MXPA06010131A - Vacuna para el virus de la anemia aviar de la linea celular. - Google Patents

Abstract

Se proporciona una vacuna de virus de anemia infecciosa de pollo (CIAV), comprendiendo CIAV vivo pasado en las celulas MDCC-MSB-1 (MSB-1) en donde la vacuna no causa la Enfermedad de Marek. Tambien se proporciona una vacuna CIAV comprendiendo un virus CIAV que tiene la secuencia de SEC ID NO: 1. Se proporciona un metodo para fabricar una vacuna CIAV, comprendiendo cultivar el CIAV en las celulas MSB-1 y remover o eliminar cualquier virus de enfermedad de Marek presente en el cultivo CIAV conteniendo MSB-1. Se proporciona un metodo de inmunizar un pollo en contra de la infeccion CIAV, comprendiendo administrar al pollo una cantidad de la vacuna de CIAV de la invencion suficiente para inducir una respuesta inmune a CIAV.

Description

VACUNA PARA EL VIRUS DE LA ANEMIA AVIAR DE LA LÍNEA CELULAR CAMPO DE LA INVENCIÓN La ¡nvención se relaciona generalmente a una vacuna para el virus de anemia infecciosa en los pollos, métodos para fabricar la vacuna y métodos de inmunización que usan la vacuna.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El CIAV provoca enfermedad clínica y sub-clínica en pollos, y se reconoce como un importante patógeno aviar alrededor del mundo. En pollos jóvenes, el CIAV provoca una severa anemia temporal debida a la destrucción de las células eritoblastoides en la médula espinal e inmunodeficiencia debida a la reducción de timocitos corticales. La reducción de timocitos corticales se considera que provoca una inmunodeficiencia temporal que resulta en infecciones simultáneas mejoradas y a fracasos de vacunación. La destrucción de timocitos y más probablemente también de células eritoblastoides ocurre a través de la apoptosis inducida por VIAC.

CIAV es un virus pequeño de un tipo único de un diámetro de partícula de 23-25 nm y un genoma que consiste de un ADN de una sola hebra circular (hebra negativa). Este ADN se multiplica en células infectadas a través del intermediario replicativo de doble hebra circular. El CIAV no se relaciona a otros virus de ADN circular de una sola hebra de animales conocidos, tales como circovirus porcino y virus de la enfermedad de pico de aves y plumas de psitaccine.

La mayor transcripción a partir del genoma de CIAV es un ARNm policistrónico no empalmado de aproximadamente 2100 nucleótidos que codifican tres proteínas de 51.6 kDa (VP1), 24.0 kDa (VP2) y 13.6 kDa (VP3 o apoptina). Todas las tres proteínas se sintetizan en células infectadas con CAIV.

Para reducir el daño económico provocado por la infección por CIAV, es necesario proporcionar una vacuna de costo efectiva contra CIAV. Los intentos anteriores para proporcionar una vacuna contra CIAV han requerido el paso y propagación de CIAV en embriones de SPF susceptibles a CIAV (Véase Vielitz y Voss, International Symposium on Infectious Bursal Disease and Chicken Infectious Anemia, Rauischholzhausen, Alemania, 21-24 Junio 19114). Los intentos para producir CIAV en líneas celulares han sido problemáticos debido a la infección de las líneas celulares susceptibles con el virus de la enfermedad de Marek. De esta forma, existe una necesidad para una vacuna producida en células cultivadas que no provocará la enfermedad de Marek.

La presente invención cumple las necesidades de este campo proporcionando una vacuna sin las desventajas del paso de embriones y sin las desventajas de la contaminación del virus de la enfermedad de Marek.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN De acuerdo con el o los propósitos de esta invención, como se manifiesta y ampliamente describe en este documento, esta invención, en un aspecto, se relaciona a una vacuna contra el virus de anemia infecciosa de pollo (CIAV), que comprende el CIAV activo trasladado en células MDCC-MSB-1 (MSB-1), en donde la vacuna no provoca la Enfermedad de Marek.

