JP5535910B2 - ウイルスワクチンを生産する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ウイルスワクチンを生産するための方法に関する。
ワクチンは、抗原性物質の免疫原性の構成成分(composition)であり、例えば(非感染性の)病原体、例えばウイルス、そのエンベロープ、粒子またはそのタンパク質抗原である。投与またはワクチン接種(vaccination)は、対象、例えば哺乳類、例えばヒトまたはトリにおいて免疫化をもたらす。ワクチン接種は、該ワクチンに対する特異的応答およびいくらかの軽度の炎症を引き起こし得るが、これは一般的にワクチンがそれを阻止するよう設計される完全に生存能力のあるウイルスの感染よりもずっと害が少ない。対象の免疫系は、ワクチンの抗原を特異的に認識するよう自らを適合させ、対象が病原体へさらに曝露された後に、該病原体を速やかに不活化する。こうして、病原体に対する耐性の増大がワクチン接種を通して達成される。
感染性の物質を扱う必要のある工程の数が少なく、反応性の減少したウイルス抗原を生産する、ウイルスワクチンを生産する方法を提供することが本発明の目的である。
a) 液体(fluid)中において細胞に感染性ウイルスを接種する工程、
b) 該細胞中において該ウイルスを増殖(propagation)させる工程、
c) 該細胞培養上清中の該増殖したウイルスを回収する工程、
d) 該回収したウイルスを不活化する工程、および
e) 該不活化したウイルスを洗浄剤(detergent)で処理し、それによりウイルス抗原を含む調製物を得る工程。
a) 感染性ウイルスを含む液体を得る工程、
b) 該回収したウイルスを完全に不活化する工程、
c) 該不活化したウイルスを洗浄剤で処理する工程、および
d) 該不活化したウイルスを精製し、それによりウイルス抗原を含む調製物を得る工程。
以下の工程を含む、ウイルス抗原を含む調製物の製造のための方法が提供される:
a) 液体中において細胞に感染性ウイルスを接種する工程、
b) 該細胞中において該ウイルスを増殖させる工程、
c) 該細胞培養上清中の該増殖したウイルスを回収する工程
d) 該回収したウイルスを完全に不活化する工程、および
e) 該不活化したウイルスを洗浄剤で処理し、それによりウイルス抗原を含む調製物を得る工程。この手順の中心となるのは、活性なウイルスに対して行われる工程の数を減らすことが可能である事であり、該ウイルスは最初の収穫物(primary harvest)の回収の後、洗浄剤処理および/または任意の精製工程の前に不活化される。
a) 感染性ウイルスを含む液体を得る工程、
b) 該回収したウイルスを完全に不活化する工程、
c) 該不活化したウイルスを洗浄剤で処理する工程、
d) 該不活化したウイルスを精製し、それによりウイルス抗原を含む調製物を得る工程。当然、上記のいずれかの細胞上清からのものであり得る感染性ウイルスを含有する液体自体を、不活化、洗浄剤処理および精製に用いることも可能である。好ましくは、該感染性ウイルスを含む液体は、細胞培養物から得られる。
実施例 1: 感染性ウイルスの不活化
3つの異なるインフルエンザ株、2つの A-株 Hiroshima (HR、H3N2)、New Caledonia (NC、H1N1) および B-株、Malaysia (MA) を、Vero 細胞培養において生産した。ウイルスの増殖後、図 1a のフローチャートに示される通りに、感染性ウイルス収穫物を精製の前に不活化する。
ホルマリンを用いる最初の不活化工程を、細胞を含まない、感染性の一価のウイルス収穫物、すなわち遠心分離を介した清澄化(clarification)後のバイオリアクター収穫物について行う。30 から 34 ℃における回収の後、一価のウイルス収穫物を 30 から 34 ℃において、4 から 8 時間、約 0.9 から 約 1.1 U/ml のベンゾナーゼで処理する。次いでそれを、24 から 24.5 時間、32+/-2 ℃において <=92 mg/l ホルマリンで処理する。
65 W UV ランプおよび薄層チャンバーを備える不活化チャンバーを用いて、ホルマリンで不活化されたウイルスを用いる多数の不活化実験を行う。一価のウイルス収穫物の完全な不活化は、時間あたり 100 リットルの流速を3サイクルの間用いる場合に実証され得るが、この工程は稼働中の(on-line) UV シグナルの測定を許容しなかった。インフルエンザ生産のために用いられる Vero 細胞培養の培地は、UV シグナルの吸収の原因となる様々な有機化合物を含有している。そのため、該系は、一価のウイルス収穫物の処理の間に UV シグナルの連続的モニタリングを可能にする 110 W ランプを備えている。
