saison particulière et de la nature de l’antigène inclus dans le vaccin, les antigènes de la grippe peuvent être tirés d’un ou plusieurs des sous-types d’hémagglutinine suivants : H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ou H16. De préférence, le virus de la grippe ou des antigènes correspondants proviennent des sous-types H1, H2, H3, H5, H7 ou H9. Dans un mode de réalisation, les virus de la grippe proviennent des sous-types H2, H5, H6, H7 ou H9. Dans une variante de mode de réalisation, les virus de la grippe proviennent de sous-types H1, H3 ou B.

Compositions immunogènes du virus de la grippe

Le procédé de purification selon l’invention est particulièrement adapté pour préparer des compositions immunogènes du virus de la grippe, y compris des vaccins. Différentes formes de virus de la grippe sont actuellement disponibles. Elles sont généralement basées soit sur un virus vivant, soit sur un virus inactivé. Les vaccins inactivés peuvent être basés sur des virions entiers, des virions fragmentés, ou des antigènes de surface purifiés (y compris HA). Des antigènes de la grippe peuvent également être présentés sous la forme de virosomes (particules liposomiques semblables aux virus sans acides nucléiques).

Des procédés d’inactivation de virus et les procédés de fragmentation ont été décrits ci-dessus et sont applicables au virus de la grippe.

Les souches de virus de la grippe pour utilisation dans des vaccins changent d’une saison à l’autre. Dans la période inter-pandémique actuelle, les vaccins comprennent généralement deux souches de la grippe A et une souche de la grippe B. Des vaccins trivalents sont typiques mais une valence supérieure, comme une quadrivalence, est également envisagée dans la présente invention. L’invention peut également utiliser de ΙΉΑ provenant de souches pandémiques (à savoir des souches auxquelles le destinataire du vaccin et la population humaine générale sont immunologiquement naïfs), et les vaccins de la grippe pour des souches pandémiques peuvent être monovalents ou peuvent être basés sur un vaccin trivalent normal complété par une souche pandémique.

Des compositions de l’invention peuvent inclure un (des) antigène(s) à partir d’une ou plusieurs souches du virus de la grippe, y compris le virus de la grippe A et/ou le virus de la grippe B. En particulier, un vaccin trivalent comprenant des antigènes provenant de deux souches de virus de la grippe A et d’une souche de virus de la grippe B est envisagé par la présente invention. En variante, un vaccin quadrivalent comprenant des antigènes provenant de deux souches de virus de la grippe A et de deux souches de virus de la grippe B est également dans le cadre de la présente invention.

Les compositions de l’invention ne sont pas limitées aux compositions monovalentes, à savoir qui ne comprennent qu’un type de souche, à savoir uniquement des souches saisonnières ou uniquement des souches pandémiques. L’invention comprend également des compositions polyvalentes comprenant une combinaison de souches saisonnières et/ou de souches pandémiques. En particulier, une composition quadrivalente, qui peut être adjuvantée, comprenant trois souches saisonnières et une souche pandémique, tombe dans le cadre de l’invention. D’autres compositions tombant dans le cadre de l’invention sont une composition trivalente comprenant deux souches A et une souche B, comme des souches H1N1, H3N2 et B, et une composition quadrivalente comprenant deux souches A et deux souches B d’une lignée différente, comme H1N1, H3N2, B/Victoria et B/Yamagata. HA est le principal immunogène dans les vaccins de la grippe inactivés actuels, et les doses de vaccin sont standardisées en se référant aux niveaux de HA, généralement mesurés par SRD. Les vaccins existants contiennent généralement environ 15 pg de HA par souche, bien que des doses inférieures puissent être utilisées, par exemple pour les enfants, ou dans des situations pandémiques, ou lors de l’utilisation d’un adjuvant. Des doses fractionnées comme une moitié (à savoir 7,5 pg de HA par souche) ou un quart, ont été utilisées, de même que des doses supérieures, en particulier des doses 3x ou 9x. Donc, des compositions immunogènes de la présente invention peuvent inclure entre 0,1 et 150 pg de HA par souche de la grippe, en particulier, entre 0,1 et 50 pg, par exemple 0,1-20 pg, 0,1-15 pg, 0,1-10 pg, 0,1-7.5 pg, 0,5-5 pg, etc. Des doses particulières comprennent environ 15, environ 10, environ 7,5, environ 5 pg par souche, environ 3,8 pg par souche et environ 1,9 pg par souche.