En otro aspecto, la invención proporciona una vacuna contra CIAV que comprende un virus de CÍA que tiene la secuencia de la SEC. DE ID. NO: 1.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para fabircar una vacuna contra CIAV, que comprende cultivar CIAV en células MSB-1 , y remover o eliminar cualquier virus de la enfermedad de Marek presente en el cultivo MSB-1 que contiene CIAV. El método puede incluir someter el cultivo de célula MSB-1 que contiene CIAV en al menos 3 ciclos de congelamiento y descongelamiento, seguido por una etapa para mantener las células durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 37°C. Alternativamente, puede usarse filtración, o centrifugación seguida por tratamiento en aproximadamente 37°C.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para inmunizar un pollo en contra de la infección de CIAV, comprendiendo administrar al pollo una cantidad de la vacuna contra CIAV de la invención, suficiente para inducir una respuesta inmune a CIAV.

La invención tiene la ventaja que proporciona una vacuna contra CIAV que puede producirse en una línea celular y está libre de virus contaminantes.

Las ventajas adicionales de la invención se establecerán en parte en la descripción que sigue, y en parte será obvia a partir de la descripción, o puede aprenderse mediante la práctica de la invención. Las ventajas de la invención se realizarán y lograrán por medio de los elementos y combinaciones particularmente indicadas en las reivindicaciones anexas. Se entiende que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son ejemplarizadoras y explicativas únicamente y no son restrictivas de la invención, como se reclama.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los dibujos anexos, que se incorporan en, y constituyen una parte de esta especificación, ilustran (una) o varias modalidades de la invención y junto con la descripción sirven para explicar los principios de la invención.

La Figura 1 muestra los productos PCR (1 = marcador, 2 = Del Ros, 3 = vacuna adaptada y atenuada del embrión CIAV Intervet, 4 = células 1:2, 5 = sobrenadante 1 :2, 6 = células 1:10, 7 = sobrenadante 1 :10, 8 = células MSB-1 solamente ).

La Figura 2 muestra el análisis de enzima de restricción con Hindlll (1=marcador, 2=ClAV Del Ros sin cortar, 3= CIAV Del Ros Hindlll, CIAV 4=lnterver sin cortar, CIAV 5=lntervet Hindlll, CIAV 6=1 :2 CIAV Intervet sin cortar, 7= CIAV Intervet muestra Hindi, 8 = Intervet 1 :10 CIAV Hindlll).

La Figura 3 muestra el efecto de congelamiento-descongelamiento en la viabilidad del MDV (virus de Rispen)., en donde: A = Número de placas por ml (log2) B = Ciclos de congelamiento-descongelamiento y La Figura 4 muestra el efecto de 37°C en la viabilidad de MDV (virus de Rispen) después de 3 ciclos de congelamiento-descongelamiento, en donde: C = Días.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención puede entenderse más fácilmente por referencia a la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la invención y los Ejemplos incluidos en este documneto y a las Figuras y su descripción previa y siguiente.

Como se usa en la especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen plurales referentes a menos que el contexto lo establezca claramente de otra manera.

Los rangos pueden expresarse en este documento como de "aproximadamente" un valor particular, y/o a "aproximadamente" otro valor particular. Cuando dicho rango se expresa, otra modalidad incluye de un valor particular y/o al otro valor particular. Similarmente, cuando los valores se expresan como aproximaciones, por el uso del antecedente "alrededor" o "aproximadamente", se entenderá que el valor particular forma otra modalidad. Se entenderá además que los puntos finales de cada uno de los rangos son significativos tanto en la relación al otro punto fina e independientemente del otro punto final.

La invención proporciona una vacuna en contra del virus de anemia infecciosa en pollos (CIAV), que comprende CIAV activo trasladado en células MDCC-MSB-1 (MSB-1), en donde la vacuna no provoca la Enfermedad de Marek.

La vacuna contra CIAV de la invención no produce lesiones totales en un número significativo de embriones de pollo. La vacuna ha sido probada en embriones, y en estudios hechos, produce lesiones en menos del 10% de los embriones. Esto es en contraste a una vacuna contra CIAV diferente que se produce en embriones de pollo, y provoca lesiones significativas en los embriones.

La vacuna contra CIAV de la invención no produce tampoco anemia significativa en embriones de pollo.

