CN108697786B

CN108697786B - 含有固定化病毒粒子的疫苗

Info

Publication number: CN108697786B
Application number: CN201780005292.XA
Authority: CN
Inventors: 小沼浩人; 鹤留由香里; 池田千将; 山上亮; 来海和彦; 阿部元治; 渡边彰大; 大原有树
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Km Biomedical Co Ltd
Priority date: 2016-01-15
Filing date: 2017-01-10
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2037-01-10
Also published as: KR20180101354A; JPWO2017122635A1; EP3403671B1; JP6941566B2; US20190000960A1; KR102405736B1; CN108697786A; EP3403671A4; EP3403671A1; WO2017122635A1; AU2017207076B2; CA3010049A1; TWI781700B; CA3010049C; TW202144003A; AU2017207076A1; EP3403671C0; US10881723B2; TW201733616A; TWI781088B

Abstract

本发明涉及一种疫苗，其含有固定化病毒粒子，其中，以作为固定化病毒粒子来源的病毒粒子或对应的灭活病毒粒子的3只兔的发热反应之和为基准，固定化病毒粒子在发热试验中的3只兔的发热反应之和小于80％。

Description

含有固定化病毒粒子的疫苗

技术领域

本发明涉及含有固定化病毒粒子的疫苗。更详细而言，本发明涉及通过将病毒的粒子结构用固定化剂固定而使副反应得到抑制的含有固定化病毒粒子的疫苗。

背景技术

由流感病毒和日本脑炎病毒等病毒引起的感染症有时会由于病毒的种类、感染的对象不同而发生重症化。作为对这样的病毒引起的感染症的防御、预防的方法，已知疫苗的接种等。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2016/010081号

非专利文献

非专利文献1：J.Infect.Dis.2009 200(6)841-848

非专利文献2：Vaccine 2009 27(5)786-791

发明内容

本发明所要解决的课题

对于针对流感病毒和日本脑炎病毒等病毒的疫苗，制造、市售有灭活疫苗和活疫苗这两种。其中，灭活疫苗大致分为用福尔马林等灭活剂对精制后的病毒粒子进行处理而制备的全粒子疫苗和将精制的病毒粒子用有机溶剂或表面活性剂破坏(裂解)而制备的裂解疫苗。全粒子疫苗的免疫原性高，在预防感染的效果方面优异。但是，全粒子疫苗具有局部反应和发热反应等副反应强的倾向。另一方面，裂解疫苗的局部反应降低，几乎没有发热反应，因此安全性优异。但是，在基础免疫未建立的儿童或免疫反应衰退的老年人中，有在裂解疫苗的免疫原性低的倾向。因此，期望开发出显示出优于裂解疫苗的有效性(免疫原性)且安全性高的疫苗。

本发明是鉴于以上情况而完成的，其目的在于提供一种免疫原性高且副反应得到抑制的疫苗。

用于解决课题的手段

本发明者们等为了解决上述课题进行了深入研究，结果令人惊讶地发现，通过不破坏(裂解)病毒粒子的粒子结构而是用固定化剂进行固定，含有保持了与本来的病毒粒子同等的成分和结构的病毒粒子(以下有时称为“固定化病毒粒子”)的疫苗在免疫原性试验中为同等、而发热试验等副反应的成绩优异，从而完成了本发明。

即，本发明提供以下的[1]～[15]。

[1]一种疫苗，其含有固定化病毒粒子，其中，以作为上述固定化病毒粒子的来源的病毒粒子或对应的灭活病毒粒子的3只兔的发热反应之和为基准，上述固定化病毒粒子在发热试验中的3只兔的发热反应之和小于80％。

[2]根据[1]所述的疫苗，其中，上述固定化病毒粒子在发热试验中的3只兔的发热反应之和为1.3℃以下。

[3]一种疫苗，其含有固定化病毒粒子，其中，以由受到作为上述固定化病毒粒子来源的病毒粒子或对应的灭活病毒粒子刺激的人末梢血单核细胞产生的炎性细胞因子的量为基准，由受到上述固定化病毒粒子刺激的人末梢血单核细胞产生的炎性细胞因子的量小于80％。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的疫苗，其中，作为上述固定化病毒粒子来源的病毒粒子包含正黏病毒粒子、黄病毒粒子或小核糖核酸病毒粒子。

[5]根据[4]所述的疫苗，其中，上述病毒粒子包含流感病毒粒子、日本脑炎病毒粒子或甲型肝炎病毒粒子。

[6]根据[5]所述的疫苗，其中，上述病毒粒子包含流感病毒粒子。

[7]根据[6]所述的疫苗，其中，上述流感病毒粒子包含甲型流感病毒粒子或乙型流感病毒粒子。

[8]根据[6]或[7]所述的疫苗，其中，上述流感病毒粒子包含被分类为H1N1亚型株、H2N2亚型株、H3N2亚型株、H3N8亚型株、H5N1亚型株、H5N2亚型株、H5N6亚型株、H6N1亚型株、H7N3亚型株、H7N7亚型株、H7N9亚型株、H9N2亚型株、或H10N8亚型株的流感病毒粒子。

[9]根据[5]所述的疫苗，其中，上述病毒粒子包含日本脑炎病毒粒子。

[10]根据[9]所述的疫苗，其中，上述日本脑炎病毒粒子包含北京-1株、中山株、SA14-14-2株或P3株。

[11]根据[1]～[10]中任一项所述的疫苗，其中，上述固定化病毒粒子表面的蛋白的0％～90％未被固定化。

[12]根据[1]～[11]中任一项所述的疫苗，其中，上述固定化病毒粒子的比活性相对于作为上述固定化病毒粒子来源的病毒粒子的比活性(抗原含量/蛋白含量)的相对值为0％～95％。

[13]根据[1]～[12]中任一项所述的疫苗，其中，上述固定化病毒粒子具有作为上述固定化病毒粒子来源的病毒粒子或对应的灭活病毒粒子的粒径的80％～150％的平均粒径。

[14]根据[1]～[13]中任一项所述的疫苗，其中，在用蔗糖密度梯度离心测定上述固定化病毒粒子的情况下，在蔗糖浓度35％以上检测到峰。

[15]根据[1]～[14]中任一项所述的疫苗，其中，在用高效液相色谱法测定上述固定化病毒粒子的情况下，确认到单峰性的峰。

[16]根据[1]～[15]中任一项所述的疫苗，其中，在免疫小鼠的情况下，与对上述固定化病毒粒子特异性的IgG1相比，更为诱导对上述固定化病毒粒子特异性的IgG2a。

此外，本发明还提供以下的[17]～[31]。

[17]一种固定化病毒粒子的制造方法，其包含在含有作为来源的病毒粒子或对应的灭活病毒粒子的悬浮液中加入固定化剂的工序。

[18]根据[17]所述的制造方法，其中，所述固定化剂包含醛类。

[19]根据[18]所述的制造方法，其中，上述醛类选自甲醛、多聚甲醛、戊二醛、以及它们的组合。

[20]根据[19]所述的制造方法，其中，所述醛类包含甲醛。

[21]根据[20]所述的制造方法，其中，以上述悬浮液及上述固定化剂的总量为基准，上述甲醛的浓度为0.005～0.5w/v％。

[22]根据[19]所述的制造方法，其中，所述醛类包含戊二醛。

[23]根据[22]所述的制造方法，其中，以上述悬浮液及上述固定化剂的总量为基准，上述戊二醛的浓度为0.001～0.06w/v％。

[24]根据[17]所述的制造方法，其中，上述固定化剂包含碳二亚胺类。

[25]根据[24]所述的制造方法，其中，上述碳二亚胺类选自二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、它们的类似物及它们的组合。

[26]根据[25]所述的制造方法，其中，上述碳二亚胺类包含1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。

[27]根据[26]所述的制造方法，其中，以上述悬浮液及上述固定化剂的总量为基准，上述1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为0.05～1500mM。

[28]根据[17]～[27]中任一项所述的制造方法，其中，作为来源的上述病毒粒子是通过感染培养细胞、鸡蛋或小鼠大脑而回收的病毒粒子。

[29]根据[28]所述的制造方法，其中，上述培养细胞包含原代细胞或细胞系。

[30]根据[29]所述的制造方法，其中，上述培养细胞包含Vero细胞或MDCK细胞。

[31]一种疫苗的制造方法，其包含添加通过[17]～[30]中任一项所述的制造方法得到的固定化病毒粒子的工序。

发明效果

根据本发明，可以提供免疫原性高且副反应得到抑制的疫苗。

附图说明

图1是用电子显微镜拍摄固定化流感病毒粒子的照片(福尔马林处理)。

图2是用电子显微镜拍摄固定化流感病毒粒子的照片(戊二醛处理)。

图3是用电子显微镜拍摄固定化流感病毒粒子的照片(EDC处理)。

图4是用电子显微镜拍摄固定化日本脑炎病毒粒子的照片(戊二醛处理)。

图5是用电子显微镜拍摄固定化日本脑炎病毒粒子的照片(福尔马林处理)。

图6是用电子显微镜拍摄固定化日本脑炎病毒粒子的照片(EDC处理)。

具体实施方式

以下，对本发明的优选实施方式进行详细说明。但是，本发明并不限定于以下的实施方式。

(含有固定化病毒粒子的疫苗)

本实施方式的疫苗含有固定化病毒粒子，以作为上述固定化病毒粒子来源的病毒粒子或对应的灭活病毒粒子的3只兔的发热反应之和为基准，上述固定化病毒粒子在发热试验中的3只兔的发热反应之和(℃)降低。另外，关于上述疫苗，以由受到作为上述固定化病毒粒子来源的病毒粒子或对应的灭活病毒粒子刺激的人末梢血单核细胞产生的炎性细胞因子的量为基准，由受到固定化病毒粒子刺激的人末梢血单核细胞产生的炎性细胞因子的量降低。即，含有固定化病毒粒子的疫苗的免疫原性为裂解疫苗的免疫原性以上、局部反应和发热反应等副反应与裂解疫苗同等地得到抑制。在其他方面，固定化病毒粒子与以往的含有灭活病毒粒子的全粒子疫苗相比稳定性优异。

“固定化病毒粒子”是指对宿主没有感染能力、病毒粒子表面的蛋白彼此之间交联而使粒子结构固定化的病毒粒子。固定化病毒粒子维持与原病毒粒子或对应的灭活病毒粒子同等的粒子性，因此免疫原性高。固定化病毒粒子是通过用固定化剂处理作为来源的病毒粒子或对应的灭活病毒粒子而得到的。这里，“固定化剂”是指通过共价键将病毒粒子的蛋白彼此之间交联的药剂。例如，固定化剂是使表面抗原彼此之间、表面抗原与基质蛋白或膜蛋白、或基质蛋白彼此之间、或者膜蛋白彼此之间交联，保持病毒粒子的粒子结构的药剂。

“灭活病毒粒子”是指对宿主没有感染能力、粒子结构未被固定化的病毒粒子。灭活病毒粒子是通过用灭活剂处理作为来源的病毒粒子而得到的。在流感病毒粒子的情况下，灭活病毒粒子例如可以通过向含有流感病毒粒子的悬浮液中添加福尔马林(36～38w/v％甲醛水溶液)使其最终浓度达到0.02v/v％(以甲醛换算计为0.0072～0.0076w/v％)，在4℃下反应6周而得到。在日本脑炎病毒粒子的情况下，灭活病毒粒子例如也可以是市售的Vero细胞培养日本脑炎疫苗原药(由化学及血清疗法研究所制，商品名“ENCEVAC”，其含有用0.08v/v％福尔马林灭活得到的日本脑炎病毒粒子)。

发热试验按照基于生物学制剂基准(日本、厚生劳动省告示第192号)所示的发热试验法的方法进行。“发热反应”是指将检体向耳静脉内注射后测定的兔的体温(有时称为“测定值”)和在注射前测定的兔的体温(有时称为“对照体温”)之差(有时称为“体温差”)的最大值。这里，在体温差为负值时，发热反应被解释为0。