Une fois qu’un virus de la grippe a été purifié pour une souche particulière, il peut être combiné avec des virus d’autres souches pour réaliser un vaccin trivalent, par exemple, comme décrit ci-dessus. Il est plus adapté de traiter chaque souche séparément et de mélanger des ensembles monovalents pour donner un mélange polyvalent final, plutôt que de mélanger des virus et de dégrader l’ADN et de le purifier d’un mélange polyvalent.

Des compositions d’adjuvant peuvent comprendre une émulsion huile-en-eau qui comprend une huile métabolisable et un agent émulsionnant. Afin qu’une composition huile en eau soit adaptée pour administration humaine, la phase huileuse du système d’émulsion doit comprendre une huile métabolisable. La signification du terme huile métabolisable est bien connue dans la technique. Métabolisable peut être défini comme « capable d’être transformé par le métabolisme » (Dorland’s lllustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25th édition (1974)). L’huile peut être n’importe quelle huile végétale, huile de poisson, huile animale ou huile synthétique, qui n’est pas toxique pour le destinataire et est capable d’être transformée par le métabolisme. Les arachides, les plantes et les graines sont des sources communes d’huiles végétales. Les huiles synthétiques font également partie de la présente invention et peuvent inclure des huiles disponibles dans le commerce telles que NEOBEE® et d’autres. L’émulsion huile-en-eau comprend en outre un agent émulsionnant. L’agent émulsionnant peut être convenablement un monooléate de polyoxyéthylène sorbitane. En outre, ledit agent émulsionnant est convenablement présent dans le vaccin ou la composition immunogène à 0,125 à 4% (en masse/volume) du volume total de la composition. L’émulsion huile-en-eau comprend éventuellement un tocol. Les tocols sont bien connus dans la technique et sont décrits dans EP0382271. Un tocol adapté est l’alpha-tocophérol ou un dérivé correspondant comme le succinate d’alpha-tocophérol (également connu sous le nom de succinate de vitamine E). Ledit tocol est convenablement présent dans la composition d’adjuvant dans une quantité de 0,25% à 10% (en masse/volume) du volume total de la composition immunogène. L’invention sera par la suite décrite en se référant aux exemples suivants, non limitatifs.

Exemple I : Formation de gradient pour un rotor de 3.2L- Gradient auto-générateur L’ultracentrifugeuse à flux continu était une centrifugeuse KM utilisant un rotor K3 (3,2L de capacité) d’Alfa Wasserman. Le rotor K3/3,2L a été rempli d’une solution tampon de PBS/Citrate à 125mM. Une fois remplie, la centrifugeuse a été démarrée tout en maintenant la solution tampon en circulation en circuit fermé pour faire sortir tout l’air du rotor. La centrifugeuse a ensuite été arrêtée et la moitié du volume (1,6L) de la solution tampon PBS/Citrate à 125 mM a été remplacée par une solution de PBS/Citrate à 125mM contenant 55% de saccharose. Après le remplacement, le rotor a été tout d’abord lentement accéléré à 4000 tr/min, puis jusqu’à une vitesse finale de 35000 tr/min. Au fur et à mesure que le rotor a été progressivement accéléré à 4000 tr/min, un gradient linéaire de 0% à 55% de saccharose a été formé dans le rotor. Après la formation, des fractions successives de 100 ml du gradient ont été collectées et analysées pour leur teneur en saccharose par réfractométrie (% Brix) afin de vérifier la linéarité du gradient. Les résultats sont indiqués sur la Figure 1. Résultats - Conclusions

Le gradient obtenu a été sensiblement linéaire, à savoir linéaire sur la plupart de son volume.

