CN107308446B - 一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法，疫苗半成品毒液经澄清过滤、浓缩纯化、灭活、稀释、与双相佐剂混合乳化，制备猪圆环病毒2型灭活疫苗，并评价疫苗质量。与现有生产工艺相比，本发明制备的疫苗副反应小、抗原含量高、疫苗质量稳定、生产成本低、疫苗免疫效果评价快速有效。

Description

一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法

技术领域

本发明涉及一种疫苗的生产方法，尤其是一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法，属于生物技术领域。

背景技术

猪圆环病毒2型（PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原，自1991年加拿大首次报道PMWS以来，该病现已波及世界各地，在我国猪群中流行十分严重，临床上常与猪高致病性繁殖与呼吸综合征、猪口蹄疫以及猪细小病毒病等混合感染、继发感染，给全世界养猪业造成了重大的经济损失。

疫苗免疫接种是防控猪圆环病毒病（PCVD）的有效手段，目前商品化的猪圆环病毒疫苗均为灭活疫苗，受生产方式限制，还普遍存在着抗原含量偏低、副反应机率大和效力评价方法单一等问题，影响了疫苗应用效果。⑴抗原含量偏低： 按照生产标准PCV2疫苗半成品毒液毒价趋于10^6.0～10^7.0TCID₅₀/ml，毒液处理及灭活过程中抗原损失量大。⑵疫苗效力评价方法单一：目前PCV2灭活疫苗效力检验是采用仔猪或小鼠免疫攻毒法，仔猪攻毒实验尤其存在筛选阴性实验猪的困难，动物攻毒实验检测周期长（小鼠52天、仔猪45天），PCV2攻毒模型建立困难，检验结果批间差异大。⑶疫苗副反应机率大：由于灭活病毒液含有大量异物蛋白及灭活剂，因此仔猪和母猪免疫过程中极易出现副反应。

因此有必要开发一种新型的猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法，以解决以上问题，提升疫苗质量。

发明内容

本发明的目的为提供一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法，经PCV2病毒澄清过滤、浓缩纯化、灭活、乳化及成品苗评价，生产出抗原含量高、副反应小、质量稳定的猪圆环病毒2型灭活疫苗。

一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法，包括以下步骤：

⑴提供猪圆环病毒2型疫苗半成品病毒液，所述半成品病毒液为猪圆环病毒2型细胞培养液，病毒含量≥10^7.0TCID₅₀/ml；

⑵所述半成品病毒液经微滤中空纤维膜澄清过滤，收集滤过液，残余液加入1/3~1倍体积量的pH 7.2的 PBS液，再次澄清过滤，收集洗液，混合所述滤过液和所述洗液，得到澄清过滤后的病毒液；

⑶将所述澄清过滤后的病毒液经100KD~1000KD超滤中空纤维膜浓缩纯化，收集浓缩液，补加pH 7.2的PBS液进行洗涤，再次浓缩，最终获得浓缩液为原病毒液体积的1/10~1/5；得到纯化浓缩病毒液；

⑷按照所述纯化浓缩病毒液的体积的0.05%~0.2%加入灭活剂，搅拌灭活24~36小时，灭活过程中控制灭活体系pH稳定在7.0~7.4之间；

⑸测定灭活抗原液中Cap蛋白含量，添加pH7.2 PBS液进行稀释，使Cap蛋白含量定量于25~80μg/ml；

⑹抗原液与双相佐剂混合乳化，制备猪圆环病毒2型灭活疫苗；

⑺疫苗效力评价：猪圆环病毒2型灭活疫苗与破乳剂按照体积比1:5~1:10震荡混合，静置至油相、水相分离，高速离心，弃去上层液体，室温干燥后加入去离子水溶解析出蛋白，制备成疫苗蛋白液，测定疫苗蛋白液中Cap蛋白含量以快速评价疫苗质量。

