JPH05260962A

JPH05260962A - ニワトリ貧血因子ワクチン

Info

Publication number: JPH05260962A
Application number: JP4251374A
Authority: JP
Inventors: Carla Christina Schrier; カーラ・クリステイーナ・スリール
Original assignee: Akzo NV
Current assignee: Akzo NV
Priority date: 1991-09-20
Filing date: 1992-09-21
Publication date: 1993-10-12
Anticipated expiration: 2022-07-18
Also published as: ATE147632T1; HU9202976D0; HUT65367A; US5728569A; HU217214B; EP0533294A1; CN1050302C; MX9205336A; HU211896A9; GR3022755T3; ES2099200T3; JP3945830B2; DE69216732T2; AU659490B2; DE69216732D1; NZ244361A; AU2521792A; JP4148980B2; EP0533294B1; KR100221710B1

Abstract

(57)【要約】【構成】この発明は、ワクチン接種したニワトリにお
いて免疫反応を誘導することができる、生の及び不活性
化したニワトリ貧血因子（ＣＡＡ）ワクチンを提供す
る。このワクチンのＣＡＡウイルスは孵化卵内における
連続継代により弱毒化される。この発明はまた、このよ
うな新規のＣＡＡウイルスおよび該ウイルスの製造方法
も提供する。【効果】インビトロにおいてＣＡＡウイルスを高力価
に増殖させることができ、得られたウイルスは免疫原性
を保持し且つ病原性も極めて低い。これにより、該ワク
チンは、ＣＡＡに対する家禽類の保護に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ニワトリ貧血因子（Ｃ
ＡＡ）に対する家禽類の保護のための、生のもしくは不
活性化されたワクチン、このようなワクチンの製造方
法、ＣＡＡウイルス産物の製造方法、並びに、ＣＡＡウ
イルスの微生物学的に純粋な組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ニワ
トリ貧血因子（ＣＡＡ）は鳥類の感染性貧血の原因とな
る因子であり、最初にＹｕａｓａらにより１９７９年に
記載された（ＡｖｉａｎＤｉｓｅａｓｅｓ２３巻、
３６６‐３８５ページ、１９７９年）。幼若で感受性で
あるニワトリにおいて、ＣＡＡは骨髄の形成不全症／減
形成症及び胸腺の萎縮を伴う顕著な貧血を引き起こす。

【０００３】ニワトリは、ＣＡＡに起因する実験的に誘
導した疾患に対して年令抵抗性を発現する。これは主に
２週令までに完了するが、それより年上の鳥もやはり感
染に対して感受性である（Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、１９７
９年、上掲；Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、ＡｖｉａｎＤｉｓ
ｅａｓｅｓ２４巻、２０２‐２０９ページ、１９８０
年）。しかしながら、ニワトリがＣＡＡと免疫抑制剤
（ＩＢＤＶ、ＭＤＶ等）で２重に感染される場合には、
疾患に対する年令抵抗性は遅延する（Ｙｕａｓａ、Ｎ．
ら、１９７９年及び１９８０年、上掲；Ｂｕｌｏｗｖ
ｏｎＶ．ら、Ｊ．ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉ
ｃｉｎｅ３３巻、９３‐１１６ページ、１９８６
年）。ＣＡＡを接種したニワトリにおける疾病率及び死
亡率は、接種に使用されたＣＡＡの用量と強く関連して
おり、つまり、用量が多ければ疾患の重症度が高くなる
（Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、１９７９年、上掲）。

【０００４】ＣＡＡは、腎臓、胸腺、ファブリシウスの
粘液嚢、骨髄もしくは白血球細胞に由来するニワトリ胚
の線維芽細胞（ＣＥＦ）、ニワトリ胚の脳細胞、ニワト
リ胚の肝細胞、及び、ニワトリ細胞のような様々なニワ
トリ及びニワトリ胚の組織から誘導される標準的な培養
単層細胞中においては増殖せず（Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、
１９７９年、上掲；Ｙｕａｓａ、Ｎ．、Ｎａｔｌ．Ｉ
ｎｓｔ．Ａｎｉｍ．ＨｅａｌｔｈＱ．、２３巻、１
３‐２０ページ、１９８９年）、あるいは、ＶＥＲＯ、
ＣＲＦＫ、ＭＤＣＫ及びＡ‐７２のような一般的に用い
られる種々の哺乳類細胞系においても増殖しない（Ｒｏ
ｓｅｎｂｅｒｇｅｒ、Ｊ．Ｋ．及びＣｌｏｕｄ、Ｓ．
Ｓ．、ＡｖｉａｎＤｉｓｅａｓｅｓ３３巻、７０７
‐７１３ページ、１９８９年）。ＣＡＡは、マレック病
から樹立されたある種のリンパ芽球細胞系及びリンパ系
白血症リンパ腫の中、特にＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞培養
物中において増殖する（Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、１９８３
年、上掲）。しかしながら、都合の悪いことに、ＣＡＡ
はＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞中においては比較的低い力価
でしか増殖できない。すなわち、ＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細
胞中においては、１０^5.0〜１０^6.0ＴＣＩＤ₅₀／０．
１ｍｌの力価が得られたにすぎなかった。更に、ＣＡＡ
は、ＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞中において、接種用量の約
１０倍までしか増殖しないことが判明している（Ｙｕａ
ｓａ、Ｎ．ら、１９８３年、上掲、Ｂｕｌｏｗｖｏｎ
Ｖ．ら、ＺｅｎｔｒａｌｂｌａｔｔＶｅｔ．Ｍｅ
ｄ．３２巻、６７９‐６９３ページ、１９８５年）。