Exemple II : Formation de gradient pour un rotor de 8L - Gradient auto-générateur

Le même procédé que celui décrit dans l’Exemple I a été appliqué pour la formation d’un gradient dans un rotor de 8L. L’ultracentrifugeuse à flux continu était une centrifugeuse Kll utilisant un rotor K10 (capacité de 8L) d’Alfa Wasserman. Le rotor K10/8L a été rempli d’une solution tampon de PBS/Citrate à 125mM. Une fois remplie, la centrifugeuse a été démarrée tout en maintenant la solution tampon en circulation en circuit fermé pour faire sortir tout l’air du rotor. La centrifugeuse a ensuite été arrêtée et la moitié du volume (4L) de la solution tampon PBS/Citrate 125 mM a été remplacée par une solution de PBS/Citrate 125mM contenant 55% de saccharose. Après le remplacement, le rotor a été lentement accéléré à 4000 tr/min et ensuite ultérieurement jusqu’à une vitesse finale de 35000 tr/min. Après la formation, des fractions successives de 250 ml du gradient ont été collectées et analysées pour leur teneur en saccharose par réfractométrie (% Brix) afin de vérifier la linéarité du gradient. Les résultats sont indiqués sur la Figure 2. Résultats - Conclusions

Aucun gradient linéaire n’a été obtenu. Le gradient obtenu était un gradient échelonné - Un premier plateau aux alentours de 55% de saccharose a été observé sur les 3,5 premiers litres du gradient et un second plateau a été observé aux alentours de 5% de saccharose sur les 3 derniers litres du gradient. La partie linéaire du gradient s’est étendue uniquement de 3,5L à 5L, à savoir le gradient était linéaire sur 1,5L, c’est-à-dire sur seulement environ 20% de son volume total.

Exemple III : Formation de gradient pour un rotor de 8L - Gradient préformé 111.1 La même centrifugeuse et le même rotor que dans l’Exemple II ont été utilisés. Le premier (récipient 1) contenait 4L de tampon de PBS/Citrate 125mM comprenant 55% de saccharose. Le second (récipient 2) et le troisième (récipient 3) contenaient chacun 1L de tampon PBS/Citrate 125mM. Le récipient 1 était raccordé au récipient 2 qui était raccordé au récipient 3. Les liquides dans les récipients 2 et 3 ont été mélangés par un agitateur magnétique à une vitesse de 90 tr/min. Le récipient 3 a été raccordé à travers une pompe à la partie inférieure du rotor K10/8L qui a été rempli de tampon de PBS/Citrate 125mM. Lorsque la pompe a été allumée à un débit de 160 ml/min, un vide s’est créé dans les récipients 2 et 3 et le saccharose provenant du récipient 1 a été tout d’abord dilué dans le récipient 2, dont le contenu a été ultérieurement dilué dans le récipient 3, dont le contenu a été injecté dans le rotor (Figure 3A). Une fois le récipient 1 vide, le gradient a été formé dans le rotor et la centrifugeuse a été démarrée. La centrifugation a été réalisée à 35000 tr/min. Après la formation, des fractions successives de 250 ml du gradient ont été récoltées et analysées pour leur teneur en saccharose par réfractométrie (% Brix) afin de vérifier la linéarité du gradient. Les résultats sont indiqués sur la Figure 3B. Résultats - Conclusions

En utilisant le procédé ci-dessus qui s’appuie sur la dilution progressive successive d’une solution mère unique de 55% de saccharose avant l’injection dans un rotor de 8L, un gradient a été obtenu qui est sensiblement linéaire, à savoir linéaire sur la plupart de son volume. En particulier, aucun plateau significatif à chaque extrémité du gradient a été observé (aux alentours de 55% de saccharose et 5% de saccharose), par opposition aux deux plateaux observés sur la Figure 2 à ces pourcentages de saccharose. La partie linéaire du gradient s’est étendue d’environ 1L à environ 7L, à savoir le gradient était linéaire sur 6L, à savoir sur environ 75% de son volume total. Les inventeurs ont également vérifié la linéarité du gradient avant centrifugation et ils ont observé une courbe similaire à celle présentée sur la Figure 3B. III.2 La même centrifugeuse et le rotor que dans l’Exemple II ont été utilisés. Le premier (récipient 1) contenait 4L de tampon PBS/Citrate 125mM comprenant 55% de saccharose. Le second (récipient 2) contenait 1L de tampon PBS/Citrate 125mM. Le récipient 1 était relié au récipient 2 qui était relié à travers une pompe à la partie inférieure du rotor K10/8L qui a été rempli de tampon PBS/Citrate 125mM. Le liquide dans le récipient 2 a été mélangé par un agitateur magnétique à une vitesse de 90 tr/min. Quand la pompe a été allumée à un débit de 160 ml/min, un vide a été créé dans le récipient 2 et le saccharose provenant du récipient 1 a été dilué dans le récipient 2, dont le contenu a été injecté dans le rotor (Figure 4A). Une fois le récipient 1 vide, le gradient a été formé dans le rotor et la centrifugeuse a été démarrée. La centrifugation a été réalisée à 35000 tr/min. Après la formation, des fractions successives de 250 ml du gradient ont été récoltées et analysées pour leur teneur en saccharose par réfractométrie (% Brix) afin de vérifier la linéarité du gradient. Les résultats sont indiqués sur la Figure4B. Résultats - Conclusions