上述技术方案中，步骤⑵中所述微滤中空纤维膜的孔径为0.45μm或0.65μm。

上述技术方案中，步骤⑶中所述超滤中空纤维膜的孔径为100KD或300KD。

上述技术方案中，步骤⑷中所述灭活剂为β-丙内酯、甲醛或戊二醛。

上述技术方案中，步骤⑷中通过实时监测所述灭活体系的pH值，并根据pH值而实时加入NaOH溶液来控制所述灭活体系的pH稳定在7.0~7.4。

上述技术方案中，步骤⑸和步骤⑺中使用SDS-PAGE结合分光光度计定量法测定所述Cap蛋白含量。

上述技术方案中，步骤⑸中所述Cap蛋白含量定量于50~80μg/ml。

上述技术方案中，步骤⑺中所述破乳剂为丙酮、异丙醇或正丁醇。

与现有生产工艺相比，本发明猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法具有以下有益效果：

⑴疫苗副反应小：病毒液中的细胞碎片和异物蛋白是造成猪体副反应的主要原因，本发明采用澄清过滤去除细胞碎片和大蛋白，使用超滤浓缩去除小分子异物蛋白，经检测纯化后病毒液异物蛋白去除率达75%，极大的降低了疫苗副反应几率。

⑵抗原含量高：传统生产工艺生产猪圆环病毒2型灭活疫苗，其有效免疫蛋白Cap蛋白含量≤25μg/头份，且批间差异大。本发明首先通过浓缩纯化工艺可提高抗原含量，获得高浓度Cap蛋白含量的抗原液，是传统工艺抗原含量的3倍；其次灭活过程中控制灭活体系pH值，能够有效减少由于低pH值造成的蛋白析出，降低Cap蛋白损失。

⑶疫苗质量稳定：传统生产工艺由于半成品毒液效价偏低、灭活过程损失的影响，造成生产的灭活疫苗的有效免疫抗原含量批间差异大。本发明通过控制乳化前抗原液Cap蛋白含量，确保成品疫苗中有效免疫蛋白含量，提高疫苗批间质量稳定性。

⑷生产成本低：本发明中病毒灭活剂使用量降低为传统工艺的20%，灭活过程中控制pH值减少有效蛋白析出，两项技术结合有效降低疫苗生产成本。

⑸疫苗免疫效果评价快速有效：与传统的仔猪或小鼠免疫攻毒法比较，本发明疫苗破乳后测定Cap蛋白含量以评价疫苗质量的检测方法，检验周期是4天，极大缩短疫苗评价时间。通过大量Cap蛋白含量与免疫效果的实验数据分析，疫苗中Cap蛋白含量的多少与疫苗免疫保护效果呈线性相关关系，因此本发明中的疫苗评价方法具有高效、快速和稳定的优点。

附图说明

图1 SDS-PAGE图(标准品和各测试样品蛋白电泳图)。

1～6泳道分别是20μg BSA、16μg BSA、12μg BSA、8μg BSA、4μg BSA、2μg BSA；

7～9泳道是灭活前样品、控pH灭活后样品、未控pH灭活后样品；

10泳道为Marker(M)，其分子量标尺100、75、50、40、30、25KD。

图2 疫苗免疫后抗体水平图(不同Cap蛋白含量的疫苗免疫猪体后不同时间抗体水平曲线图)。

具体实施方式

实施例1：半成品毒液澄清过滤、浓缩纯化

猪圆环病毒2型 ZJ/C株由瑞普（保定）生物药业有限公司生产部提供，2012年11月28日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:V201251。

A.病毒液的准备

已长满单层的PK-15细胞经消化分散接入细胞培养瓶中，使每个10L瓶内细胞数量为2~3×10⁸个。同时按照培养液体积的0.5%加猪圆环病毒2型种毒到细胞悬液里。混匀后，37℃转动培养，10r/h。接毒后培养72小时收获，得到猪圆环病毒2型疫苗半成品毒液。

使用间接免疫荧光检测法（IFA方法）测定病毒含量，病毒含量为≥10^7.0TCID₅₀/ml。

B.澄清过滤

⑴组装系统，安装入0.45μm微滤中空纤维膜。0.5M NaOH 溶液浸泡处理1h，对系统进行灭菌处理。用灭菌水对系统进行循环冲洗，洗去残余的溶液，直至pH为7.0左右。将0.1MpH 7.2 PBS溶液加入处理系统，循环，弃尽。

