HU217214B - Eljárás csirkeanémia-ágens vakcina előállítására - Google Patents

Eljárás csirkeanémia-ágens vakcina előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU217214B
HU217214B HU9202976A HU9202976A HU217214B HU 217214 B HU217214 B HU 217214B HU 9202976 A HU9202976 A HU 9202976A HU 9202976 A HU9202976 A HU 9202976A HU 217214 B HU217214 B HU 217214B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
caa
virus
vaccine
viruses
egg
Prior art date
Application number
HU9202976A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9202976D0 (en
HUT65367A (en
Inventor
Carla Christina Schrier
Original Assignee
Akzo N.V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Akzo N.V. filed Critical Akzo N.V.
Publication of HU9202976D0 publication Critical patent/HU9202976D0/hu
Publication of HUT65367A publication Critical patent/HUT65367A/hu
Publication of HU217214B publication Critical patent/HU217214B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12211—Orthoreovirus, e.g. mammalian orthoreovirus
    • C12N2720/12234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/816—Viral vaccine for avian species, e.g. poultry or other birds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás élő, inaktivált csirkeanémia-ágens vakcinaelőállítására, amely a vakcinázőtt csirkében imműnválaszt képeskiváltani. A vakcinát képező CAA-vírűst tőjásembriókban való sőrőzatőspasszálásőkkal attenűálják. A találmány magas titerben szapőrítható,attenűált CAA-vírűsők előállítására és a CAA- vírűs biőlógiailagtiszta kőmpőzíciójának előállítására is vőnatkőzik. ŕ

