CN1073879A - 鸡贫血病因子疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种活的和失活的鸡贫血病因子疫 苗，它能在被接种的鸡体内引起免疫响应。这种疫苗 的CAA病毒是在含胚蛋中经一系列传代而被减弱 了毒性的。

Description

本发明涉及一种保护禽类抵抗鸡贫血病因子（CAA）的，既可是活，也可是失活的疫苗、一种制备这种疫苗的方法、一种制备CAA病毒产物的方法，以及涉及一种微生物纯的CAA病毒组合物。
鸡贫血病因子（CAA）是鸟类有传染性的贫血病病原体，于1979年首次被Yuasa等人描述过（Avian  Diseases  23，366-385，1979）。
在幼小的易感病的鸡体中CAA造成带有骨髓发育不全/再生不良和胸腺萎缩病状的贫血病。鸡长到一定年龄就能抵御实验诱发的，因CAA引起的病。对两周龄的鸟基本上是这样的，但对更大龄的鸟来说仍易被感染（Yuasa，N.et  al.，1979  supra;Yuasa，N.et  al.，Avian  Diseases  24，202-209，1980）。然而如果用CAA和免疫抑制因子（如IBDV，MDV等）使鸡双重感染，则抗疾病的年龄就会被推迟（Yuasa，N.et，al.，1979  and  1980  supra;Bulow  von  V  et  al.，J，Veterinary  Medicine  33，93-116，1986）。接种CAA的鸡的发病风险率和死亡率与接种所用的CAA的剂量关系极大，即剂量越大疾病越严重（Yuasa，N.et  al.，1979  supra）。
在标准培养成的，由各种鸡和鸡的胚胎组组产生的单层细胞中，如鸡胚胎脑细胞、鸡胚胎肝细胞和自肾、胸腺、Bursa  of  Fabricius（囊组织）、骨髓产生的鸡细胞或白血细胞产生的鸡细胞中CAA不生长（Yuasa，N.et  al.，1979  supra;Yuasa，N.Natl.Inst.Anim.Health  Q，23，13-20，1989），而且在常用的各种哺乳动物细胞系，如VERO、CRFK，MDCK和A-72中也不生长（Rosenberger，J.K.and  Cloud，S.S.，Avian  Diseasea  33，707-713，1989）。
CAA在某些由Marek的病和淋巴白细胞淋巴瘤确定的淋巴细胞株中，尤其是有MDCC-MSBI细胞培养物中生长（Yuasa，N.，1983）。然而不利的是CAA在MDCC-MSBI细胞中只长到较低的滴定度。在MDCC-MSBI细胞中只得到105.0-106.0TCID50/0.1ml的滴定度。另外发现，在MDCC-MSBI细胞中增殖的CAA仅为接种剂量的大约10倍（Yuasa，N.，1983 supra，Bülow von，V.et al.，Zentralblatt Vet.Med.32，679-693，1985）。
除鸡之外，CAA还可在鸡胚胎中繁殖（Yuasa，N.and Yoshida，I.，Natl.Inst.Anim.Health Q.23，99-100，1983;Bülow von，V.and Witt，M.，J，Vet，Med.33，664-659，1986）。然而，在这些胚胎中见不到致死的或病理学的影响，这表明在含胚蛋中CAA不会繁殖得大到足以影响胚胎的量。当在MDCC-MSBI细胞中分析时，能从整个胚胎中得到的CAA的最高滴定值的变化范围在105.4-106.5TCID50/ml之间，该值等于自实验感染的鸡肝提取物所得的滴定值。
Bülow  von，V和Witt研究了作为产生可被施于亲本原种而无需减弱病毒毒性的活疫苗手段的在含胚蛋中有毒性的CAA的繁殖。然而在此要提到的是：必须防止减弱病毒毒性，因为这会导致丧失免疫性（Bülow  von，V.and  Fuchs，B.，J，Vet.Med.33，568-573，1986）。