【０００５】ニワトリに加え、ＣＡＡは、ニワトリ胚中
においても増殖することができる（Ｙｕａｓａ、Ｎ．及
びＹｏｓｈｉｄａ、Ｉ．、Ｎａｔｌ．Ｉｎｓｔ．Ａ
ｎｉｍ．ＨｅａｌｔｈＱ．２３巻、９９‐１００
ページ、１９８３年；ＢｕｌｏｗｖｏｎＶ．及びＷ
ｉｔｔ、Ｍ．、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．３３巻、６
６４‐６６９ページ、１９８６年）。しかしながら、こ
れらの胚については致死的もしくは病理学的作用は何ら
観察されず、ＣＡＡは孵化卵内において、胚に影響を与
えるほど充分大量には増殖しないことが示された。胚全
体から取得できたＣＡＡの最高力価は、ＭＤＣＣ‐ＭＳ
Ｂ１細胞中においてアッセイした場合には１０^5.0〜１
０^6.5ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌの間で変化し、これは、実験的
に感染させたニワトリの肝臓抽出物から取得された力価
に等しい。

【０００６】ＢｕｌｏｗｖｏｎＶ．及びＷｉｔｔ、
Ｍ．（上掲）は、ウイルスの弱毒化を必要としない親貯
蔵株（ｐａｒｅｎｔｓｔｏｃｋ）を投与することがで
きる生ワクチンの製造のための手段として、孵化卵内に
おける発病性ＣＡＡの増殖を研究した。しかしながら、
ウイルスの弱毒化は、免疫原性の損失を引き起こすこと
があるという理由から、それを避けなければならないこ
とが下記の文献中に記載されている（Ｂｕｌｏｗｖｏ
ｎ、Ｖ．及びＦｕｃｈｓ、Ｂ．、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍ
ｅｄ．３３巻、５６８‐５７３ページ、１９８６
年）。

【０００７】Ｂｕｌｏｗ及びＦｕｃｈｓ（Ｊ．Ｖｅ
ｔ．Ｍｅｄ．３３巻、５６８‐５７３ページ、１９
８６年）は、ＣＡＡ株Ｃｕｘ‐１の病原性はＭＤＣＣ‐
ＭＳＢ１細胞内での１２回連続の継代の後に低減するこ
とを報告しているが、これらの病原性の弱い株の免疫原
性に関するデータはその文献中に何ら開示されていな
い。実際のところ、病原性の低減を伴う免疫能力の減少
がＢｕｌｏｗ及びＦｕｃｈｓにより予想されている。

【０００８】Ｙｕａｓａ（１９８３年、上掲）またはＧ
ｏｒｙｏら（ＡｖｉａｎＰａｔｈｏｌｏｇｙ１６
巻、１４９‐１６３ページ、１９８７年）またはＯｔａ
ｋｉら（ＡｖｉａｎＰａｔｈｏｌｏｇｙ１７巻、３
３３‐３４７ページ、１９８８年）のいずれもが、それ
ぞれ、Ｇｉｆｕ‐１株の１９回の継代後、ＴＫ‐５８０
３株の４０回の継代後、及び、ＣＡＡ８２‐２株の４０
回の継代後のＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞における弱毒化に
関する証拠を見出していない。

【０００９】ＶｉｅｌｉｔｚＥ．ら（Ｊ．Ｖｅｔ．
Ｍｅｄ．３４巻、５３３‐５５７ページ、１９８７
年）は、Ｃｕｘ‐１株に由来するＣＡＡ生ワクチンの評
価を報告している。しかしながら、その文献中では弱毒
化したＣＡＡ株を使用していない。発病性ＣＡＡを含む
このワクチンを９〜１５週令のニワトリに投与したが、
接種した鳥において何ら病原性を示さなかった。ＣＡＡ
に起因する実験的に誘導した疾患に対する年令抵抗性は
２週令までに本質的に完了するというこの公知の年令抵
抗性の点で、接種される鳥自身のための生ワクチンの弱
毒化のレベルは、この場合あまり重要でない。しかしな
がら、ＣＡＡ生ワクチンとの接触後の幼若なニワトリに
おける病理学的兆候を予防するために、ＣＡＡ生ワクチ
ンウイルスを大いに弱毒化するべきである。

【００１０】ＣＡＡ生ワクチンの代替物、不活性化し、
アジュバントを加えたワクチンであろう。このような不
活化ワクチンを、ニワトリ中に存在する免疫性を増強す
るために使用することができる。しかしながら、インビ
トロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）においてＣＡＡウイルスを高
力価にまで増殖させることが現在不可能であることによ
りこのアプローチを複雑なものにするという理由から、
現在までに不活化ＣＡＡワクチンは報告されていない
（ＭｃＮｕｌｔｙ、Ｍ．Ｓ．、ＡｖｉａｎＰａｔｈｏ
ｌｏｇｙ２０巻、１８７‐２０３ページ、１９９１
年）。