Description

A találmány élő vagy inaktivált, baromfíkat csirkeanémia-ágens (CAA) ellen védő vakcina előállítására, CAA-vírus-termék előállítására, valamint mikrobiológiailag tiszta összetételű CAA-vírusok előállítására vonatkozik.
A csirkeanémia-ágens (CAA) szárnyasok fertőző anémiájának kiváltója, amelyet először Yuasa és munkatársai írtak le 1979-ben [Avian Diseases 23, 366-385 (1979)]. Fiatal, fogékony csirkékben a CAA kifejezett vérszegénységet okoz, csontvelőapláziával/hipopláziával és timuszsorvadással. A csirkékben életkorral járó ellenállás fejlődik ki a CAA hatására a kísérletesen kiváltott betegséggel szemben. Ez kéthetes korban gyakorlatilag kialakul, de idősebb csirkék is fogékonyak lehetnek a fertőzésre [Yuasa N. és munkatársai (1979), lásd fent; Yuasa N. és munkatársai, Avian Diseases 24, 202-209 (1980)]. Ha azonban a csirkéket egyszerre fertőzzük CAA-val és kezeljük egy immunszupresszív anyaggal (IBDV, MDV stb.), a betegséggel szembeni, korral járó ellenállás késleltetett lesz [Yuasa N. és munkatársai (1979) és (1980), lásd fent, Bülow von V. és munkatársai, J. Veterinary Medicine 33, 93-116 (1986)]. A CAA-val beoltott csirkék morbiditása és mortalitása szigorúan arányos az oltáshoz használt CAA dózisával, tehát minél nagyobb a dózis, annál súlyosabb a betegség [Yuasa N. és munkatársai (1979) lásd fent].
A CAA nem szaporodik a különböző csirke és csirkeembrió-szövet eredetű standard, egyrétegű sejtkultúrákban, mint például a csirkeembrió-fíbroblasztok (CEF), csirkeembrióagyvelő-sejtek, csirkeembriómájsejtek, továbbá vese, timusz, Fabriciusz-tömlő, csontvelő vagy fehérvérsejt eredetű csirkesejtek tenyészetén [Yuasa N. és munkatársai (1979), lásd fent; Yuasa N., Natl. Inst. Anim. Health Q., 23, 13-20 (1989)], nem szaporodik különböző általánosan használt emlőssejtvonalakon sem, mint például VERŐ, CRFK, MDCK és A-72 sejteken [Rosenberger J. K. és Cloud S. S., Avian Diseases 33, 707-713 (1989)].
A CAA szaporodik viszont néhány, a Marek-féle betegségből és limfoid leukózis limfómából származó, limfoblasztszerű sejtvonalon, különösen az MDCC-MSB1 sejttenyészeten [Yuasa N. (1983), lásd fent]. Hátrányos azonban, hogy a CAA aránylag alacsony titereket eredményez MDCC-MSB1 sejtekben. Csupán 105-°-1060 TCID5()/0,l ml titereket kaphatunk az MDCC-MSB1 sejtekben. Azt találtuk továbbá, hogy a CAA csak körülbelül a beoltott dózis tízszeresére szaporodott az MDCC-MSB1 sejtekben [Yuasa N. (1983), lásd fent; Bülow von V. és munkatársai, Zentralblatt Vet. Med. 32, 679-693 (1985)].
Csirkéken kívül a CAA csirkeembriókban is szaporítható [Yuasa N. és Yosida I., Natl. Inst. Anim. Health Q. 23, 99-100 (1983); Bülow von V. és Witt M., J. Vet. Med. 33, 664-669 (1986)]. Nem láthatók azonban letális vagy patológiás hatások ezeknél az embrióknál, jelezve, hogy a CAA nem szaporodik a tojásembriókban olyan mértékben, ami elégséges lenne az embriók károsításához. A teljes embriókból kapható legmagasabb CAA-titerek 105·0 és 106·5 TCID50/ml között változtak, amint azt MDCC-MSB1 sejteken vizsgálták, ami megegyezik a kísérletesen fertőzött csirkék májkivonatából kapott titerekkel.
Bülow von V. és Witt M. (lásd fent) tanulmányozták a virulens CAA csirkeembriókban való tenyésztését élő vakcinák termelése céljából, amely a vírusok attenuálása nélkül beadható a szülőállománynak. Megemlítik azonban, hogy a vírusok attenuálódását meg kell akadályozni, mert ez az immunogenitás elvesztéséhez vezethet [Bülow von V. és Fuchs B., J. Vet. Med. 33, 568-573 (1986)].
Bülow és Fuchs [J. Vet. Med. 33, 568-573 (1986)] arról számolnak be, hogy a Cux-1 CAA-törzs patogenitása csökkent MDCC-MSB1 sejteken való 12-szeres passzálás után, bár nem áll rendelkezésre adat ezeknek a kevésbé patogén törzseknek az immunogenitására vonatkozólag. Gyakorlatilag Bülow és Fuchs a patogenitás csökkenésével párhuzamosan az immunizálóképesség csökkenését váqák.
Sem Yuasa (1983, lásd fent), sem Goryo és munkatársai [Avian Pathology 16, 149-163 (1987)], sem Otaki és munkatársai [Avian Pathology 17, 333-347 (1988)] nem találtak bizonyítékot MDCC-MSB1 sejteken való attenuálódásra a Gifu-l-törzs 19, a ΤΚ-5803-törzs 40, illetve a CAA82-2-törzs 40 passzálása után.
Vielitz E. és munkatársai [J. Vet. Med. 34, 533-557 (1987)] beszámolnak egy Cux-1 törzsből kapott élő CAA-vakcina értékeléséről. Ebben azonban nem használtak fel attenuált CAA-törzset. Ezt a virulens CAA-t tartalmazó vakcinát 9-15 hetes csirkéknek adták be, és így nem bizonyult kórokozónak a beoltott madarakban. A CAA-val kísérletesen kiváltott betegséggel szemben a korral kifejlődő rezisztencia szempontjából, amely gyakorlatilag 2 hetes korra kialakul, az élő vakcina vírusattenuáltságának szintje a beoltott madarak számára kevésbé fontos ebben az esetben. Azonban annak érdekében, hogy megelőzzük a patológiás tünetek kialakulását fiatal csirkékben az élő CAAvakcinával való kezelés után, az élő CAA-vakcinát jelentősen attenuálni kell.
Az élő CAA-vakcina helyett alkalmazható lenne egy inaktivált, adjuvált vakcina. Egy ilyen inaktivált vakcina a meglévő immunitás emlékeztetésére is használható lenne csirkékben. Azonban mindeddig nem írtak le inaktivált CAA-vakcinát, mivel ezt a megközelítést bonyolítja, hogy a CAA-vírust jelenleg nem tudjuk magas titerrel in vitro szaporítani [McNulty, M. S., Avian Pathology 20, 187-203 (1991)].
Ennek megfelelően a találmány tárgya egyrészt magas titerben in vitro szaporítható CAA-vírusok.
A találmány tárgya továbbá egy CAA-vírustörzs eredetű CAA-vakcina, amely jelentősen csökkent patogenitást mutat fiatal csirkékben a mezei izolátumokhoz képest, de azok immunogenitásával rendelkezik.
Emellett a találmány tárgya egy inaktivált CAAvakcina, amely elégséges mennyiségű CAA-antigént tartalmaz ahhoz, hogy csirkékben a vakcinázás után immunválaszt váltson ki.
Ezenkívül a találmány tárgya egy, a CAA-vírustörzsek attenuálására szolgáló általános eljárás.
A találmány új CAA-vírusokra vonatkozik, vagyis olyan CAA-vírusokra, amelyek csirkeembriókban károsodást képesek előidézni. A CAA okozta károsodás lehet elhullás, sápadt embriók és bevérzések, különösen a fejen. Ezek a CAA-vírusfajták több előnyös tulajdonságot mutatnak. A találmány szerinti CAA-vírusok egyik legelőnyösebb tulajdonsága, hogy in vitro magas titerben szaporíthatok, amint azt az alábbiakban részletezzük.
Az említett CAA-vírusok további előnye, hogy bár a mezei CAA-vírusokkal összehasonlítva sokkal virulensebbek csirkeembriókra, csökkent patogenitást mutatnak naposcsirkékre nézve, azonban rendelkeznek azok immunogén sajátságaival.