Bulow和Fuchs，（J.Vet.Med.33，568-573，1986）曾报导过：经在MDCC-MSBI细胞中的连续次传代后，CAA病毒株Cux-1的致病力被降低了，然而其中并未公开与这些减小致病力的病毒株的免疫力相关的数据。事实上，Bulow和Fuchs，予料到随着这种致病力的降低免疫力也会降低的。
Yuasa（1983  Supra）或Goryo等人（Avian  Pathology  16，149-163，1987）或Otaki等人（Avian  Pathology  17，333-347，1988）都未发现一点儿在MDCC-MSBI细胞上Gifu-1株、TK-5803株以及CAA82-2株分别经19、40和4.0传代后减弱毒性的证据。
Vielitz，E.等人（J.Vet.Med.34，533-557，1987）报导了对自Cux-1株衍生的CAA活疫苗的评价。然而其中并未采用减弱了毒性的CAA病毒株。这种含有毒性CAA的疫苗被施用于9-15周龄的鸡中，而在被接种的鸡身上并未显示出致病力。从抗实验诱发的，由CAA引起的病的已知年龄大体是整两周的观点来看，在此情况下对于被接种的鸡本身而言，活疫苗病毒的毒性减弱程度不大重要。然而，为防止幼鸡在接触活CAA疫苗活的病征，应使活疫苗的毒性大大减弱。
活CAA疫苗的一个替代物是失活的辅助疫苗。这种失活的疫苗也可用来增强鸡体内存在的免疫力。然而失活CAA疫苗至今未见报导，因为在目前这种方法是复杂的，不能将CAA病毒在玻璃试管内培养到高的滴定值（McNulty，M.S.，Avian  Pathology  20，187-203，1991）。
因此本发明的第一目的是提供一种可在玻璃试管内增殖到高滴定值的CAA病毒。
本发明的另一目的是提供一种在被隔离的场合下的幼鸡中明显显出降低了致病力的，产生于CAA病毒的CAA疫苗。
本发明再一目的是提供一种失活的，含有足以在接种后的鸡体中引起免疫响应量的CAA抗原的CAA疫苗。
本发明又一目的是提供一种减弱CAA病毒株毒性的通用工艺。
本发明涉及新的CAA病毒，即能在鸡胚胎内诱发病变的CAA病毒。CAA所引起的病变包括不可避免的死亡、淡白色的胚胎和出血，尤其是头部出血。这些类型的CAA病毒呈现出一些有利的特性。本发明的CAA病毒的有利特性之一是它们在玻璃试管中成长到高的滴定值，这将在后面详述。
所说的CAA病毒的另一优点是，如果与CAA领域的病毒相比，虽然这些病毒对鸡胚胎有更大的毒性，但对一天龄的鸡却有降低了的致病力而又保留其免疫特性。
本发明优先地把目标对准I-1141株的CAA病毒，它寄存在CNCM of the Institut Pasteur（第19传代程度）。这些病毒可在含胚蛋中被培养到至少为108.4TCID50/ml的滴定值，此外，它对一天龄的鸡致病力要比其亲系领域病毒株为低，而其免疫性却与其亲系相同。
可使任何现存的CAA病毒在含胚卵中传代而获得这种新类别的CAA病毒，这在下文及实施例中将详述。
一种保护家禽抗CAA的新疫苗的特征是：该疫苗包含能在鸡胚胎中诱发病变的CAA病毒，而这些病毒最好是通过在含胚卵中传代而获得的。
在从鸡的组织，如肝中分离现在已有的CAA株病毒后，该组织的匀浆可用在多步的减弱毒性的工艺中。如果需要，首先在接种到蛋内之前，CAA病毒可在适于CAA培养的组织或细胞，如MDCC-MSBI细胞中传代和增殖。然后这种病毒群体可用来感染含胚的蛋，再以本领域为此目的的已知方法使该病毒在含胚蛋中繁殖及传代。
尤其是，用卵黄囊法按标准程序，以至少104.5TCID50/蛋的CAA使蛋感染。接种13天后，收取被感染的鸡胚胎，将之均化，并用如2.5%的胰蛋白
Figure 921122845_IMG1
（tryptose）稀释（1∶20V/V）。随后，在每个蛋的传代步骤中以0.2ml/蛋的此匀浆接种新鲜的含胚蛋。随最后的蛋传代后，病毒被增殖，收取并被加工成具有抗CAA感染的免疫活性的疫苗。这最后一代病毒可在含胚蛋或在对CAA易感的细胞和组织培养物，如MDCC-MSBI细胞中繁殖。在含胚蛋的情况下，收取胚胎和/或膜和/或尿囊液。