【００１１】そのため、本発明の第１の目的は、インビ
トロにおいて高力価にまで増殖することができるＣＡＡ
ウイルスを提供することである。

【００１２】更に、本発明の目的は、野生種の単離体に
関して、幼若ニワトリにおいて病原性の著しい低下を示
しかつその免疫原性を保持するＣＡＡウイルス株から誘
導されたＣＡＡワクチンを提供することである。

【００１３】更に、本発明の目的は、ワクチン接種後に
ニワトリにおける免疫反応を引き起こすために十分高い
量のＣＡＡ抗原を含む不活化ＣＡＡワクチンを提供する
ことである。

【００１４】更に、本発明の目的は、ＣＡＡウイルス株
の弱毒化のための一般的な方法を提供することである。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明は、新しいＣＡＡ
ウイルス、すなわち、ニワトリ胚において病変を誘発す
ることができるＣＡＡウイルスに関する。ＣＡＡに起因
する病変は、死亡、青白い胚、及び、出血、特に頭部の
出血、を含む。これらの種類のＣＡＡウイルスは、様々
な有利な特性を示す。本発明のＣＡＡウイルスの好まし
い特性のうちの一つは、詳細を下記に述べてあるよう
に、それらがインビトロにおいて高力価にまで増殖する
ことができるということである。

【００１６】当該ＣＡＡウイルスの更に別の利点は、こ
れらのウイルスは、ニワトリ胚に対してより強い発病性
を示すものの、ＣＡＡ野生型ウイルスと比較した場合１
日令のヒナに対しては低減された病原性を有し、かつ、
それらの免疫原性特性を保持しているということであ
る。

【００１７】本発明はパスツール研究所のＣＮＣＭに寄
託してあるＩ‐１１４１株のＣＡＡウイルスに関する
（１９回目の継代レベル）。これらのウイルスを少なく
とも１０^8.4ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌの力価にまで孵化卵内で
培養することができ、更に、これらは親の野生型株より
も１日令のヒナに対してより低い病原性を示しかつ親株
同様の免疫原性を示す。

【００１８】新しい種類のＣＡＡを、以下及び実施例に
おいて記載するように、孵化卵内において入手できる任
意のＣＡＡウイルスを継代することにより取得すること
ができる。

【００１９】ＣＡＡに対する家禽類の保護のための新規
のワクチンは、そのワクチンが、ニワトリ胚において病
変を誘発することができるＣＡＡウイルスを含み、好ま
しくは、それらのウイルスが孵化卵内における継代の手
法により取得されるという特徴を有する。

【００２０】ニワトリ組織、例えば肝臓からの入手でき
るＣＡＡ株の単離後、組織ホモジネートを多段階の弱毒
化過程に使用することができる。まず最初に、所望なら
ば、卵内への接種前に、ＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞内のよ
うな、ＣＡＡに適する組織もしくは細胞内でＣＡＡウイ
ルスを継代及び増殖させることができる。このウイルス
ストックをその後、孵化卵に感染させ、更に、その後の
増殖、及び孵化卵内でのウイルスの継代のために、この
目的について当業者に公知の方法により使用することが
できる。

【００２１】より具体的には、標準方法に従い、卵当た
り少なくとも１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀で卵黄嚢を通して卵を
ＣＡＡで感染する。感染された胚を、接種後約１３日後
に取り出し、ホモジナイズし、更に、例えばトリプトー
ス２．５％（１：２０ｖ／ｖ）で希釈する。その後、
新鮮な孵化卵に、各卵継代段階において、卵当たり０．
２ｍｌのホモジネートを接種した。最後の卵継代の後、
ウイルスを増殖させ、その後取り出し、更に、ＣＡＡ感
染に対する免疫化活性を有するワクチンに加工する。最
終継代のウイルスを、孵化卵、または、ＭＤＣＣ‐ＭＳ
Ｂ１細胞のようなＣＡＡに対して感受性である細胞もし
くは組織培養内で増殖させることができる。孵化卵の場
合には、胚および／または膜および／または尿膜液を取
り出す。

【００２２】好ましい増殖及び弱毒化された性質を有す
るＣＡＡウイルスを取得するために必要な卵継代の回数
は、特に、特有のＣＡＡ株、及び、弱毒化および／また
は所望のインビトロでの力価に依存する。

【００２３】本発明の生ワクチンを製造するのに適す
る、病原性の顕著な減少を有するウイルスを結果として
生じるＣＡＡウイルスの卵継代の典型的な合計回数は、
１８回もしくはそれ以上の回数であり、３４回もしくは
それ以上の回数であることが好ましい。

【００２４】特に、本発明のワクチンはインターベット
（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ）ＣＡＡ株２６Ｐ４のウイルスに由
来する。この株は、元々、貧血を患う野生のニワトリの
肝臓から単離された。単離後、この株をＭＤＣＣ‐ＭＳ
Ｂ１細胞内で５回継代し、更にその後、孵化卵内で１９
回継代した。この株のサンプルは受託番号Ｉ‐１１４１
としてフランスのパスツール研究所のＣｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓ
ｄｅＭｉｃｒｏ‐ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）
に寄託してある。１９回目の継代レベルのＣＡＡウイル
スのみが本発明のワクチンの製造に使用できるだけでな
く、この株のその後の継代レベルのウイルスも非常に適
切なものである。