具体而言，按照以下步骤进行发热试验。首先，用生理盐水将固定化病毒粒子稀释，使1mL中的蛋白含量为70μg(日本脑炎病毒粒子时)或240μg(流感病毒粒子时)，将其作为试样。将上述试样按照每1kg体重1～3mL接种给兔，观察发热的上升至6小时后。求出接种试样前的兔的体温(对照体温)与接种后的兔的体温之差，将该差的最大值作为该兔的发热反应。对3只兔进行同样的试验，求出3只兔的发热反应之和(℃)。

对于上述疫苗，以作为固定化病毒粒子来源的病毒粒子或对应的灭活病毒粒子的3只兔的发热反应之和为基准，固定化病毒粒子在发热试验中的3只兔的发热反应之和可以小于80％，也可以小于60％，也可以小于40％，也可以小于20％，还可以小于10％。下限没有特别限制，以作为固定化病毒粒子来源的病毒粒子或对应的灭活病毒粒子的3只兔的发热反应之和为基准，可以为0％以上，也可以为20％以上。通过使发热反应之和为上述范围，与以往的含有灭活病毒粒子的全粒子疫苗相比，能够提供副反应得到抑制的疫苗。

上述疫苗的固定化病毒粒子在发热试验中的3只兔的发热反应之和可以为1.3℃以下，也可以为0.9℃以下，还可以为0.5℃以下。下限没有特别限制，可以为0℃以上，也可以为0.6℃以上。通过使发热反应之和为上述范围，与以往的含有灭活病毒粒子的全粒子疫苗相比，能够提供副反应得到抑制的疫苗。

“炎性细胞因子”是伴随炎症而产生的细胞因子的总称，例如可举出IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-α、IFN-γ等。

“人末梢血单核细胞”(PBMC)是指从人的末梢血得到的淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞等)及单核细胞。

炎性细胞因子的量利用基于欧洲药典MONOCYTE-ACTIVATIONTEST的方法，通过对利用病毒粒子刺激人末梢血单核细胞(PBMC)时的炎性细胞因子的产生量进行定量来求得。作为上述方法，也可以是在欧洲药典MONOCYTE-ACTIVATION TEST中对后述的实施例中所示的测定条件进行了变更的方法。

关于上述疫苗，以由受到作为固定化病毒粒子来源的病毒粒子或对应的灭活病毒粒子刺激的人末梢血单核细胞产生的炎性细胞因子的量为基准，由受到固定化病毒粒子刺激的人末梢血单核细胞产生的炎性细胞因子的量可以小于80％，也可以小于60％，也可以小于40％，也可以小于20％，还可以小于10％。下限没有特别限制，以由受到作为固定化病毒粒子来源的病毒粒子或对应的灭活病毒粒子刺激的人末梢血单核细胞产生的炎性细胞因子的量为基准，可以为0％以上，也可以为40％以上。通过使由受到固定化病毒粒子刺激的人末梢血单核细胞产生的炎性细胞因子的量为上述范围，与以往的含有灭活病毒粒子的全粒子疫苗相比，能够提供副反应得到抑制的疫苗。

在炎性细胞因子为IL-1β的情况下，由受到固定化病毒粒子刺激的人末梢血单核细胞产生的炎性细胞因子的浓度以含有上述人末梢血单核细胞的培养液为基准，可以为30pg/ml以下，也可以为20pg/ml以下。下限没有特别限制，可以为0pg/ml以上，也可以为5pg/ml以上。通过使由受到固定化病毒粒子刺激的人末梢血单核细胞产生的炎性细胞因子的浓度为上述范围，与以往的含有灭活病毒粒子的全粒子疫苗相比，能够提供副反应得到抑制的疫苗。

在炎性细胞因子为IL-6的情况下，由受到固定化病毒粒子刺激的人末梢血单核细胞产生的炎性细胞因子的浓度以含有上述人末梢血单核细胞的培养液为基准，可以为50pg/ml以下，也可以为40pg/ml以下。下限没有特别限制，可以为0pg/ml以上，也可以为5pg/ml以上。通过使由受到固定化病毒粒子刺激的人末梢血单核细胞产生的炎性细胞因子的浓度为上述范围，与以往的含有灭活病毒粒子的全粒子疫苗相比，能够提供副反应得到抑制的疫苗。

作为成为固定化病毒粒子来源的病毒粒子，例如可举出痘病毒粒子、疱疹病毒粒子、正黏病毒粒子、副黏病毒粒子、弹状病毒粒子、冠状病毒粒子、砂粒病毒粒子、披膜病毒粒子、黄病毒粒子、布尼亚病毒粒子、逆转录病毒粒子、嗜肝DNA病毒粒子、腺病毒粒子、乳头瘤病毒粒子、乳多泡病毒粒子、丝状病毒粒子、呼肠病毒粒子、小核糖核酸病毒粒子及杯状病毒粒子。上述正黏病毒粒子例如可举出流感病毒粒子。上述黄病毒粒子例如可列举日本脑炎病毒粒子。上述小核糖核酸病毒粒子例如可举出甲型肝炎病毒粒子。

作为流感病毒粒子，可举出甲型流感病毒粒子和乙型流感病毒粒子。在甲型流感病毒粒子的情况下，例如可举出被分类为H1N1亚型株、H2N2亚型株、H3N2亚型株、H3N8亚型株、H5N1亚型株、H5N2亚型株、H5N6亚型株、H6N1亚型株、H7N3亚型株、H7N7亚型株、H7N9亚型株、H9N2亚型株、或H10N8亚型株的流感病毒粒子。

作为日本脑炎病毒粒子，例如可举出日本脑炎病毒粒子的北京-1株、中山株(中山-予研株)或SA14-14-2株和P3株。

固定化病毒粒子由于未如裂解疫苗那样粒子结构被破坏，因此含有来源于病毒粒子的基因组核酸(DNA、RNA等)。来源于病毒粒子的基因组核酸可以作为佐剂发挥作用。例如，在灭活脊髓灰质炎疫苗中有含有病毒基因组RNA的D抗原和不含病毒基因组RNA的C抗原。C抗原的免疫原性弱、不显示作为疫苗抗原的效果。具有作为疫苗抗原效果的分子种类仅为D抗原。这启示内包于疫苗的病毒基因组RNA对于其效果的表现是重要的。因此，本实施方式的疫苗能够诱导Th1型应答。裂解流感疫苗诱导Th2型应答是为对照。小鼠中由Th1型应答诱导的IgG2a亚型的抗体与由Th2型应答诱导的IgG1亚型的抗体相比，对流感病毒的感染防御能力优异。因此，可以期待进一步提高上述疫苗的有效性。即，上述疫苗在免疫小鼠的情况下，可以与对固定化病毒粒子特异性的IgG1相比，更为诱导对固定化病毒粒子特异性的IgG2a。

固定化病毒粒子通过蔗糖密度梯度离心、高速液相色谱法和/或动态光散射法测定的情况下，可以是与原病毒粒子或对应的灭活病毒粒子实质上相同的参数(例如分子量、平均粒径、密度、血凝素(HA)含量等)。

例如，固定化病毒粒子可以是具有原病毒粒子或对应的灭活病毒粒子的粒径的80％～150％的平均粒径的固定化病毒粒子，也可以是具有90％～140％的平均粒径的固定化病毒粒子。日本脑炎病毒粒子的情况下，固定化病毒粒子可以是具有原病毒粒子或对应的灭活病毒粒子的粒径的90％～130％的平均粒径的固定化病毒粒子，也可以是具有100％～120％的平均粒径的固定化病毒粒子。

当固定化病毒粒子以流感病毒粒子为来源时，固定化病毒粒子的平均粒径在用动态光散射法测定的情况下可以为150nm左右，也可以为120nm～180nm，还可以为130nm～170nm。在另一方面，当固定化病毒粒子以流感病毒粒子为来源时，固定化病毒粒子的平均粒径在用动态光散射法测定的情况下可以为100nm以上，也可以为120nm以上，也可以为130nm以上，也可以为150nm以上，还可以为170nm以上。上述平均粒径可以为180nm以下，也可以为175nm以下，还可以为170nm以下。当固定化病毒粒子以日本脑炎病毒粒子为来源时，固定化病毒粒子的平均粒径在用动态光散射法测定的情况下可以为90nm左右，也可以为80nm～110nm。在另一方面，当固定化病毒粒子以日本脑炎病毒粒子为来源时，固定化病毒粒子的平均粒径在用动态光散射法测定的情况下可以为70nm以上，也可以为80nm以上，还可以为90nm以上。上述平均粒径可以为110nm以下，也可以为100nm以下。

当固定化病毒粒子以具有包膜的病毒粒子为来源时，上述固定化病毒粒子的脂质成分的含量与上述病毒粒子的脂质成分的含量可以是同等的。

固定化病毒粒子在通过蔗糖密度梯度离心测定的情况下，可以是在蔗糖浓度35％以上检测到峰的固定化病毒粒子，也可以是在蔗糖浓度45％以上且55％以下检测到峰的固定化病毒粒子。上述蔗糖浓度可以通过公知的方法求出。例如，将含有固定化病毒粒子的检体重置于15～60％的蔗糖密度梯度，在4℃、18000rpm(RCF＝57500(×g))下进行16小时离心分离，由此能够求出上述蔗糖浓度。

固定化病毒粒子在通过高效液相色谱(尺寸排阻色谱法(SEC))测定的情况下，可以是确认到单峰性的峰的固定化病毒粒子。例如，使用尺寸排阻色谱法(商品名：TSKgelG6000PWXL(TOSOH公司制)或Superose 6 10/300GE(GE Healthcare公司制))进行分子量测定(洗脱液：PBS、流速：0.5ml/min)时，可以是在洗脱时间为14～15分钟附近确认到单峰性的峰的日本脑炎病毒粒子的固定化病毒粒子，也可以是在洗脱时间为16～17分钟附近确认到单峰性的峰的流感病毒粒子的固定化病毒粒子。

关于上述疫苗，可以是固定化病毒粒子表面的蛋白的0％～90％未被固定化，也可以是固定化病毒粒子表面的蛋白的5％～80％未被固定化。

作为固定化病毒粒子表面的蛋白，可举出表面抗原、基质蛋白、膜蛋白及它们的组合。

在病毒粒子为流感病毒粒子的情况下，作为上述表面抗原，例如可举出血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)。作为上述基质蛋白，例如可举出M1蛋白。作为上述膜蛋白，例如可举出M2蛋白。

病毒粒子为日本脑炎病毒粒子时，作为上述表面抗原，例如可举出E蛋白、M蛋白。

作为计算未被固定化的蛋白的比例的方法，例如可举出求出作为对象的蛋白的本来的分子量中的固定化前和固定化后的蛋白的量的变化率(残存率)的方法。例如，在固定化病毒粒子以流感病毒粒子为来源的情况下，可举出在进行还原条件下的SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)后，通过密度测定法求出作为病毒的构成蛋白之一的M1蛋白的条带的浓度，算出M1蛋白的残存率(％)的方法。此时，随着固定化剂的浓度升高，有M1蛋白的残存率降低的倾向。通过应用该方法，能够进行利用固定化剂的交联度分析。

本实施方式中，固定化病毒粒子以流感病毒粒子为来源时，可以是M1蛋白的残存率为5％～90％的固定化病毒粒子，也可以是M1蛋白的残存率为10％～80％的固定化病毒粒子。换言之，M1蛋白的5％～90％可以未被固定化，也可以10％～80％未被固定化。

交联度分析也可以通过求出固定化病毒粒子的比活性(抗原含量/蛋白含量)来进行。用于测定病毒粒子的抗原含量的单克隆抗体识别中和表位、当中和表位的结构发生变化时，比活性降低。利用该性质，算出固定化病毒粒子相对于未进行固定化的病毒粒子的比活性的相对值(％)，评价交联度。本实施方式中，比活性的相对值为0～95％的范围。固定化病毒粒子以日本脑炎病毒为来源时，固定化日本脑炎病毒粒子的比活性的相对值可以为90～95％，也可以为70～90％，也可以为50～70％。

疫苗中所含的固定化病毒粒子的量可以根据病毒的种类或给药对象适当选择。例如，流感疫苗中所含的固定化病毒粒子的量(浓度)以血凝素浓度计可以是每病毒株为1～40μg HA/mL。

