CN105056225A - 一种灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灭活疫苗的制备方法。本发明利用BEA和甲醛联用的方法，对抗原液在温度为25～27℃的条件下，灭活12～36h。本发明解决了常温灭活问题，避免传统灭活剂甲醛对实验动物带来的应激；同时使用本发明灭活疫苗的制备方法更有利于病毒保持完整性，增强免疫效果，增加产品质量。

Description

一种灭活疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及一种疫苗技术领域，具体涉及一种灭活疫苗的制备方法。

背景技术

目前国内外应用的主要疫苗包括弱毒疫苗和灭活疫苗。由于灭活疫苗的生产工艺简单、安全、使用方便、易于保存、能刺激动物产生高滴度抗体和显著的疫苗保护效果等优点。因此开发优质高效的灭活疫苗是防控各种病毒感染的疾病的有效措施。

传统的病毒灭活剂甲醛，是一种有强烈刺激性的致癌物质。其既可用于病毒含氨基的核苷酸碱基，又可作用病毒壳蛋白。作用于病毒壳蛋白时，易使蛋白质发生交联或病毒颗粒聚集，病原体蛋白的抗原性遭到严重破坏。但是用甲醛灭活时间长，一般需要在37～39℃处理24h以上或更长时间；而且病毒灭活的效果易受温度、pH、浓度、甲醛本身的纯度、是否存在有机物、病原体的种类和含氮量等因素影响。在研究中应引起注意；并且残留的游离甲醛，若随疫苗注入机体后，会产生刺激性反应。

发明内容

[要解决的技术问题]

本发明的目的是解决上述现有技术的问题，提供一种灭活疫苗的制备方法。该方法比传统灭活方法温度低，并且只作用于病毒内的核苷酸，更有利于保持病原体蛋白的抗原性。

[技术方案]

为了达到上述的技术效果，本发明采取以下技术方案：

本发明利用BEA和甲醛联用的方法，对抗原液在温度为25～27℃的条件下，灭活12～36h。本发明解决了常温灭活问题，避免传统灭活剂甲醛对实验动物带来的应激；同时使用本发明灭活疫苗的制备方法更有利于病毒保持完整性，增强免疫效果，增加产品质量。

一种灭活疫苗的制备方法，它包括以下步骤：

首先，制备抗原液；

然后，向抗原液中加入浓度为0.2mol/L的BEI和质量分数为3.7％的甲醛。以使BEI的终浓度为5mmol/L、甲醛的最终质量分数为0.02％～0.025％，充分混匀后，将混合液放置在温度为25～27℃的条件下，振荡灭活12～36h；

最后，灭活结束后，加入1mol/L的无菌硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为5mmol/L，中和并终止灭活1h，得到所述的灭活疫苗。

本发明更进一步的技术方案，所述抗原液选自圆环病毒液、猪细小病毒液、传染性胃肠炎病毒液、流行性腹泻二联病毒液或猪繁殖与呼吸综合征病毒液。

本发明更进一步的技术方案，所述抗原液的培养方法是将病毒按体积分数1％～3％的接种量接种在宿主细胞中，当宿主细胞生长到40％～90％时，将普通培养液更换为维持液，维持观察48～72h后，收集病毒，得到所述抗原液。

本发明更进一步的技术方案，所述BEI是现配现用，其配制方法如下：

将BEA粉末加入浓度为0.4mol/L的NaOH溶液，配制浓度为0.2mol/L的BEA的溶液，然后将其放置在温度为37℃的条件下环化1h后，观察pH值降至8.5时结束环化，接着调整pH值为7.2～7.6，得到所述的BEI。

本发明更进一步的技术方案，所述灭活疫苗放置在-80℃下保存。

下面将详细地说明本发明。

一种灭活疫苗的制备方法，它包括以下步骤：

首先，制备抗原液；

然后，向抗原液中加入浓度为0.2mol/L的BEI和质量分数为3.7％的甲醛。以使BEI的终浓度为5mmol/L、甲醛的最终质量分数为0.02％～0.025％，充分混匀后，将混合液放置在温度为25～27℃的条件下，振荡灭活12～36h；

本发明使用BEI是用BEA现配现用的，BEI毒副作用小，灭活温度为20～37℃，比传统灭活方法温度低，并且其作用于病毒内的核苷酸，病毒核蛋白不会被变性，更有利于保护病原体蛋白的抗原性；但是单独使用BEI进行灭活的话，灭活的时间较长，并且灭活后得到的疫苗有效期相对较短。

