KR20100075865A

KR20100075865A - 바이러스성 백신의 제조 방법

Info

Publication number: KR20100075865A
Application number: KR1020107006633A
Authority: KR
Inventors: 오트프리드 키스트너; 크리스타 타우어; 노엘 바렛; 볼프강 문트
Original assignee: 백스터 인터내셔널 인코포레이티드; 박스터 헬쓰케어 에스.에이.
Priority date: 2007-08-28
Filing date: 2008-08-28
Publication date: 2010-07-05
Also published as: US8497112B2; CA2696090A1; ES2459166T3; RU2496519C2; CA2696090C; BRPI0816130A2; KR101760844B1; US20130287811A1; AU2008293513B2; US20090060950A1; HRP20140375T1; CN101790381B; JP2010537641A; WO2009029695A1; EP2192917A1; HK1143328A1; JP5535910B2; AU2008293513A1; IL203869A; SG10201404101RA

Abstract

본 발명은 a) 액체 중의 감염성 바이러스로 세포를 접종하는 단계, b) 상기 세포 내에서 상기 바이러스를 번식시키는 단계, c) 상기 번식된 바이러스를 수집하는 단계, d) 상기 수집된 바이러스를 불활화하는 단계, 및 e) 상기 불활화된 바이러스를 세제로 처리하여 바이러스성 항원 포함 제제를 생성시키는 단계를 포함하는 바이러스 항원 포함 제제의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

바이러스성 백신의 제조 방법{METHOD FOR PRODUCING VIRAL VACCINES}

본 발명은 바이러스 백신의 제조 방법에 관한 것이다.

백신은 항원 물질, 예컨대, 바이러스, 이의 외피, 입자 또는 이것의 단백질 항원과 같은 (비-감염성) 병원체로 된 면역원성 조성물이다. 투약 또는 예방접종은 대상체, 즉 사람 또는 새와 같은 포유류의 면역화를 가져온다. 예방접종은 백신에 대한 특이한 반응 및 약간의 가벼운 염증을 유발할 수 있으나, 이것은 일반적으로 백신이 예방하려고 계획된 완전 독자 생존가능한 바이러스의 감염보다는 훨씬 덜 해롭다. 대상체의 면역체계는 그 자신이 백신의 항원을 특이하게 인식하고 병원체에 대한 추가적인 노출이 있은 후 신속히 병원체를 불활화하도록 적응할 것이다. 따라서 예방접종을 통해서 병원체에 대한 증가된 저항력이 얻어진다.

백신의 목적으로 바이러스는 적합한 세포 배양 또는 일반적으로 세포 기질 위에서 평범하게 배양된다. 인플루엔자의 경우, 일반적으로 발육 계란이 사용된다. 감염성 바이러스 채취물은 수집되고 원치 않는 비-바이러스성 세포 구성성분들을 제거하기 위하여 정제된다. 특히, 특정한 민감한 개인들에서 닭 기질로부터 유래된 백신은 닭/계란 단백질에 대한 알러지 반응을 일으킬 수 있다.

바이러스성 백신의 제조에서 필수적인 단계는 감염성 바이러스의 불활화이다. 포르말린(포름알데하이드의 수용액)은 백신의 제조에서 불활화제로 가장 빈번하게 사용된다. 이것은 대체로 약 37 % 포름알데하이드의 농도를 가진 포화 수용액으로 사용된다. 포름알데하이드는 표면 단백질 내의 1차 아민기와 단백질 또는 DNA 내의 인접한 다른 질소 원자를 -CH₂- 결합을 통해 비가역적으로 가교결합하여 바이러스를 불활화시킨다. 특히, 이러한 교차 결합은 비-바이러스성 물질과의 결합으로 이끌 수 있고 따라서 살아있는 감염성 바이러스 상에 약간의 사전 정제를 수행하는 것이 필요한데, 정제에 앞선 불활화는 바이러스성 단백질과 불순물 사이에 많은 양의 비가역적 화학적 가교형성(bridging)을 생기게하고, 이것은 정제 작업의 효능과 제품의 품질에 해롭기 때문이다. 이러한 이유로, 살아있는 감염성 바이러스들은 처음에 종래 기술, 예컨대 조널(zonal) 초원심분리로 적어도 부분적으로 정제되고 난 후 불활화된다(미국특허 제6,048,537호). 포르말린 불활화 단계는 확립된 분석 방법으로 입증되었다.

포르말린 처리에 덧붙여, UV 불활화가 제조 과정에 통합되는 것이 고려되어왔다. 자외선 조사-불활화의 인간 백신에의 사용은 외피 없는 및 외피 바이러스에 대해서보다 앞서 입증되었다(미국특허 제2006/0270017호). 바이러스 게놈은 UV-손상에 대해 바이러스 표면 항원보다 더 민감한 바, UV-불활화는 제품의 생화학적 특징 또는 면역원성에 거의 부정적인 효과를 갖지 않는 것으로 나타났다. UV 불활화의 표적은 포르말린의 표적이 되는 단백질과는 대조적으로 주로 핵산이다.

포르말린과 UV-불활화를 조합함으로서 과학자들은 특히 회복력 있는 바이러스 계열을 불활화시키는 경우 독립된 UV-불활화 또는 포르말린-불활화 각각의 한계를 극복하려고 노력했다.

다르게는, 많은 제조업자들은 생 바이러스를 불활화하고 바이러스를 변형하는데 세제-기반 과정 단계를 사용했다. 이러한 세제-기반 과정은 조각(부분적으로 분쇄된) 또는 서브 유닛(완전히 분쇄된) 백신 항원을 얻기 위해 인플루엔자 바이러스의 지질 외피를 분쇄한다. 세제 처리는 종종 바이러스 항원의 반응성을 감소시키고, 따라서 예방접종 동안의 원치 않는 부작용을 감소시킨다. 세제 처리된 바이러스는 추가적으로 불활화, 예컨대, 포르말린 처리될 수 있다. 이러한 방법들의 예는 미국특허 제6,048,573호, 제4,522,809호 및 제WO 02/09702호에서 찾을 수 있다. 이러한 접근의 단점은 바이러스가 분쇄 단계에 앞서 다양한 정제 단계를 거치고, 따라서 살아있는 감염성 바이러스가 여러 단계에 거쳐 제조 구성원들에 의해 조작된다는 것이다. 이것은 H5N1 균주와 같은, 특히 감염성 강한 형태의 인플루엔자에 대한 백신을 제조하는 경우 특히 우려되는 것이다.