A találmány előnyösen a Pasteur Intézet CNCMben elhelyezett 1-1141 jelű CAA-vírustörzsre vonatkozik (19. passzálási fok). Ezek a vírusok embrionált tojásokban legalább ΙΟ8·4 ΤΟϋ50/ιη1 ti térig szaporíthatok, ráadásul kevésbé patogének naposcsirkékre nézve, mint a szülő mezei törzs, emellett éppolyan immunogének, mint a szülőtörzs.
A CAA-vírusok új típusát megkaphatjuk bármely rendelkezésre álló CAA-vírus embrionált tojásokban való passzálásával az alábbiakban és a példákban leírtak szerint.
A baromfiakat CAA ellen védő új vakcina olyan CAA-vírusokat tartalmaz, amelyek csirkeembriókban képesek károsodást előidézni. Ezeket a vírusokat előnyösen embrionált tojásokban való passzálással nyeljük.
Miután a rendelkezésre álló CAA-törzset csirkeszövetből, például a májból izoláltuk, a szövethomogenizátum felhasználható egy többlépéses attenuálási folyamatban. A CAA-vírust kívánt esetben először a CAA számára alkalmas szövet- vagy sejtkultúrában passzálhatjuk és szaporíthatjuk. Ilyenek például a MDCC-MSB1 sejtek, mielőtt tojásokba oltjuk őket. Ezt a vírustörzstenyészetet használhatjuk fel azután embrionált tojások fertőzésére, és ezt követően a vírusok szaporítására és passzálására embrionált tojásokban, a technika állása szerint erre a célra ismeretes módszerek felhasználásával.
Közelebbről, a tojásokat egyenként legalább 104·5 TCID50 CAA-val fertőzzük a sziktömlőn keresztül, standard eljárások szerint. A beoltás után körülbelül 13 nappal a fertőzött embriókat összegyűjtjük, homogenizáljuk, és például 2,5% (1:20 térfogatarányú) triptózzal hígítjuk. Ezután friss, embrionált tojásokat oltunk be, tojásonként 0,2 ml homogenizátummal minden egyes tojáspasszálási lépésben. Az utolsó passzálást követően a vírust felszaporítjuk, majd összegyűjtjük, és CAA-fertőzés ellen immunizálóaktivitással rendelkező vakcinává alakítjuk. Az utolsó passzálásból nyert vírus felszaporítható embrionált tojásban vagy CAA-ra fogékony sejt- vagy szövettenyészetben, mint például MDCC-MSB1 sejtekben. Embrionált tojások esetében az embriókat és/vagy a membránokat, és/vagy az allantoisz folyadékot gyűjtjük össze.
A kívánt növekedési és attenuáltsági sajátságokkal rendelkező CAA-vírusok nyeréséhez szükséges tojáspasszálások száma többek között függ az adott
CAA-törzstől és az attenuáltsági foktól és/vagy a kívánt in vitro titertől.
A CAA-vírusok összes tojáspasszálásainak tipikus száma - amely a találmány szerinti élő vakcina előállításához megfelelő, jelentősen csökkent patogenitással rendelkező vírusokat eredményezi - 18 vagy több, kedvező esetben 34 vagy több.
Közelebbről a találmány szerinti vakcina a 26P4 jelű Intervet CAA-törzs vírusaiból származik. Ezt a törzset eredetileg anémiában szenvedő (mezei) csirkék májából izolálták. Az izolálást követően ezt a törzset ötször MDCC-MSB1 sejtekben, ezután 19-szer embrionált tojásokban passzáltuk. Ennek a törzsnek egy mintáját Franciaországban, Párizsban, a Pasteur Intézet „Collection Nationale de Cultures de Microorganismes” (CNCM) gyűjteményében helyeztük el, 1-1141 nyilvántartási szám alatt. Természetesen nemcsak a 19. passzálásból származó CAA-vírusok használhatók a találmány szerinti vakcina előállítására, ennek a törzsnek a későbbi passzálási fokaiból származó vírusok ugyancsak megfelelnek.
Ez az attenuált törzs jelentősen csökkent patogenitást mutat a törzs nem tojáshoz adaptált vírusaihoz képest, míg a törzs immunogén sajátságai változatlanok, amint azt vírusneutralizációs (VN) teszttel megállapítottuk.
A fent leírt eljárás szerint nyerhető új, élő CAA-vírusok több megkülönböztető tulajdonsággal rendelkeznek, közelebbről: a CAA-vírusok CAA-ra specifikus károsodásokat hoznak létre, beleértve a máig megismert összes CAA-törzs esetében kimutatott, az embriókban okozott letális és/vagy patológiás hatásokat [Yuasa N. és munkatársai (1979), lásd fent; Yuasa N. és Yoshida I. (1983), lásd fent; Bülow von V. és Witt M. (1986), lásd fent].
Más előnyös sajátságaik:
- a CAA-vírusok attenuáltak, vagyis egynapos SPF-csirkéknek beadva szignifikánsan kevesebb patológiás tünetet hoznak létre, mint a mezei CAA-izolátumok;
- a CAA-vírusok embrionált tojásokban magas titerig való szaporodáshoz adaptálódtak.
A találmány szerinti élő, attenuált CAA-t tartalmazó vakcina előállítható és forgalmazható szuszpenzió formájában vagy ismert módon liofilizált termékként.
Elő vakcinák esetében az egy csirkére eső dózis 101·® és ΙΟ7·0 TCID50 attenuált vírus között alakulhat.
Előnyös stabilizátort adni a vakcinához, főként, ha liofilezéssel száraz készítményt állítunk elő. Alkalmas stabilizátorok például az SPGA [Bovamik és munkatársai, J. Bacteriology 59, 509 (1950)], szénhidrátok (mint például a szorbit, mannit, keményítő, szacharóz, dextrán vagy glükóz), proteinek (mint például az albumin vagy kazein) vagy ezek degradációs termékei, valamint a pufferek (mint például az alkáliföldfém-foszfátok). Kívánt esetben egy vagy több adjuvánsaktivitással rendelkező összetevő is hozzáadható. Erre a célra alkalmas összetevők, például az E-vitamin-acetát „olaj a vízben” emulzió, alumínium-hidroxid, -foszfát vagy -oxid, ásványi olaj (mint például a Bayol F®, Marcol 52®) és szaponinok.
A találmány tárgya továbbá eljárás inaktivált CAAvakcina alkalmazására csirkéknek az ezen patogén által okozott betegség elleni megvédésére. Mindeddig nem volt lehetséges olyan inaktivált CAA-vakcina előállítása, amely immunválaszt váltott ki a vakcinázott csirkékben.
A találmány értelmében először állítunk elő inaktivált CAA-vakcinát, amely a CAA-vírus hatékony mennyiségét tartalmazza, és amely alkalmas arra, hogy vakcinázás után a csirkékben CAA-vírus-neutralizáló antitestek képződését váltsa ki.
Közelebbről, az inaktivált vakcinát a találmány szerinti új CAA-vírusból készítjük.
A találmány szerinti inaktivált CAA-vakcina előnyösen egy vagy több, inaktivált CAA-izolátumot tartalmaz, amelyeket a fent leírtak szerint embrionált tojásokban való sorozatos passzázsokkal attenuáltunk. Kívánt esetben a tojáshoz adaptált CAA-t az inaktiválási folyamat előtt fogékony sejt- vagy szövetkultúrában, például MDCC-MSB1 sejtekben szaporíthatjuk fel.
A találmány szerinti inaktivált vakcina előnyösen annyi CAA-t tartalmaz, amelynek titere az inaktiválás előtt legalább 107>5 TCID50/dózis, előnyösebben legalább ΙΟ8·0 TCID50/dózis, még előnyösebben 1090 TCID50/dózis MDCC-MSB1 sejteken vizsgálva.