为获得具有良好的生长及减弱毒性性能的CAA病毒的必需的传代数是取决于具体的CAA品系及毒性减弱程度和/或在玻璃试管中的所期望的滴定值的交互入口（inflr  alia）。
导致带有明显降低了致病性的，适于制备符合本发明的活性疫苗的CAA病毒的典型的总蛋传代数为18或更多，最好是34或更多。
特别是，符合本发明的疫苗是从Intervet  CAA品系26P4的病毒产生的。这种品系原是从野外的患贫血病的鸡的肝中分离出来的。分离后，在MDCC-MSBI细胞内将此品系传代5次，随后在含胚蛋中传代19次。这种品系的样品一直寄存在Collection  Nationale  de  Cultures  de  Micro-organismes（CNCM）of  the  Institut  Pasteur  at  Patis，France，收藏号为I-1141。显然，不仅此第19次传代的CAA病毒可用于制备本发明的疫苗，而且该品系再后传代程度的病毒也是很适用的。
相对于该品系中适于非蛋传代的病毒，这种减弱毒性的病毒株显出了其致病力明显下降，而以病毒中和试验（VN）所测的该系病毒的免疫性却不受影响。
按上述工艺获得的这种新的活CAA病毒有几个明显的区别特征，尤其是
-和截止目前所公开的CAA的品系不同（Yuasa，N.et  al.，1979，supra;Ynasa.N.and  Yoshida，I.，1983  supra;Bülow  von，V.and  Witt，M.，1986  supra），此CAA病毒诱发专门为CAA所引起的病变，这包括在鸡胚胎内致命和/或病理上的效应。其它的有利的特点是：
-该CAA病毒被减弱了毒性，即当施药于1天龄的SPF鸡体时，相对于从野外分离出来的CAA，只诱发明显小的病理病症;
-该CAA病毒适于在含胚蛋中长到高的滴定值;
本发明的含有被减弱了毒性的活CAA病毒的疫苗是可制成的，并可以悬浮液或以本质上是已知的冷冻干燥制品的形式上市。
这种活疫苗的每只鸡的剂量率范围为101.0-107.0TCID50的该减弱毒性的病毒。
添加一种稳定剂，尤其是如果用冷冻干燥法制备干的组合物时是有益的。适宜的稳定剂如是SPGA（Bovarnik  et  al.，J.Bacterilogy  59，509，905），糖类（如山梨糖、甘露糖醇、淀粉、蔗糖、右旋糖酶或葡萄糖），蛋白质（如白蛋白或酪蛋白）或其降解产物，以及缓冲物（如碱金属磷酸盐）。如果愿意也可加一种或多种有辅助活性的化合物。适于此目的化合物例如维生素E乙酸盐油/水乳化液、铝的氢氧化物、磷酸盐或氧化物，矿物油（如Bayol F（R）、Marcol 52（R）及完角苷。
本发明另一重要方面是用一种失活的CAA疫苗来防止因这种病原体在鸡体中引起的疾病。至今尚未能制出可在被接种的鸡体中免疫响应的失活CAA疫苗。
本发明第一次提供了一种失活的CAA疫苗，它含有有效量的CAA病毒，该疫苗在接种后能在鸡体内诱发出CAA中和抗体。
该失活的疫苗是从本发明新类别的CAA中产生的时尤为如此。
优选的本发明失活的CAA疫苗包括在含胚蛋中经上述数次传代后已减弱了毒性的失活的CAA的一种或多种分离体。如果愿意，在失活工艺之前，适于蛋传代面CAA可在易感的细胞和组织培养物，如MDCC-MSBI细胞中增殖。
这种失活的疫苗最好含具有一定予失活病毒滴定值的CAA，该值是按MDCC-MSBI细胞测得的，该值为每剂量约大于107.5TCID50，优选每剂量约大于108.0TCID50，而更好是每剂量约大于109.0TCID50。
失活的CAA流体可用任何的若干现有技术，如Amicon浓缩装置，如用聚乙二醇的沉淀技术，借助超速离心或辅助浓缩技术的浓缩被浓缩。
使CAA病毒失活的目的在于消除病毒的繁殖。一般这可利用化学或物理方式完成。可利用如酶、甲醛、β-丙醇酸内酯、亚乙二胺或其衍生物处理该病毒来完成化学失活。如果需要，此失活化合物随后被中和;用甲醛失活的原料比如可用硫代硫酸盐进行中和。物理失活最好将该病毒经受高能辐照，如紫外线;X射线或γ射线辐照而进行。若愿意，处理后将其pH值调回到大约7。