【００２５】この弱毒化された株は、卵を適用させなか
ったこの株のウイルスに関してウイルス中和（ＶＮ）テ
ストを用いて測定する場合、その病原性の著しい低下を
示す一方、この株のウイルスの免疫原特性は何の影響も
受けない。

【００２６】上述の方法に従って取得することができる
新規のＣＡＡ生ウイルスは、いくつかの他と異なる特性
を有しており、特に、 ‐これまでに開示されている全てのＣＡＡ株に対立する
ものとして、そのＣＡＡウイルスは胚中において致死的
または病理学的作用を含む、ＣＡＡに特異的な病変を誘
導する。（Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、１９７９年、上掲；Ｙ
ｕａｓａ、Ｎ．及びＹｏｓｈｉｄａ、Ｉ．、１９８３
年、上掲；Ｂｕｌｏｗｖｏｎ、Ｖ．及びＷｉｔｔ、
Ｍ．、１９８６年、上掲）。他の好ましい特性は、 ‐このＣＡＡウイルスは弱毒化され、つまり、１日令の
ＳＰＦニワトリに投与する場合、野外から単離したＣＡ
Ａに関して顕著に低い病原的兆候を誘発するにすぎな
い、 ‐このＣＡＡウイルスは、孵化卵中において高力価にま
で増殖するのに適合している。

【００２７】生の弱毒化されたＣＡＡを含む本発明のワ
クチンを、それ自体公知の方法で懸濁液の形態もしくは
凍結乾燥物として製造し、かつ、市販することができ
る。

【００２８】生ワクチンについて、ヒナ当たりの用量割
合は弱毒化ウイルスの１０^1.0〜１０^7.0ＴＣＩＤ₅₀の
範囲であることができる。

【００２９】特に、乾燥組成物を凍結乾燥により製造す
る場合には、安定剤を添加すると都合がよい。適切な安
定剤は、例えば、ＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋら、Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ５９巻、５０９ページ、
１９５０年）、炭水化物（例えば、ソルビトール、マン
ニトール、デンプン、ショ糖、デキストランもしくはグ
ルコース）、蛋白質類（例えば、アルブミンもしくはカ
ゼイン）、あるいは、それらの分解産物、及び、バッフ
ァー（例えば、リン酸アルカリ金属塩）である。所望な
らば、アジュバント活性を有する１種類もしくはそれ以
上の化合物を添加することができる。この目的に適する
化合物は、例えば、ビタミンＥアセテートのｏ／ｗ（油
中水型）乳化液、水酸化アルミニウム、リン酸塩もしく
は酸化物、鉱物油（例えば、ＢａｙｏｌＦ（登録商
標）、Ｍａｒｃｏｌ５２（登録商標））及びサポニン
類である。

【００３０】本発明の他の重要な態様は、この病原体に
より引き起こされるニワトリにおける疾患の予防のため
の、不活性化したＣＡＡワクチンの使用である。現在ま
でに、接種されるニワトリにおいて免疫反応を誘導する
不活性化ＣＡＡワクチンは製造されていない。

【００３１】最初に本発明は、ＣＡＡウイルスの有効量
を含む不活性化ＣＡＡワクチンを提供するが、このワク
チンは、ワクチン接種後ニワトリ内でＣＡＡウイルス中
和抗体の産生を誘起することができる。

【００３２】特に不活性化ワクチンは、本発明の新しい
種類のＣＡＡウイルスから誘導される。

【００３３】本発明の好ましい不活性化ＣＡＡワクチン
は、上述したように、連続した継代により孵化卵内にお
いて弱毒化された不活性化ＣＡＡの１種類もしくはそれ
以上の単離物を含む。所望ならば、卵を適応させたＣＡ
Ａを、不活性化過程の前に、ＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞の
ような感受性の細胞もしくは組織培養内において増殖さ
せることができる。

【００３４】ＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞上でアッセイする
場合、この不活性化ワクチンが、用量当たり約１０^7.5
ＴＣＩＤ₅₀を上回る、好ましくは用量当たり約１０^8.0
ＴＣＩＤ₅₀を上回る、更に、より好ましくは用量当たり
約１０^9.0ＴＣＩＤ₅₀を上回る、前不活性化ウイルス力
価を有するＣＡＡを含むことが好ましい。

【００３５】不活性化ＣＡＡ液を、アミコン濃縮器のよ
うな有効な技術、ポリエチレングリコールを用いるよう
な沈殿技術、超遠心の方法による濃縮、あるいは、アジ
ュバント濃縮技術のうち任意の数の技術を用いて濃縮す
ることができる。

【００３６】ＣＡＡウイルスの不活性化の目的は、ウイ
ルスの再生をなくすことである。一般的には、これを化
学的もしくは物理学的方法により行うことができる。化
学的不活性化は、ウイルスを、例えば、酵素、フォルム
アルデヒド、β‐プロピオラクトン、エチレンイミンも
しくはそれらの誘導体で処理することにより実施するこ
とができる。必要ならば、この不活性化用化合物をその
後中和するが、例えば、フォルムアルデヒドで不活性化
された材料をチオ硫酸で中和することができる。物理学
的不活性化は、好ましくは、紫外線、Ｘ線照射もしくは
γ線照射のような高エネルギー照射にウイルスを供する
ことにより実施することができる。所望ならば、ｐＨを
処理後に約７の値に戻すことができる。