疫苗也可以是包含来源于相同种类的病毒或细菌的抗原的单一疫苗。疫苗也可以是包含来源于多种病毒或细菌的抗原的混合疫苗。疫苗是相同属的病毒或细菌，也可以是包含来源于多种型的抗原的多价疫苗。例如，疫苗为流感病毒疫苗时，可以含有固定化甲型流感病毒粒子或固定化乙型流感病毒粒子中的任一种，也可以含有它们两者。疫苗为日本脑炎病毒疫苗时，可以包含来源于细胞培养或来源于小鼠脑的病毒中的任一种。上述流感病毒疫苗或日本脑炎病毒疫苗也可以包含来源于其他病毒或细菌的抗原。例如，也可以混合在白喉·百日咳·破伤风·灭活脊髓灰质炎混合疫苗(DPT-IPV疫苗)中。

疫苗的剂型例如可以为液态、粉末状(冷冻干燥粉末、干燥粉末等)、胶囊状、片剂、冷冻状态。

疫苗也可以含有作为医药品可容许的载体。作为上述载体，可以没有限制地使用疫苗制造中通常使用的载体。具体而言，上述载体可举出食盐水、缓冲食盐水、葡萄糖、水、甘油、等渗水性缓冲液和它们的组合。疫苗也可以进一步适当配合乳化剂、防腐剂(例如硫柳汞)、等渗剂、pH调节剂、灭活剂(例如福尔马林)等。

疫苗的给药途径例如可以是经皮给药、舌下给药、滴眼给药、皮内给药、肌肉内给药、经口给药、经肠给药、经鼻给药、静脉内给药、皮下给药、腹腔内给药、从口向肺的吸入给药。

疫苗的给药方法例如可以是通过注射器、经皮性贴剂、微针、可移植的缓释性装置、带有微针的注射器、无针装置或喷雾进行给药的方法。

为了进一步提高免疫原性，疫苗也可以含有佐剂。作为佐剂，可举出例如含有铝佐剂或角鲨烯的水包油型乳化佐剂(AS03、MF59等)、CpG及3-O-脱酰基化-4’-单磷酰基脂质A(MPL)等Toll样受体的配体、皂苷系佐剂、聚γ-谷氨酸等聚合物系佐剂、以及壳聚糖和菊糖等多糖类。

作为成为对象的哺乳动物，例如可举出小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、绵羊、猪、牛、马、山羊、猴、人等。本实施方式的疫苗可以用于人，也可以用于小于5岁的儿童、65岁以上的老年人。

疫苗根据给药目的、给药方法、给药对象的状态(性别、年龄、体重、病情等)的不同而不同，但在对人给予流感病毒疫苗的情况下，可以按照每次给予3.8μg HA～30μg HA的有效成分(固定化病毒粒子)的方式使用。

(固定化病毒粒子的制造方法)

本实施方式的固定化病毒粒子的制造方法包含对作为来源的病毒粒子或对应的灭活病毒粒子将粒子结构固定化的工序。

作为提高疫苗安全性的技术，以往已知有使用表面活性剂或有机溶剂破坏(裂解)具有包膜的病毒粒子的方法。但是，在这些方法中，伴随粒子的崩解，有疫苗的有效性(免疫原性)降低的倾向。在上述制造方法中，由于用与病毒粒子蛋白形成共价键的固定化剂对作为来源的病毒粒子或对应的灭活病毒粒子进行处理，因此病毒粒子结构得以维持，其结果能够维持疫苗的有效性，并且提高安全性。

上述制造方法还可以包含培养宿主的工序、使病毒感染宿主的工序、在宿主内使病毒增殖的工序、从宿主回收病毒粒子的工序、或使回收的病毒粒子灭活的工序。

病毒粒子可以是在病毒粒子感染宿主并增殖后从宿主回收的病毒粒子。宿主也可以根据病毒粒子的种类来适当选择。灭活病毒粒子的方法可以使用公知的方法，例如可举出用福尔马林等灭活剂进行灭活的方法。病毒粒子为流感病毒粒子时，作为宿主，例如可举出培养细胞、鸡蛋及小鼠脑。作为培养细胞，可以是原代细胞，也可以是细胞系。作为培养细胞，例如可举出Vero细胞和MDCK细胞。

作为流感病毒的感染、增殖方法，使用将鸡蛋或Vero细胞用作宿主的方法(Vaccine.1998May-Jun；16(9-10)：960-8.)、将Vero细胞用作宿主的方法(Vaccine.2007August 10；25(32)：6028-6036.)、将MDCK细胞用作宿主的方法(JVirol.2012Nov；86(22)：12341-50)是本领域技术人员公知的方法。

病毒粒子的固定化

上述进行固定化的工序可例示用固定化剂处理作为来源的病毒粒子或对应的灭活病毒粒子的方法，例如可举出在含有作为来源的病毒粒子或对应的灭活病毒粒子的悬浮液中加入固定化剂的工序。悬浮液中的病毒粒子的浓度可以根据病毒的种类、固定化剂的种类及其浓度等适当变更。例如，悬浮液中的病毒粒子的浓度以病毒粒子的蛋白的浓度计，可以为60～90μg/mL，也可以为300～3000μg/mL，还可以为500～2500μg/mL。

固定化剂的种类可以根据病毒的种类适当变更。例如，上述固定化剂可举出有机溶剂、醛类、二酰亚胺酯、双(3,5-二溴水杨酸)富马酸酯(DBBF)、碳二亚胺类以及它们的组合。作为有机溶剂，例如可举出甲醇、乙醇、丙酮和它们的组合。作为醛类，例如可举出甲醛(FA)(例如福尔马林)、多聚甲醛、戊二醛(GA)以及它们的组合。作为碳二亚胺类，例如可举出二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、它们的类似物以及它们的组合。

固定化剂的浓度可以根据病毒的种类、固定化剂的种类适当变更。固定化剂含有甲醛时，以含有病毒粒子的悬浮液及固定化剂的总量为基准，甲醛的浓度可以为0.005～0.5w/v％。上述甲醛的浓度小于0.005w/v％时，固定化变弱，有粒子结构难以保持的倾向。上述甲醛的浓度超过0.5w/v％时，有固定化强、交联引起的化学修饰过度进行的倾向。从进一步提高HA活性的观点出发，以上述悬浮液及固定化剂的总量为基准，甲醛的浓度可以为0.01～0.5w/v％，0.018～0.152w/v％，也可以为0.029～0.152w/v％，也可以为0.029～0.076w/v％。使用含有甲醛的固定化剂的方法可以用于病毒粒子为流感病毒粒子、日本脑炎病毒粒子的情况。

固定化剂为福尔马林(36～38w/v％甲醛水溶液)时，以上述悬浮液及固定化剂的总量为基准，福尔马林浓度可以为0.014～0.4v/v％，也可以为0.05～0.4v/v％，也可以为0.08～0.4v/v％，还可以为0.08～0.2v/v％。

固定化剂含有戊二醛时，以上述悬浮液及固定化剂的总量为基准，戊二醛的浓度可以为0.001～0.06w/v％，也可以为0.002～0.05w/v％，也可以为0.004～0.02w/v％，也可以为0.005～0.01w/v％。上述浓度小于0.001w/v％时，使用日本脑炎病毒粒子作为病毒粒子时，粒子有凝聚的倾向。当上述浓度超过0.06w/v％时，使用日本脑炎病毒粒子作为病毒粒子时，有作为主要结构蛋白的E蛋白的表位失活的倾向。使用戊二醛作为固定化剂的方法可以用于病毒粒子为流感病毒粒子、日本脑炎病毒粒子的情况。

固定化剂含有EDC时，以上述悬浮液及固定化剂的总量为基准，EDC的浓度可以为0.05～1500mM，也可以为0.15～500mM，还可以为5～50mM。使用含有EDC的固定化剂的方法可以用于病毒粒子为流感病毒粒子、日本脑炎病毒粒子的情况。

用固定化剂处理时的温度可以根据病毒的种类、固定化剂的种类、固定化剂的浓度等适当变更。上述温度可以为0℃(冰浴)～37℃，也可以为4℃～37℃，也可以为25℃～37℃。

用固定化剂处理时的期间(处理时间)可以根据病毒的种类、固定化剂的种类、固定化剂的浓度、处理的温度等适当变更。上述期间可以为1天～4周，也可以为3天～4周，还可以为1周～4周。在使用EDC作为固定化剂时，上述期间可以为5分钟～24小时，也可以为0.5小时～24小时，还可以为2小时～20小时。

为了停止由固定化剂引起的交联的进行，可以使用甘氨酸等氨基酸进行淬灭处理。需要说明的是，淬灭处理有时是以提高疫苗的稳定性、免疫原性和安全性为目的而进行的。

根据需要，还可以包含对回收的固定化病毒粒子进行精制的工序。作为精制固定化病毒粒子的方法，可以通过公知的方法适当进行，例如可举出使用超滤膜进行过滤的方法。

本实施方式的疫苗的制造方法包含添加通过上述固定化病毒粒子的制造方法得到的固定化病毒粒子的工序。疫苗的制造方法还可以包含添加作为医药品可容许的载体、乳化剂、防腐剂、等渗剂、pH调节剂、灭活剂等的工序。

疫苗接种中，优选可以对对象赋予与实际感染时同样的免疫的质量和量，由疫苗诱导的免疫对由实际感染引起的免疫的仿效性决定其效果。疫苗中可以含有全部作为用于感染防御的抗原的病毒蛋白。本发明者们认为，如果考虑用于提高病毒蛋白的免疫原性的病毒来源的基因组核酸的存在、病毒粒子的大小、形状等分别在免疫应答中起作用，则最佳的疫苗应具有更接近于实际病毒的成分和结构。本实施方式的固定化病毒粒子由于仅用固定化剂进行固定化，除此以外具有与原病毒粒子同等的成分和结构，因此可以提供免疫原性高且副反应得到抑制的疫苗。

实施例

以下，通过实施例详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的任何限定。

[实施例1]

1.来源于流感病毒粒子的抗原的制备

(1)FA固定化流感病毒粒子的制备

甲醛(FA)处理

将甲型流感病毒H1N1亚型株(A/California/07/2009(X-179A)株，以下有时记为“A/CA株”)接种于11天龄的发育鸡蛋的绒毛膜尿囊腔内，在34℃下培养2天。将得到的绒毛膜尿囊液澄清化后，通过超离心分离使流感病毒粒子沉淀。用磷酸缓冲生理盐水(PBS)使上述流感病毒粒子再悬浮，得到悬浮液。将得到的悬浮液用蔗糖密度梯度离心(RCF＝57500(×g)、16小时)离心分离，回收蔗糖浓度为33％～50％的级分，由此精制流感粒子。将所得的级分稀释，以使精制后的流感病毒粒子的蛋白的最终浓度达到500μg/mL，得到悬浮液。然后，向上述悬浮液中添加福尔马林(36～38w/v％甲醛水溶液)以使最终浓度达到0.05～0.20v/v％(以甲醛换算计为0.018～0.076w/v％)，在25℃下使其反应1周。反应结束后，用PBS透析反应液，除去甲醛，由此得到固定化流感病毒粒子(以下有时记为“FA固定化流感病毒粒子”)。

(2)灭活流感病毒粒子的制备

向上述悬浮液中添加福尔马林(36～38w/v％甲醛水溶液)以使最终浓度达到0.02v/v％(以甲醛换算计为0.0072～0.0076w/v％)，在4℃下使其反应6周～8周。反应结束后，用PBS透析反应液，除去甲醛，由此得到灭活流感病毒粒子。用同样的方法，对其它流感病毒株(亚型株)也制备灭活流感病毒粒子，在实施例1～6中作为比较对照使用。

(3)裂解流感病毒抗原的制备

作为比较对照的裂解流感病毒抗原(以下有时记为“裂解流感抗原”)使用流感HA疫苗(化学及血清疗法研究所制，商品名“流感HA疫苗‘化血研’”)中所含的各菌株的原液。

2.发热试验

按照生物学制剂基准(日本、厚生劳动省告示第192号)进行发热试验。用生理盐水将灭活流感病毒粒子、FA固定化流感病毒粒子及裂解流感抗原稀释，使1mL中的蛋白含量为240μg，将其作为试样。将上述试样以每1kg体重1～3mL接种于兔，观察发热的上升至6小时后。求出接种试样前的兔的体温(对照体温)与接种后的兔的体温之差，将其差的最大值作为该兔的发热反应。对3只兔进行同样的试验。将3只兔的发热反应之和(℃)示于表1。