如果愿意，通常还将助剂和一种或多种乳化剂，如Tween（R）和Span（R）加到此失活的原料中。
本发明的疫苗是以该病毒原料的有效剂量，即在鸡体中诱发抗CAA的免疫响应的病毒原料的量施用的。
本发明的疫苗可通过喷雾、滴眼、滴鼻、口服（如饮水）或利用肌内或皮下注射向任何年龄的鸡施药。
本发明的疫苗，活的或失活的，可由任何现有的或从受这种病原体感染的鸡中得到的CAA病毒株制备。现有技术已述及一些CAA分离体，如Cux-1病毒株（Bülow  von，V.et  al.，J.Veterinary  Medicine  30，742-750，1983）、Gifu-1病毒株（Yuasa，N.et  al.，1979  Supra）及CAA82-2病毒株（Otaki  et  al.，1988  Supra）。
本发明活的或失活的疫苗优先用寄存号I-1141，寄存于CNCM的Intervet  CAA病毒株26P4产生。
本发明的疫苗，最好是含失活CAA的疫苗，可含CAA组分与一种或多种没有联系鸟类病毒的结合体，这些没有联系的鸟类病毒最好是：Newcastle  Pisease病毒（NDV）、Infectious  Bronchitis病毒（IBV）、Infectious  Bursal  Disease病毒（IBDV）、Marek′s  Disease病毒（MDV）、Herpes  Virus  of  Turkey′s（HVT）、Infections  Laryngotrachetis病毒或其它的鸟类疱疹病毒、Reo病毒、Egg  Drop  Syndrome病毒、Avian  Encephalomyelitis病毒、Reticuloendothe、leisis病毒、Leucosis病毒、Fowlpox病毒、Turkey  Rhinotracheitis病毒（TRTV）或Adeno病毒。
本发明的另一重要方面是CAA病毒产品的新生产体系。所得到的病毒产品可用来配制抗家禽中CAA感染的疫苗。直到本发明，可从玻璃试管内增殖的最大滴定值才于106.0-107.0BTCDI50/ml间变动。现有技术还没有消除用现有的生产体系，以令人可接受的价格得到令人满意的CAA抗原的不可能性。而且现有的使CAA病毒长到高滴定值的不可能性仍妨碍着制备要求高浓度抗原的失活CAA疫苗。
制备本发明的CAA病毒产品的方法包括：在合适的基体上接种能在鸡胚胎内诱发疾病的CAA病毒，特别是用已在含胚蛋内减弱了毒性的这种CAA病毒接种，然后繁殖CAA以及收取含CAA原料三个步骤。
在其上繁殖这些CAA的基体最好是SPF含胚蛋。含胚蛋可用，比如0.2ml的含CAA的悬浮液或匀浆接种，每个蛋至少包括104.5TCID50。最好蛋用约106.0TCID50接种，接着在100°F下孵化13天。13天后收取CAA病毒产品，其步骤是，通过集取胚胎的和/或膜和/或尿囊液，然后将此料适当均化。然后可将此匀浆以2500g离心力离心分离15分钟，接着用过滤器（100μm）滤出上清液。
另一选择是可将上述CAA病毒接种在易感的细胞培养物，如MDCC-MSBI细胞上，随后培育该细胞和收集已增殖的病毒。
接种10-18天后，最好是接种13天后得到至少约为108.0TCID50/ml，通常至少约为108.4TCID50/ml的可取得的病毒的滴定值（在MDCC-MSBI细胞中测得）。可将获取的液体与前述的病毒稳定剂结合，以便供应最终产品和/或将产品冻结成块或冷冻干燥。再一选择是可将获取的液体失活。CAA液体可用多种失活剂，如，但不限于，二元的亚乙二胺、乙酰基亚乙二胺、β-丙醇酸内酯失活，所述失活剂最好以0.1-0.5的浓度使用。可将失活剂加到含病毒的匀浆或其滤液内。
将β-丙醇酸内酯加到病毒流体内，而用氢氧化钠或碳酸氢钠溶液控制pH向酸性方向的逆向移动。将结合了的失活剂-病毒流体在4-37℃的温度下培育。可用1-72小时的培养时间。
此外，本发明还包括控制在家禽内的CAA感染的方法，这包括施用由在含胚蛋中减弱了毒性的CAA系的病毒而制成的疫苗。该方法包括施用活的或失活的疫苗。