【００３７】通常は、１種類のアジュバント（例えば上
述したようなもの）、及び、所望ならば、さらに、Ｔｗ
ｅｅｎ（登録商標）及びＳｐａｎ（登録商標）のような
１種類以上の乳化剤を不活性化した材料に添加する。

【００３８】本発明のワクチンを、ウイルス材料の有効
用量、すなわち、ＣＡＡに対するニワトリ内の免疫反応
を誘導するウイルス材料の量で投与する。

【００３９】本発明のワクチンを、任意の年令におい
て、噴霧、点眼、点鼻、経口的（例えば、飲料水）、あ
るいは、筋肉内もしくは非経口的な注射により投与する
ことができる。

【００４０】生であれ不活性化物であれ、本発明のワク
チンを、この病原体での感染に冒されているニワトリか
ら入手できるもしくは取得できる任意のＣＡＡ株から製
造することができる。多数のＣＡＡ単離物が従来の技術
において既に記載されており、それらは例えば、Ｃｕｘ
‐１株（Ｂｕｌｏｗｖｏｎ、Ｖ．ら、Ｊ．Ｖｅｔｅ
ｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ３０巻、７４２‐７
５０ページ、１９８３年）、Ｇｉｆｕ‐１株（Ｙｕａｓ
ａ、Ｎ．ら、１９７９年、上掲）、ＴＫ‐５８０３株
（Ｇｏｒｙｏ、Ｍ．ら、１９８７年、上掲）及びＣＡＡ
８２‐２株（Ｏｔａｋｉら、１９８８年、上掲）であ
る。

【００４１】生であれ不活性化物であれ、本発明のワク
チンは、受託番号Ｉ‐１１４１としてＣＮＣＭに寄託し
てあるインターベットＣＡＡ株２６Ｐ４のウイルスから
誘導される。

【００４２】本発明のワクチン、好ましくは不活性化し
たＣＡＡを含むワクチンは、ＣＡＡ成分と１種類もしく
はそれ以上の無関係な鳥類ウイルスとの組合せ物を含む
ことができ、その鳥類ウイルスは、ニューキャッスル病
ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢ
Ｖ）、伝染性粘液嚢疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）、マレッ
ク病ウイルス（ＭＤＶ）、七面鳥のヘルペルウイルス
（ＨＶＴ）、伝染性喉頭気管炎、もしくは他の鳥類のヘ
ルペスウイルス、レオウイルス、エッグドロップ（Ｅｇ
ｇＤｒｏｐ）症候群ウイルス、鳥類の脳脊髄膜炎ウイ
ルス、細網内膜症ウイルス、白血症（Ｌｅｕｃｏｓｉ
ｓ）ウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、七面鳥の鼻気管
支炎ウイルス（ＴＲＴＶ）、もしくはアデノウイルスで
ある。

【００４３】本発明の他の重要な態様は、ＣＡＡウイル
ス生成物のための新しい生産系である。得られたウイル
ス生成物を、家禽類におけるＣＡＡ感染の撲滅のための
ワクチン組成物を処方するために使用することができ
る。本発明の完成以前は、インビトロの増殖から取得で
きる最高力価は約１０^6.0〜１０^7.0ＴＣＤＩ₅₀／ｍｌ
の範囲であった。手頃な値段で、本生産系によるＣＡＡ
抗原を充分なレベル取得することが不可能であったこと
を、従来の技術においてはまだ克服できなかった。更
に、ＣＡＡウイルスを高力価にまで増殖させることが現
在不可能であることが、高濃度の抗原を必要とする不活
性化ＣＡＡワクチンの製造を妨げてきた。

【００４４】本発明のＣＡＡウイルス生成物の製造方法
は、ニワトリ胚において病変を誘発することができるＣ
ＡＡウイルス、特に孵化卵内で弱毒化されたＣＡＡウイ
ルスを感受性の基体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）接種し、Ｃ
ＡＡを増殖させ、更に、ＣＡＡを含有する物質を取り出
す段階を含む。

【００４５】これらのＣＡＡウイルスが増殖する基体は
ＳＰＦ孵化卵であることが好ましい。孵化卵に、例え
ば、卵当たり少なくとも１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀を含むＣＡ
Ａ含有懸濁液もしくはホモジネート０．２ｍｌを接種す
ることができる。卵に約１０^6.0ＴＣＩＤ₅₀で接種し、
更にその後、１００°Ｆで１３日間インキュベートする
ことが好ましい。１３日後、ＣＡＡウイルス生成物を、
胚および／または膜および／または尿膜液を採取するこ
とにより取り出すことができ、更にこの物質を適切にホ
モジナイズする。このホモジネートを、その後１０分
間、２５００ｇで遠心することができ、その後上清をフ
ィルター（１００μｍ）を通して濾過する。

【００４６】あるいは、上述のＣＡＡウイルスを、例え
ばＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞のような、感受性の細胞培養
上へ接種することができ、その後、その細胞を培養し、
更に、増殖したウイルスを回収する。

【００４７】ＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞内においてアッセ
イする場合、少なくとも約１０^8.0ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌ
の、通常は少なくとも約１０^8.4ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌの手
取可能なウイルス力価を、接種後１０から１８日後、好
ましくは接種後１３日後に取得することができる。取り
出した液体を、最終生成物をそのまま充填および／また
は塊状に凍結するかあるいは凍結乾燥する前に、前述し
たウイルス安定剤と配合することができる。