標準的な Vero 安全性試験は、不活化されたインフルエンザ株の残存する感染性についての高度に厳密な品質試験である。該試験は、他のウイルスにも適用できる。一価のバルク産物、すなわちスクロース勾配遠心分離および超-ダイアフィルトレーション(ultra-diafiltration)後の精製されたウイルス抗原を、5 つのルー(Roux)フラスコへ添加する(4 ml/フラスコ)。Vero 培地中において 32 ℃で 7 日間インキュベートした後、細胞培養物を収穫し、プールし、5 つのルーフラスコへ添加する(10 ml/フラスコ)。32 ℃におけるさらなる 7 日間のインキュベーション工程の後、細胞培養物を収穫し、プールし、ヘマグルチニン(HA)について試験する。
インフルエンザウイルス抗原の精製の間、一価の収穫物(MVH)を遠心分離によって濃縮する。連続フロー遠心分離の手法を、スクロース水溶液を用いて形成されるスクロース勾配に基づき、Vero 細胞培養で増殖させたウイルスワクチンの製造に適用することができる。用いた遠心機モデルは、前清澄機(preclarifier)を備えていた。20mM トリスバッファー中のおよそ 42% および 55% (w/w) のスクロース溶液を用いて形成された密度勾配を用いる小スケール実験を、異なる遠心分離条件下で行った。さらに、前清澄機を伴わないが、増大した重力加速度(g-force)を伴う超遠心分離は、収量の改善にとって有益なツールであることが判明した。
インフルエンザ候補ワクチンとして、3つの異なるインフルエンザ株を、実施例 2 に記載される通りに超遠心分離から精製し、回収した。抗原の収量は、ピークプールによって異なっていた。インフルエンザ株 New Caledonia が最も低い抗原収量を有し、Hiroshima 株がそれに次ぎ、最後が Malaysia 株であった。タンパク質含量は、Malaysia において最も高く、Hiroshima において最も低かった。SRD (一元放射免疫拡散アッセイ(HA-定量化)) 対総タンパク質の比は、Malaysia および New Caledonia からのピークプールにおいては同程度であったが、Hiroshima においてはより高かった(表 1)。
粘性の低減のために、ピークプールを TBS バッファーで 3 倍希釈し、スクロース濃度を減少させる。
希釈されたピークプールを、高圧力のホモジナイザー“NS 1001L Panda”(Niro Soavi S.p.A.)を用いて処理する。ウイルス懸濁液に、800 bar で 3 回、ホモジナイザーを通過させる。この圧力は、ウイルス凝集物(aggregate)を破壊することによってその後の加工工程を改善するのに十分である。
細胞由来の DNA を分解するため、大腸菌(E. coli)において生産される組換えヌクレアーゼであるベンゾナーゼを、3U/ml の終濃度においてウイルス懸濁液へ添加する。
ベンゾナーゼの添加後、その後のインキュベーション期間の間、ウイルス懸濁液を外来性の(adventitious)生物、例えば細菌を含まない状態に維持するために、0.22 μm 圧力濾過を行う。インキュベーションは、終夜、32℃にて行う。
ベンゾナーゼインキュベーションが終了した後、小スケールにおいては 0.1 m2 、試験スケールにおいては 0,5 m2 の濾過面積を有する 30 kD の停止チャンネル(suspended channel)限外濾過膜(Pall)を用いて限外濾過/ダイアフィルトレーションを行う。限外残余物(Ultraretentate)を、10 残余物(Retentate)容量の TBS (トリス緩衝生理食塩水) + 0.008% TritonX100 (w/w) を用いてダイアフィルトレートする。
ウイルス分断(splitting)のために、0.5% (w/w) の終濃度まで TritonX100 を添加し、室温にて終夜インキュベートする。
高い Triton X100 濃度を除去するために、30 kD の停止チャンネル限外濾過膜(Pall)を用いてダイアフィルトレーションを行う。限外残余物を、15 残余物容量の TBS (トリス緩衝生理食塩水)を用いてダイアフィルトレートする。
抗原の安定化のため、限外濾過/ダイアフィルトレーション残余物(Ultra/Diaretentate)中へ、0.025% の終濃度までホルマリンを添加する。室温にて 18-24 時間、インキュベーションを行う。ホルマリンは、〜36-37% のホルムアルデヒドガスの飽和水溶液である。
その後の加工工程は、希釈工程およびさらなる限外濾過/ダイアフィルトレーションからなる。UDR を Triton X 100 (TX 100、〜0.015%、250μM、水溶液の状態)についての CMC 未満へ希釈することを可能にするために、分析的 TX 100 決定工程を導入して TX 100 の濃度を定義した。希釈係数は、この TX 100 濃度に依存する。