⑵过滤病毒：将50000ml病毒液通过澄清过滤系统循环处理，收集40000ml滤过液；残余液中加入5000ml pH 7.2 PBS液，再次澄清过滤，得到5000ml洗液1；重复洗涤过滤1次，得到6500ml洗液2和7500ml残渣。收集混合滤过液、洗液1和洗液2获得51500ml澄清后毒液。

⑶使用IFA方法测定澄清过程中的原液、滤过液、洗液1、洗液2、澄清后毒液和残渣的病毒含量，以监测澄清过程中病毒的损失率。使用BCA蛋白含量检测试剂盒测定所有样品内水溶性蛋白含量。

C.浓缩纯化

⑴组装系统，安装入300KD超滤中空纤维膜。用3000mL无菌超纯水对系统进行循环冲洗15min。用0.5M NaOH 溶液对系统进行浸泡处理15min。再用5000mL无菌超纯水对系统进行循环冲洗，洗去残余的溶液，直至pH为7.0左右。

⑵操作：50000ml澄清后病毒液经300KD超滤中空纤维膜浓缩纯化，当浓缩液达到原病毒液体积的1/3即17000ml时停止浓缩，收集32000ml透出液；补加17000ml的pH 7.2PBS液进行洗涤，再次浓缩至17000ml，收集17000ml洗液1；重复洗涤浓缩1次，收集24000ml洗液2；最终获得浓缩液10000ml，收集全部浓缩液和滤过液小样（透出液、洗液1、洗液2），得到纯化浓缩病毒液；

⑶检测：使用IFA方法测定浓缩纯化过程中的滤过液和浓缩液的病毒含量，以监测浓缩纯化过程中病毒的回收率和损失率。使用BCA蛋白含量检测试剂盒测定各样品内水溶性蛋白含量。

D.结果

⑴病毒含量检测

经IFA法检测澄清和浓缩纯化步骤里各样品的病毒含量，其结果见表1：

表1 澄清、浓缩样品毒价

根据表1的结果计算经0.45μm澄清过滤后病毒的回收率：

病毒回收率=（10^6.9×5000＋ 10^7.0×6500＋ 10^7.0×40000）/ 10^7.2×50000=63.7%

经300KD浓缩纯化后病毒的回收率：

病毒回收率=10^7.68×10000/ 10^7.0×51500=92.9%

经过澄清过滤、浓缩纯化整套处理工艺后病毒的回收率=63.7%×92.9%=59.2%，该病毒回收率属于正常水平。

⑵水溶性蛋白含量测定

使用BCA蛋白含量检测试剂盒测定各样品内水溶性蛋白含量，结果见表2。

表2 各样品水溶性蛋白浓度测定值

澄清的水溶性蛋白回收率：

（3.16×40000+1.97×5000+1.59×6500）/(3.25×50000)=90.2%

浓缩阶段，经300KD浓缩纯化后水溶性蛋白的回收率：

(3.44×10000)/(2.40×51500)=27.8%

病毒液澄清浓缩处理阶段水溶性蛋白回收率为：

(3.44×10000)/(3.25×50000)=21.2%

异物蛋白去除率为78.8%。

实施例2：PCV2纯化浓缩病毒液的灭活、乳化

A.纯化PCV2病毒液灭活

按照纯化浓缩PCV2病毒液体积的0.1%加入β-丙内酯，4℃ 100r/min搅拌灭活，灭活过程中每2h监测记录一次灭活体系pH值，当灭活体系pH值低于7.0时，缓慢加入0.5MNaOH溶液，使体系pH值调整至7.4，从而使灭活体系始终保持pH7.0~7.4，灭活36h结束。取样测定灭活前、后上清液中Cap蛋白含量。

常规方法：纯化PCV2病毒液体积的0.1%加入β-丙内酯，4℃ 100r/min搅拌灭活，不调整灭活体系pH值，灭活36h结束。取样测定常规法灭活前、后上清液中Cap蛋白含量。