实施例1
在含胚蛋中使CAA减弱毒性
从在野外的患贫血病的鸡的肝中分离出原始Intervet病毒株26P4（实验VIM-CA-89-4-153）。分离后，将该病毒株接种到蛋内之前，先将其在MDCC-MSBI细胞内传代5次。用0.2ml病毒株26P4或Gifu病毒株（Yuasa，N.et al.，Avian Diseasea 23，366-385，1979）在卵黄囊中将蛋接种。经在100°F孵化13天后（相对湿度55%）收获胚胎并将之均化。以2500g离心力将匀浆离心分离10分钟。集取上清液，并将之经1个100μm的过滤器倾倒。将该匀浆以1∶20的比例在2.5%的胰蛋白
Figure 921122845_IMG2
中稀释，然后每个蛋接种0.2ml。通过这样作，病毒株26P4传代1.9次以上。将该病毒株的第19次传代后的样品以寄存号I-1141寄存在CNCM of Institut Pasteur，Paris，France。通过在含胚蛋中传代14次来减弱Gifu病毒株的毒性。
实施例2
两种高蛋-传代CAA病毒和低蛋-传代CAA
病毒在含胚鸡蛋中的生长特征的比较
用蛋-传代程度不同的病毒将30-60个SPF蛋接种于卵黄囊中。于100°F（相对湿度55%）孵化7天后对蛋作透光检验，捻去死亡的含胚蛋或未受精的蛋。自第7天后，每天都对蛋作透光检查，并记录胚胎的死亡率。因CAA致死的胚胎的记录始于10天后，即始于第11天。接种13天后，胚胎被集取，均化并在2500g离心力下离心分离10分钟。收集上清液并在MDCC-MSBI细胞中作病毒感染性的滴定。
表1和2显示了能诱发胚胎病变和/或死亡的高蛋-传代的CAA病毒能在玻璃试管中生长到与低蛋-传代病毒一样的高滴定值。
表1 在含胚蛋中病毒株26P4的生长特性
蛋－传代 取得的滴定值对数TCID50/ml 因CAA致死的胚胎 因CAA致死的胚胎％
11天 14天
3101417192433 7.67.48.08.68.48.49.3 1N.D.N.D.6N.D.N.D.7 0N.D.N.D.2N.D.N.D.6 3.3N.D.N.D.26.6N.D.N.D.21.7
N.D.＝未测定。
13天后获取胚胎。
用第3次蛋-传代的26P4病毒株接种的胚胎未见任何胚胎病变。
用第17次蛋-传代病毒株接种的胚胎是淡白色的，一些胚胎（尤其是已死的）显示出头部血。
表2 Gifu病毒株在含胚胎蛋中的生长特征
蛋－传代 获得滴定值对数TCID50/ml 因CAA致死的胚胎，天 因CAA所致的胚胎病变 因CAA所致的胚胎死亡和胚胎病变
11 12 13 14
234567891011121314 N.D.7.07.37.67.67.68.07.48.57.87.88.38.3 0000000100130 0101000210233 0000000002050 0000200010106 001103446510711 03.33.36.66.610.013.311.613.311.623.330.033.3
N.D.＝未测定
实施例3
用活CAA疫苗的实验性接种
进行此实验是为了测定通过用含胚蛋使病毒传代后CAA病毒的毒性减弱和免疫性的保留。
-活CAA疫苗的致病力
在实验1中，使用下列传代程度的Intervet病毒株：
＊第一次蛋-传代程度（低蛋-传代程度）
＊第18次蛋-传代程度（高蛋-传代程度）
＊由未感染的含胚SPF蛋产生的胚胎匀浆（接种13天）。
在实验2中，使用下列传代程度的Intervet病毒株：
＊第4次蛋-传代程度（低蛋-传代程度）
＊19次蛋-传代程度（高蛋-传代程度）
第19次传代程度的CAA病毒作为“主种贮藏”
＊由未感染的含胚SPF蛋产生的胚胎匀浆（接种13天）
病毒以如下方式稀释：含大约106.0TCID50的0.2ml该疫苗以肌内注射对1天龄的SPF鸡进行接种。
在实验3中，用下列传代程度的Gifu病毒株：
＊第1次蛋-传代
＊第14次蛋传代
将107只一天龄的鸡分成三组，每组35-36只（见上）第3组不接种（对比组）。