Az inaktivált CAA felülúszó a számos rendelkezésre álló technika bármelyikével koncentrálható, így például Amicon koncentrálóeszközzel, precipitációs technikákkal, például polietilénglikollal, ultracentrifugálással való koncentrálás vagy adjuvánskoncentrációs technikákkal.
A CAA-vírusok inaktiválásának célja, hogy a vírus szaporodását megakadályozzuk. Ez általában kémiai vagy fizikai eszközökkel érhető el. A kémiai inaktiválást, például a vírusok enzimmel, formaldehiddel, bétapropiolaktonnal, etilén-iminnel vagy ezek származékával való kezelésével végezhetjük. Kívánt esetben az inaktiválóvegyületet utólag neutralizálhatjuk; a formaldehiddel inaktivált anyag például tioszulfáttal neutralizálható. A fizikai inaktiválást előnyösen úgy végezhetjük, hogy a vírusokat nagy energiájú sugárzásnak, például UV-fénynek, röntgensugárzásnak vagy gammasugárzásnak tesszük ki. Kívánt esetben a kezelés után a pH-t körülbelül 7-es értékre állíthatjuk vissza.
Rendszerint egy adjuvánst (például amelyeket fent említettünk) és kívánt esetben egy vagy több emulgeálószert, például Tween®-t vagy Span®-t is adagolhatunk az inaktivált anyaghoz.
A találmány szerinti vakcinát a vírus hatásos dózisát tartalmazó mennyiségben adjuk be, tehát azt a vírusmennyiséget, amely a csirkékben CAA ellen immunválaszt vált ki.
A találmány szerinti vakcinát beadhatjuk levegőben porlasztva, szemcseppben, orrcseppben, szájon át (például ivóvízzel), vagy izomba vagy bőrbe adott injekcióval, bármely korban.
A találmány szerinti élő vagy inaktivált vakcina bármely rendelkezésre álló vagy ezzel a kórokozóval fertőzött csirkéből származó CAA-törzsből előállítható. Számos CAA-izolátumot leírtak már a szakirodalomban, például a Cux-1-törzset [Bülow von V. és munkatársai, J. Veterinary Medicine 30, 742-750 (1983)], a
Gifu-1-törzset (Yuasa N. és munkatársai, 1979, lásd fent), a TK-5803 törzset (Goryo M. és munkatársai, 1987, lásd fent) és a CAA82-2-törzset (Otaki és munkatársai, 1988, lásd fent).
A találmány szerinti élő vagy inaktivált vakcina az 1-1141 nyilvántartási szám alatt a CNCM-ben letétbe helyezett 26P4 Intervet CAA-törzsből származik.
A találmány szerinti vakcinák, előnyösen az inaktivált CAA-t tartalmazó vakcina, tartalmazhatja a CAAkomponenst, és egy vagy több, azzal nem rokon madárvírust, előnyösen baromfipestis-vírust (Newcastle-betegség-vírus/NDV), fertőzőbronchitis-vírust (IBV), Gumboro-betegség-vírust (IBDV), Marek-féle betegség vírusát (MDV), pulykák herpeszvírusát (HVT), fertőző gége-légcső gyulladás vírusát vagy más madárherpeszvírust, Reo-vírust, EDS- (Egg Drop Syndrome) vírust, madáragyvelőgyulladás-vírust, reticuloendoteliumgyulladás-vírust, leukózisvírust, baromfihimlő-vírust, pulykarhinotracheitis-vírust (TRTV) vagy adenovírust.
A találmány tárgya továbbá a CAA-vírus-termék előállítására szolgáló új termelési rendszer. Az így kapott vírustermék felhasználható baromfik CAA-fertőzésének leküzdésére alkalmas vakcinakészítmény előállítására. A találmány megalkotása előtt az in vitro elszaporítással elérhető maximális titerek körülbelül 106·0 és 107·0 TCID50/ml között változtak. Ez idáig még nem sikerült leküzdeni azt a problémát, hogy a jelenlegi előállítási rendszerekkel elégséges szintű CAA-antigént elfogadható áron nem tudtak nyerni. Továbbá az a tény, hogy a CAA-vírust nem lehetett magas titerig szaporítani, mindmáig megakadályozta egy magas antigénkoncentrációt igénylő, inaktivált CAA-vakcina előállítását.
A találmány szerinti CAA-vírus-termék előállítására szolgáló módszer a következő lépéseket tartalmazza: fogékony szubsztrátot olyan CAA-vírusokkal oltunk be, amelyek csirkeembriókban károsodást képesek előidézni, különösen olyan CAA-vírusokkal, amelyeket embrionált tojásokban attenuáltunk, majd a CAA-t felszaporítjuk, és a CAA-tartalmú anyagot összegyűjtjük.
A CAA-vírusok felszaporítását előnyösen SPF embrionált tojásokban végezzük. Az embrionált tojásokat például 0,2 ml, tojásonként legalább 104·5 TCID50 CAA-t tartalmazó szuszpenzióval vagy homogenizátummal oltjuk be. A tojásokat előnyösen körülbelül 1O6·0 TCID50-nel oltjuk be, majd 13 napig 38 °C hőmérsékleten inkubáljuk. 13 nap elteltével a CAA-vírus-terméket az embriók és/vagy a membránok, és/vagy az allantoisz folyadék összegyűjtésével és a kapott anyag megfelelő homogenizálásával kinyeijük. A homogenizátumot ezután 10 percig 2500 g-n centrifugálhatjuk, majd a felülúszót szűrőn (100 pm) leszűrhetjük.
Eljárhatunk úgy is, hogy a fent említett CAA-vírusokat fogékony sejtkultúrába, például MDCC-MSB1 sejtekbe oltjuk, ezt követően a sejteket tenyésztjük, és a felszaporodott vírusokat összegyűjtjük.
A beoltást követően 10-18 nappal, előnyösen 13 nappal az elérhető, ülepíthető vírustiter legalább 108>° TCID5c/ml, rendszerint legalább 108·4, MDCC-MSB1sejteken vizsgálva. Az összegyűjtött folyadékot, amint
HU 217 214 Β azt korábban ismertettük, a végső termék ampullázása és/vagy tömegben lefagyasztása vagy fagyasztva szárítása előtt vírusstabilizátorral keverhetjük.
Eljárhatunk úgy is, hogy az összegyűjtött folyadékot inaktiváljuk. A CAA-tartalmú folyadékok számos inaktiválóanyaggal inaktiválhatók, így például 0,1-0,5%-os koncentrációban használt dietilén-iminnel, acetil-etiléniminnel, β-propiolaktonnal. Az inaktiválóanyagot a homogenizátumba vagy ennek szűrletében található vírushoz adhatjuk.
Amennyiben β-propiolaktont adunk a vírustartalmú folyadékhoz, a pH savas irányba való eltolódását nátrium-hidroxiddal vagy nátrium-bikarbonát-oldattal állíthatjuk be. Az inaktiválóanyagot és a vírust tartalmazó folyadék keverékét 4-37 °C-on inkubáljuk. 1-72 órás inkubációs időt alkalmazhatunk.
A találmány tárgya továbbá eljárás baromfik CAAfertőzésének leküzdésére, amely abban áll, hogy a baromfiaknak embrionált tojásokban attenuált CAA-törzsből származó vírusokból előállított vakcinát adagolunk. Az eljárásban élő vagy inaktivált vakcinát adagolhatunk.
A találmány szerinti megoldást a következő példákkal szemléltetjük.
1. példa
CAA attenuálása embrionált tojásokban
Az eredeti 26P4 Intervet törzset anémiában szenvedő csirkék májából izoláltuk terepen (exp. VIM-CA89-4-153). Az izolálást követően a törzset ötször MDCC-MSB1 sejteken passzáltuk, mielőtt tojásokba oltottuk.
A tojások sziktömlőjébe 0,2 ml 26P4 vagy Gifu CAA-törzset oltottunk [Yuasa N. és munkatársai, Avian Diseases 23, 366-385 (1979)]. Miután 13 napig 38 °C-on inkubáltuk (relatív páratartalom 55%), az embriókat összegyűjtöttük és homogenizáltuk. A homogenizátumot 10 percig 2500 g-n centrifugáltuk. A felülúszót összegyűjtöttük, és egy 100 pm pórusnagyságú szűrőn átszűrtük. A homogenizátumot 1:20 arányban 2,5%-os triptózzal hígítottuk, és ebből az egyes tojásokba 0,2 ml-t oltottunk. Ily módon több mint 19-szer passzáltuk a 26P4 törzset. Ennek a törzsnek a 19. tojáspasszálásból származó mintáját helyeztük letétbe 1-1141 nyilvántartási szám alatt a Pasteur Intézet CNCM-ben (Párizs, Franciaország).