<발명의 요약>

본 발명의 목적은 감소된 반응성을 가진 바이러스성 항원을 생산하면서 감염성 물질의 조작이 요구되는 단계의 수는 적어진 바이러스성 백신을 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

따라서 본 발명은

a) 유체 중의 감염성 바이러스를 세포에 접종하는 단계,

b) 상기 세포 내에서 상기 바이러스를 번식시키는 단계,

c) 세포 배양 상청액 내 상기 번식된 바이러스를 수집하는 단계,

d) 상기 수집된 바이러스의 불활화하는 단계, 및

e) 상기 불활화된 바이러스를 세제로 처리하여 바이러스 항원 포함 제제를 생성시키는 단계

를 포함하는 바이러스 항원 포함 제제의 제조 방법을 제공한다.

두번째 측면으로,

a) 감염성 바이러스를 포함하는 유체를 수득하는 단계,

b) 상기 수집된 바이러스를 완전히 불활화하는 단계,

c) 상기 불활화된 바이러스를 세제로 처리하는 단계 및

d) 상기 불활화된 바이러스를 정제하여 바이러스성 항원 포함 제제를 생성시키는 단계를 포함하는 바이러스성 항원을 포함하는 제제의 제조 방법이 제공된다.

발명의 다른 측면은 본 발명의 방법에 따라 제조된 바이러스성 항원으로부터 제조된 백신 제제를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 바이러스성 항원 포함 제제를 제조하는 단계 및 대상체에 상기 제제를 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 바이러스성 감염에 대한 저항성의 증가 방법을 제공한다.

도 1a는 번식 이후의 바이러스 수집에서 불활화된 채취까지의 발명 진행과정의 흐름도이다.
도 1b는 불활화된 채취에서 항체 제제 원액까지의 발명 진행과정의 흐름도의 연장이다.

<발명의 상세한 설명>

본 발명은

a ) 유체 중의 감염성 바이러스를 세포에 접종하는 단계,

b) 상기 세포 내에서 상기 바이러스를 번식시키는 단계,

c) 상기 번식된 바이러스를 수집하는 단계,

d) 상기 수집된 바이러스를 불활화하는 단계, 및

e) 상기 불활화된 바이러스를 세제로 처리하여 바이러스 항원 포함 제제를 생성시키는 단계를 포함하는 바이러스 항원 포함 제제의 제조 방법을 제공한다. 이러한 진행과정의 중심은 활성 바이러스 상에 수행되는 단계의 수를 감소할 수 있고 따라서 바이러스는 세제 처리 및/또는 임의적인 정제 단계에 앞서 최초의 채취물을 수집한 후 불활화된다는 것이다.

본 발명에 따른 "바이러스 항원"은 상기 항원에 대하여 대상체 내에서 면역 반응을 유발할 수 있는 바이러스 또는 바이러스의 일부이다. 대상체이 완전한 면역력을 갖도록 하는 측면에서 절대적인 성공이 요구되지는 않으나 추가적인 노출 후에 상기 바이러스와 관련된 질병의 발병 기회를 감소시키는 상기 바이러스에 대한 면역 방어 또는 면역 반응의 증가 측면에서 이해되어야 한다. 이러한 바이러스 항원은, 예컨대, 전체 불활화된 바이러스, 조각난 바이러스, 변형된 바이러스, 바이러스성 단백질, 특히, 헤마글루티닌 또는 뉴라미니다아제와 같은, 표면 단백질 일 수 있다. "백신"은 주입, 경비 또는 경피 투여와 같은 투여를 위한 형태의 상기 바이러스 항원 제제이다. 본 발명에 따른 "정제"는 채취된 유체의 비-바이러스성 구성성분을 제거하는 단계에 관련된다. 수집 단계 후에 얻을 수 있는 채취된 유체는 바람직하게는 고형물 또는 거대한 불순물들, 예컨대 남아있는 무상 세포 또는 바이러스 번식 동안 파열된 감염된 세포의 세포 조각들이 침전, 즉 원심분리를 통하여 제거된 정제된 상청액이다. 따라서 "수집"은 유체, 특히 투명한 유체 내의 전체 감염성 바이러스를 수득하는 임의의 단계를 의미한다. 세포 조각의 제거를 떠나서 수집 단계는 또한 세포 성장 매체 또는 기질, 예컨대 세포가 배양되는 임의의 종류의 기질의 다른 고형물 구성성분들을 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 번식된 전체 바이러스는 그것이 수집될 수 있었던 상기 세포 배양 상청액으로 방출된다. 따라서 본 발명의 구체적인 실시태양에서 번식된 바이러스의 수집 단계는 감염 후 세포 및/또는 상기 세포의 세포 조각으로부터 바이러스의 분리를 포함한다. 이러한 분리는 유체로부터 눈에 보이는 입자들을 분리하는, 예컨대 약 2000 g 내지 3000 g, 5000 g 이하, 10000 g, 15000 g 또는 20000 g의 저속의 원심분리로 가능할 수 있다. 다르게는, 분리는 여과에 의해 수행될 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에서 예컨대, 바이러스 번식에 사용되는 세포, 예컨대, 배아 란 대신 포유류, 조류 또는 곤충류 세포 배양물의 선택으로, 상기 유체에는 알란토인, 콜라겐 및/또는 난백 알부민과 같은 알부민이 실질적으로 없다. 본 발명의 구체적인 실시태양으로, 아프리카 녹색 원숭이 장기(VERO) 세포가 바이러스의 번식에 사용되었다.

수집 단계 후에 바이러스는 바이러스 불활화를 위한 임의의 공지의 수단, 예컨대 본원에 참고문헌으로 도입된 미국 공개 특허 제2006/0270017 A1호에 개시된 대로 불활화된다. 구체적으로, 불활화는 포름알데하이드 처리 및/또는 자외선 조사 단독으로 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있다. 본원에서 사용된 "완전한 불활화" 또는 "완전히 불활화되었다"는 것은 바이러스의 번식에 관한 경우, 바이러스의 번식이 계(鷄) 배 섬유아세포(CEF) 또는 VERO 세포 상의 바이러스의 번식의 배양에 의해 결정된 배아 프라그 생성 단위(pfu,)를 포함하지 않는다는 것을 의미한다.