表1

A/CA株(H1N1亚型株)：3只兔的发热反应之和

FA固定化流感病毒粒子均未确认到1.3℃以上的发热反应之和，与灭活流感病毒粒子相比，观察到3℃以上的发热反应之和的降低。可知FA固定化流感病毒粒子与裂解流感抗原同样，发热反应之和足够低。由此也启示，FA固定化流感病毒粒子与裂解流感抗原同样地具有高的安全性。

3.炎性细胞因子的产生量的定量

通过基于欧洲药典MONOCYTE-ACTIVATION TEST的方法，对用0.05v/v％、0.08v/v％、0.11v/v％的福尔马林浓度固定的FA固定化流感病毒粒子或灭活流感病毒粒子刺激人末梢血单核细胞(PBMC)时的炎性细胞因子(IL-6)的产生量进行定量。具体而言，将欧洲药典MONOCYTE-ACTIVATION TEST中的将人PBMC最少取样4位供给者量使用这点变更为1位供给者量进行测定。将FA固定化流感病毒粒子及灭活流感病毒粒子的细胞因子的产生量的结果示于表2。可知FA固定化流感病毒粒子的IL-6的产生量与灭活流感病毒粒子相比足够低。由此启示，FA固定化流感病毒粒子与灭活流感病毒粒子相比具有高的安全性。

表2

A/CA株(H1N1亚型株)：炎性细胞因子的产生量

[实施例2]

物性评价

1.利用蔗糖密度梯度离心法的分析

按照上述实施例1的方法，对得到的级分进行稀释，以使流感病毒粒子(A/CA株)的蛋白的最终浓度达到2500μg/mL，得到悬浮液。然后，向上述悬浮液中添加福尔马林以使最终浓度达到0.12v/v％，在25℃下使其反应1周。将反应液用PBS透析，由此得到FA固定化流感病毒粒子。通过蔗糖密度梯度离心法分析得到的FA固定化流感病毒粒子。将检体重置于15～60％的蔗糖密度梯度，在4℃、18000rpm(57500(×g))下进行16小时的离心分离。离心后，按照每1级分0.6mL依次分级，测定各级分的蔗糖浓度、HA值和蛋白浓度。将A/CA菌株(H1N1亚型株)的结果示于表3。在裂解流感抗原中，显示蛋白在蔗糖浓度25～50％中广泛分布，病毒粒子分解。与此相对，对于FA固定化流感病毒粒子，显示出在高的蔗糖浓度(44.3％)作为单峰(粒子性)而被分级。HA活性为10240倍。

表3

A/CA株(H1N1亚型株)：蔗糖密度梯度离心分析及HA活性

2.利用电子显微镜的解析

为了进一步详细研究上述FA固定化流感病毒粒子(A/CA株)的形状，利用电子显微镜进行观察。使用戊二醛将检体在室温下固定20分钟。然后，在观察用的经离子涂布的片状网(日新EM公司制)上载置经固定的检体，静置约60秒，用2％磷钨酸水溶液进行负染色。使用透射型电子显微镜(FEICOMPANY公司制的Tecnai G2：加速电压为120kV)观察并拍摄染色后的检体。

将用电子显微镜拍摄的FA固定化流感病毒粒子的照片示于图1。FA固定化流感病毒粒子与灭活流感病毒粒子同样地粒子结构得以保持。

3.动态光散射

按照实施例1的方法制作以甲型流感病毒H3N2亚型株(A/New York/39/2012(X-233A)株，以下有时记为“A/NY株”)和乙型流感病毒维多利亚系统株(B/Brisbane/60/2008株，以下有时记为“B/BR株”)为来源的FA固定化流感病毒粒子，使用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司制)解析各自的平均粒径。将通过动态光散射法测得的液体中的平均粒径示于表4。FA固定化流感病毒粒子的平均粒径在140～150nm左右为单峰性。由此可知，FA固定化流感病毒粒子的平均粒径与灭活流感病毒粒子是同等的。另外，FA固定化流感病毒粒子的粒子结构得以保持，没有发现如凝聚体那样的杂质。

表4

通过动态光散射法测得的液体中的平均粒径(体积荷重平均粒径(主峰)(nm))

4.分子量分布测定(SEC))

按照上述实施例1的方法制作乙型流感病毒的山形系统株(B/Massachusetts/02/2012(BX-51B)株(以下有时记为“B/MA株”))的FA固定化流感病毒粒子(B/MA株)。对A/CA菌株(H1N1亚型株)、A/NY株(H3N2亚型株)及B/MA株(B型株)，使用尺寸排阻色谱法(商品名：TSKgel G6000PWXL(TOSOH公司制))进行裂解流感抗原及FA固定化流感病毒粒子的分子量分布测定，进行分子量测定(洗脱液使用PBS，以0.5ml/min的流速进行)。将其洗脱模式示于表5。FA固定化流感病毒粒子在洗脱时间为16～17分钟附近确认到单峰性的峰。另一方面，来源于相同菌株的裂解流感抗原在洗脱时间为19～30分钟附近确认到三峰性的峰。

表5

SEC的洗脱模式(洗脱时间(分钟))

5.基于交联度的分析

对于实施例1中制备的FA固定化流感病毒粒子(A/CA株)，按照以下步骤分析使用固定化剂时的交联度。首先，向检体中添加SDS-Buffer(终浓度：Tris 0.76w/v％、SDS 1w/v％、Glycerol 10v/v％、Bromophenol Blue(BPB)0.01w/v％)和2-巯基乙醇(终浓度：0.8v/v％)，煮沸6分钟后，使用PAGEL NPU-12.5L(ATTO公司制，商品名)或PAGEL NPU-R12.5 L(ATTO公司制，商品名)进行SDS-PAGE。电泳后，进行CBB(考马斯亮蓝)染色，用LAS 3000(富士胶片株式会社制，商品名)读取影像。当由固定化剂引起的交联进行时，作为构成病毒的蛋白之一的M1蛋白从本来的条带位置(25～37kDa)向高分子侧移动。因此，启示在本来位置处检测出的M1蛋白的条带(M1条带)变稀薄，将其作为交联度的指标。具体而言，算出用各福尔马林浓度处理的FA固定化流感病毒粒子在本来位置处检测出的M1条带的密度测定值相对于未进行固定化的流感病毒粒子的M1条带的密度测定值的相对值(％)(以下有时将该相对值记为“M1蛋白残存率”(％))。将结果示于表6。以0.05％、0.08％、0.11％、0.14％的福尔马林浓度固定的FA固定化流感病毒粒子(A/CA株)的M1蛋白残存率分别为35.7％、23.8％、11.0％、5.4％，启示随着福尔马林浓度升高，交联得到促进，M1蛋白残存率降低。

表6

A/CA株(H1N1亚型株)：M1蛋白残存率

6.免疫原性1(小鼠肌肉内接种)

使用小鼠评价FA固定化流感病毒粒子(A/CA株)的免疫原性。对ddY小鼠(雌性、8周龄)按蛋白量计以0.8μg的接种量肌肉内接种(每组13只)裂解流感抗原、灭活流感病毒粒子或FA固定化流感病毒粒子(A/CA株)。免疫3周后对小鼠进行全采血，并使其安乐死。通过离心分离得到血清，按照“病原体检测手册”(国立感染症研究所编)测定HI抗体效价。将对小鼠进行肌肉内接种时的免疫原性(HI抗体效价(GMT))的结果示于表7。FA固定化流感病毒粒子(A/CA株)与裂解流感抗原相比为高免疫原性，与灭活流感病毒粒子为同等的免疫原性。

表7

A/CA株(H1N1亚型株)：HI抗体效价(GMT)(小鼠肌肉内接种)

7.免疫原性2(小鼠皮内接种)

按照与上述“6.免疫原性1(小鼠肌肉内接种)”相同的步骤通过小鼠皮内接种来评价FA固定化流感病毒粒子(A/CA株)的免疫原性。对ddY小鼠(雌性、8周龄)按蛋白量计以0.2μg的接种量皮内接种(每组5只)裂解流感抗原、灭活流感病毒粒子或FA固定化流感病毒粒子。免疫3周后对小鼠进行全采血，并使其安乐死。通过离心分离得到血清，测定HI抗体效价。将对小鼠进行皮内接种时的免疫原性(HI抗体效价(GMT))的结果示于表8。FA固定化流感病毒粒子与裂解流感抗原相比免疫原性显著性地高，与灭活流感病毒粒子是同等的免疫原性。

表8

A/CA株(H1N1亚型株)：HI抗体效价(GMT)(小鼠皮内接种)

*1：P<0.05

8.免疫原性3(食蟹猴皮下接种))

对于A/CA菌株(H1N1亚型株)、A/NY株(H3N2亚型株)、B/BR株和B/MA株(B型株)，使用食蟹猴(雄性或雌性、17～25个月龄)评价裂解流感抗原、灭活流感病毒粒子和FA固定化流感病毒粒子的免疫原性。对每1组8或9只以相当于7.5μg HA(相当于裂解流感抗原的HA量的蛋白量)的接种量，以21天间隔2次皮下接种裂解流感抗原、灭活流感病毒粒子或FA固定化流感病毒粒子。在2次免疫前和2次免疫后第21天进行部分采血。通过离心分离得到血清，按照“病原体检测手册”(国立感染症研究所编)测定HI抗体效价和中和抗体效价。将免疫原性的结果示于表9(2次免疫后第21天的HI抗体效价(GMT))、表10(2次免疫后第21天的中和抗体效价(GMT))。可知对于HI抗体效价，FA固定化流感病毒粒子与裂解流感抗原相比具有高的免疫原性。特别是除B/MA株以外时，与裂解流感抗原相比，免疫原性显著性地高。对于中和抗体效价，FA固定化流感病毒粒子与裂解流感抗原相比，在A型株及B型株中免疫原性均显著性地高。

表9

HI抗体效价(GMT)：食蟹猴皮下接种(2次免疫后第21天)

*1：P<0.05、*2：P<0.01

表10

中和抗体效价(GMT)：食蟹猴皮下接种(2次免疫后第21天)

*1：P<0.05、*2：P<0.01

9.抗体亚型解析

作为抗体亚型解析，对上述“6.免疫原性1(小鼠肌肉内接种)”中得到的A/CA株(H1N1亚型株)和B/MA株(B型株)，通过酶免疫测定(ELISA)法测定小鼠血清中所含的对病毒抗原特异性的IgG1和IgG2a抗体效价。其结果显示，与抗原特异性IgG1相比，FA固定化流感病毒粒子更诱导抗原特异性IgG2a(表11、表12)。这是与灭活流感病毒粒子同样的结果，在与裂解流感抗原的比较中，也观察到更强的IgG2诱导倾向。由该结果可期待，FA固定化流感病毒粒子与能活化体液性免疫但几乎不能活化细胞性免疫的裂解流感抗原相比，疫苗的有效性进一步提高。

表11

A/CA株(H1N1亚型株)：亚型解析的结果(EU/mL)

将免疫裂解流感抗原得到的小鼠血清分别稀释25600倍时的值作为1EU/mL。

表12

B/MA株(山形系统株)：亚型解析的结果(EU/mL)

10.RNA释放量的评价

对于按照实施例1的方法制备的FA固定化流感病毒粒子(A/NY株)，按照以下步骤评价蛋白酶处理中的经时的RNA释放量。首先，用PBS稀释FA固定化流感病毒粒子，加入SDS和蛋白酶K，在55℃下使其反应，经时地提取RNA。RNA提取使用TRIzol LS Reagent和PureLink RNA Mini Kit、PureLink DNase(invitrogen公司制、商品名)。提取的RNA的含量用Quant-iT RiboGreen RNA Reagent and Kit(invitrogen公司制、商品名)测定。将各FA浓度经时的RNA含量示于表13。其结果显示RNA释放为FA浓度依赖性地缓慢释放。启示通过FA固定的RNA释放的缓释化使炎性细胞因子产生缓释化，产生高的安全性。

表13

蛋白酶处理后释放的RNA含量的经时变化

[实施例3]