A Gifu-törzset tojásembriókban való 14-szeri paszszálással attenuáltuk.
2. példa
Két magas és alacsony tojáspasszálási fokú CAAvírus növekedési sajátságainak összehasonlítása embrionált tojásokban
30-60 SPF-tojás sziktömlőjébe különböző paszszálási fokú vírusokat oltottunk be. Miután 7 napig 38 °C-on inkubáltuk (relatív páratartalom 55%), a tojásokat lámpáztuk, és az elhullott embriókat tartalmazó, valamint a nem termékenyült tojásokat kidobtuk.
A tojásokat a beoltás utáni 7. naptól fogva naponta lámpáztuk, és az embriók elhullását feljegyeztük.
A CAA okozta embrióelhullás a beoltás után tíz nappal kezdődött, vagyis all. napon.
A beoltás utáni 13. napon az embriókat összegyűjtöttük, homogenizáltuk és 2500 g-n 10 percig centrifugáltuk. A felülúszót összegyűjtöttük, és MDCC-MSB1 sejteken titráltuk a vírus fertőzőképességére nézve.
Az alábbi 1. és 2. táblázatok azt mutatják, hogy a magas tojáspasszálási fokú CAA-vírusok, amelyek embriókárosodást és/vagy elhullást képesek kiváltani, in vitro magas titerig felszaporíthatók, összehasonlítva az alacsony tojáspasszálási fokú vírusokkal.
1. táblázat
A 26P4-törzs növekedési sajátságai embrionált tojásokban
Tojáspasszálás Végső titcr, lóg TCID50/ml CAA okozta embrióelhullás CAA okozta embrióelhullás (%)
11. nap 14. nap
3 7,6 1 0 3,3
10 7,4 n. v. n. v. n. v.
14 8,0 n. v. n. v. n. v.
17 8,6 6 2 26,6
19 8,4 n. v. n. v. n. v.
24 8,4 n. v. n. v. n. v.
33 9,3 7 6 21,7
n. v.=ncm vizsgáltuk
Az embriókat a beoltás után a 13. napon összegyűj- passzálással beoltott embriók sápadtak voltak, és nétöttük. A 26P4-törzs 3. tojáspasszálásával beoltott emb- hány embrió (különösen az elhullottak) a fejen bevérzériók nem mutattak embriókárosodást. A 17. tojás- 60 seket mutatott.
2. táblázat
A Gifu-törzs növekedési sajátságai embrionált tojásokban
Tojáspasszálás Végső titcr (TCIDJ(l/ml lóg) CAA okozta cmbrióelhullás (nap) CAA okozta embriókárosodás CAA okozta embrióelhullás és embriókárosodás (%)
11. 12. 13. 14.
2 n. v. 0 0 0 0 0 0,0
3 7,0 0 1 0 0 0 3,3
4 7,3 0 0 0 0 1 3,3
5 7,6 0 1 0 0 1 6,6
6 7,6 0 0 0 2 0 6,6
7 7,6 0 0 0 0 3 10,0
8 8,0 0 0 0 0 4 13,3
9 7,4 1 2 0 0 4 11,6
10 8,5 0 1 0 1 6 13,3
11 7,8 0 0 2 0 5 11,6
12 7,8 1 2 0 1 10 23,3
13 8,3 3 3 5 0 7 30,0
14 8,3 0 3 0 6 11 33,3
n.v.=ncm vizsgáltuk
3. példa
Kísérletes vakcinázás első CAA-vakcinával
Kísérleteket végeztünk azzal a céllal, hogy meghatározzuk a CAA-vírusok attenuáltságának a fokát és azt, hogy az immunogenitási képesség milyen mértékben maradt meg az embrionált tojásokban való passzálások során.
Elő CAA-vakcinákpatogemtása
Az 1. kísérletben az Intervet törzs következő passzálási fokait használtuk fel:
- 1. tojáspasszálási fok (alacsony tojáspasszálásí fok),
- 18. tojáspasszálási fok (magas tojáspasszálási fok),
- nem fertőzött, embrionált SPF-tojásokból származó embrióhomogenizátum (13 napos inkubálás).
A 2. kísérletben az Intervet-törzs következő paszszálási fokait használtuk fel:
- 4. tojáspasszálási fok (alacsony tojáspasszálási fok),
- 19. tojáspasszálási fok (magas tojáspasszálási fok) - a 19. tojáspasszálási fokból származó CAA-vírust tettük el mint „Master” törzset,
- nem fertőzött, SPF embrionált tojásokból származó embrióhomogenizátum (13 napos inkubálás).
A vírusokat oly módon hígítottuk, hogy a CAA-törzs hígításának 0,2 milliliteré körülbelül 106’0 TCID50-et tartalmazott. Egynapos SPF-csirkéket oltottunk 0,2 milliliter vakcinával, izomba adva.
A 3. kísérletben a Gifu-törzs következő passzálási fokait használtuk fel:
- 1. tojáspasszálás,
- 14. tojáspasszálás.
107 darab egynapos csirkét három, egyenként 3536 madarat számláló csoportra osztottunk (lásd fent). A harmadik csoportot nem vakcináztuk (kontrollcso35 port).
A vakcinázást követő 10. és 14. napokon csoportonként 10 madarat kivettünk az elkülönítőbői hematokritvizsgálat és boncolás céljára.
héttel a vakcinázás után a madarakat elvéreztettük, 40 és a szérumokat CAA-antitestek jelenlétére vizsgáltuk indirekt immunfluoreszcenciás módszerrel (IIFT).
A vakcinázást az 1. és 2. kísérletben ismertetettek szerint végeztük.
Az 1. és 2. kísérletben 150 darab egynapos SPF45 csirkét három, egyenként 50 madarat számláló csoportra osztottuk, és mindegyik csoportot negatív nyomású elkülönítőbe helyeztük.
Csoportonként 40 csirkét a fent említett vírusok egyikével vakcináztunk, csoportonként 10 csirkét nem vakci50 náztunk, az utóbbiak szolgáltak kontakt kontrollként.
A vakcinázás után a 10., 14. és 21. napokon csoportonként 4 vagy 8 madarat kivettünk az elkülönítőbői hematokritvizsgálat és boncolás céljára.
A vakcinázás után 5 héttel a madarakat elvéreztet55 tűk, és a szérumokat CAA-antitestek jelenlétére vizsgáltuk (vírusneutralizációs) VN-módszerrel.
Vírustitrálás
A vírusokat MDCC-MSB1 sejteken titráltuk, 96 rekeszű mikrolemezek felhasználásával (szövette60 nyésztő minőségű). A vírusokból 10-es léptékű hígítási sort készítettünk 10% borjúszérummal és antibiotikumokkal kiegészített RPMI 1640 táp folyadékban.
A 96 rekeszű mikrolemez 10 rekeszébe egyenként 100 μΐ-t adtunk minden egyes vírushígításból, majd hozzáadtunk 100 μΐ MDCC-MSB1 sejtet (6xl05 sejt/ml végkoncentráció).
A sejteket minden 2-3 napban passzáltuk, és a végpontot a 10. passzálás után olvastuk le. A fertőzőképességi titert Reed és Muench szerint számítottuk [Reed L. J. és Muench H„ Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938)].
Szerológiai vizsgálat
A CAA-ellenes ellenanyagokat VN-módszerrel vizsgáltuk, 96-rekeszű mikrolemezeken, MDCC-MSBl-sejteket és a szokásos, állandó vírus-változó szérum módszert alkalmazva [Kunitoshi I. és Yuasa N., Jpn. J. Vet. Sci. 52, 873-875(1990)].
IIFT-t végeztünk ismert módszerek szerint [Yuasa N. és munkatársai, Avian Pathology 14, 521-530 (1985)].
Hematokritértékek
A számyvénából heparinozott kapilláris csövekbe vért vettünk. A hematokritértéket (%) 12000 rpm-en való 5 perces centrifugálás után olvastuk le. A csirkéket anémiásnak tekintettük 27,0% alatti hematokritértéknél [Yuasa N. és munkatársai (1979), lásd fent].
Az 1-3. kísérletekben szereplő SPF-csirkékben kiváltott fő patológiás károsodásokat a 3-5. táblázatokban foglaltuk össze.
3. táblázat