【００４８】あるいは、取り出した液体を不活性化する
ことができる。ＣＡＡ液を、二成分エチレンイミン、ア
セチルエチレンイミンのような不活性化用試薬の数々の
もので不活性化することができるが、その試薬はこれら
に限定されることはなく、０．１から０．５％の濃度の
β‐プロピオラクトンが好んで用いられる。この不活性
化用試薬を、ホモジネートもしくはその濾液中に含まれ
るウイルスに添加することができる。

【００４９】水酸化ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウ
ム溶液で調整しながらｐＨを酸性側に逆シフトさせて、
β‐プロピオラクトンをウイルス液に添加する。配合さ
れた不活性化用試薬‐ウイルス液を、４℃から３７℃の
温度でインキュベートする。１から７２時間のインキュ
ベーション時間を用いることができる。

【００５０】更に、本発明は、孵化卵内で弱毒化したＣ
ＡＡ株のウイルスから製造したワクチンを投与すること
を含む、家禽類においてＣＡＡ感染を制御するための方
法を含む。この方法は生もしくは不活性化したワクチン
の投与を含む。

【００５１】

【実施例】実施例１孵化卵内でのＣＡＡの弱毒化親株であるインターベット株２６Ｐ４を、貧血を患って
いる野生のニワトリの肝臓から単離した（ｅｘｐ．Ｖ
ＩＭ‐ＣＡ‐８９‐４‐１５３）。単離後、その株を、
卵内に接種する前にＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞内で５回継
代した。卵の卵黄嚢内に、０．２ｍｌのＣＡＡ株２６Ｐ
４もしくはＧｉｆｕ（Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、Ａｖｉａｎ
Ｄｉｓｅａｓｅｓ２３巻、３６６‐３８５ページ、
１９７９年）を接種した。１３日間の１００°Ｆでのイ
ンキュベーションの後（湿度：５５％）、胚を取り出
し、更に、ホモジナイズした。このホモジネートを２５
００ｇで１０分間遠心した。上清を集め、更に、１００
μｍのフィルターを通して濾した。このホモジネートを
トリプトース２．５％で２０倍に希釈し、更に、卵当た
り０．２ｍｌを接種した。同様に処理することにより、
１９回より多い回数の継代を、株２６Ｐ４に施した。こ
の株の１９回目の卵継代の試料（ＣＡＡの種親（ｍａｓ
ｔｅｒｓｅｅｄ）１８‐０９‐１９９０；１ｍｌ／ｆ
ｌ）を、受託番号Ｉ‐１１４１として、パスツール研究
所（パリ、フランス）のＣＮＣＭに寄託した。Ｇｉｆｕ
株を、孵化卵内で１４回継代することにより弱毒化し
た。

【００５２】実施例２２種類の高卵継代ＣＡＡウイルスと低卵継代ＣＡＡウイ
ルスの孵化ニワトリ卵内における増殖特性の比較３０から６０個のＳＰＦ卵の卵黄嚢内に、様々な卵継代
レベルのウイルスを接種した。１００°Ｆでの７日間の
インキュベーションの後（湿度５５％）、卵に燭光をあ
て、死んだ孵化卵もしくは未受精卵は廃棄した。接種後
（ｐ．ｉ．）７日目から、卵を毎日燭光をあて、胚死亡
率を記録した。ＣＡＡに起因する胚死の記録は、接種後
１０日後、つまり１１日目に開始した。接種後１３日目
に胚を取り出し、ホモジナイズし、更に、２５００ｇで
１０分間遠心した。上清を集め、ＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細
胞内でウイルス感染を測定した。

【００５３】表１及び２は、胚病変および／または胚死
を誘導することができる高卵継代ＣＡＡウイルスが、低
卵継代ウイルスと比較して高い力価にまでインビトロで
増殖することができることを示す。

【００５４】

【表１】

【００５５】

【表２】

【００５６】胚を接種後１３日目に取り出した。３回目
の卵継代の２６Ｐ４株を接種した胚は全く胚病変を示さ
なかった。１７回目の卵継代株を接種した胚は青白く、
数個の胚（特に死んだ胚）は頭部の出血を示した。

【００５７】実施例３ＣＡＡ生ワクチンでの実験的ワクチン接種ＣＡＡウイルスの弱毒化及び、孵化卵を通してのウイル
スの継代による免疫原性の維持を測定するために実験を
行った。

【００５８】‐ＣＡＡ生ワクチンの病原性実験１においては、以下に示すインターベット株の継代
レベルを使用した：＊１回目の卵継代レベル（低卵継代レベル）＊１８回目の卵継代レベル（高卵継代レベル）＊未感染のＳＰＦ孵化卵からの胚ホモジネート（１３
日間インキュベーシンしたもの）。

【００５９】実験２においては、以下に示すインターベ
ット株の継代レベルを使用した：＊４回目の卵継代レベル（低卵継代レベル）＊１９回目の卵継代レベル（高卵継代レベル）１９回目の継代レベルのＣＡＡウイルスを「種親」とし
て貯蔵した。