B.测定Cap蛋白含量（SDS-PAGE结合分光光度计定量法）

⑴将标准1mg/ml牛血清白蛋白与测定液样品分别加入5×Bμffer，100℃煮沸5min后取上清备用，配制12%分离胶的SDS-PAGE进行电泳，考马斯亮蓝染色90分钟，于脱色液中脱色2h。

⑵将SDS-PAGE分离胶平铺于白板上，用手术刀片将凝胶上的标准牛血清白蛋白条带和目的蛋白条带（30KD）准确地切下，且在分离胶上没有条带的区域切下一块与标准牛血清白蛋白最大量条带面积同等大小的胶条作为空白对照，按顺序分别放置于试管中。

⑶每支试管加入0.5ml含3%SDS的50%异丙醇，用封口膜封口，放入试管架中，放在37℃24h，期间可以间断摇晃。

⑷24h后将混合液分别加入到96孔透明酶标板中，每孔加100μl样品，3个复孔，用多功能微孔板检测仪测595nm 处的吸光值，每3个复孔取平均值绘制标准曲线导出线性方程及相关系数。

⑸将Cap蛋白在595nm 处的吸光值代入线性方程y值，可以计算出x值即Cap蛋白的含量，再除以电泳时上样的体积，可得Cap蛋白的浓度。

C.乳化

⑴测定灭活抗原液中Cap蛋白含量，向抗原液中加入pH7.2 PBS液，使抗原液中Cap蛋白含量分别达到50μg/ml、70μg/ml和100μg/ml；

⑵将上述三种标定好的灭活抗原液与W/O/W（水包油包水）双相佐剂按照1:3（V:V）进行搅拌乳化，搅拌转速300r/min 乳化30min，制备猪圆环病毒2型灭活疫苗，分别编号为疫苗1、疫苗2、疫苗3。

D.结果

使用SDS-PAGE方法结合分光光度计测定标准样品和各测试样品的OD₅₉₅数值，结合标准品浓度，获得标准曲线和计算公式，从而获得各测试样品Cap蛋白含量。

标准品和各测试样品蛋白电泳图见图1。

标准品蛋白含量及OD₅₉₅值见表3。

表3 标准品蛋白含量及OD₅₉₅值

根据表3结果绘制标准曲线，得到线性方程，线性方程为y=0.042x＋0.029（x是蛋白含量μg，y是OD₅₉₅数值）

表4 检测样品蛋白含量及OD₅₉₅值

检测样品蛋白含量及OD₅₉₅值见表4，检测样品上样量全部是20μl/孔，通过分光光度计获得OD₅₉₅数值，再经过标准公式得到Cap蛋白含量。

由检测结果可知，常规的未控制灭活系统pH值的方法生产的灭活抗原，其Cap蛋白损失率高达55.7%；而通过控制pH值进行灭活的抗原，样品Cap蛋白损失率仅有5.8%，有效减少由于低pH值造成的蛋白析出，降低Cap蛋白损失。

实施例3：猪圆环病毒2型灭活疫苗效力快速评价及免疫效果评估

A.疫苗破乳及总蛋白提取

选取猪圆环病毒2型灭活疫苗3个样品（疫苗1、疫苗2、疫苗3）进行检测，各取成品疫苗100μl与-20℃保存丙酮1000μl震荡混合，4℃静置30min，使油相、水相分离，12000r/min高速离心20min，弃去上层液体，室温干燥，加入75μl去离子水溶解析出蛋白，制备成疫苗总蛋白液。

B.Cap蛋白含量测定

方法同实施例2 B步骤操作。

C.免疫效果平行评估

小鼠免疫攻毒法：3种疫苗样品同时进行，用 6～8 周龄的健康 Balb/C 小鼠 10只，各腹腔注射疫苗 0.2ml ，免疫后 21 日，连同对照小鼠 10 只，用 PCV2-ZJ/C 株检验用毒（10 ^7.0 TCID ₅₀ /ml ）攻击，每只小鼠腹腔注射 0.45ml 。攻毒后 21 日，扑杀取脾脏进行病毒分离，分离到病毒即判为病毒分离阳性。对照小鼠应至少 7 只病毒分离阳性，免疫小鼠应至少 7 只病毒分离阴性。