Egynapos SPF-csirkéken végzett patogenitási kísérletek (26P4-törzs)
Passzálási fok Összes elhullás (%)
Elhullás1 TA2 PB3 Ht (alacsony)4
1. tojáspasszálás 33 80 65 40
8. tojáspasszálás 4 40 40 21
Kontakt kontrollok, 1. tojáspasszálás 0 0 0 0
Kontakt kontrollok, 18. tojáspasszálás 0 0 0 0
Kontrollok 0 0 0 0
1 A beoltást követő 14-21. napon, a CAA-fcrtőzés következtében bekövetkezett elhullás 2 Timuszsorvadásban szenvedő madarak száma/vizsgált madarak száma χ 100% 3 Sápadt, clzsirosodott csontvclcjű madarak száma/vizsgált madarak száma χ 100% 4 27%-nál alacsonyabb Ht-crtékkel rendelkező madarak száma/vizsgált madarak száma χ 100%
4. táblázat
Egynapos SPF-csirkéken végzett patogenitási kísérletek (26P4-törzs)
Passzálási fok Összes elhullás (%)
Elhullás1 TA2 PB3 Ht (alacsony)4
4. tojáspasszálás 13 70 61 87
19. tojáspasszálás 0 33 31 35
Kontakt kontrollok, 4. tojáspasszálás 0 0 0 0
Kontakt kontrollok, 19. tojáspasszálás 0 0 0 0
Kontrollok 0 0 0 0
1 A beoltást követő 14-21. napon a CAA-fertőzés következtében bekövetkezett elhullás 2 Timuszsorvadásban szenvedő madarak száma/vizsgált madarak száma χ 100% 3 Sápadt, clzsirosodott csontvclcjű madarak száma/vizsgált madarak száma χ 100% 4 27%-nál alacsonyabb Ht-értékkel rendelkező madarak száma/vizsgált madarak száma χ 100%
5. táblázat
Patogenitási kísérlet egynapos korú SPF-csirkékben (Gifú-törzs)
Passzálási fok Összes elhullás (%)
Elhullás1 TA2 PB3 Ht (alacsony)4 Szerológiai titer5
1. passzálás 44 100 85 85 8,3 ±1,2
14. passzálás 0 70 60 60 8,2 ±1,4
Kontrollok 0 0 0 0 <4,0 ±0,0
14 lásd 3. táblázat s 2-cs alapú logaritmus, standard eltéréssel
Jelentős különbség figyelhető meg a két CAAizolátum alacsony és magas passzálási fokú vírusai által okozott patológiás változások között, nem csak az érintett madarak számát, hanem a patológiás elváltozások súlyossági fokát illetően is, amint azt a Ht-középértékek különbségei mutatják.
A magas passzálási fokú vírusok által kiváltott, kiterjedt csontvelő- és timuszkárosodások is kevésbé súlyosak, mint az alacsony tojáspasszálási fokú vírusok által okozott elváltozások.
Az élő CAA-vakcina immunogenitása
Az 5. táblázat azt mutatja, hogy a Giíu-törzs immu15 nogenitását nem befolyásolta hátrányosan a CAA-vírusok attenuálása.
A 6. táblázat az 1. és 2. kísérlet szerológiai eredményeit mutatja. A magas tojáspasszálási fokú vírusok patogenitási sajátságaiban bekövetkezett csökkenés el20 lenére nem volt észrevehető csökkenés ezen vírusok immunogenitásában.
6. táblázat
A vírusneutralizációs vizsgálat eredményei 5 héttel a beoltás után
Passzálási szint VN-titer-közcpcrtékl
vakcináit kontakt kontrollok
1. tojáspasszálás 8,7±0,9 8,5 ±1,4
18. tojáspasszálás 8,2 ±1,3 7,6±1,5
Kontrollok <4
4. tojáspasszálás >10,2 ±0,6 >10,0±0,8
19. tojáspasszálás 9,2±0,9 >10,3±0,6
Kontrollok <4
1 2-cs alapú logaritmusban kifejezve, standard eltéréssel
4. példa
Vakcinázás élő, kombinált vakcinával
Reo-vírus-vakcina: kereskedelmileg hozzáférhető (Intervet International Β. V., Hollandia) Nobilis® élő Reo-vírus-vakcina (016 091 gyártási számú tétel). A vakcinát az oldószerben a gyártó előírása szerint hígítottuk.
CAA-vakcina: az Intervet-törzs 19. tojáspasszálási fokából származó élő CAA-vírusokat oly módon hígítottuk az oldószerben, hogy az egy madárra eső dózis (0,2 ml) 102·6 TCID50-et tartalmazott.
Négyhetes SPF-csirkéket vakcináztunk izomba adva
- 1 madárdózis élő Reo-vakcinával;
- 1 madárdózis élő CAA-vakcinával; vagy
- 1 madárdózis élő, kombinált Reo- és CAA-vak45 cinával. A vakcinázás után négy és hat héttel vérmintákat vettünk, és a szérumokat vírusneutralizációs módszerrel CAA- és Reo-vírusok elleni ellenanyagok jelenlétére vizsgáltuk (7. táblázat).
7. táblázat
A vírusneutralizációs vizsgálat eredményei
Vakcina VN-titer-közepérték1
CAA-vakcinálás után Reo-vírus-vakcinálás után
4 héttel 6 héttel 4 héttel 6 héttel
Reo-vakcina <4,0±0,0 <4,0±0,0 2,3±2,0 2,3 ±1,4
CAA-vakcina >9,6±0,8 >9,5 ±1,2 <1,0±0,0 <l,0±0,0
7. táblázat (folytatás)
Vakcina VN-titcr-középérték1
CAA-vakcinálás után Rco-vírus-vakcinálás után
4 héttel 6 héttel 4 héttel 6 héttel
kombinált vakcina >9,1 ±1,1 >9,8±1,1 3,4±1,8 1,5±I,8
kontrollok <4,0±0,0 <4,0±0,0 <l,0±0,0 <l,0±0,0
1 2-cs alapú logaritmusban kifejezve, standard eltéréssel
A fenti táblázatból kiderül, hogy bár a kombinált vakcina mindkét vírustípust élő formában tartalmazza, immunogenitásukban nem volt megfigyelhető kedvezőtlen kölcsönhatás.
5. példa
Kísérleti vakcinázás inaktivált CAA-vakcinával
Négyhetes SPF csirkéket vakcináztunk izomba adott inaktivált CAA-vakcinával, víz-olaj emulzió formájában (v/o). A vakcinát a 19. passzálási szintű Intervet-törzs embrióhomogenizátumából készítettük. A vírust 0,5% béta-propiolaktonnal inaktiváltuk 3 óra hosszat 37 °Con. A v/o emulzióit 50% inaktivált CAA-tojás alapanyag és 50% ásványi olaj emulziójából készítettük.
A fertőző titer alapján az egyes csirkéket 107-5 TCID5o vírusantigént tartalmazó, 0,5 ml v/o emulzióval oltottuk, izomba adva. A vakcinázás után 8 héttel a madarakat ugyanazzal az inaktivált vakcinával egy máso15 dik vakcinázásban részesítettük, izomba adva. Az első és a második vakcinázás után különböző időpontokban vérmintákat vettünk, és a szérumokat VN-módszerrel CAA-ellenanyagok jelenlétére vizsgáltuk (8. táblázat). Kimutattuk, hogy a fertőző dózis alapján 107-5 TCID50 vírusantigént tartalmazó, inaktivált vakcina képes immunválaszt kiváltani a beoltott állatban. A többi vakcinázási kísérletben ugyanazt a fent ismertetett eljárást követtük, kivéve, hogy a vakcina dózisa 1 ml olaj-víz emulzióban 108·0 és 109·0 TCID50 voltak (9. táblázat).
8. táblázat
A vírusneutralizációs vizsgálat eredményei
Csirke VN-titcr1
vakcinázás utáni hetek megerősítés utáni hetek
4 hét 6 hét 8 hét 2 hét 4 hét 6 hét
801/802 <4 <4 <4 6 6 7
803/804 8 7 n. v. 9 8 8
805/806 5 4 6 6 6 4
807/808 6 8 9 10 >11 >11
809/810 6 5 4 7 n. v. 6
811/812 4 <4 4 4 4 4
813/814 4 <4 <4 <4 <4 <4
815/816 4 4 4 6 6 5
817/818 <4 <4 <4 4 4 n. v.
819/820 <4 5 <4 6 5 n. v.
821/822 <4 <4 <4 6 7 6
823/824 6 7 6 8 7 7
kontakt kontrollok n. v. n. v. <4 <4 <4 <4
n. v. n. v. <4 <4 <4 <4
n. v. n. v. <4 <4 n. v. n. v.
1 2-cs alapú logaritmusban kifejezve n. v.=ncm vizsgáltuk
9. táblázat
A vírusneutralizációs vizsgálat eredményei
Csoport Dózis (TC1D5O) Csirkék VN-titcr1
vakcinázás utáni hetek megerősítés utáni hetek
4 6 2 4 6
510 10«·° vakcinázott kontrollok 3,9 4,1 7,9 8,3 8,3
3,0 3,0 3,0 3,0 3,0
515 10’·» vakcinázott kontrollok 5,0 5,3 9,2 10,4 9,6
3,0 3,0 3,0 3,0 3,0
1 2-cs alapú logaritmusban kifejezve