本发明使用的甲醛灭活温度为37～39℃，并且甲醛的作用是在病毒含氨基的核苷酸碱基和病毒壳蛋白上的，作用于病毒壳蛋白时，易使蛋白质发生交联或病毒颗粒聚集，病原体蛋白的抗原性遭到严重破坏。而且病毒灭活的效果易受温度、pH、浓度、甲醛本身的纯度、是否存在有机物、病原体的种类和含氮量等因素影响。残留的游离甲醛，若随疫苗注入机体后，会产生刺激性反应。

将BEI和甲醛联用，选择最为合适的使用量，有效地降低了灭活温度，因为在37℃的温度下，对病毒损伤较大，主要是因为大部分酶的最适温度在37℃左右，这样容易降解病毒核蛋白；并且在25～27℃范围内，随着温度的降低，灭活的效果就越好；同时，本发明使用的甲醛量很少，是单独使用甲醛的1/10不到，有效的避免了甲醛的应激影响；另外，在本发明BEI和甲醛联用后，灭活时间有效的缩短至12h。

最后，灭活结束后，加入1mol/L的无菌硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为5mmol/L，中和并终止灭活1h，得到所述的灭活疫苗。

本发明的一个优选实施方式，本发明所述甲醛的最终质量分数为0.02％。

本发明更进一步的技术方案，所述抗原液选自圆环病毒液、猪细小病毒液、传染性胃肠炎病毒液、流行性腹泻二联病毒液或猪繁殖与呼吸综合征病毒液。

本发明更进一步的技术方案，所述抗原液的培养方法是将病毒按体积分数1％～3％的接种量接种在宿主细胞中，当宿主细胞生长到40％～90％时，将普通培养液更换为维持液，维持观察48～72h后，收集病毒，得到所述抗原液。

本发明除了控制灭活剂的使用量，来控制了最佳的病毒处理量，以便最高效的灭活病毒，得到尽可能多的灭活疫苗。

本发明更进一步的技术方案，所述BEI是现配现用，其配制方法如下：

将BEA粉末加入浓度为0.4mol/L的NaOH溶液，配制浓度为0.2mol/L的BEA的溶液，然后将其放置在温度为37℃的条件下环化1h后，观察pH值降至8.5时结束环化，接着调整pH值为7.2～7.6，得到所述的BEI。

本发明的BEI的pH值调至上述范围内的灭活效果最佳。

本发明更进一步的技术方案，所述灭活疫苗放置在-80℃下保存。

[有益效果]

本发明与现有技术相比，具有以下的有益效果：

1，本发明解决了常温灭活问题，使灭活的温度低至25～27℃，并且在该范围内，灭活的温度越低，效果越好；本发明灭活的时间缩短至12h；

2，本发明避免传统灭活剂甲醛对实验动物带来的应激；

3，使用本发明灭活疫苗的制备方法更有利于病毒保持完整性，增强免疫效果，增加产品质量。

附图说明

图1为本发明实施例1的阳性对照细胞显微图；

图2为本发明实施例1的阴性对照细胞显微图；

图3为本发明实施例1的灭活疫苗处理后的细胞显微图。

具体实施方式

下面结合本发明的实施例对本发明作进一步的阐述和说明。

实施例1：

一种传染性胃肠炎病毒灭活疫苗的制备方法，它包括以下步骤：

将BEA粉末加入浓度为0.4mol/L的NaOH溶液，配制浓度为0.2mol/L的BEA的溶液，然后将其放置在温度为37℃的条件下环化1h后，观察pH值降至8.5时结束环化，接着调整pH值为7.2～7.6，得到所述的BEI溶液，过滤，4℃保存备用。

首先，将传染性胃肠炎病毒按体积分数3％的接种量接种在ST宿主细胞中，当宿主细胞生长到90％时，将普通培养液更换为维持液，维持观察48后，收集病毒，得到抗原液；

然后，向抗原液中加入浓度为0.2mol/L的BEI和质量分数为3.7％的甲醛。以使BEI的终浓度为5mmol/L、甲醛的最终质量分数为0.02％，充分混匀后，将混合液放置在温度为27℃的条件下，振荡灭活12h；

最后，灭活结束后，加入1mol/L的无菌硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为5mmol/L，中和并终止灭活1h，得到所述的灭活疫苗。

将本发明12h的灭活疫苗、未处理的传染性胃肠炎病毒(作为阳性对照)、和病毒稀释液(作为阴性对照)接种到健康的ST细胞中，盲传到第三代观察细胞病变。

使用显微镜观察细胞状态。结果如图1和图2所示，图1中细胞量少，阳性全部病变；图2中细胞量多，符合一般细胞生长状态，阴性未病变；而本发明12h的灭活疫苗显示灭活彻底，具体如图3所示，细胞数量多，同阴性对照一致。