接种后第10和14天，从隔离器中每组取10只鸡作血细胞比容测定和尸体剖检。
接种后三周取鸡血，以间接免疫萤光实验（IIFT）对血浆作CAA抗体检验。
为实验1和2进行上述接种。
在实验1和2中，将150天龄的SPF鸡分成三组，每组50只，各组均放在隔离器中。每组取40只用上述病毒中的一种接种，另10只不接种，作为接触对比物。
接种后第10、14和21天，从隔离器中每组取4或8只鸡作血细胞比容测定和尸体剖检。
接种后5周对这些鸡取血，并以VN-试验对血清作CAA抗体检测。
病毒滴定。
用96井的微量培养板（组织培养级）在MDCC-MSBI细胞中滴定病毒。
在补充有10%的胎腓肠血清和抗体的RPMI1640介质中制作一系列病毒的10倍稀释液。
将96井微量培养板中的10个井充以每种病毒的稀释液，每井充100μl。
随后加100μl的MDCC-MSBI细胞（最终浓度为每ml有6×105个细胞）。
每2-3天将细胞进行传代培养，10次传代后读出终点。按Reed和Muench的方法（Reed，L.J.and  Muench，H.Am.J.Hyg.27，493-497，1938）算出感染力值。
血清试验
抗CAA的抗体是以VN-试验，用96井微量培养板，用MDCC-MSBI细胞和常规的定型病毒改变血清的方法进行测定的（Kunitoshi，I.，and  Yuasa，N.Jpn.J.Vet.Sci，52，873-875，1990）。
按标准程序进行IIFT（Yuasa，N.et  al.，Avian  Pathology  14，521-530，1985）。
血细胞比容值
从翅膀静脉取血，放入肝素酶化了的微血细胞容量计毛细管中。在每分钟12000转的离心机将其甩5分钟后进行血细胞比容值（%）读数。当鸡显示出其血细胞比容值低于27.0%时，可以为这些鸡贫血（Yuasa，N.et  al.，1979  Supra）。
从实验1-3中，在SPF鸡中诱发的主要病理学病变分别列于表3-5中。
表3 一天龄SPF鸡中的致病力实验（26P4病毒株）
传代程度 总发病率％ Ht（低）4
发病率（1） TA(2) PB(3)
第一次蛋一传代 33 80 65 40
第18次蛋－传代 4 40 40 21
接触对比物第一次蛋－传代 0 0 0 0
接触对比物第18次蛋－传代 0 0 0 0
1）因CAA感染的发病率，发生在接种后14-21天。
2）有胸腺萎缩的鸡总数/被检验的鸡总数×100%
3）有淡白的，脂肪骨髓的鸡总数/被检验的鸡总数×100%
4）Ht值低于27%的鸡总数/被检验的鸡总数×100%。
表4
1天龄的SPF鸡中致病力实验（26P4病毒株）
表4 一天龄SPF鸡中的致病力实验（26P4病毒株）
传代程度 总发病率％
发病率（1） TA(2) PB(3) Ht(低)(4)
第4次蛋一传代 13 70 61 87
第19次蛋－传代 0 33 31 35
接触对比物第4次蛋－传代 0 0 0 0
接触对比物第19次蛋－传代 0 0 0 0
对比物 0 0 0 0
1）CAA感染的发病率，发生在接种后14-21天后
2）有胸腺萎缩的鸡总数/被检验的鸡总数×100%
3）有淡白的，脂肪骨髓的鸡总数/被检验的鸡总数×100%
4）Ht值低于27%的鸡总数/被检验的鸡总数×100%。
表5 一天龄的SPF鸡中的致病力实验（Gifu病毒株）
传代程度 总发病率（％） 血清滴定值（5）
发病率（1） TA(2) PB(3) Ht（低）（4）
第1次传代 44 100 85 85 8.3±1.2
第14次传代 0 70 60 60 8.2±1.4
对比物 0 0 0 0 ≤4.0±0.0
1）-4）如表3中所述
5）带有标准误差的平均的以2为底的对数
在都是CAA分离物的低蛋-传代病毒和高蛋-传代病毒之间有病理变化的差别，该差别不仅在于受损害的鸡的总数方面，而且还在于由平均Ht值的差所表明的病理学变化的严重性上。还有，被高蛋-传代病毒所诱发的骨髓和胸腺的总的病变也不如低蛋-传代病毒所诱发的病变严重。
-活CAA疫苗的免疫性