본 발명의 방법의 이로운 효과들 중 하나는 특이한 안전책이 요구되는 감염성 바이러스성 매체에 수행되는 단계의 감소이다. 관련 분야에서 포르말린 처리 동안 바이러스와 가교 결합을 형성할 수 있는 비-바이러스성 단백질 또는 핵산을 실질적으로 감소시키거나 제거하기 위해서는 최초의 채취물에 정제 단계를 수행하는 것이 필요하다고 여겨졌다. 이러한 편견은 정제에 앞서 바이러스 수집 단계 직후에 불활화를 하는 것이 사실상 가능하며 또한 이롭기까지 함을 보인 본 발명에 의해 극복되었다. 불활화 동안의 그러한 역반응을 피하기 위해, 바이러스 함유 유체, 또는 이것의 비-바이러스성 구성성분(들)은 수집 단계 동안 또는 그 후에 바람직하게는 추가적으로 농축되지 않거나 또는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2 배 미만으로 농축된다. 바람직하게는 세포 배양에서 얻은 태생의 상청액의 DNA 및/또는 비-바이러스성 단백질의 농도가 불활화 단계에 앞서 유지된다. 구체적인 실시태양에서 전체 단백질 또는 비-바이러스성 단백질 농도는 바이러스의 불활화 동안 또는 수집 이후 유체 내에서 950 ㎍/ml, 900 ㎍/ml, 850 ㎍/ml, 800 ㎍/ml, 700 ㎍/ml, 650 ㎍/ml, 600 ㎍/ml, 550 ㎍/ml, 500 ㎍/ml, 450 ㎍/ml, 400 ㎍/ml, 350 ㎍/ml, 300 ㎍/ml, 250 ㎍/ml, 200 ㎍/ml, 150 ㎍/ml, 100 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 60 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 8 ㎍/ml, 6 ㎍/ml, 4 ㎍/ml, 3 ㎍/ml, 2 ㎍/ml 미만 또는 1 ㎍/ml 미만과 같은 ㎍/ml 범위이다.

불활화를 위해서 바이러스를 불활화하는데 유효한 임의의 포름알데하이드 양 또는 자외선 조사 선량이 단독으로 또는 이들의 조합으로 선택될 수 있다. 본 출원의 바람직한 실시태양에서 샘플 내 바이러스의 불활화로 인한 바이러스의 역가 감소는 적어도 약 1×1O⁵, 더욱 바람직한 실시태양에서 적어도 약 1×10⁷, 더욱 더 바람직한 실시태양에서 적어도 약 1×1O¹⁰, 가장 바람직한 실시태양에서 적어도 약 1×1O¹⁴ 이다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 샘플은 약 12 내지 약 96 시간 동안 포르말린 유효 농도로 처리된다. 더욱 바람직한 실시태양에서, 샘플은 약 24 내지 약 48 시간 동안, 더욱 더 바람직하게는 약 24 내지 30 시간 동안 포르말린 유효 농도로 처리된다. 본 발명의 특히 바람직한 실시태양에서, 샘플은 약 24 내지 약 24.5 시간 동안 포르말린 유효 농도로 처리된다. 백신 분야의 당업자들은 단독으로 또는 자외선과 함께 완전한 불활화를 행하기 위해서 처리되는 바이러스의 특정 균주에 대하여 포르말린 농도와 처리 시간이 최적화될 필요가 있다는 것을 인식할 것이다. 추가적인 실시태양에서 포르말린 유효 농도로 샘플을 처리하는 단계는 약 10 내지 약 40 ℃에서 수행된다. 본 명세서에서 특히 바람직한 실시태양에서 포르말린 유효 농도로 샘플을 처리하는 단계는 약 32 ℃에서 수행된다

본 발명의 바람직한 실시태양은 포르말린 유효 농도로 샘플을 처리하는 것을 포함하며, 상기 포르말린 유효 농도의 범위는 유효 농도를 맞추기 위해 37 % 포르말린 용액을 사용하는 경우 각각 바람직하게는 약 0.01 % 내지 약 1 %(w/w), 바람직하게는 약 0.01 % 내지 약 0.1 %, 더욱 바람직하게는 약 92 mg/l 내지 약 368 mg/l에 해당하는 약 0.025 % 내지 약 0.1 % 이다.

본원에서 사용된 용어 "자외선"은 100 내지 400 nm 파장을 가지는 자외선을 의미한다. 자외선은 자외선 C (100 내지 280 nm), 자외선 B (280 내지 320 nm), 및 자외선 A(320 내지 400 nm)로 구성되는 그룹에서 선택될 수 있다. DNA 사이에 들어가고 자외선에 의해 불활화되는 이러한 감방사선성제, 예컨대, 소랄렌(psoralens)은 자외선의 불활화 효과를 증강하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 자외선은 약 100 내지 약 280 nm의 파장을 가지는 자외선 C 이다. 본 발명의 더욱 바람직한 실시태양에서, 자외선은 약 240 내지 약 290 nm의 파장을 가진다. 본 발명의 특히 바람직한 실시태양에서 85 % 이상의 자외선이 약 254 nm의 파장을 가진다.

자외선 방출은 연속 형태의 자외선 방출, 예컨대 수은 램프 기술, 또는 펄스 자외선(pulsed UV light), 예컨대 단색 레이져 기술일 수 있다. 원하는 자외선 강도는 두개 이상의 램프를 조합하여 발생될 수 있다. 본 발명의 주제는 자외선의 임의의 유효량, 즉 바람직하게는 포르말린 처리와 조합되는 경우 주어진 바이러스를 안전하게 불활화시키는 자외선의 임의의 선량을 아우른다. 백신 분야의 당업자들은 단독으로 또는 포르말린 처리와 함께 완전한 불활화를 행하기 위해 처리되는 바이러스의 특정 균주에 대해 자외선 파장 및 노출이 최적화될 필요가 있다는 것을 인식할 것이다. 유효량은 당 분야에 일반적으로 공지된 다양한 요인들, 예컨대 램프와 챔버의 크기와 직경, 바이러스 포함 매체와 자외선원 간의 거리, 챔버 재료의 흡광도 및 반사성과 같은 자외선 불활성 챔버의 물리적 변수에 의존할 수 있다. 마찬가지로, 자외선 C의 파장 및 강도 뿐만 아니라 바이러스가 자외선에 노출되는 접촉 시간도 또한 유효량을 위해서 대단히 중요하다. 추가적으로, 유효량은 또한 바이러스 그 자체, 바이러스 포함 매체 및 그들의 흡광 속성에 영향받는다. 유효량은 바람직하게는 샘플 내 포함된 바이러스의 적어도 99.99 %를 불활화, 더욱 바람직하게는 포유류 또는 조류 세포 배양 시험에서 활성 바이러스가 감지되지 않거나, 또는 완전히 불활화되는 수준으로 바이러스를 불활화하기에 충분하다. 자외선 C를 사용하는 바람직한 실시태양에서 바이러스 포함 샘플은 약 5 내지 약 200 mJ/cm² 범위의 유효량에 노출된다. 바람직한 실시태양에서 유효량은 약 20 내지 약 100 mJ/cm² 범위, 다른 바람직한 실시태양에서 유효량은 약 40 내지 약 90 mJ/cm² 범위이다. 바람직한 실시태양에서, 유효량은 최초 바이러스 역가를 1x10⁵ 감소시킨다. 원액 백신 불활화에서, 유효량은 화학적(포르말린) 불활화 단계 후에 존재할 수 있는 임의의 잔여 생 바이러스를 제거하는데 충분해야 한다. 실시예에 기재된 바와 같이, 매우 민감한 포유류의 세포 배양 감염 시험, 예컨대 실시예 1.3 에 묘사된 Vero 세포 배양 시험에서 결정될 수 있다.