(1)GA固定化流感病毒粒子的制备

1.戊二醛(GA)处理

用与实施例1同样的方法培养、精制甲型流感病毒(H3N2亚型株(A/NY株))和乙型流感病毒(乙型维多利亚系统株(B/BR株))。将各流感病毒粒子稀释，以使经精制的各流感病毒粒子的蛋白的最终浓度达到1000μg/mL，得到悬浮液。接着，使用1w/v％GA溶液进行稀释，以使GA浓度达到0.016w/v％或0.008w/v％。将上述悬浮液与经稀释的GA溶液(0.016w/v％或0.008w/v％)等量混合，在4℃下使其反应3天。反应结束后，用PBS透析反应液，除去GA，由此得到固定化流感病毒粒子(以下有时记为“GA固定化流感病毒粒子”)。将得到的GA固定化流感病毒粒子(A/NY株和B/BR株)的发热活性通过用3只兔的发热反应之和进行评价的发热试验、以及刺激人PBMC时的炎性细胞因子的产生量的定量来评价。

2.发热试验

通过与实施例1同样的方法进行发热试验。用生理盐水将灭活流感病毒粒子和GA固定化流感病毒粒子(A/NY株和B/BR株)稀释，使1mL中的蛋白含量为240μg，将其作为试样。将上述试样按照每1kg体重1mL接种给兔，观察发热的上升至6小时后。将A/NY株的3只兔的发热反应之和(℃)示于表14，将B/BR株的3只兔的发热反应之和(℃)示于表15。

GA固定化流感病毒粒子均未确认到1.3℃以上的发热反应之和，以灭活流感病毒粒子为基准观察到2.5℃以上或3℃以上的发热反应之和的降低。可知GA固定化流感病毒粒子的发热反应之和足够低。由此也启示，与灭活流感病毒粒子相比，GA固定化流感病毒粒子具有高的安全性。

表14

A/NY株(H3N2亚型株)：3只兔的发热反应之和

表15

B/BR株(B型维多利亚系统株)：3只兔的发热反应之和

3.炎性细胞因子的产生量的定量

通过基于欧洲药典MONOCYTE-ACTIVATION TEST的方法，对用GA固定化流感病毒粒子或灭活流感病毒粒子刺激人PBMC时的细胞因子(IL-1β)的产生量进行定量。具体而言，将欧洲药典MONOCYTE-ACTIVATION TEST中的将人PBMC以最少4位供给者量作为混合池使用这点变更为1位供给者量进行测定。将GA固定化流感病毒粒子(A/NY株和B/BR株)的细胞因子的产生量的结果示于表16、表17。可知GA固定化流感病毒粒子与灭活流感病毒粒子相比，炎性细胞因子的产生量足够低。由此启示，GA固定化流感病毒粒子与裂解流感抗原同样地具有高的安全性。

表16

A/NY株(H3N2亚型株)：炎性细胞因子的产生量

表17

B/BR株(B型维多利亚系统株)：炎性细胞因子的产生

[实施例4]

物性评价

用以下方法评价上述实施例3中得到的GA固定化流感病毒粒子的物性。

1.利用电子显微镜的解析

为了进一步详细研究GA固定化流感病毒粒子(A/NY株)的形状，通过与实施例2同样的方法，利用电子显微镜进行观察。作为代表，将拍摄的以0.008w/v％的GA浓度在4℃下使其反应3天得到的GA固定化流感病毒粒子(A/NY株)的照片示于图2。GA固定化流感病毒粒子的粒子结构得以保持，没有发现粒子彼此之间结合而成的凝聚体。

2.动态光散射

使用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司制)解析GA固定化流感病毒粒子的平均粒径。将通过动态光散射法测得的液体中的平均粒径示于表18。GA固定化流感病毒粒子的平均粒径为130～160nm左右、为单峰性。由此可知，GA固定化流感病毒粒子的平均粒径与作为来源的病毒粒子是同等的。即可知，GA固定化流感病毒粒子的平均粒径单一、没有变化。另外，GA固定化流感病毒粒子的粒子结构得以保持，没有发现如凝聚体那样的杂质。

表18

3.分子量分布测定(SEC))

通过与实施例2同样的方法(SEC)测定GA固定化流感病毒粒子的分子量分布。将其洗脱模式示于表19。裂解流感抗原在洗脱时间为16～30分钟附近确认到四峰性的峰。另一方面，GA固定化流感病毒粒子在洗脱时间为16～17分钟附近确认到单峰性的峰。

表19

SEC的洗脱模式(洗脱时间(分钟))

4.基于交联度的分析

通过与实施例2同样的方法分析GA固定化流感病毒粒子使用固定化剂时的交联度。将B/BR株(B型维多利亚系统株)的结果示于表20。可知以0.004w/v％、0.008w/v％的戊二醛浓度固定的GA固定化流感病毒粒子的M1蛋白残存率分别为23.8％、10.8％，随着戊二醛浓度升高，交联得到促进，M1蛋白残存率降低。

表20

B/BR株(B型维多利亚系统株)：M1蛋白残存率

5.免疫原性(小鼠肌肉内接种)

按照以下步骤评价GA固定化流感病毒粒子(B/BR株)的免疫原性。首先，对ddY小鼠(雌性、8周龄)按蛋白量计以0.8μg的接种量肌肉内接种(每组16只)裂解流感抗原或GA固定化流感病毒粒子。免疫3周后对小鼠进行全采血，并使其安乐死。通过离心分离得到血清，测定中和抗体效价。作为代表，将B/BR株(B型维多利亚系统株)的免疫原性(中和抗体效价(GMT))的结果示于表21。在B型株的情况下，GA固定化流感病毒粒子与裂解流感抗原相比为高免疫原性。

表21

B/BR株(B型维多利亚系统株)：中和抗体效价(GMT)(小鼠肌肉内接种)

6.抗体亚型解析

作为抗体亚型解析，通过ELISA法测定对上述“5.免疫原性(小鼠肌肉内接种)”中得到的小鼠的血清中所含的流感病毒的抗原特异性的IgG1和IgG2a抗体效价。其结果，与裂解流感抗原对照性地显示，与抗原特异性IgG1相比，GA固定化流感病毒粒子更诱导抗原特异性IgG2a(表22)。这是与灭活流感病毒粒子同样的结果。由该结果可期待，GA固定化流感病毒粒子与能活化体液性免疫而几乎不能活化细胞性免疫的裂解流感抗原相比，疫苗的有效性进一步提高。

表22

B/BR株(B型维多利亚系统株)：亚型解析的结果(EU/mL)

将免疫裂解流感抗原(IgG1)、病毒样粒子(IgG2a)得到的小鼠血清分别稀释25600倍时的值作为1EU/mL。

[实施例5]

(1)EDC固定化流感病毒粒子的制备

1.1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)处理

与实施例1同样地培养、精制甲型流感病毒(H3N2亚型株(A/NY株))和乙型流感病毒(维多利亚系统株B/BR株)。将得到的级分稀释，以使经精制的各流感病毒粒子的蛋白的最终浓度达到A/NY株为2500μg/mL、B/BR株为500μg/mL，得到悬浮液。将EDC溶液用PBS进行阶段稀释以达到0.1～4M，添加到悬浮液中使最终浓度达到50～500mM，在冰冷(0℃)下使其反应2～20小时。反应结束后，用PBS透析反应液，除去EDC，由此得到固定化流感病毒粒子(以下有时记为“EDC固定化流感病毒粒子”)。得到的EDC固定化流感病毒粒子(A/NY株、B/BR株)的发热活性通过用3只兔的发热反应之和进行评价的发热试验、以及刺激人PBMC时的炎性细胞因子的产生量的定量来评价。

2.发热试验

通过与实施例1同样的方法进行发热试验。用生理盐水将EDC固定化流感病毒粒子稀释，使1mL中的蛋白含量为240μg，将其作为试样。EDC固定化流感病毒粒子使用以50mM或500mM的EDC浓度在冰冷下反应2小时后、用PBS对反应液进行透析处理而得到的检体(对于A/NY株，也实施了5mM的EDC浓度)。另外，对于A/NY株，也使用了以5mM的EDC浓度在4℃下反应20小时后、用PBS对反应液进行透析处理而得到的检体。将上述试样以每1kg体重1mL接种给兔，观察发热的上升至6小时后。将3只兔的发热反应之和(℃)示于表23、表24。

EDC固定化流感病毒粒子在全部的EDC处理条件下均未确认到1.3℃以上的发热反应之和。由此也启示，EDC固定化流感病毒粒子与裂解流感抗原同样地具有高的安全性。

表23

A/NY株(H3N2亚型株)：3只兔的发热反应之和

表24

B/BR株(B型维多利亚系统株)：3只兔的发热反应之和

3.炎性细胞因子的产生量的定量

通过基于欧洲药典MONOCYTE-ACTIVATION TEST的方法，对用EDC固定化流感病毒粒子或灭活流感病毒粒子刺激人PBMC时的细胞因子(IL-1β及IL-6)的产生量进行定量。具体而言，将欧洲药典MONOCYTE-ACTIVATION TEST中的将人PBMC以最少4位供给者量作为混合池使用这点变更为1位供给者量进行测定。将A/NY株和B/BR株的EDC固定化流感病毒粒子及灭活流感病毒粒子的细胞因子的产生量的结果示于表25、表26。可知与灭活流感病毒粒子相比，EDC固定化流感病毒粒子的炎性细胞因子产生量足够低。由此启示，与灭活流感病毒粒子相比，EDC固定化流感病毒粒子容易抑制副反应。

表25

A/NY株(H3N2亚型株)：炎性细胞因子的产生量

表26

B/BR株(B型维多利亚系统株)：炎性细胞因子的产生量

[实施例6]

物性评价

用以下方法评价上述实施例5中得到的EDC固定化流感病毒粒子的物性。

1.利用蔗糖密度梯度离心法的分析

通过与实施例2同样的方法，利用蔗糖密度梯度离心法分析EDC固定化流感病毒粒子。作为代表，将以50mM的EDC浓度在冰冷下反应2小时后的EDC固定化流感病毒粒子(A/NY株(H3N2亚型株))的结果示于表27。对于裂解流感抗原，显示蛋白在蔗糖浓度25～50％中广泛分布，病毒粒子分解。与此相对，对于EDC固定化流感病毒粒子，显示在高的蔗糖浓度(47.2％)作为单峰(粒子性)而被分级。HA活性为10240倍。

表27

A/NY株(H3N2亚型株)：蔗糖密度梯度离心分析及HA活性

2.利用电子显微镜的解析

为了详细研究EDC固定化流感病毒粒子的形状，通过与实施例2同样的方法，利用电子显微镜进行观察。作为代表，将拍摄的以500mM的EDC浓度在冰浴下反应2小时后的EDC固定化流感病毒粒子的照片示于图3。EDC固定化流感病毒粒子的粒子结构得以保持，未发现抗原彼此之间结合而成的凝聚体。

3.动态光散射

使用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司制)对EDC固定化流感病毒粒子的平均粒径进行解析。将通过动态光散射法测得的液体中的平均粒径示于表28。EDC固定化流感病毒粒子(A/NY株(H3N2亚型株)、B/BR株(B型株))的平均粒径为130～160nm左右、为单峰性。由此可以确认，EDC固定化流感病毒粒子的平均粒径与作为来源的病毒粒子是同等的。即可知，即使经EDC处理，固定化流感病毒粒子的平均粒径也是单一的、没有变化。另外，EDC固定化流感病毒粒子的粒子结构得以保持，没有发现如凝聚体那样的杂质。

表28

利用动态光散射法测得的液体中的平均粒径(体积荷重平均粒径(主峰)(nm))

4.分子量分布测定(SEC))

测定以H3N2亚型株(A/NY株)为来源的EDC固定化流感病毒粒子的分子量分布。测定使用尺寸排阻色谱法(商品名：TSKgel G6000PWXL(TOSOH公司制))进行(洗脱液使用PBS，以0.5ml/min的流速进行)。其洗脱模式如表29所示。裂解流感抗原在洗脱时间为16～30分钟附近确认到四峰性的峰。另一方面，EDC固定化流感病毒粒子在洗脱时间为16～17分钟附近确认到单峰性的峰。

表29

SEC的洗脱模式(洗脱时间(分钟))