实施例2

一种猪圆环病毒灭活疫苗的制备方法，它包括以下步骤：

将BEA粉末加入浓度为0.4mol/L的NaOH溶液，配制浓度为0.2mol/L的BEA的溶液，然后将其放置在温度为37℃的条件下环化1h后，观察pH值降至8.5时结束环化，接着调整pH值为7.2～7.6，得到所述的BEI溶液，过滤，4℃保存备用。

首先，将猪圆环病毒按体积分数3％的接种量接种在PK-15宿主细胞中，当宿主细胞生长到90％时，将普通培养液更换为维持液，维持观察72后，收集病毒，得到抗原液；

然后，向抗原液中加入浓度为0.2mol/L的BEI和质量分数为3.7％的甲醛。以使BEI的终浓度为5mmol/L、甲醛的最终质量分数为0.02％，充分混匀后，将混合液放置在温度为27℃的条件下，振荡灭活12h；

最后，灭活结束后，加入1mol/L的无菌硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为5mmol/L，中和并终止灭活1h，得到所述的灭活疫苗。

将本发明12h的灭活疫苗、未处理的猪圆环病毒(作为阳性对照)、和病毒稀释液(作为阴性对照)接种到健康的PK-15细胞中，盲传到第三代观察细胞病变。

利用间接免疫荧光技术，染色后，利用荧光显微镜观察荧光情况。阳性全部有翠绿色荧光，阴性和灭活样品无荧光；本发明12h的灭活疫苗显示灭活彻底。

实施例3

一种猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活疫苗的制备方法，它包括以下步骤：

将BEA粉末加入浓度为0.4mol/L的NaOH溶液，配制浓度为0.2mol/L的BEA的溶液，然后将其放置在温度为37℃的条件下环化1h后，观察pH值降至8.5时结束环化，接着调整pH值为7.2～7.6，得到所述的BEI溶液，过滤，4℃保存备用。

首先，将猪繁殖与呼吸综合征病毒按体积分数3％的接种量接种在Marc145宿主细胞中，当宿主细胞生长到90％时，将普通培养液更换为维持液，维持观察72后，收集病毒，得到抗原液；

然后，向抗原液中加入浓度为0.2mol/L的BEI和质量分数为3.7％的甲醛。以使BEI的终浓度为5mmol/L、甲醛的最终质量分数为0.025％，充分混匀后，将混合液放置在温度为25℃的条件下，振荡灭活12h；

最后，灭活结束后，加入1mol/L的无菌硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为5mmol/L，中和并终止灭活1h，得到所述的灭活疫苗。

将本发明12h的灭活疫苗、未处理的猪繁殖与呼吸综合征病毒(作为阳性对照)、和病毒稀释液(作为阴性对照)接种到健康的Marc145细胞中，盲传到第三代观察细胞病变。

利用显微镜观察细胞情况。阳性全部病变，阴性和灭活样品未病变；本发明12h的灭活疫苗显示灭活彻底。

尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，上述实施例仅为本发明较佳的实施方式，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。

Claims (5)

1.一种灭活疫苗的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：

首先，制备抗原液；

然后，向抗原液中加入浓度为0.2mol/L的BEI和质量分数为3.7％的甲醛。以使BEI的终浓度为5mmol/L、甲醛的最终质量分数为0.02％～0.025％，充分混匀后，将混合液放置在温度为25～27℃的条件下，振荡灭活12～36h；

最后，灭活结束后，加入1mol/L的无菌硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为5mmol/L，中和并终止灭活1h，得到所述的灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述抗原液选自圆环病毒液、猪细小病毒液、传染性胃肠炎病毒液、流行性腹泻二联病毒液或猪繁殖与呼吸综合征病毒液。

3.根据权利要求1所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述抗原液的培养方法是将病毒按体积分数1％～3％的接种量接种在宿主细胞中，当宿主细胞生长到40％～90％时，将普通培养液更换为维持液，维持观察48～72h后，收集病毒，得到所述抗原液。

4.根据权利要求1所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述BEI是现配现用，其配制方法如下：

将BEA粉末加入浓度为0.4mol/L的NaOH溶液，配制浓度为0.2mol/L的BEA的溶液，然后将其放置在温度为37℃的条件下环化1h后，观察pH值降至8.5时结束环化，接着调整pH值为7.2～7.6，得到所述的BEI。

5.根据权利要求1所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述灭活疫苗放置在-80℃下保存。