불활화 후에 바이러스 항원들은 정제된다. 정제는 바람직하게는 예컨대, 적어도 50000 g, 60000 g, 70000 g, 80000 g, 또는 90000 g, 또는 최대 200000 g, 180000 g, 160000 g, 140000, g 120000 g 또는 110000 g과 같이 약 100000 g 범위에서 초원심분리로 수행된다. 초원심분리 방법은 당 분야에서 공지되어 있고 예컨대 본원에 참고문헌으로 도입된 미국 특허 제6,048,537호에 개시된 바와 같이, 바이러스성 백신의 일상적인 제조에서 사용된다. 바람직하게는 초원심분리는 원심분리 동안 그것이 확립되는 자당 밀도 구배에서 수행된다. 특히 바람직한 실시태양에서 자당 구배는 자당(또는 당 분야에 공지된 임의의 다른 적절한 탄수화물 또는 설탕) 약 42 % 내지 55 % (w/w-%)의 용액을 사용하여 형성된다. 초원심분리를 위하여 연속-흐름 원심분리가 사용될 수 있다. 초원심분리 후의 분별을 위한 변수들은 사용된 바이러스 균주의 특징에 의존한다. 피크 풀 분획물(peak pool fractions)의 수집을 위한 변수들은 각각의 바이러스 균주들에 대해 개별적으로 평가되고 결정되고 자당 약 46 - 50 % 내지 34 - 38 %의 범위이다. 바람직하게는 비-바이러스성 물질들(예컨대, 이 단계에서 전체 불활성 바이러스)은 밀도 분리에 의해 제거된다. 리포솜 및 단백질을 포함하는 세포막 파편 각각은 특징적인 특이한 밀도를 가진다. 단백질, 핵산 및 외피 바이러스의 경우 또한 막의 특유한 조성물인 바이러스는 그들의 특이한 밀도를 이용하여 비-바이러스성 물질로부터 정제할 수 있다. 특히 전체 바이러스성 항원은 불완전한 바이러스 부분으로부터 정제될 수 있고, 역의 경우도 가능하다.

상기 불활화 바이러스 정제 단계는 바이러스로부터 용해성 비-바이러스성 물질을 적어도 부분적으로 제거하는 것을 포함한다. 특히 용해성 비-바이러스성 물질은 원 세포 매체 또는 배양물의 세포에서 얻은 세포 단백질 또는 세포 핵산을 포함한다. 불완전 바이러스 일부를 포함하는, 비-바이러스성 물질은, 정제 동안 바람직하게는 적어도 20 %, 바람직하게는 적어도 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % 또는 적어도 90 % 양만큼 감소한다.

특히 바람직한 실시태양에서, 수집된 유체는 뉴클레아제로 처리되어 숙주 세포의 핵산을 저하시킨다. 상기 뉴클레아제는 예컨대, 벤조나아제일 수 있다.

본 발명의 추가적인 실시태양에서, 세포 배양 및 바이러스성 번식에 사용되는 세포는 원시 세포 또는 바이러스 생산에 적합한 임의의 배양된 세포주일 수 있다. 사용될 수 있는 세포의 예로, 포유류 세포(예컨대, CHO, BHK, VERO, HELA 또는 perC6 세포), 조류 세포(계 배 섬유 아세포 또는 조류로부터의 연속 세포주) 및 곤충 세포(예컨대, Sf9 세포)를 들 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에서 세포들은 세포 배양물의 형태이다. 본 발명의 방법은, 상기 불활화 시약의 잠재적인 가교 결합 속성에도 불구하고 물질을 조각내는 것을 포함하는 효과적인 정제를 가능케 한다. 난 성장 바이러스와 대조적으로, 세포 배양에서 얻어진 바이러스는 더 높은 최초 정제도를 가지며, 알부민 및 콜라겐이 없어 포르말린 처리된 수집물의 정제에서 중요한 장점을 나타낸다. 결과된 생성물의 혁신적인 제제는 토코페롤 또는 라우레스-9(laureth-9)와 같은 안정제에 대한 어떠한 필요도 없이 응결로부터 자유롭다.

본 발명에서, 불활화되는 바이러스들은 단일 또는 이중 (DNA) 가닥 게놈을 가지는, 센스 또는 안티센스, 연속적이거나 또는 분절된, 외피 DNA 또는 RNA 바이러스에서 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 플라비바이러스, 토가바이러스, 레트로바이러스, 코로나바이러스, 필로바이러스, 라브도바이러스, 부냐바이러스, 오르쏘믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 아레나바이러스, 헤파드나바이러스, 헤르페스바이러스, 및 폭스바이러스를 포함하는 외피 바이러스 그룹에서 선택된다. 다른 바람직한 실시태양으로, 바이러스들은 플라바이러스, 코로나바이러스, 오르쏘믹소바이러스, 또는 토가바이러스이다. 인플루엔자 A, B 또는 C 균주를 포함하는 인플루엔자, 웨스트 나일, 및 로스 리버 바이러스(RRV.)와 같은 외피바이러스가 특히 바람직하다. 본 발명의 다른 바람직한 실시태양에서, 바이러스들은 플라비바이러스, 토가바이러스, 레트로바이러스, 코로나바이러스, 필로바이러스, 라브도바이러스, 부냐바이러스, 오르쏘믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 및 아레나바이러스를 포함하는, 외피 RNA 바이러스 군에서 선택된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 바이러스는 오르쏘믹소바이러스, 예컨대, 인플루엔자 바이러스 균주: 헤마글루티아닌 및 뉴라미다아제 표면 단백질의 가지각색의 조합을 가질 수 있는 인플루엔자 바이러스 균주에서 선택된다. 또 다른 특히 바람직한 예에서, 바이러스는 토가바이러스, 예컨대 RRV와 같은 알파바이러스에서 선택된다. 원액 바이러스성 용액으로 사용하기 위한 또 다른 바람직한 바이러스 군은, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS)와 관련된 바이러스를 포함하는 코로나바이러스이다. 바람직한 바이러스의 또 다른 군은 일본 뇌염, 진드기 매개 뇌염(TBE), 댕기열 바이러스, 황색열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스 및 출혈열 바이러스를 포함하는 플라비바이러스이다. 바이러스의 또 다른 바람직한 군은 오르쏘폭스바이러스(예를 들면, 백시니아 또는 변형된 백시니아 앙카라 바이러스)를 포함하는 폭스바이러스, 및 아비폭스바이러스이다.

추가적인 실시태양에서, 정제된 바이러스는 추가적으로 처리된다. 정제 이후에 추가적인 단계는 정제된 바이러스의 희석을 포함할 수 있고, 특히 약 40% 자당을 포함하고 있을 것으로 기대되는 점성 피크 풀 분획물을 희석하기 위한 자당 초원심분리 후이다. 정제된 바이러스는 균질화, 추가적으로 뉴클레아제 처리, 압력 및/또는 초/정용여과될 수 있다.