【００６０】＊未感染のＳＰＦ孵化卵からの胚ホモジ
ネート（１３日間インキュベーシンしたもの）。

【００６１】０．２ｍｌの希釈したＣＡＡ株が約１０
^6.0ＴＣＩＤ₅₀を含むようにウイルスを希釈した。１日
齢のＳＰＦニワトリに、筋肉内経路により、０．２ｍｌ
のワクチンを接種した。

【００６２】実験３においては、以下に示すＧｉｆｕ株
の継代レベルを使用した：＊１回目の卵継代レベル＊１４回目の卵継代レベル１０７羽の１日齢のニワトリを３５〜４６羽の３つの群
に分けた（上述を参照せよ）。３番目の群はワクチン接
種しなかった（対照群）。ワクチン接種後１０及び１４
日目に、群当たり１０羽の鳥を、ヘマトクリット値測定
及び検死のため隔離室（ｉｓｏｌａｔｏｒ）から取りだ
した。ワクチン接種後３週間後に鳥を脱血し、更に、間
接免疫蛍光法テスト（ＩＩＦＴ）によりＣＡＡ抗体につ
いて血清を調べた。ワクチン接種は、実験１及び２につ
いて記載したように行った。

【００６３】実験１及び２においては、１５０羽の１日
齢のＳＰＦニワトリを各５０羽の３つの群に分け、更
に、各群を陰圧隔離室内に入れた。群当たり４０羽の鳥
に、上述のウイルスの内の１種類をワクチン接種し、更
に、群当たり１０羽の鳥はワクチン接種せず、接触対照
として利用した。ワクチン接種後１０、１４及び２１日
目に、群当たり４もしくは８羽の鳥を、ヘマトクリット
値測定及び検死のため隔離室から取り出した。ワクチン
接種後５週間目に鳥を脱血し、更に、ＶＮテストにより
ＣＡＡ抗体について調べた。

【００６４】ウイルス滴定９６穴マイクロプレート（組織培養グレード）を用い
て、ＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞内でウイルスを滴定した。
ウイルスの連続した１０倍希釈液を、１０％のウシ胎児
血清及び抗生物質を補充したＲＰＭＩ１６４０培地内で
調整した。９６穴マイクロプレートの１０穴を、各ウイ
ルス希釈液の穴当たり１００μｌで満たした。その後、
１００μｌのＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞（終濃度は１ｍｌ
当たり６×１０⁵細胞である）を添加した。その細胞を
２、３日毎に二次培養し、更に、１０回の二次培養後に
終点を読み取った。感染力価をＲｅｅｄ及びＭｕｅｎｃ
ｈ（Ｒｅｅｄ、Ｌ．Ｊ．及びＭｕｅｎｃｈ、Ｈ．、Ａ
ｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．２７巻、４９３‐４９７ペー
ジ、１９３８年）に従い計算した。

【００６５】血清学的テストＣＡＡに対する抗体を、９６穴のマイクロプレートを使
用し、ＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞及び従来の定常ウイルス
を用いてＶＮテスト、改良した血清法により測定した。
（Ｋｕｎｉｔｏｓｈｉ、Ｉ．、及びＹｕａｓａ、Ｎ．、
Ｊｐｎ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．５２巻、８７３‐
８７５ページ、１９９０年）。ＩＩＦＴは、標準的な方
法に従って行った（Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、Ａｖｉａｎ
Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ１４巻、５２１‐５３０ページ、
１９８５年）。

【００６６】ヘマトクリット値血液は、羽の血管からヘパリン処理マイクロヘマトクリ
ット毛細管内へ採取した。ヘマトクリット値（％）は、
１２，０００ｒｐｍで５分間の遠心の後読み取った。ニ
ワトリは、２７．０％を下回るヘマトクリット値を示す
場合に貧血であると見なされる（Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、
１９７９年、上掲）。

【００６７】実験１〜３からの、ＳＰＦニワトリ内に誘
導された主な病理学的病変を、表３〜５にそれぞれ要約
した。

【００６８】

【表３】

【００６９】

【表４】

【００７０】

【表５】

【００７１】影響を受けた鳥の総数ばかりでなく、平均
Ｈｔ値の差により証明される病理学的変化の重症度にお
いても、ＣＡＡ単離物の低卵継代ウイルスと高継代ウイ
ルスとの間の病理学的変化に著しい差異が存在する。ま
た、高卵継代ウイルスにより誘導される骨髄及び胸腺の
病変全般は、低卵継代ウイルスにより誘導される病変に
比較して重症度はより低かった。

【００７２】‐ＣＡＡ生ワクチンの免疫原性表５は、Ｇｉｆｕ株の免疫原性はＣＡＡウイルスの弱毒
化の結果として悪影響を受けなかったことを証明してい
る。表６は、実験１及び２の血清学の結果を示してい
る。高継代ウイルスの病原性の低下にも拘わらず、この
ウイルスの免疫原性の低下は何ら認められなかった。

【００７３】

【表６】

【００７４】実施例４配合生ワクチンでのワクチン接種レオウイルスワクチン：市販の（インターベットイン
ターナショナルＢ．Ｖ．、オランダ）レオ生ワクチン
Ｎｏｂｉｌｉｓ（登録商標）（バッチ０１６９０
１）。このワクチンを製造元の推奨により希釈剤で希釈
した。