猪体免疫法：选择14~21日龄的PCV2抗原和抗体双阴性、蓝耳和猪瘟抗原阴性猪进行免疫，每种疫苗免疫5头猪，猪体颈部肌肉注射疫苗2.0ml，同时留5头猪作为阴性对照，分别采集免疫后7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d和56d血液样本，使用猪圆环病毒2-dCap-ELISA抗体检测试剂盒测定血清中PCV2抗体水平。

D.结果

表5 成品疫苗Cap蛋白含量

表6 小鼠攻毒法阳性分离率

使用猪圆环病毒2-dCap-ELISA抗体检测试剂盒测定免疫后7d~56d猪体血清中PCV2抗体水平，每个样品免疫5头猪，测定OD₄₅₀数值求平均数。结果见表7。

表7 免疫后不同时间PCV2抗体检测OD₄₅₀值

不同Cap蛋白含量的疫苗免疫猪体后不同时间抗体水平曲线图见图2，可见Cap蛋白含量高的疫苗免疫猪血清抗体产生快且抗体水平高；同时Cap蛋白含量高疫苗免疫小鼠攻毒保护率也高。

经过多次数据分析得知疫苗中Cap蛋白含量的多少与疫苗免疫保护效果呈线性相关关系。因此本发明充分利用抗原液中Cap蛋白定量可控制疫苗有效抗原量，从而控制疫苗质量及免疫效果。

本发明猪圆环病毒2型灭活疫苗破乳后测定Cap蛋白含量以评价疫苗质量的检测方法本发明，整体检测周期为4天，极大缩短疫苗效力评价周期。

Claims (6)

1.一种以Cap蛋白含量进行疫苗快速评价的猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供猪圆环病毒2型疫苗半成品病毒液，所述半成品病毒液为猪圆环病毒2型细胞培养液，病毒含量≥10^7.0TCID₅₀/ml；

所述半成品病毒液经微滤中空纤维膜澄清过滤，收集滤过液，残余液加入1/3～1倍体积量的pH 7.2的 PBS液，再次澄清过滤，收集洗液，混合所述滤过液和所述洗液，得到澄清过滤后的病毒液；

将所述澄清过滤后的病毒液经100KD～1000KD超滤中空纤维膜浓缩纯化，收集浓缩液，补加pH 7.2的PBS液进行洗涤，再次浓缩，最终获得浓缩液为原病毒液体积的1/10～1/5；得到纯化浓缩病毒液；

按照所述纯化浓缩病毒液的体积的0.05%～0.2%加入选自β-丙内酯、甲醛或戊二醛的灭活剂，搅拌灭活24～36小时，灭活过程中控制灭活体系pH稳定在7.0～7.4之间；

测定灭活抗原液中Cap蛋白含量，添加pH7.2 PBS液进行稀释，使Cap蛋白含量定量于50～70μg/ml；

抗原液与双相佐剂混合乳化，制备猪圆环病毒2型灭活疫苗；

疫苗效力评价：猪圆环病毒2型灭活疫苗与破乳剂按照体积比1:5～1:10震荡混合，静置至油相、水相分离，高速离心，弃去上层液体，室温干燥后加入去离子水溶解析出蛋白，制备成疫苗蛋白液，测定疫苗蛋白液中Cap蛋白含量以快速评价疫苗质量。

2.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤

中所述微滤中空纤维膜的孔径为0.45μm或0.65μm。

3.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤

中所述超滤中空纤维膜的孔径为100KD或300KD。

4.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤

中通过实时监测所述灭活体系的pH值，并根据pH值而实时加入NaOH溶液来控制所述灭活体系的pH稳定在7.0～7.4。

5.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤

和步骤⑺中使用SDS-PAGE结合分光光度计定量法测定所述Cap蛋白含量。

6.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤

中所述破乳剂为丙酮、异丙醇或正丁醇。

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