表5说明Gifu病毒株的免疫性并未因CAA病毒的毒性减弱而受到有害影响。
表6示出了实验1和2的血清学结果。虽然高蛋-传代病毒的致病特性有所降低，但可注意到该病毒的免疫性并未降低。
表6
接种5周后病毒中和试验的结果
Figure 921122845_IMG3
1.以以2为底的对数表达，带有标准误差。
实施例4
用活的结合疫苗接种
Reo病毒疫苗：市售的（Intervet International B.V.，The Netherlands）活Reo疫苗Nobilis（R）（批号016901）。该疫苗在制造者推荐的稀释剂中稀释。
CAA疫苗：将Intervet病毒株的第19次蛋-传代的活CAA病毒以一只鸡剂量（0.2ml）含102.6TCID50的方式稀释。
将4周龄的SPF鸡以肌内注射进行接种，既可用1只鸡剂量的活Reo疫苗;1只鸡剂量的活CAA疫苗，也可用1只鸡剂量的活的Reo和CAA的结合疫苗接种。接种4和6周后取血样，并用病毒中和试验检验血清，以检测CAA和Reo病毒抗体的存在（表7）。
表7
病毒中和试验的结果
1.以以2为底的对数表达，带有标准误差。
从上表可明了，虽然结合疫苗含两类活体形式的疫苗，但并未发现它们的免疫性的有害的相互干扰。
实施例5
用失活CAA疫苗的实验性接种
用存在于水混于油的乳液（W/O）中的失活的CAA疫苗对4周龄的SPF鸡作肌内接种。该疫苗是用19次蛋-传代程度的Intervet病毒株的胚胎匀浆制得的。用0.5%β-丙醇酸内酯于37℃使该疫苗失活3小时。制备一种含50%的失活CAA原料和50%矿物油的乳液的W/O乳液。
向每只鸡肌内注射0.5ml含107.5TCID50病毒抗原（以感染力滴定值为基数）的W/O乳液。接种8周后，用相同的失活疫苗对这批鸡作第二次肌内接种。在第一和第二次接种后，按不同的次数取血样，并用VN试验分析血清以检查CAA抗体的存在（表8）。该表表明，含107.5TCID50病毒抗原（以感染力滴定值为基数）的失活疫苗能在被接种的动物体中诱发免疫响应。
在其它的接种实验中，除疫苗剂量为1ml的油混于水乳液中存有108.0及109.0TCID50外，其余按同样方法进行（表9）
表8
病毒中和实验结果
Figure 921122845_IMG5
1.用以2为底的对数表达
N.D.＝未测定。
表9
病毒中和试验结果
1.用以2为底的对数表达。

Claims (14)

1、一种能在鸡胚胎中诱发病变的鸡贫血病因子(CAA)病毒。
2、根据权利要求1的CAA病毒，其特征是该病毒是寄存在CNCN  OF  Institut  Pasteur的品系I-1141中的病毒。
3、根据权利要求1或2的CAA病毒的一种微生物纯的组合物。
4、根据权利要求3的微生物纯的组合物，其特征是该组合物每ml含至少108.0TCID50。
5、一种保护家禽抗CAA的，含减弱毒性的活CAA病毒的疫苗，其特征是它含权利要求1或2的CAA病毒。
6、根据权利要求5的疫苗，其特征是该CAA病毒是在含胚蛋中被减弱毒性的。
7、一种保护家禽抗CAA的疫苗，其特征是它含有效量的失活CAA病毒，该疫苗能在接种后于鸡体内诱发产生CAA病毒中和抗体。
8、根据权利要求7的疫苗，其特征是该CAA病毒的予失活量为每剂量至少约107.5TCID50。
9、根据权利要求8的疫苗，其特征是该予失活量为每剂量至少约108.0TCID50，最好每剂量至少约109.0TCID50。
10、根据权利要求5-9的疫苗，其特征是它含权利要求1或2的CAA病毒。
11、根据权利要求7-10的疫苗，其特征是它还含助剂。
12、根据权利要求5或7的疫苗，其特征是它还含一种或多种不相联系的鸟类病原体的抗体。
13、一种制备CAA病毒制品的方法，包括如下步骤：
a）将权利要求1或2的CAA病毒接种于合适的基体上，
b）繁殖该CAA病毒，及
c）集取含CAA病毒的原料。
14、根据权利要求13的方法，其特征是该基体是含胚蛋。
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