En utilisant le procédé ci-dessus qui s’appuie sur la dilution progressive successive d’une solution mère unique de 55% de saccharose avant l’injection dans un rotor de 8L, un gradient a été obtenu qui est linéaire sur les 5 premiers litres de son volume, à savoir sur environ 62% de son volume total. Un plateau à 5% de saccharose a été observé sur les 3 derniers litres du gradient, à savoir représentant environ 40% de son volume total. Les inventeurs ont également vérifié la linéarité du gradient avant centrifugation et ils ont observé une courbe similaire à celle présentée sur la Figure 4B.

Exemple IV : Rendement et pureté du virus

Un gradient de saccharose de 0-55% a été formé soit dans un rotor K3/3,2L comme décrit dans l’Exemple I ou dans un rotor K10/8L comme décrit dans l’Exemple III.1. Une fois que la centrifugeuse a atteint une vitesse de 35000 tr/min, un fluide contenant un virus de la grippe entier dérivé d’une culture cellulaire a été chargé sur chaque rotor pour la purification du virus. 17L dudit fluide par L de rotor ont été chargés sur le rotor de 3,2L et 35L du même fluide par L de rotor ont été chargés sur le rotor de 8L avec un temps de cerclage d’1 heure. Le virus entier purifié a été regroupé depuis les fractions de gradient correspondant à un pourcentage de saccharose allant de 23% à 50% (rotor de 3,2L) ou 11% à 42% (rotor de 8L). Ces plages ont été déterminées sur la base de profils provenant de SDS-PAGE et à partir d’une analyse Western Blot utilisant des anticorps anti-HA. La teneur en protéine HA (Hémagglutinine) a été évaluée par un test SRD (comme décrit dans l’Exemple V) avant et après la centrifugation, de sorte que le pourcentage de « récupération de HA » après l’étape de centrifugation en gradient de saccharose puisse être calculé. Le pourcentage de « pureté » représente le pourcentage de protéine HA sur le total des protéines obtenues à la fin de la centrifugation. Le pourcentage de « suppression de protéine » représente l’élimination des protéines totales suite à l’étape de centrifugation en gradient de saccharose. La concentration totale de protéine a été évaluée par la méthode Lowry avant et après la centrifugation, de sorte que le pourcentage de « pureté » et le pourcentage de « suppression de protéine » après l’étape de centrifugation en gradient de saccharose puissent être calculé. Les résultats sont indiqués dans le Tableau 1.

Tableau 1 - Rendement et pureté du virus après ultracentrifugation en gradient de saccharose

Résultats - Conclusions

Le procédé pour créer un gradient de saccharose linéaire préformé dans un rotor à capacité élevée de 8L permet d’obtenir un virus de la grippe (après purification par centrifugation) avec un rendement similaire et un niveau de pureté similaire à celui obtenu lors de l’utilisation d’un rotor plus petit de 3,2L. Un tel résultat indique qu’avec un tel procédé, la purification de virus par centrifugation en gradient de densité peut être augmentée en réduisant le nombre d’équipements/cycles requis, sans impact sur la qualité ou la quantité du produit (rendement et pureté du virus).