Claims (12)

1. Eljárás csirkeanémia-ágens (CAA) vírus mikrobiológiailag tiszta kompozíciójának előállítására, azzal jellemezve, hogy egy fogékony szubsztrátot olyan CAA-vírussal oltunk be, amely károsodást képes kiváltani csirkeembriókban, a beoltott szubsztrát inkubálásával a vírust elszaporítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vírust legalább 108·0 TCID50/ml értékig szaporítjuk.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szaporítást embrionált tojáson végezzük.
4. Eljárás magas titerben szaporítható, attenuált CAA-vírusok előállítására, azzal jellemezve, hogy
i) embrionált tojást beoltunk CAA-vírussal, és a vírust a tojáson tenyésztjük, ii) összegyűjtjük az embriókat és/vagy a korioallantoisz membránokat és/vagy az allantoisz folyadékot, iii) az összegyűjtött anyagot homogenizáljuk, ív) a homogenizátummal friss embrionált tojást oltunk be, és
v) a vírust addig passzáljuk, míg csökkent patogenitást mutató, csirkeembriókon léziókat létrehozni képes vírusokat nem kapunk.
5. Eljárás élő, attenuált vírusokat tartalmazó vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy
i) embrionált tojást olyan attenuált CAA-vírussal oltunk be, amely képes csirkeembriókon léziókat létrehozni, ii) a beoltott tojásokat inkubáljuk,
20 iii) összegyűjtjük az embriókat és/vagy a korio-allantoisz membránokat, és/vagy az allantoisz folyadékot, iv) az összegyűjtött anyagot homogenizáljuk, és
v) a homogenizátumot farmakológiailag elfogadható hordozóanyaggal keverjük.
25
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tojásembriókban attenuált CAA-vírusokat alkalmazunk.
7. Az 5. igénypont szerinti eljárás baromfikat CAA ellen védő vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy
30 hatásos mennyiségű inaktivált CAA-vírust tartalmazó és a vakcinázást követően csirkékben CAA-vírus elleni neutralizáló ellenanyagok termelését kiváltani képes vakcinát állítunk elő.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,
35 hogy a CAA-vírusok inaktiválás előtti dózisát legalább
107·5 TCID50-értékre állítjuk be.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inaktiválás előtti vírustartalmat dózisonként legalább 108>° TCID50-, előnyösen 109·0 TCID50-értékre
40 állítjuk be.
10. Az 5-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított kompozíciót vagy a 4. igénypont szerinti eljárással előállított vírust alkalmazunk.
45
11. Az 5 -10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy adjuvánst is adagolunk.
12. Az 5. vagy 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy vagy több, CAA-val rokonságot nem mutató madárkórokozó antigénjeit is adagoljuk.
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: Törőcsik Zsuzsanna osztályvezető
HU9202976A 1991-09-20 1992-09-18 Eljárás csirkeanémia-ágens vakcina előállítására HU217214B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP91202452 1991-09-20