5.基于交联度的分析

通过与实施例2同样的方法分析实施例5中制备的EDC固定化流感病毒粒子使用固定化剂时的交联度。将A/NY株(H3N2亚型株)的结果示于表30。可知，以50mM、500mM的EDC浓度固定的EDC固定化流感病毒粒子的M1蛋白残存率(％)分别为85.7％、53.4％，随着EDC浓度升高，交联得到促进，M1蛋白残存率降低。将B/BR株(B型维多利亚系统株)的结果示于表31。以5mM、50mM、500mM的EDC浓度固定的EDC固定化流感病毒粒子的M1蛋白残存率(％)分别为85.1％、56.1％、27.2％。可知与A/NY株(H3N2亚型株)同样地，随着EDC浓度升高，交联得到促进、M1蛋白残存率降低。

表30

A/NY株(H3N2亚型株)：M1蛋白残存率

表31

B/BR株(B型维多利亚系统株)：M1蛋白残存率

6.免疫原性(小鼠肌肉内接种)

使用小鼠评价EDC固定化流感病毒粒子的免疫原性。通过与实施例4同样的方法得到血清，测定HI抗体效价和中和抗体效价。作为代表，将以50mM和500mM的EDC浓度在冰浴下反应2小时后的EDC固定化流感病毒粒子的免疫原性的结果示于表32(A/NY株的HI抗体效价(GMT))、表33(A/NY株的中和抗体效价(GMT))和表34(B/BR株的中和抗体效价(GMT))。在A/NY株(H3N2亚型株)和B/BR株(B型维多利亚系统株)的情况下，EDC固定化流感病毒粒子与裂解流感抗原相比为显著性高的免疫原性。

表32

HI抗体效价(GMT)：免疫原性(小鼠肌肉内接种)

*1：P<0.05、*2：P<0.001

表33

中和抗体效价(GMT)：免疫原性(小鼠肌肉内接种)

*1：P<0.01、*2：P<0.001

表34

中和抗体效价(GMT)：免疫原性(小鼠肌肉内接种)

*1：P<0.01

7.抗体亚型解析

作为抗体亚型解析，通过ELISA法测定上述“6.免疫原性(小鼠肌肉内接种)”中得到的小鼠的血清中所含的、对病毒抗原特异性的IgG1和IgG2a抗体效价。其结果显示，与裂解流感抗原对照性地，与抗原特异性IgG1相比，EDC固定化流感病毒粒子更诱导抗原特异性IgG2a(表35、表36)。由该结果可期待，EDC固定化流感病毒粒子与能活化体液性免疫但几乎不能活化细胞性免疫的裂解流感抗原相比，疫苗的有效性进一步提高。

表35

A/NY株(H3N2亚型株)：亚型解析的结果(EU/mL)

表36

B/BR株(B型维多利亚系统株)：亚型解析的结果(EU/mL)

8.免疫原性(食蟹猴皮下接种))

使用食蟹猴按照以下步骤评价EDC固定化流感病毒粒子的免疫原性。首先，按HA含量计以15μg的接种量将裂解流感抗原或EDC固定化流感病毒粒子皮下接种(每组8只)给食蟹猴(雄性或雌性，29～35个月龄)。以3周间隔进行2次皮下接种，在2次免疫后第4周进行采血。通过与实施例2同样的方法得到血清，测定HI抗体效价和中和抗体效价。作为代表，将以5mM的EDC浓度在4℃下反应20小时后的EDC固定化流感病毒粒子的免疫原性的HI抗体效价(GMT)的结果示于表37，将中和抗体效价(GMT)的结果示于表38。对于A/CA株(H1N1亚型株)及A/NY株(H3N2亚型株)、B/MA株(B型山形系统)、B/BR株(B型维多利亚系统株)，EDC固定化流感病毒粒子与裂解流感抗原相比，免疫原性显著性地高。

表37

HI抗体效价(GMT)：免疫原性(食蟹猴皮下接种)

*1：P<0.05、*2：P<0.001(与裂解流感抗原的显著性检验)

表38

中和抗体效价(GMT)：免疫原性(食蟹猴皮下接种)

*1：P<0.05、*2：P<0.001(与裂解流感抗原的显著性检验)

9.严格试验前后的稳定性(基于交联度的分析))

以严格试验前后的交联度的变化为指标评价实施例5中制备的EDC固定化流感病毒粒子的稳定性。首先，通过与实施例2同样的方法算出M1蛋白残存率(％)，进而算出将严格试验前的M1蛋白残存率作为100％时的、37℃、1周的严格试验后的M1蛋白残存率的比例。将A/NY株(H3N2亚型株)的结果示于表39。灭活流感病毒粒子在严格试验后的M1蛋白残存率与严格试验前相比上升24％。另一方面，以50、500mM的EDC浓度固定的EDC固定化流感病毒粒子在严格试验后的M1蛋白残存率与严格试验前相比分别减少18％，启示与灭活流感病毒粒子相比变化率更小，更为稳定。

表39

A/NY株(H3N2亚型株)：严格试验前后的M1蛋白残存率的变化率

10.严格试验中的稳定性(基于单向放射免疫扩散试验的分析))

以严格试验前后的HA含量的变化为指标评价实施例5中制备的EDC固定化流感病毒粒子的稳定性。首先，通过单向放射免疫扩散试验(生物学制剂基准(日本，厚生劳动省告示第192号))算出HA含量，进而算出将严格试验前的HA含量作为100％时的、37℃、1周的严格试验后的HA含量的变化率。将A/CA株(H1N1亚型株)及A/NY株(H3N2亚型株)、B/MA株(B型山形系统)、B/BR株(B型维多利亚系统株)的结果示于表40。启示EDC固定化流感病毒粒子在严格试验后的HA含量的变化率小、稳定。

表40

严格试验前后的EDC固定化流感病毒粒子的HA含量的变化率

11.5℃保存11个月时的稳定性(基于交联度的分析))

以5℃保存11个月前后的交联度的变化为指标评价实施例5中制备的EDC固定化流感病毒粒子的稳定性。首先，通过与实施例2同样的方法算出M1蛋白残存率(％)，进而算出将5℃保存11个月前的M1蛋白残存率作为100％时的、5℃保存11个月下的M1蛋白残存率的比例。将A/CA株(H1N1亚型株)及A/NY株(H3N2亚型株)、B/MA株(B型山形系统)、B/BR株(B型维多利亚系统株)的结果示于表41。启示EDC固定化流感病毒粒子在5℃保存11个月下的M1蛋白残存率的变化率小、稳定。

表41

5℃保存11个月后的EDC固定化流感病毒粒子的M1蛋白残存率的变化率

12.5℃保存11个月下的稳定性(基于单向放射免疫扩散试验的分析))

以5℃保存11个月前后的HA含量的变化为指标评价实施例5中制备的EDC固定化流感病毒粒子的稳定性。首先，通过单向放射免疫扩散试验(生物学制剂基准(日本，厚生劳动省告示第192号))算出HA含量，进而算出以5℃保存11个月前的HA含量作为100％时的、5℃保存11个月下的HA含量的变化率。将A/CA株(H1N1亚型株)及A/NY株(H3N2亚型株)、B/MA株(B型山形系统)、B/BR株(B型维多利亚系统株)的结果示于表42。启示EDC固定化流感病毒粒子在5℃保存11个月下的HA含量的变化率小、稳定。

表42

EDC固定化流感病毒粒子的HA含量的变化率

13.5℃保存9个月下的稳定性(小鼠免疫原性(肌肉内接种))

使用小鼠免疫原性(肌肉内接种)评价实施例5中制备的EDC固定化流感病毒粒子在5℃保存9个月下的稳定性。通过与实施例4同样的方法得到血清，测定HI抗体效价和中和抗体效价。作为代表，将以5mM的EDC浓度在4℃下反应20小时后的EDC固定化流感病毒粒子的免疫原性的HI抗体效价(GMT)的结果示于表43，将中和抗体效价(GMT)的结果示于表44。对于A/CA株(H1N1亚型株)及A/NY株(H3N2亚型株)、B/MA株(B型山形系统)、B/BR株(B型维多利亚系统株)，EDC固定化流感病毒粒子与裂解流感抗原相比免疫原性高。

表43

HI抗体效价(GMT)：免疫原性(小鼠肌肉内接种)

表44

中和抗体效价(GMT)：免疫原性(小鼠肌肉内接种)

14.5℃保存9个月下的稳定性(抗体亚型))

作为抗体亚型解析，通过ELISA法测定上述“13.5℃保存9个月下的稳定性(小鼠免疫原性(肌肉内接种))”中得到的小鼠的血清中所含的、对病毒抗原特异性的IgG1和IgG2a抗体效价。其结果显示，即使在5℃保存9个月后，与裂解流感抗原对照性地，与抗原特异性IgG1相比，EDC固定化流感病毒粒子更诱导抗原特异性IgG2a(表45)。由该结果可期待，EDC固定化流感病毒粒子所活化的细胞性免疫在5℃保存9个月后也得以维持。

表45

IgG抗体亚型解析的结果(EU/mL)

15.5℃保存10个月下的稳定性(食蟹猴免疫原性(皮下接种))

使用食蟹猴免疫原性(皮下接种)评价实施例5中制备的EDC固定化流感病毒粒子在5℃保存10个月下的稳定性。首先，按HA含量计以15μg的接种量将裂解流感抗原、EDC固定化流感病毒粒子及灭活流感病毒粒子皮下接种(每组8只)给食蟹猴(雄性或雌性、29～35个月龄)。以3周间隔进行2次皮下接种，在2次免疫后第4周进行采血。通过与实施例2同样的方法得到血清，测定HI抗体效价和中和抗体效价。作为代表，将以5mM的EDC浓度在4℃反应20小时后的EDC固定化流感病毒粒子在5℃保持10个月下的HI抗体效价(GMT)的结果示于表46，将中和抗体效价(GMT)的结果示于表47(表46、表47分别是表37、表38的再表示)。对于A/CA株(H1N1亚型株)及A/NY株(H3N2亚型株)、B/MA株(B型山形系统)、B/BR株(B型维多利亚系统株)，EDC固定化流感病毒粒子与裂解流感抗原相比，免疫原性显著性地高。

表46

HI抗体效价(GMT)：免疫原性(食蟹猴皮下接种)

*1：P<0.05、*2：P<0.001(与裂解流感抗原的显著性检验)

表47

中和抗体效价(GMT)：免疫原性(食蟹猴皮下接种)

*1：P<0.05、*2：P<0.001(与裂解流感抗原的显著性检验)

16.RNA释放量的评价

评价实施例5中制备的EDC固定化流感病毒粒子在蛋白酶处理中的经时的RNA释放量。首先，用PBS稀释灭活流感病毒粒子和EDC固定化流感病毒粒子，加入SDS和蛋白酶K，在55℃下使其反应，经时地提取RNA。RNA提取使用TRIzol LS Reagent和PureLink RNA MiniKit、PureLink DNase(invitrogen公司制、商品名)。提取的RNA的含量用Quant-iTRiboGreen RNA Reagent and Kit(invitrogen公司制、商品名)测定。作为代表，将A/NY株(H3N2亚型株)的结果示于表48。该结果显示，与灭活流感病毒粒子相比，EDC固定化流感病毒粒子的RNA释放被缓释化。

表48

蛋白酶处理后释放的RNA含量的经时变化

17.炎性细胞因子产生量的评价

对实施例5中制备的EDC固定化流感病毒粒子的炎性细胞因子的经时产生量进行评价。方法依据欧洲药典MONOCYTE-ACTIVATION TEST。具体而言，将欧洲药典MONOCYTE-ACTIVATION TEST中的将人PBMC以最少4位供给者量作为混合池使用这点变更为1位供给者进行测定。将A/NY株(H3N2亚型株)中的灭活流感病毒粒子及EDC固定化流感病毒粒子的IL-1β产生量的经时变化示于表49，将IL-6产生量的经时变化示于表50。另外，将B/BR株(B型维多利亚系统株)的灭活流感病毒粒子和EDC固定化流感病毒粒子的IL-1β产生量的经时变化示于表51，将IL-6产生量的经时变化示于表52。其结果显示，与灭活流感病毒粒子相比，EDC固定化流感病毒粒子的炎性细胞因子产生被缓释化。即，通过EDC固定体内的RNA释放被缓释化，延迟了炎性细胞因子产生，由此启示EDC固定化流感病毒粒子具有高的安全性。