Exemple V : Procédé SRD utilisé pour mesurer la teneur en HA

Des plaques en verre (12,4 - 10 cm) ont été revêtues d’un gel d’agarose contenant une concentration de sérum HA anti-grippe recommandée par le NIBSC. Une fois que le gel a durci, 72 puits d’échantillon (3 mm de diamètre) ont été poinçonnés dans l’agarose. 10 pi de dilutions appropriées de la référence et de l’échantillon ont été chargés dans les puits. Les plaques ont été incubées pendant 24 heures à la température ambiante (20 à 25°C) dans une chambre humide. Après quoi, les plaques ont été immergées toute la nuit dans une solution de NaCI et lavées brièvement dans de l’eau distillée. Le gel a ensuite été comprimé et séché. Une fois totalement sèches, les plaques ont été colorées sur une solution de Bleu Brillant de Coomassie pendant 10 minutes et décolorées deux fois dans un mélange de méthanol et d’acide acétique jusqu’à ce que des zones décolorées clairement définies deviennent visibles. Après séchage des plaques, le diamètre des zones colorées entourant les puits d’antigène a été mesuré dans deux directions perpendiculaires. En variante, un équipement pour mesurer la surface peut être utilisé. Des courbes dose-réponse de dilutions d’antigène contre la surface ont été réalisées et les résultats ont été calculés selon des procédés de test du rapport de pente standards (Finney, D.J. (1952). Statistical Methods in Biological Assay. London: Griffin, Cité dans : Wood, JM, et al (1977). J. Biol. Standard. 5, 237-247).

Claims (38)