본 발명의 실시태양에서, 바이러스는 변형된 전체 바이러스 또는 조각난 바이러스 백신을 생산하기 위한 세제 처리에 의해 변형된다. 바이러스의 지질 외피의 변형은 바이러스, 특히 바이러스성 지질 외피 막을 불안정화 또는 분해하기에 적합한 농도의 트리톤 X100(Triton XlOO)과 같은 세제로 가용화하여 수행된다. 세제 처리는 적어도 부분적으로는 상기 바이러스의 막을 제거할 것이다. 바람직하게는 세제 농도는, 예컨대 정용여과 또는 크로마토그래피 공정으로 제거된다. 세제 처리 단계에서 사용되기 위한 세제로 이온성(양이온성, 음이온성, 쯔비터이온성) 세제 또는 비-이온성 세제를 들 수 있다. 적절한 세제로 세제의 트윈 그룹(Tween group) (예컨대, 트윈 80(Tween 80)), 및 세제의 트리톤 그룹(Triton group) (예컨대, 트리톤 100(Triton 100))을 들 수 있다.

임의로는, 바이러스성 항원 제제는 추가적인 포름알데하이드 처리 또는 본원에 참고문헌으로 도입된 WO 02/097072 A2에 개시된 세제의 사용과 같은 안정제 첨가에 의해 추가적으로 안정화될 수 있다. 상기 세제는 예컨대 트윈 80, 트리톤 X 100, 데옥시콜레이트, 라우레스-9 및 토코페롤과 같은 HA 단백질을 안정화하는데 적합한 세제이다. 막 구성성분 및 세제의 복합 미셀에 의해 표면 단백질은 용해된 상태로 있게 된다고 생각된다.

특히 바람직한 실시태양에서, 상기 바이러스는 희석, 균질화, 뉴클레아제 처리, 압력 여과, 초/정용여과, 가용화, 정용여과, 포름알데하이드 처리, 희석, 초/정용여과, (세제) 안정제 첨가에 의한 안정화, 2차 균질화 및 살균 여과의 단계 중 임의의 하나를 포함하는 추가적인 처리를 거쳐 조각난 바이러스가 된다.

다른 특정한 바람직한 실시태양에서, 바이러스는 희석, 균질화, 뉴클레아제 처리, 압력 여과, 세제 처리, 초/정용 여과, 안정제 첨가, 2차 균질화 및 살균 정제의 단계 중 임의의 하나를 포함하여 추가적으로 가공되어 변형된 바이러스 제제가 된다. 특히 세제 안정화는 외피 바이러스의 경우에 세제를 바이러스성 막에 도입하여, 완전 바이러스의 안정성을 증가시키도록 수행되고, 따라서 변형된다.

추가적인 실시태양에서, 바이러스는 단일 바이러스성 서브유닛 또는 바이러스성 단백질, 특히 히메그 - 구티닌 ( heamag - gutinin ) 또는 뉴라미니다제 같은 표면 단백질의 단리를 포함하는 서브-유닛 백신으로 가공된다. 단리는 예컨대, 친화성 정제 및/또는 이온 교환크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 방법으로 수행될 수 있다.

놀랍게도 본 발명의 방법은 바이러스 항원 백신의 산업적 규모의 생산에 적합하다. 따라서 바람직하게는 불활화 또는 임의의 다른 단계, 예를 들면 접종, 번식, 수집 또는 정제는 적어도 바이러스 또는 바이러스성 항원 포함 유체의 0.5 l, 1 l, 2 l, 3 l, 4 l, 5 l, 6 l, 7 l, 8 l, 9 l, 10 l, 12 l, 14 l, 16 l, 18 l, 20 l, 25 l, 30 l, 35 l, 40 l, 60 l, 80 l, 100 l, 120 l, 140 l, 160 l, 180 l, 200 l의 양으로 수행되거나 또는 그 양으로 수득된다.

본 발명의 추가적인 측면은

a) 감염성 바이러스를 포함하는 유체를 얻는 단계,

b) 상기 수집된 바이러스를 완전히 불활화하는 단계,

c) 상기 불활화된 바이러스를 세제로 처리하는 단계,

d) 상기 불활화된 바이러스를 정제하여 바이러스성 항원 포함 제제를 생성시키는 단계를 포함하는 바이러스성 항원 포함 제제의 생산 방법을 또한 제공한다. 물론, 상기에 개시된 바와 같은, 임의의 세포 상청액에서 얻을 수 있는 감염성 바이러스를 포함하는 유체 그 자체를, 불활화, 세제 처리, 및 정제에 사용하는 것 또한 가능하다. 바람직하게는 상기 감염성 바이러스를 포함하는 유체는 세포 배양으로부터 얻는다.

특히 바람직한 실시태양에서, 바이러스 항원, 특히 조각난 바이러스 또는 변형된 바이러스 항원들은, 트윈 80의 유효량, 특히 바람직하게는 약 0.125 % 농도, 예컨대0.01 %, 0.05 % 또는 0.4 % 초과 및 0.6 %, 0.5 %, 0.4 %, 0.3 %, 또는 0.2 % 미만을 첨가함으로서 안정화된다. 따라서, 본 발명은 추가적인 측면으로 트윈 80을 첨가함으로서 바이러스성 항원을 안정화시키는 방법을 또한 제공한다. 본 발명에 따르면 세제로서 세제 트윈 80은 바이러스성 막을 가용화하기에는 트리톤 X100 보다 덜 강력하지만, 훨씬 더 생체적합성 있으며 백신 제제 내에서 존재할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 바이러스성 항원을 안정화시키는 유효량은 바람직하게는 예컨대 0.5 %의 높은 농도의 트리톤 X100을 사용하는 조각난 바이러스 가용화 과정에서와 같이 바이러스성 막을 가용화시키는 양 미만이다. 다른 실시태양에서 바이러스성 항원은 안정제가 없다. 특정한 실시태양에서 조각난 백신의 생산은 바이러스 채취물들이 조각화 및 정제 과정에 앞서 완전히 불활화되는 과정에 의해 제공된다. 놀랍게도, 포르말린 처리 및 UV 처리를 이용한 불활화 과정은 후속적인 세제 처리 및 정제 과정을 방해하지 않는다.