表49

PBMC刺激后释放的IL-1β产生量的经时变化(A/NY株)

表50

PBMC刺激后释放的IL-6产生量的经时变化(A/NY株)

表51

PBMC刺激后释放的IL-1β产生量的经时变化(B/BR株)

表52

PBMC刺激后释放的IL-6产生量的经时变化(B/BR株)

[实施例7]

GA固定化日本脑炎病毒粒子的制备

1.戊二醛处理(将病毒粒子的粒子结构固定化的工序))

在Vero细胞培养日本脑炎疫苗原药(化学及血清疗法研究所制、商品名“ENCEVAC”、以蛋白浓度计含有60～90μg/mL用0.08v/v％福尔马林灭活的日本脑炎病毒粒子。以下，有时记为“灭活日本脑炎病毒粒子”)中添加戊二醛，使最终浓度达到0.005～0.02w/v％，在4℃下使其反应3天。反应结束后，用PBS样溶液(添加了作为活化剂的乳糖(终浓度为5w/v％)的PBS)透析得到的反应液。通过透析除去戊二醛，得到固定化日本脑炎病毒粒子(以下有时记为“GA固定化日本脑炎病毒粒子”)。得到的GA固定化日本脑炎病毒粒子的发热活性通过用3只兔的发热反应之和进行评价的发热试验、刺激人PBMC时的炎性细胞因子的产生量的定量来评价。

2.发热试验

通过与实施例1同样的方法进行发热试验。将GA固定化日本脑炎病毒粒子或灭活日本脑炎病毒粒子用生理盐水进行稀释，使1mL中的蛋白含量为70μg，将其作为试样。将上述试样以每1kg体重3mL接种给兔，观察发热的上升至6小时后。将3只兔的发热反应之和(℃)示于表53。作为代表，对以0.01w/v％的戊二醛浓度在4℃反应3天后的GA固定化日本脑炎病毒粒子进行评价。

GA固定化日本脑炎病毒粒子未确认到1.3℃以上的发热反应之和，与灭活日本脑炎病毒粒子相比，观察到1.6℃以上的发热反应之和的降低。由此也启示，GA固定化日本脑炎病毒粒子具有高的安全性。

表53

GA固定化日本脑炎病毒粒子：3只兔的发热反应之和

3.炎性细胞因子的产生量的定量

按照基于欧洲药典MONOCYTE-ACTIVATION TEST的方法，对用GA固定化日本脑炎病毒粒子或灭活日本脑炎病毒粒子刺激人PBMC时的细胞因子(IL-1β及IL-6)的产生量进行定量。具体而言，将欧洲药典MONOCYTE-ACTIVATION TEST中的将人PBMC以最少4位供给者量作为混合池使用这点变更为1位供给者量进行测定。将其结果示于表54。可知与灭活日本脑炎病毒粒子相比，GA固定化日本脑炎病毒粒子的炎性细胞因子的产生量足够低。由此也启示，GA固定化日本脑炎病毒粒子与灭活日本脑炎病毒粒子相比具有高的安全性。

表54

炎性细胞因子的产生量

[实施例8]

物性评价

用以下方法评价上述实施例7中得到的GA固定化日本脑炎病毒粒子的物性。

1.利用电子显微镜的分析

为了详细研究GA固定化日本脑炎病毒粒子的形状，通过与实施例2同样的方法，利用电子显微镜进行观察。作为代表，将拍摄的以0.01w/v％的戊二醛浓度在4℃反应3天后的GA固定化日本脑炎病毒粒子的照片示于图4。GA固定化日本脑炎病毒粒子通过用戊二醛固定，与灭活日本脑炎病毒粒子同样地粒子结构得以保持。

2.动态光散射

使用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司制)对GA固定化日本脑炎病毒粒子的平均粒径进行解析。将通过动态光散射法测得的液体中的平均粒径示于表55。GA固定化日本脑炎病毒粒子的平均粒径为约90nm、为单峰性。另一方面，灭活日本脑炎病毒粒子为约80nm、为单峰性。另外，GA固定化日本脑炎病毒粒子的粒子结构得以保持，没有发现如凝聚体那样的杂质。

表55

通过动态光散射法测得的液体中的平均粒径

3.分子量分布测定(SEC))

测定GA固定化日本脑炎病毒粒子的分子量分布。测定使用尺寸排阻色谱法(商品名：Superose 6 10/300GE(GE Healthcare公司制))进行(洗脱液使用PBS，以0.5ml/min的流速进行)。其洗脱模式如表56所示。GA固定化日本脑炎病毒粒子在洗脱时间为14～15分钟附近确认到单峰性的主峰。另外，灭活日本脑炎病毒粒子也在洗脱时间为14～15分钟附近确认到单峰性的主峰。

表56

SEC的洗脱模式

4.抗原含量

通过使用了抗日本脑炎病毒抗体的夹心ELISA法，按照以下步骤测定抗原的含量(抗原含量)。检体中所含的E抗原被结合有抗日本脑炎病毒兔IgG(一次抗体；多克隆抗体)的微孔板捕获。然后，通过使其与结合有辣根过氧化物酶(HRP)的抗日本脑炎病毒E蛋白单克隆抗体(二次抗体；单克隆抗体)反应，形成与板结合的抗E抗原抗体/E抗原/二次抗体的复合物。通过清洗除去未反应的残留试剂和检体，与酶底物液(邻苯二胺溶液：OPD溶液)反应时，E抗原复合体上的HRP发生反应，产生显色。利用与复合体的量(反映E抗原量)成比例的OPD的显色强度，测定E抗原含量(抗原含量)。

将GA固定化日本脑炎病毒粒子和灭活日本脑炎病毒粒子各自的抗原含量示于表57。作为代表，对以0.01w/v％的戊二醛浓度在4℃反应3天后的GA固定化日本脑炎病毒粒子进行评价，结果含有与灭活日本脑炎病毒粒子同等的抗原。

表57

抗原含量的结果

5.基于比活性的分析

对于实施例7中制备的GA固定化日本脑炎病毒粒子，利用比活性(抗原含量/蛋白含量)评价用固定化剂时的交联度。具体而言，用于测定抗原含量的单克隆抗体(503)识别中和表位，当发生中和表位的结构变化时，比活性降低。相对于未进行固定化的灭活日本脑炎病毒粒子的比活性，以各戊二醛浓度处理了的GA固定化日本脑炎病毒粒子的比活性的相对值(％)(以下有时将该相对值记为“503抗体反应率”(％))。将结果示于表58。以0.005w/v％、0.01w/v％、0.02w/v％的戊二醛浓度固定的GA固定化日本脑炎病毒粒子的503抗体反应率分别为95.1％、74.7％、55.2％，随着戊二醛浓度升高，交联得到促进，启示由503抗体表位的结构变化引起反应率的降低。

表58

GA固定化日本脑炎病毒粒子：503抗体反应率

6.免疫原性(小鼠腹腔内接种))

对ddY小鼠(雌性、4周龄)，作为代表，以1μg或0.25μg的接种量腹腔内接种(每组10只)以0.005或0.01w/v％的戊二醛浓度在4℃反应3天后的GA固定化日本脑炎病毒粒子或灭活日本脑炎病毒粒子。免疫1周后再次免疫，在其一周后对小鼠进行全采血，并使其安乐死。通过离心分离得到血清，按每组等量地取样，按照“病原体检测手册”(国立感染症研究所编)测定中和抗体效价。将由50％溶斑减少率算出的结果示于表59。GA固定化日本脑炎病毒粒子与灭活日本脑炎病毒粒子相比为同等或其以上的中和抗体效价。

表59

免疫原性(中和抗体效价)的结果

7.加速试验中的稳定性(抗原含量)

用PBS样溶液稀释GA固定化日本脑炎病毒粒子和灭活日本脑炎病毒粒子，使最终蛋白浓度达到8μg/mL。以抗原含量为指标，评价25℃下的保存稳定性。作为代表，将以0.01w/v％的戊二醛浓度在4℃反应3天后的GA固定化日本脑炎病毒粒子或灭活日本脑炎病毒粒子的结果示于表60。GA固定化日本脑炎病毒粒子在25℃保存下得以维持一个月。另一方面，灭活日本脑炎病毒粒子在25℃保存下显示降低。显示GA固定化日本脑炎病毒粒子与灭活日本脑炎病毒粒子相比稳定性提高。

表60

稳定性(抗原含量(μg/mL))的结果

括号内为以第0天的抗原含量为100％时的抗原含量变化的比例(％)

8.加速试验中的稳定性(动态光散射))

用PBS样溶液稀释GA固定化日本脑炎病毒粒子和灭活日本脑炎病毒粒子，使最终蛋白浓度达到8μg/mL。以使用Zetasizer Nano ZS的动态光散射法测得的液体中的平均粒径为指标，评价25℃下的保存稳定性。作为代表，将以0.01w/v％的戊二醛浓度在4℃反应3天后的GA固定化日本脑炎病毒粒子或灭活日本脑炎病毒粒子的结果示于表61。GA固定化日本脑炎病毒粒子在25℃保存下得以维持一个月。另一方面，灭活日本脑炎病毒粒子在25℃保存下显示增加。由此显示，GA固定化日本脑炎病毒粒子与灭活日本脑炎病毒粒子相比稳定性提高。

表61

稳定性(体积荷重平均粒径(nm))的结果

括号内为以第0天的平均粒径为100％时的平均粒径变化的比例(％)

9.4℃保存下的稳定性(免疫原性)

用PBS样溶液稀释GA固定化日本脑炎病毒粒子和灭活日本脑炎病毒粒子，使最终蛋白浓度达到8μg/mL。以对小鼠的免疫原性(中和抗体效价)为指标，评价4℃下的保存稳定性。作为代表，将以0.01w/v％的戊二醛浓度在4℃反应15个月后的GA固定化日本脑炎病毒粒子或灭活日本脑炎病毒粒子的结果示于表62。推测虽然在0个月和15个月后给药量不同，但GA固定化日本脑炎病毒粒子在4℃保存下得以维持15个月。另一方面，推测灭活日本脑炎病毒粒子在4℃保存下降低。推测GA固定化日本脑炎病毒粒子与灭活日本脑炎病毒粒子相比，稳定性提高。

表62

免疫原性(中和抗体效价)的结果

[实施例9]

FA固定化日本脑炎病毒粒子的制备

1.福尔马林处理(对病毒粒子的粒子结构进行固定化的工序))

在灭活日本脑炎病毒粒子中添加福尔马林(36～38w/v％甲醛水溶液)，使最终浓度达到0.014～0.04v/v％(以甲醛换算计为0.005～0.015w/v％)，在25℃下使其反应1周。反应结束后，用PBS样溶液透析反应液，除去福尔马林，由此得到固定化日本脑炎病毒粒子(以下有时记为“FA固定化日本脑炎病毒粒子”)。通过刺激人PBMC时的炎性细胞因子的产生量的定量评价得到的FA固定化日本脑炎病毒粒子的发热活性。

2.炎性细胞因子的产生量的定量

通过基于欧洲药典MONOCYTE-ACTIVATION TEST的方法，对用FA固定化日本脑炎病毒粒子或灭活日本脑炎病毒粒子刺激人PBMC时的细胞因子(IL-1β及IL-6)的产生量进行定量。具体而言，将欧洲药典MONOCYTE-ACTIVATION TEST中的人PBMC最少取样4位供给者量这点变更为1为供给者量进行测定。将其结果示于表63。可知与灭活日本脑炎病毒粒子相比，FA固定化日本脑炎病毒粒子的炎性细胞因子的产生量足够低。由此也启示，FA固定化日本脑炎病毒粒子具有比灭活日本脑炎病毒粒子高的安全性。

表63

炎性细胞因子的产生量

[实施例10]