1. REVENDICATIONS

   1. Procédé de purification d’un virus comprenant au moins les étapes suivantes : a) l’obtention d’un fluide contenant un virus ; b) la fourniture d’un gradient de densité linéaire préformé d’une plage donnée X%-Y% (en masse/volume) (X étant la limite inférieure et Y étant la limite supérieure) dans un rotor centrifuge ayant une capacité d’au moins 4L, au moins 6L, au moins 8L, ou au moins 10L, c) l’addition du fluide au gradient de densité linéaire préformé, d) la centrifugation de façon à séparer le virus des impuretés contaminantes, et e) la collecte des fractions comprenant le virus purifié, dans lequel la partie linéaire du gradient comprend le pourcentage en densité correspondant au pourcentage auquel le virus à purifier migrera.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la séparation est isopycnique
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel le gradient de densité linéaire préformé de l’étape b) est linéaire sur au moins 30%, au moins 50%, au moins 60%, au moins 70%, au moins 80%, au moins 90% de son volume total ou est linéaire sur l’intégralité de son volume.
4. 4. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel le gradient de densité linéaire préformé de l’étape b) comprend des plateaux à ses extrémités dont le volume ajouté ne dépasse pas 70%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, ou 5% de son volume total.
5. 5. Procédé selon la revendication 1 à 4, dans lequel le gradient de densité linéaire préformé de l’étape b) est formé en diluant une solution mère formant un gradient avant l’injection dans le rotor.
6. 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel la solution mère formant un gradient est une solution à Y% (en masse/volume).
7. 7. Procédé selon les revendications 5 et 6, dans lequel la solution mère formant un gradient est diluée au moins une fois dans une solution de dilution avant l’injection dans le rotor.
8. 8. Procédé selon les revendications 5 et 6, dans lequel la solution mère formant un gradient est diluée dans une première solution de dilution, ladite solution mère diluée étant diluée dans une seconde solution de dilution avant l’injection dans le rotor.
9. 9. Procédé selon les revendications 7 et 8, dans lequel la (les) solutions) de dilution ne contien(nen)t aucun milieu de gradient.
10. 10. Procédé selon les revendications 7 à 9, dans lequel la solution de dilution a, ou les solutions de dilution ont, un volume d’au moins 10%, au moins 15%, au moins 20%, au moins 25%, au moins 30%, ou au moins 50% de la solution mère formant le gradient.
11. 11. Procédé selon les revendications 7 à 9, dans lequel le rapport entre le volume de la solution mère formant le gradient et le volume de la (des) solution(s) de dilution est d’au moins 2 :1, au moins 3:1, au moins 4:1, au moins 5:1 ou au moins 6:1.
12. 12. Procédé selon les revendications 5 à 11, dans lequel la solution mère formant un gradient et la (les) solution(s) de dilution sont reliées les unes aux autres et reliées au rotor.
13. 13. Procédé selon les revendications 5 à 12, dans lequel la dilution est une dilution progressive s’appuyant sur un système de goutte à goutte.
14. 14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel le système de goutte à goutte est obtenu en créant un vide dans le(s) récipient(s) contenant la (les) solution(s) de dilution.
15. 15. Procédé selon les revendications 1 à 14, dans lequel le gradient de densité linéaire préformé de l’étape b) est un gradient de saccharose.
16. 16. Procédé selon les revendications 1 à 15, dans lequel le rotor a une capacité d’au moins 8L.
17. 17. Procédé selon les revendications 1 à 16, dans lequel le gradient linéaire préformé de l’étape b) est compris entre 0 et 55%.
18. 18. Procédé selon les revendications 1 à 17, dans lequel le virus est propagé sur des œufs.
19. 19. Procédé selon la revendication 18, dans lequel le fluide contenant le virus de l’étape a) est le fluide allantoïque collecté après inoculation d’œufs avec le virus.
20. 20. Procédé selon les revendications 1 à 17, dans lequel le virus est propagé sur une culture cellulaire.
21. 21. Procédé selon la revendication 20, dans lequel le fluide contenant le virus de l’étape a) est le milieu de culture cellulaire collecté après infection de cellules avec le virus et la libération du virus dans le milieu de culture cellulaire.
22. 22. Procédé selon les revendications 1 à 18 ou la revendication 20, dans lequel le fluide contenant le virus de l’étape a) est partiellement purifié avant d’être ajouté au gradient de densité linéaire préformé.
23. 23. Procédé selon la revendication 22, dans lequel le fluide contenant le virus a été clarifié.
24. 24. Procédé selon les revendications 1 à 23, dans lequel la centrifugation est réalisée en mode par lots.
25. 25. Procédé selon les revendications 1 à 23, dans lequel la centrifugation est réalisée en mode continu.
26. 26. Procédé selon la revendication 25, dans lequel la centrifugeuse est démarrée après l’étape b) et avant l’étape c).
27. 27. Procédé selon les revendications 1 à 26, comprenant en outre une étape d’inactivation du virus.
28. 28. Procédé selon la revendication 27, dans lequel l’inactivation est réalisée avec de la bêta-propiolactone, UV ou les deux.
29. 29. Procédé selon la revendication 27, dans lequel l’inactivation est effectuée avec du formaldéhyde.
30. 30. Procédé selon les revendications 1 à 29, comprenant en outre une étape de fragmentation de virus.
31. 31. Procédé selon les revendications 1 à 30, dans lequel le virus est un virus de la grippe.
32. 32. Procédé selon la revendication 31, dans lequel le virus de la grippe est de sous-type H2, H5, H6, H7 ou H9.
33. 33. Procédé selon la revendication 31, dans lequel le virus de la grippe est de sous-type H1, H3 ou B.
34. 34. Procédé selon les revendications 20 à 33, dans lequel le virus est propagé sur des cellules mammifères ou aviaires.
35. 35. Procédé selon la revendication 34, dans lequel le virus est propagé sur des cellules souches embryonnaires de canard telles que des cellules EB66®.
36. 36. Procédé pour la préparation d’un vaccin, dans lequel le virus à utiliser comme antigène dans le vaccin st purifié selon le procédé des revendications 1 à 35 et le virus purifié est formulé dans un vaccin.
37. 37. Procédé pour la préparation d’un vaccin comprenant au moins les étapes suivantes : A) l’obtention d’un fluide contenant un virus, B) la fourniture d’un gradient de densité linéaire préformé d’une plage donnée X%-Y% (en masse/volume) (X étant la limite inférieure et Y étant la limite supérieure) dans un rotor centrifuge ayant une capacité d’au moins 4L, au moins 6L, au moins 8L, ou au moins 10L, dans lequel la partie linéaire du gradient comprend le pourcentage de densité correspondant au pourcentage auquel le virus migrera. C) l’addition du fluide au gradient de densité linéaire préformé, D) la centrifugation de façon à séparer le virus des impuretés contaminantes, et E) la collecte des fractions comprenant le virus purifié, F) la formulation du virus purifié dans un vaccin.
38. 38. Procédé selon la revendication 37, comprenant une ou plusieurs caractéristiques selon l’une quelconque des revendications 2 à 35.