추가적인 실시태양에서, 하나 이상의 바이러스성 항원을 포함하는 백신 또는 제약학적 조성물이 제공된다. 상기 제약학적 조성물은 약제학적 운반체 및/또는 보조약을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 제약학적 운반체들로 예컨대, 안정화 염, 에뮬게이터(emulgator), 가용화제 또는 삼투-조절제(osmo-regulator), 현탁제, 증점제, 생리학적 산화 환원 전위를 유지시키는 레독스 성분이 있다. 바람직한 보조약으로 면역 반응을 증진시키기 위하여 사용되는 알루미늄 염, 마이크로에멀젼, 지질 입자, 및/또는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다. 본 발명의 추가적인 측면은, 항원 포함 백신과 같은 제약학적 조성물 또는 제제이다. 백신은 예컨대, 바이러스 관련 질병의 예방 수단으로서의 주입을 위해 사용될 수 있다. 특히 바람직한 실시태양으로 조성물 또는 백신은, 특정히 다른 바이러스 균주들, 서브타입 또는 타입, 예를 들면 A형 인플루엔자 및 B 형 인플루엔자, 특히 하나 이상의 인간 HlNl, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7 서브타입, 돼지 독감의 HlNl, H1N2, H3N1 및 H3N2 서브타입, 개 또는 말 독감의 H7N7 , H3N8 서브타입 또는 조류 H5N1, H7N2, H1N7, H7N3, H13N6, H5N9, H11N6, H3N8, H9N2, H5N2, H4N8, H10N7, H2N2, H8N4, H14N5, H6N5, H12N5 서브타입 중에서 선택된 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8의 하나 이상의 항원을 포함한다.

적절한 보조약들은 미네랄 겔, 수산화알루미늄, 표면 활성 물질, 라이소레시틴, 플루로닉 폴리올(pluronic polyols), 폴리음이온 또는 오일 내 물 또는 물 내 오일과 같은 오일 에멀젼, 또는 이들의 조합에서 선택될 수 있다. 물론, 보조약의 선택은 사용 목적에 달려 있다. 예컨대, 독성은 목적하는 대상 유기물에 의존할 수 있으며, 무독성 내지 높은 독성까지 변화할 수 있다.

본 발명의 조성물 또는 백신의 다른 바람직한 실시태양은 완충제 물질을 추가적으로 포함한다. 완충제 물질은 본 발명에 따른 조성물의 용액에서 생리학적 조건을 확립하기 위해 작업자에 의해 선택될 수 있다. pH 및 이온 강도 및 이온 함량과 같은 속성들은 원하는 대로 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 추가적인 바람직한 조성물 또는 백신은, 제약학적 허용가능한 운반체를 포함한다.

"운반체"는 희석제, 예컨대, 물, 식염수, 부형제 또는 조성물과 함께 투여될 수 있는 비히클(vehicle)을 의미한다. 고형 조성물에서, 제약학적 조성물 내 운반체는 결합제, 예컨대, 미결정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 (폴리비돈 또는 포비돈), 트라가칸트 고무(gum tragacanth), 젤라틴, 전분, 락토오스 또는 락토오스 일수화물(lactose monohydrate); 붕해제, 예컨대, 알긴산, 옥수수 전분 등; 윤활제 또는 계면 활성제, 예컨대, 스테아르산 마그네슘, 또는 소듐 라우릴 술페이트(sodium lauryl sulphate); 활택제, 예컨대, 콜로이드성 이산화 규소; 감미제, 예컨대 자당 또는 사카린을 포함할 수 있다.

하나 이상의 다른 바이러스성 항원 포함 제제의 제조 및 상기 하나 이상의 바이러스를 포함하는 상기 제제의 대상체에 대한 투여를 포함하는 대상체 내 바이러스성 감염에 대한 저항성의 증가 방법을 또한 제공한다. 상기 제제는 바람직하게는 백신이다. 본 발명에 따라 준비된 바이러스 항원을 백신으로서 또는 상기 바이러스 항원을 투여함으로서 대상체 내 바이러스성 감염에 대한 저항성을 증가키 위해 제공하는 것이 또한 고려된다.

<실시예>

실시예 1: 감염성 바이러스의 불활화

Vero 세포 배양에서 두개의 A-균주 히로시마 (HR, H3N2), 뉴 칼레도니아 (NC, HlNl) 및 하나의 B-균주, 말레이시아(MA)의 세 개의 다른 인플루엔자 균주가 생산되었다. 바이러스 번식 후에 감염성 바이러스 채취물은 도. Ia.의 흐름도에 도시된 바와 같이 정제에 앞서 불활화되었다.

1.1. 포르말린 불활화

처음의 포르말린을 이용한 불활화 단계는 무세포, 감염성 항체가 1가의 바이러스 채취물, 즉, 원심분리를 통한 침전 후의 바이오리액터(bioreactor) 채취물에서 수행한다. 30 내지 34 ℃에서의 수집 후에, 1가 바이러스 채취물을 30 내지 34 ℃에서 벤조나아제 약 0.9 내지 1.1 U/ml로 4 내지 8시간 동안 처리한다. 그 후, 32+/-2 ℃에서 포르말린 <=92 mg/1 로 24 내지 24.5 시간 동안 처리한다.

1.2. UV 불활화

포르말린-불활화된 바이러스의 다수의 불활화 실험은 65 W UV 램프가 있는 불활화 챔버 및 박막 챔버(thin layer chamber)를 사용하여 수행한다. 비록 1가 바이러스 채취물의 완전한 불활화는 3 사이클 동안 시간 당 100 리터의 유량을 사용하는 경우 증명될 수 있지만, 상기 설치에서는 UV 신호의 온라인 측정장치가 허용되지 않는다. 인플루엔자 생산을 위해 사용된 Vero 세포 배양 배지는 UV 신호의 흡수에 영향을 주는 다양한 유기물을 포함한다. 따라서, 시스템에는, 1가 바이러스 채취물의 처리 동안 UV 신호의 연속적인 모니터링을 가능케 하는 110 W 램프를 장착한다.

포르말린 처리된 1가 인플루엔자 파나마 채취물(Influenza Panama harvest)을 불활화를 위한 모델 기질로 사용한다. 박막 UV 기술을 이용한 연속적인 불활화를 위하여 비자 램프(VISA lamp) (110W)가 장착된 웨데코 비자 시스템(WEDECO VISA system )(독일)를 사용하였다. UV 박막 챔버는 직경 30 mm 석영관이 있는 스테인레스 강 1.4435 장치이다. 눈금이 매겨진 UV 센서는 UV 신호의 온라인 조절을 가능케 한다. UV 박막 챔버는 상온에서 시간 당 240+/-10 리터의 유량으로 작동한다. 유량 조건은 눈금이 매겨진 유량계에 의해 조절한다. 1가 채취물을 10 UV 사이클에 노출한다. 각 사이클 후에 20 리터의 UV 처리된 1가 채취물들을 제거하고 연속적 초원심분리를 사용한 자당 구배 정제에 의해 추가적으로 정제한다.