(HPLC によって決定される)約0.1-0.2%の残余の TX 100 を含有する限外濾過/ダイアフィルトレーション残余物を、明らかに CMC (臨界ミセル濃度)未満の濃度である 0.008 % の最終 TX 100 濃度まで TBS で希釈する。
同一の 30 kD 停止チャンネル限外濾過膜を用いて、限外濾過/ダイアフィルトレーションを行う。限外残余物を、5 残余物容量の TBS (トリス緩衝生理食塩水) + 5 VC TBS + 0.008 % TritonX100 (w/w) を用いてダイアフィルトレートする。
TX 100 濃度を標的レベルまで減少させた後、さらなるウイルス抗原安定化のために、Tween 80 を 0.125% ± 0,025% の終濃度まで、懸濁液に添加する。これは、低すぎる TX 100 濃度による抗原の再凝集を回避する。
0.22 μm 濾過工程における抗原の損失を低く保つため、第2の高圧力ホモジナイゼーション工程を行う。セクション 3.2 に記載されるものと同じホモジナイザーを、同一の設定で用いる。
2nd ホモジナイゼーション工程に続いて、0.22 μm フィルター(Millipore)を用いて無菌濾過を行う。無菌濾過されたバルク物質を、一価のバルク(MVB)と称する。
Claims (19)
- ウイルス抗原を含む調製物を製造するための方法であって、
a) 液体中において細胞にエンベロープを有する感染性ウイルスを接種する工程、ここで、前記細胞は、初代細胞または培養細胞株である、
b) 前記細胞中において前記ウイルスを増殖させる工程、ここで、前記細胞は、細胞培養物の形態である、
c) 前記増殖したウイルスを回収する工程、
d) ウイルスの回収直後に、任意の精製工程に先だち、前記回収したウイルスを完全に不活化する工程、ここで、ウイルスを含有する液体、またはその非ウイルス性成分は、前記不活化工程の前にそれ以上濃縮されない、および
e) スプリットウイルスワクチンを生産するために前記不活化したウイルスを洗浄剤で処理し、それによりウイルス抗原を含む調製物を得る工程、
を含む、方法。 - 前記増殖したウイルスを回収する工程が、感染後に前記細胞および/または前記細胞の細胞片からウイルスを分離することを含む、請求項1の方法。
- 前記不活化を、ホルムアルデヒドの添加によって行う、またはUV照射によって行う、請求項1の方法。
- 前記増殖したウイルスが、前記液体中に放出される、請求項1の方法。
- 回収の後、回収した液体をヌクレアーゼで処理する、請求項1の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、ベンゾナーゼ R (登録商標名)である、請求項5の方法。
- 前記細胞が、哺乳類または鳥類の細胞である、請求項1の方法。
- 前記細胞が、上皮細胞である、請求項1の方法。
- 前記細胞が、Vero細胞である、請求項8の方法。
- 前記ウイルスが、オルソミクソウイルスである、請求項1の方法。
- 前記ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項10の方法。
- 前記不活化の間における非ウイルス性タンパク質の濃度が、350μg/ml未満である、請求項1の方法。
- 前記製造が、工業規模の量のものである、請求項1の方法。
- 前記不活化を、少なくとも1Lのウイルスを含有する液体について行う、請求項13の方法。
- ウイルス抗原を含む調製物を製造するための方法であって、
a) 細胞中において接種された、エンベロープを有する感染性ウイルスを含む液体を得る工程、ここで、前記細胞は、初代細胞、または培養細胞株である、
b) 任意のウイルスの精製工程に先だって、工程(a)から前記回収したウイルスを不活化する工程、ここで、ウイルスを含有する液体、またはその非ウイルス性成分は、前記不活化工程の前にそれ以上濃縮されない、
c) スプリットウイルスワクチンを生産するために前記不活化したウイルスを洗浄剤で処理する工程、および
d) 前記不活化したウイルスを精製し、それによりウイルス抗原を含む調製物を得る工程、
を含む、方法。 - 前記液体が、細胞培養物から得られる、請求項15の方法。
- 前記ウイルス抗原を安定化する工程をさらに含む、請求項15の方法。
- 前記ウイルス抗原を、有効量のポリソルベート80の添加によって安定化する、請求項17の方法。
- ポリソルベート80が、0.125%の量である、請求項18の方法。
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