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9202976D0 HU9202976D0 (en) 1992-11-30
HUT65367A HUT65367A (en) 1994-05-02
HU217214B true HU217214B (hu) 1999-12-28

Family

ID=8207891

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9202976A HU217214B (hu) 1991-09-20 1992-09-18 Eljárás csirkeanémia-ágens vakcina előállítására
HU95P/P00564P HU211896A9 (en) 1991-09-20 1995-06-29 Chicken anaemia agent vaccine

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU95P/P00564P HU211896A9 (en) 1991-09-20 1995-06-29 Chicken anaemia agent vaccine

Country Status (17)

Country Link
US (1) US5728569A (hu)
EP (1) EP0533294B1 (hu)
JP (2) JP3945830B2 (hu)
KR (1) KR100221710B1 (hu)
CN (1) CN1050302C (hu)
AT (1) ATE147632T1 (hu)
AU (1) AU659490B2 (hu)
CA (1) CA2078605C (hu)
DE (1) DE69216732T2 (hu)
DK (1) DK0533294T3 (hu)
ES (1) ES2099200T3 (hu)
GR (1) GR3022755T3 (hu)
HU (2) HU217214B (hu)
MX (1) MX9205336A (hu)
NZ (1) NZ244361A (hu)
TW (1) TW340873B (hu)
ZA (1) ZA927014B (hu)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6071520A (en) * 1990-09-12 2000-06-06 Leadd Bv Chicken anemia virus mutants and vaccines and uses based on the viral proteins VP1, VP2 and VP3 or sequences of that virus coding therefor
US6217870B1 (en) 1990-09-12 2001-04-17 Leadd, Bv Chicken anemia virus mutants and vaccines and uses based on the viral proteins VP1 VP2 and VP3 or sequences of that virus coding therefor
NL9301272A (nl) * 1993-07-20 1995-02-16 Aesculaap Bv Chicken Anemia Virus mutanten en vaccins en toepassingen gebaseerd op de virale eiwitten VP1, VP2 en VP3 of daarvoor coderende sequenties van dat virus.
US6162461A (en) 1990-09-12 2000-12-19 Leadd B.V. Chicken anemia virus mutants and vaccines and uses based on the viral proteins VP1, VP2 and VP3 or sequences of that virus coding therefor
US5981502A (en) * 1990-09-12 1999-11-09 Leadd B.V. Methods and compositions for inducing apoptosis in tumor cells
GB9414888D0 (en) * 1994-07-23 1994-09-14 Univ Belfast Method and composition
EP0802796B1 (en) * 1995-01-06 2001-10-04 Akzo Nobel N.V. Chicken anaemia agent broiler vaccine
ZA978434B (en) * 1996-09-27 1998-03-26 Akzo Nobel Nv Inactivated vaccines.
US6159472A (en) * 1998-11-16 2000-12-12 Akzo Nobel N.V. Intradermal Avian immunization with inactivated vaccines
JP2001275664A (ja) * 2000-02-29 2001-10-09 Akzo Nobel Nv 低い病原性のニワトリ貧血ウイルス
US6593134B1 (en) 2000-03-10 2003-07-15 Cornell Research Foundation, Inc. Method of propagating chicken infectious anemia virus
BR0212279A (pt) * 2001-09-05 2004-10-13 Biomune Vacina obtida de linhagem celular para vìrus causador de anemia em galinhas
WO2005087262A1 (en) * 2004-03-05 2005-09-22 Biomune Company Chicken anemia virus vaccine from cell line
WO2006082588A2 (en) * 2005-02-07 2006-08-10 Pharmalight Inc. Method and device for ophthalmic administration of active pharmaceutical ingredients
US9944904B2 (en) 2015-05-14 2018-04-17 Merial Inc. Method for porcine circovirus production and PCV2 vaccines

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3616262A (en) * 1967-06-09 1971-10-26 Merck & Co Inc Apparatus and method for propagating viruses i in the extra-embryonic fluids of eggs
BE853923A (fr) * 1977-04-25 1977-10-25 Rit Rech Ind Therapeut Nouveau vaccin vivant ameliore contre le pseudopeste aviaire et son procede de preparation
US4530831A (en) * 1982-11-02 1985-07-23 Akzo N.V. Infectious Bursal Disease vaccine

Also Published As

Publication number Publication date
ES2099200T3 (es) 1997-05-16
CA2078605C (en) 2003-06-17
EP0533294A1 (en) 1993-03-24
CN1050302C (zh) 2000-03-15
HU9202976D0 (en) 1992-11-30
CN1073879A (zh) 1993-07-07
CA2078605A1 (en) 1993-03-21
JPH05260962A (ja) 1993-10-12
KR930006150A (ko) 1993-04-20
US5728569A (en) 1998-03-17
KR100221710B1 (ko) 1999-10-01
ZA927014B (en) 1993-03-19
JP3945830B2 (ja) 2007-07-18
GR3022755T3 (en) 1997-06-30
ATE147632T1 (de) 1997-02-15
AU2521792A (en) 1993-03-25
DE69216732D1 (de) 1997-02-27
DE69216732T2 (de) 1997-06-12
MX9205336A (es) 1993-07-01
TW340873B (en) 1998-09-21
JP4148980B2 (ja) 2008-09-10
HUT65367A (en) 1994-05-02
DK0533294T3 (da) 1997-07-07
HU211896A9 (en) 1995-12-28
JP2007125039A (ja) 2007-05-24
NZ244361A (en) 1995-06-27
EP0533294B1 (en) 1997-01-15
AU659490B2 (en) 1995-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4148980B2 (ja) ニワトリ貧血因子ワクチン
US4559229A (en) Avian proventriculitis vaccine
EP0086025B1 (en) Infectious bronchitis vaccines
AU759179B2 (en) Novel antigenic class of avian reoviruses
GB1590448A (en) Vaccine and its preparations
US20100003279A1 (en) Vaccine for in ovo inoculation
EP0760394B1 (en) Mild Newcastle disease virus vaccine
AU782013B2 (en) IBDV strain for in ovo administration
US5686077A (en) Methods of immunization of poultry with vaccines against chicken anemia agent (CAA)
EP0848956A1 (en) In ovo vaccination against Newcastle Disease
US20080317776A1 (en) Vaccines Containing Viruses Involved in Avian Malabsorption Syndrome and Methods of Administration Therefor
HU205265B (en) Process for producing living vaccine combinations againstvirus infections of fowls
EP0861665A1 (en) Infectious bursitis vaccine
HU225801B1 (en) Chicken anaemia viruses of low pathogenicity
JPS6244528B2 (hu)
EP1161953A2 (en) IBDV strain for in OVO administration

Legal Events

Date Code Title Description
GB9A Succession in title

Owner name: INTERVET INTERNATIONAL B.V., NL

Free format text: FORMER OWNER(S): AKZO N.V., NL