1.3. 안전성 테스트

표준 Vero 안전성 테스트는 불활화된 인플루엔자 균주의 잔여 감염성을 알기 위한 매우 엄격한 품질 테스트이다. 상기 테스트는 또한 다른 바이러스들에 대해서도 적용될 수 있다. 1가 원액 생성물, 즉 자당 구배 원심분리 및 초-정용여과 후에 정제된 바이러스 항원을 5 루 플라스크(Roux flasks)(4 ml/플라스크)에 첨가한다. Vero 세포 배양 배지에서 32 ℃에서 7일 간 인큐베이션한 후, 세포 배양물을 채취하고, 모으고, 5 루 플라스크(10 ml/플라스크)에 첨가한다. 32 ℃ 에서 7 일간 또다른 인큐베이션 단계 후에, 세포 배양물을 채취하고, 모아서, 헤마글루티닌(HA)에 대해 테스트를 한다.

상기 HA-테스트는 인플루엔자 바이러스는 그들의 표면 단백질 헤마글루티닌을 이용하여 적혈구에 결합할 수 있다는 사실에 기초한 것이다. 시험은 멸균 환경에서 수행된다. 형성된 HA 역가를 가지는 인플루엔자 바이러스 현탁액은 양성 대조군을 제공하고, 0.9% NaCl 수용액은 음성 대조군을 제공한다. 0.9% NaCl에 1:2 희석된 테스트될 샘플의 50 ㎕를 96-웰 플레이트(96-well plate)의 하나의 웰에 넣는다. 각각의 웰에 대해 50 ㎕의 닭 적혈구를 첨가한다. 후속적으로, 플레이트들을 30 내지 45 분간 실온에서 인큐베이션한다. 그리고 난 후 헤마글루티닌은 시각적으로 결정되며, 상기에서 만일 동일한 샘플을 포함하고 있는 다섯 개의 웰이 어떠한 헤마글루티닌도 보이지 않으면, 그 샘플은 HA 테스트를 통과한다.

실시예 2: 초원심분리를 이용한 정제

인플루엔자 바이러스 항원의 정제 동안, 1가 채취물(MVH)을 원심분리로 농축한다. 연속 흐름 원심분리 과정은 자당 수용액을 사용하여 형성된 자당 구배에 기초하여 Vero 세포 배양에서 성장한 바이러스성 백신의 제조에 적용될 수 있다. 사용한 원심분리 모델에 사전침전지(preclarifier)가 장착되어 있었다. 트리스-버퍼(Tris-buffer) 2O mM 내에 약 42% 및 55% (w/w)의 자당 용액을 사용하여 형성된 밀도 구배에서 소규모 실험을 다른 원심분리 조건 하에 수행하였다. 추가적으로, 사전침전지는 없으나 증가된 g력을 가지는 초원심분리는 수득율의 향상을 위한 값진 도구인 것으로 판명되었다.

1가 인플루엔자 바이러스 채취물(MVHs)들을 비교연구를 위하여 사용하였다. 상기 MVH들을 35.000 rpm에서 실험실의 원심분리 모델 RK-6를 이용한 연속상 초원심분리로 정제하였다.

실시예 3: 정제/공정

인플루엔자 백신 후보로, 세개의 다른 인플루엔자 균주가 실시예 2에 기재된 바에 따라 초원심분리로부터 정제되고 수집되었다. 항원 수득률은 피크 풀( Peak Pools)에서 다르다. 뉴 칼레도니아 인플루엔자 균주가 최저 항원 수득률을 가졌고, 그 다음 히로시마 그리고 마지막으로 말레이시아다. 단백질 함량은 말레이시아에서 가장 높았고 히로시마에서 가장 낮았다. 전체 단백질에 대한 SRD (단일 방사상 면역 확산 분석법(Single Radial Immunodiffusion Assay) (HA- 정량화)) 비는 말레이시아 및 뉴 칼레도니아로부터의 피크 풀에서 동등했으며, 그러나 히로시마에서 더 높았다.(표 1)

<표 1> 피크 풀의 분석 결과

추가적인 공정은 하기 개요에 따랐다:

3.1. 피크 풀의 희석

상기 피크 풀은 점도의 감소를 위하여 자당 농도를 감소시키기 위해 TBS 완충제를 이용하여 3배로 희석되었다.

3.2. 1차 균질화 피크 풀

희석된 피크 풀을 고압 균질화기 "NS 1001 L 판다"(나이로 소아비 에스. 피.에이)("NS 1001L Panda" (Niro Soavi S. p.A.))로 처리된다. 바이러스 현탁액은 균질화기를 800 bar에서 3번 통과하였다. 상기 압력은 바이러스 응집물을 파괴하여 후속적인 공정 단계를 개선하기에 충분하다.

3.3. 벤조나아제 첨가

대장균에서 생산된 재조합형 뉴클레아제인 벤조나아제는 세포 유래 DNA를 분해하기 위하여 3 U/ml의 최종 농도로 바이러스 현탁액에 첨가하였다.

3.4. 압력 여과

벤조나아제의 첨가 후, 후속적인 인큐베이션 기간 동안 박테리아와 같은 외부 유기물이 없는 바이러스 현탁액을 유지하기 위해 0.22 ㎛ 압력 여과를 수행하였다. 인큐베이션은 밤새 32 ℃에서 수행하였다.

3.5. 초/정용여과

벤조나아제 인큐베이션이 완료된 후, 소규모에서 0.1 m² 및 파일럿 규모에서 0.5 m²의 여과면적으로 30 kD 부유 채널 초원심분리 막(Pall)으로 초/정용여과를 수행하였다. 초농축물(ultraretentate)을 TBS(트리스(Tris) 완충 식염수)의 10 보유물 부피 + 0.008 % 트리톤 X100(w/w)으로 정용여과하였다.

3.6. 가용화를 위한 트리톤 X100 첨가 및 인큐베이션

바이러스 조각냄을 위해, 트리톤 X100을 0.5% (w/w)의 최종 농도가 되도록 첨가하고, 실온에서 밤새 인큐베이션하였다.

3.7. 정용여과 II

높은 트리톤 X100 농도의 제거를 위해, 정용여과를 30 kD 부유 채널 초원심분리 막(Pall)으로 수행하였다. 초농축물은 TBS(트리스 완충 식염수)의 15 보유물 부피로 정용여과하였다.

3.8. 포름알데하이드 첨가 및 인큐베이션

포르말린을 항원 안정화를 위해 0.025 %의 최종농도가 되도록 초/정용여과 보유물에 첨가하였다. 인큐베이션은 18-24 시간 동안 실온에서 수행하였다. 포르말린은 ~36-37 % 포름알데하이드 기체의 포화 수용액이다.

3.9. HPLC 후속 공정 단계를 통한 트리톤 X100 농도 결정

후속 가공 단계는 희석 단계 및 추가적인 초/정용여과로 구성된다. UDR을 트리톤 X100에 대해 CMC 미만(TX 100, ~0.015%, 250 μM, 수용액에서)으로 희석할 수 있기 위해서, 분석적인 TX 100 결정 단계를 도입하여 TX 100의 농도를 결정한다. 희석 배수는 상기 TX100 의 농도에 의존한다.