物性评价

用以下方法评价上述实施例9中得到的FA固定化日本脑炎病毒粒子的物性。

1.利用电子显微镜的解析

为了详细研究FA固定化日本脑炎病毒粒子的形状，通过与实施例2同样的方法，利用电子显微镜进行观察。作为代表，示出拍摄的以0.014v/v％的福尔马林浓度在25℃反应一周后的FA固定化日本脑炎病毒粒子的照片(图5)。FA固定化日本脑炎病毒粒子通过用福尔马林固定，与灭活日本脑炎病毒粒子同样地粒子结构得以保持。

2.动态光散射

使用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司制)解析FA固定化日本脑炎病毒粒子的平均粒径。将通过动态光散射法测得的液体中的平均粒径示于表64。FA固定化日本脑炎病毒粒子的平均粒径为约90nm、为单峰性。另一方面，灭活日本脑炎病毒粒子为约80nm、为单峰性。另外，FA固定化日本脑炎病毒粒子的粒子结构得以保持，没有发现如凝聚体那样的杂质。

表64

通过动态光散射法测得的液体中的平均粒径

3.分子量分布测定(SEC))

通过与实施例8同样的方法(SEC)测定FA固定化日本脑炎病毒粒子的分子量分布。洗脱模式如表65所示。FA固定化日本脑炎病毒粒子在洗脱时间为14～15分钟附近确认到单峰性的主峰。另外，灭活日本脑炎病毒粒子也在洗脱时间为14～15分钟附近确认到单峰性的主峰。

表65

SEC的洗脱模式

4.抗原的含量

通过使用了抗日本脑炎病毒抗体的夹心ELISA法，用与实施例8同样的方法测定抗原的含量(抗原含量)。

将FA固定化日本脑炎病毒粒子和灭活日本脑炎病毒粒子各自的抗原含量示于表66。作为代表，对以0.014v/v％及0.02v/v％的福尔马林浓度在25℃反应1周后的FA固定化日本脑炎病毒粒子进行评价，其结果含有与灭活日本脑炎病毒粒子同等的抗原。

表66

抗原含量的结果

5.免疫原性(小鼠腹腔内接种))

通过与实施例8同样的方法，作为代表，测定以0.02v/v％的福尔马林浓度在25℃反应1周后的FA固定化日本脑炎病毒粒子的中和抗体效价。将由50％溶斑减少率算出的结果示于表67。FA固定化日本脑炎病毒粒子与灭活日本脑炎病毒粒子相比为同等或其以上的中和抗体效价。

表67

免疫原性(中和抗体效价)的结果

6.严格试验中的稳定性(抗原含量))

用PBS样溶液稀释FA固定化日本脑炎病毒粒子和灭活日本脑炎病毒粒子，使最终蛋白浓度达到8μg/mL。以抗原含量为指标，评价37℃下的保存稳定性。作为代表，将以0.014v/v％的福尔马林浓度在25℃反应1周后的结果示于表68。FA固定化日本脑炎病毒粒子在37℃保存下得以维持1周。另一方面，灭活日本脑炎病毒粒子在37℃保存下显示降低。显示FA固定化日本脑炎病毒粒子与灭活日本脑炎病毒粒子相比稳定性提高。

表68

稳定性(抗原含量(μg/mL))的结果

[实施例11]

EDC固定化日本脑炎病毒粒子的制备

1.1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)处理

在灭活日本脑炎病毒粒子中添加EDC，使最终浓度达到0.15～15mM，在4℃下使其反应2～20小时。在进行淬灭处理的情况下，进一步将作为猝灭剂的甘氨酸以EDC的8倍量(摩尔质量比)添加到反应液中。反应结束后，用PBS样溶液透析反应液，除去EDC和甘氨酸，由此得到固定化日本脑炎病毒粒子(以下有时记为“EDC固定化日本脑炎病毒粒子”)。通过刺激人PBMC时的炎性细胞因子的产生量的定量对得到的EDC固定化日本脑炎病毒粒子的发热活性进行评价。

2.炎性细胞因子的产生量的定量

通过基于欧洲药典MONOCYTE-ACTIVATION TEST的方法，作为代表，对用以0.15mM或1.5mM的EDC浓度在4℃反应20小时后的EDC固定化日本脑炎病毒粒子或灭活日本脑炎病毒粒子刺激人PBMC时的细胞因子(IL-1β及IL-6)的产生量进行定量。具体而言，将欧洲药典MONOCYTE-ACTIVATION TEST中的人PBMC最少取样4位供给者量这点变更为1位供给者量进行测定。将其结果示于表69。可知与灭活日本脑炎病毒粒子相比，EDC固定化日本脑炎病毒粒子的炎性细胞因子产生量足够低。由此也启示，EDC固定化日本脑炎病毒粒子与灭活日本脑炎病毒粒子相比具有高的安全性。

表69

炎性细胞因子的产生量

[实施例12]

物性评价

用以下方法评价上述实施例11中得到的EDC固定化日本脑炎病毒粒子的物性。

1.利用电子显微镜的解析

为了详细研究EDC固定化日本脑炎病毒粒子的形状，通过与实施例2同样的方法，利用电子显微镜进行观察。作为代表，将拍摄的以1.5mM的EDC浓度在4℃反应20小时后的EDC固定化日本脑炎病毒粒子的照片示于图6。EDC固定化日本脑炎病毒粒子通过用EDC固定，与灭活日本脑炎病毒粒子同样地粒子结构得以保持。

2.动态光散射

使用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司制)对EDC固定化日本脑炎病毒粒子的平均粒径进行解析。将通过动态光散射法测得的液体中的平均粒径示于表70。EDC固定化日本脑炎病毒粒子的平均粒径为约90nm、为单峰性。另一方面，灭活日本脑炎病毒粒子为约80nm、为单峰性。另外，EDC固定化日本脑炎病毒粒子的粒子结构得以保持，没有发现如凝聚体那样的杂质。

表70

通过动态光散射法测得的液体中的平均粒径

3.分子量测定(SEC))

通过与实施例8同样的方法测定EDC固定化日本脑炎病毒粒子的分子量分布。洗脱模式如表71所示。EDC固定化日本脑炎病毒粒子在洗脱时间为14～15分钟附近确认到单峰性的主峰。另外，灭活日本脑炎病毒粒子也在洗脱时间为14～15分钟附近确认到单峰性的主峰。

表71

SEC的洗脱模式

4.抗原含量

通过使用了抗日本脑炎病毒抗体的夹心ELISA法，用与实施例8同样的方法测定抗原的含量(抗原含量)。作为代表，将以1.5mM的EDC浓度在4℃反应20小时后的EDC固定化日本脑炎病毒粒子及灭活日本脑炎病毒粒子各自的抗原含量示于表72。EDC固定化日本脑炎病毒粒子含有与灭活日本脑炎病毒粒子同等的抗原。

表72

抗原含量的结果

5.免疫原性(小鼠腹腔内接种))

通过与实施例8同样的方法测定EDC固定化日本脑炎病毒粒子的中和抗体效价。将由50％溶斑减少率算出的结果示于表73。作为代表，对以1.5mM的EDC浓度在4℃反应2小时后、将作为猝灭剂的甘氨酸以EDC的8倍量(摩尔质量比)添加到反应液中得到的EDC固定化日本脑炎病毒粒子进行评价，其结果与灭活日本脑炎病毒粒子相比为同等或其以上的中和抗体效价。

表73

免疫原性(中和抗体效价)的结果

6.稳定性(抗原含量))

用PBS样溶液稀释EDC固定化日本脑炎病毒粒子和灭活日本脑炎病毒粒子，使最终蛋白浓度达到8μg/mL。以抗原含量为指标，评价25℃、37℃下的保存稳定性。将结果示于表74、表75。EDC固定化日本脑炎病毒粒子在25℃保存下得以维持1个月和在37℃保存下得以维持1周。另一方面，灭活日本脑炎病毒粒子在25℃保存下、37℃保存下均显示抗原含量的降低。显示EDC固定化日本脑炎病毒粒子与灭活日本脑炎病毒粒子相比，稳定性提高。

表74

稳定性(抗原含量(μg/mL))的结果

表75

稳定性(抗原含量(μg/mL))的结果

产业上的可利用性

本发明在医药品领域、特别是疫苗领域中是有用的。

Claims

1.一种疫苗，其含有固定化病毒粒子，

所述固定化病毒粒子是通过用固定化剂处理含有作为来源的病毒粒子或对应的灭活病毒粒子的悬浮液而得到的，

所述固定化剂包含戊二醛或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，

所述病毒粒子为流感病毒粒子或日本脑炎病毒粒子，

以所述悬浮液及所述固定化剂的总量为基准，所述戊二醛的浓度为0.001～0.06w/v％，

以所述悬浮液及所述固定化剂的总量为基准，所述1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为0.05～1500mM，

其中，以作为所述固定化病毒粒子来源的病毒粒子或对应的灭活病毒粒子的3只兔的发热反应之和为基准，所述固定化病毒粒子在发热试验中的3只兔的发热反应之和小于80％。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其中，

所述固定化病毒粒子在发热试验中的3只兔的发热反应之和为1.3℃以下。

3.一种疫苗，其含有固定化病毒粒子，

所述病毒粒子为流感病毒粒子或日本脑炎病毒粒子，

其中，以由受到作为所述固定化病毒粒子来源的病毒粒子或对应的灭活病毒粒子刺激的人末梢血单核细胞产生的炎性细胞因子的量为基准，由受到所述固定化病毒粒子刺激的人末梢血单核细胞产生的炎性细胞因子的量小于80％。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的疫苗，其中，

所述病毒粒子为流感病毒粒子。

5.根据权利要求4所述的疫苗，其中，

所述流感病毒粒子为甲型流感病毒粒子或乙型流感病毒粒子。

6.根据权利要求4所述的疫苗，其中，

所述流感病毒粒子为被分类为H1N1亚型株、H2N2亚型株、H3N2亚型株、H3N8亚型株、H5N1亚型株、H5N2亚型株、H5N6亚型株、H6N1亚型株、H7N3亚型株、H7N7亚型株、H7N9亚型株、H9N2亚型株、或H10N8亚型株的流感病毒粒子。

7.根据权利要求1～3中任一项所述的疫苗，其中，

所述病毒粒子为日本脑炎病毒粒子。

8.根据权利要求7所述的疫苗，其中，

所述日本脑炎病毒粒子为北京-1株、中山株、SA14-14-2株或P3株。

9.根据权利要求1～3中任一项所述的疫苗，其中，

所述固定化病毒粒子表面的蛋白的0％～90％未被固定化。

10.根据权利要求1～3中任一项所述的疫苗，其中，

所述固定化病毒粒子的比活性即抗原含量/蛋白含量相对于作为所述固定化病毒粒子来源的病毒粒子的比活性的相对值为0～95％。

11.根据权利要求1～3中任一项所述的疫苗，其中，

所述固定化病毒粒子具有作为所述固定化病毒粒子来源的病毒粒子或对应的灭活病毒粒子的粒径的80％～150％的平均粒径。

12.根据权利要求1～3中任一项所述的疫苗，其中，

在以蔗糖密度梯度离心测定所述固定化病毒粒子的情况下，在蔗糖浓度35％以上检测到峰。

13.根据权利要求1～3中任一项所述的疫苗，其中，

在用高效液相色谱法测定所述固定化病毒粒子的情况下，确认到单峰性的峰。

14.根据权利要求1～3中任一项所述的疫苗，

在免疫小鼠的情况下，与对所述固定化病毒粒子特异性的IgG1相比，更诱导对所述固定化病毒粒子特异性的IgG2a。

15.一种固定化病毒粒子的制造方法，其包含在含有作为来源的病毒粒子或对应的灭活病毒粒子的悬浮液中加入固定化剂的工序，

所述病毒粒子为流感病毒粒子或日本脑炎病毒粒子，

以所述悬浮液及所述固定化剂的总量为基准，所述1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为0.05～1500mM。

16.根据权利要求15所述的制造方法，其中，

作为来源的所述病毒粒子是通过感染培养细胞、鸡蛋或小鼠脑而回收的病毒粒子。

17.根据权利要求16所述的制造方法，其中，

所述培养细胞包含原代细胞或细胞系。

18.根据权利要求17所述的制造方法，其中，

所述培养细胞包含Vero细胞或MDCK细胞。

19.一种疫苗的制造方法，其包含添加通过权利要求15～18中任一项所述的制造方法得到的固定化病毒粒子的工序。