【００７５】ＣＡＡワクチン：インターベット株の１９
回目の卵継代レベルのＣＡＡ生ワクチンを、１羽の鳥用
量（０．２ｍｌ）が１０^2.6ＴＣＩＤ₅₀を含むように希
釈剤で希釈した。

【００７６】４週齢のＳＰＦニワトリを、１羽の鳥用量
のレオ生ワクチン、１羽用量のＣＡＡ生ワクチン、ある
いは、１羽用量の配合したレオ及びＣＡＡ生ワクチン、
のいずれかで筋肉内注射でワクチン接種した。接種後４
及び６週目に血液試料を採取し、更に、その血清を、Ｃ
ＡＡとレオウイルスに対する抗体の存在について、ウイ
ルス中和テストでテストした（表７）。

【００７７】

【表７】

【００７８】上の表から、配合したワクチンは生の形態
で両方の種類のウイルスを含むけれども、それらの免疫
原性の負の相互干渉（妨害）は観察されないことが明ら
かである。

【００７９】実施例５不活性化ＣＡＡワクチンでの実験的ワクチン接種４週齢のＳＰＦニワトリに、油中水型の乳化剤（ｗ／
ｏ）中で不活性化したＣＡＡワクチンを筋肉内注射によ
りワクチン接種した。そのワクチンは、インターベット
株の１９回目の卵継代レベルの胚ホモジネートから調製
した。そのウイルスをβ‐プロピオラクトンで、３７℃
で３時間不活性化した。５０％の不活性化したＣＡＡ‐
卵材料と５０％の鉱物油‐乳化液を含むｗ／ｏ乳化液を
調製した。

【００８０】感染力価に基づく、ニワトリ当たり１０
^7.5ＴＣＩＤ₅₀ウイルス抗原を含むｗ／ｏ乳化液０．５
ｍｌを、筋肉内に注射した。その鳥は、ワクチン接種後
８週間目に、筋肉内注射により同一の不活性化ワクチン
で２回目のワクチン接種を受けた。第１及び第２ワクチ
ン接種後の様々な時間に、血液試料を採取し、更に、そ
の血清を、ＶＮテストでＣＡＡ‐抗体の存在についてテ
ストした（表８）。１０^7.5ＴＣＩＤ₅₀ウイルス抗原を
含む不活性化ワクチンは接種した動物内において免疫反
応を誘導することができることが証明された。

【００８１】他のワクチン接種実験においては、ワクチ
ンの用量が１ｍｌの油中水型乳化液中あたり１０^8.0及
び１０^9.0ＴＣＩＤ₅₀であることを除き、上述してある
ものと同一の方法に従った（表９）。

【００８２】

【表８】

【００８３】

【表９】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ニワトリ胚において病変を誘発すること
ができるニワトリ貧血因子（ＣＡＡ）ウイルス。
【請求項２】ウイルスがパスツール研究所のＣＮＣＭ
に寄託してあるＩ‐１１４１株のものであることを特徴
とする、請求項１に記載のＣＡＡウイルス。
【請求項３】請求項１または２に記載のＣＡＡウイル
スの微生物学的に純粋な組成物。
【請求項４】組成物が１ｍｌ当たり少なくとも１０
^8.0ＴＣＩＤ₅₀を含むことを特徴とする、請求項３に記
載の微生物学的に純粋な組成物。
【請求項５】弱毒化した生きているＣＡＡウイルスを
含む、ＣＡＡに対する家禽類の保護のためのワクチンで
あって、それが請求項１または２に記載のＣＡＡウイル
スを含むことを特徴とするワクチン。
【請求項６】ＣＡＡウイルスが孵化卵内において弱毒
化されることを特徴とする、請求項５に記載のワクチ
ン。
【請求項７】ＣＡＡに対する家禽類の保護のためのワ
クチンであって、それが不活性化したＣＡＡウイルスの
有効量を含み、そのワクチンはワクチン接種後にニワト
リ内においてＣＡＡウイルス中和抗体の産生を誘導する
ことができることを特徴とするワクチン。
【請求項８】ＣＡＡウイルスの前不活性化量が用量当
たり少なくとも約１０^7.5ＴＣＩＤ₅₀であることを特徴
とする、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】前不活性化量が用量当たり少なくとも約
１０^8.0ＴＣＩＤ₅₀であり、好ましくは少なくとも約１
０^9.0ＴＣＩＤ₅₀であるという特徴を有する、請求項８
に記載のワクチン。
【請求項１０】ワクチンが請求項１または２に記載の
ＣＡＡウイルスを含むことを特徴とする、請求項５〜９
のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１１】ワクチンが更にアジュバントを含むこ
とを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか一項に記載
のワクチン。
【請求項１２】ワクチンが更に１種類またはそれ以上
の無関係の鳥類の病原体の抗原を含むことを特徴とす
る、請求項５または７に記載のワクチン。
【請求項１３】ＣＡＡウイルス生成物の製造方法であ
って、ａ）感受性基体に請求項１または２に記載のＣＡＡウイ
ルスを接種し、ｂ）ＣＡＡウイルスを増殖させ、および、ｃ）ＣＡＡウイルスを含有する物質を取り出す段階を含む方法。
【請求項１４】基体が孵化卵であることを特徴とす
る、請求項１３に記載の方法。