3.10. TX100 의 임계 미셀 농도 미만의 UDR 희석

상기 약 0.1- 0.2 % (HPLC에 의해 결정)의 잔여 TX 100을 포함하는 초/정용여과보유물(Ultra/Diaretentate)을 명확히 CMC(임계 미셀 농도) 미만의 농도인, 0.008 %의 TX 100 최종 농도가 되도록 TBS로 희석하였다.

3.11. 초/정용여과 III

초/정용여과는 동일한 30 kD 부유 채널 초원심분리 막으로 수행하였다. 초q보유물은 TBS (트리스 완충 식염수)의 5 보유물 부피 + 5 VC TBS + 0.008 % 트리톤 X100 (w/w) 으로 정용여과하였다.

3.12. 세제 안정화

TX 100 농도를 목표 수준으로 감소 후, 트윈 80을 추가적인 바이러스 항원 안정화를 위하여 0.125 % ± 0.025 %의 최종 농도가 되도록 현탁액에 첨가한다. 이것은 너무 낮은 TX 100 농도에 기인한 항원의 재-응집을 방지한다.

3.13. 이차 균질화

이차 고압 균질화 단계는 항원 손실을 여과 단계에서 0.22 ㎛로 낮게 유지하도록 수행된다. 3.2 부분에서 설명된 것과 동일한 균질화기가 동일한 설정에서 사용된다.

3.14. 살균 여과

이차 균질화 단계에 이어 0.22 ㎛ 필터(밀리포어(Millipore))를 사용하여 살 균여과를 수행한다. 살균 여과된 벌크 물질을 단일 벌크(MVB)라고 칭한다.

실시예 4: 결과

<표 2> 예시로써 조각난 바이러스(히로시마)의 초원심분리 후의 정제의 결과

DIL (1:3)...피크 풀의 희석 ; UDR...초정용여과 후의 초정용여과보유물; HOM-1, HOM-2...균질화 1 및 2; PFIL...0.22 ㎛ 압력 여과; MVB ...단일 벌크

MVB 내의 전체 SRD는 73 mg이었다. 전체 Vero 단백질 수준은 80.8% 감소되어, 5.2 mg에서 1 mg으로 감소되었다. 전체 Vero DNA는 MVB 내에서 0.28 ㎍으로 감소되었다. 전체 단백질은 56.5 %의 감소를 구성하며 487 mg에서 212 mg으로 감소되었다.

유사한 결과가 말레이시아 균주에서 얻어졌다: 전체 Vero 단백질은 8.3 mg에서 2.4 mg으로 감소될 수 있었고, 이는 피크 풀에서 MVB로 약 67.5% 감소된 것이다. MVB 내 Vero DNA 함량은 1.8 ㎍였다. 정제 동안 전체 단백질의 감소는 58.6 %로 748 mg 에서 310 mg이 되었다.

정제의 마지막에서 뉴 칼레도니아 균주의 경우, 전체 Vero 단백질은 피크 풀의 8 mg에서 MVB의 2 mg으로 감소될 수 있었고 이는 75 %의 감소이다. MVB 내 전체 Vero DNA 함량은 0.27 ㎍이었다. 전체 단백질은 피크 풀의 382 mg에서 MVB의 162 mg으로 감소했고, 이는 57.6 %의 감소를 구성한다.

정제과정은 매우 일관되며 확고하다. 고도로 정제된 바이러스 제제는, 내독소의 부족 및 트리톤 X100, 포름알데하이드, 자당 및 벤조나아제와 같은 화학적 공정 및 숙주 세포 단백질 및 DNA의 성공적인 감소로부터 생성되었다. 모든 제제들은 생산된 후에 살균되었다. 세 개의 모든 MVB에서 단백질에 대한 SRD의 비는 본원에 따른다.

Claims

a ) 유체 중의 감염성 바이러스를 세포에 접종하는 단계,
b) 상기 세포 내에서 상기 바이러스를 번식시키는 단계,
c) 상기 번식된 바이러스를 수집하는 단계,
d) 상기 수집된 바이러스를 완전히 불활화하는 단계, 및
e) 상기 불활화된 바이러스를 세제로 처리하여 바이러스 항원 포함 제제를 생성시키는 단계
를 포함하는 바이러스 항원 포함 제제의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 번식된 바이러스의 수집 단계는 감염 후 상기 세포들 및/또는 상기 세포들의 파편들로부터 바이러스를 분리하는 것을 포함하는 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 불활화는 포름알데히드를 첨가하여 수행되는 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 불활화는 자외선 조사에 의해 수행되는 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 번식된 바이러스가 상기 유체 속으로 방출되는 제조 방법.
제1항에 있어서, 수집된 후에 수집된 유체는 뉴클레아제로 처리하는 제조 방법.
제6항에 있어서, 상기 뉴클레아제가 벤조나아제인 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포가 상기 바이러스 번식 동안 세포 배양물의 형태인 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포가 포유류 또는 조류의 세포인 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포가 상피 세포인 제조 방법.
제 8항에 있어서, 상기 세포가 베로(Vero) 세포인 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 바이러스가 외피 바이러스인 제조 방법.
제12항에 있어서, 상기 바이러스가 오르소믹쏘(orthomyxo) 바이러스인 제조 방법.
제13항에 있어서, 상기 바이러스가 인플루엔자 바이러스인 제조 방법.
제1항의 제조 방법에 있어서, 상기 불활화 동안 비-바이러스성 단백질의 농도가 350 ㎍/ml 미만인 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 제조가 공업적 규모의 양인 제조 방법.
제16항의 제조 방법에 있어서, 상기 불활화는 적어도 1l의 바이러스를 포함하는 유체 상에서 수행되는 제조 방법.
a) 감염성 바이러스를 포함하는 유체를 수득하는 단계,
b) 상기 수집된 바이러스를 불활화하는 단계,
c) 상기 불활화된 바이러스를 세제를 이용하여 처리하는 단계 및,
d) 상기 불활화된 바이러스의 정제하여 바이러스성 항원을 포함하는 제제를 생성시키는 단계를 포함하는 바이러스성 항원을 포함하는 제제의 제조 방법.
제18항에 있어서, 상기 유체가 세포 배양물부터 수득되는 제조 방법.
제19에 있어서, 상기 바이러스성 항원을 안정화시키는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
제20항에 있어서, 상기 바이러스성 항원들이 유효량의 트윈 80(Tween 80)을 첨가함에 의해 안정화되는 제조 방법.
제21항에 있어서, 트윈 80의 양이 약 0.125 %인 제조 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따라 획득한 제제를 대상체에 투여함으로서 바이러스성 항원 포함 제제를 제조하는 것을 포함하는 대상체의 바이러스성 감염에 대한 저항성을 높이는 방법.