La invención proporciona una vacuna contra CIAV que comprende cualquiera de las cepas reportadas (por ejemplo, cepa intervet, cepa Cux-1, cepa Texas, DRP5 (Del Ros después de 5 pasos), cepa CAV-15, etc.). Por ejemplo, la invención proporciona una vacuna contra CIAV que comprende un CIAV que tiene la secuencia de la SEC. DE ID. NO: 1. Esta es la secuencia de la cepa Del Ros. La invención también proporciona una vacuna contra CIAV que comprende cualquier cepa de CIAV que se aisla nuevamente o es una forma modificada de una cepa conocida.

Se proporciona un método para fabricar una vacuna contra CIAV, que comprende cultivar CIAV en MSB-1. Además de proporcionar un método para fabricar CIAV cultivado de MSB-1 libre del virus de la enfermedad de Marek (MDV) (ver lo siguiente y el Ejemplo 1), el método también producir CIAV a una cantidad de sustancia de al menos 108'1. Esto es una cantidad más elevada que la normalmente obtenida para este virus en las células MSB-1. Se proporcionan los detalles de este proceso en el Ejemplo 1. Se reconoce que otros métodos para cultivar CIAV en células MSB-1 pueden desarrollarse y practicarse rutinariamente.

Puede utilizarse el método para fabricar una vacuna contra CIAV con cualquiera de las cepas CIAV reportadas (por ejemplo, cepa intervet, cepa Cux-1 , cepa Texas, DRP5 (Del Ros después de 5 pasos), cepa CAV-15, etc.). Por ejemplo, el método para fabricar una vacuna contra CIAV puede usar un CIAV que tiene la secuencia de la SEC. DE ID. NO: 1. El método para fabricar una vacuna contra CIAV puede también usar cualquier cepa CIAV que se aisla recientemente o es una forma modificada de cepa conocida.

El método para realizar una vacuna contra CIAV además puede comprender la etapa de separar el CIAV cultivado de las células MSB-1 , que normalmente contiene MDV. El CIAV se segrega en el medio de cultivo, permitiendo así una variedad de etapas para separar el CIAV a partir de las células MSB-1. Por ejemplo, el método para realizar una vacuna contra CIAV puede comprender una etapa para someter el CIAV en al menos 3 ciclos de congelamiento y descongelamiento. Esto interrumpe las células e inactiva una cantidad sustancial del MDV (un patógeno intracelular obligado). Esta etapa se sigue usualmente con una etapa para mantener las células durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 37°C. Esto inactiva cualquier MDV restante. Un método adicional para fabricar el cultivo de CIAV en células MSB-1 libres de MDV puede comprender la etapa de filtrar las células MSB-1 que contienen el virus a través de un filtro de 5 mieras. El filtrado puede penetrar a través de las células debido a que son frágiles, y también remueve cualesquiera de las células intactas. Ejemplos de estos procesos para remover MDV a partir de la vacuna contra CIAV y para eliminar cualquier MDV en el cultivo de C1AV se proporcionan en el Ejemplo 1 y el Ejemplo 9. Se reconoce que otros métodos para obtener la vacuna contra CIAV a partir de células MSB-1 que está libre de MDV pueden desarrollarse y practicarse rutinariamente. Por ejemplo, también es efectivo un proceso para centrifugar las células MSB-1 infectadas con CIAV para remover células y la mayoría de los MDV, seguido por ciclos de congelamiento-descongelamiento del sobrenadante, y mantenimiento a 37°C para eliminar cualquier MDV restante. De este modo, los métodos para realizar la vacuna contra CIAV proporcionados en este documento, producen una vacuna que no provoca la enfermedad de Marek en pollos inmunizados con la vacuna.

La ¡nvención proporciona un método para inmunizar un pollo en contra de la infección de CIAV, que comprende administrar al pollo una cantidad de la vacuna contra CIAV de la invención lo suficiente para inducir una respuesta inmune a CIAV. La respuesta inmune producida es protectora en contra de la infección por CIAV. Además, la respuesta inmune producida es también protectora en contra de la enfermedad clínica provocada por la infección CIAV. Aunque en un ejemplo, la vacuna contra CIAV presente no se atenúa a pollos inmunizados (por ejemplo, embriones, polluelos y gallinas) no se enferman normalmente, debido a la resistencia reconocida de este virus.

El término "inactivado" también se referido como "muerto" significa que el virus CIAV se trata mediante cualquiera de varios medios conocidos en la técnica de manera que ya no crezcan o se reproduzcan pero que lo microorganismos aún sean capaces de provocar una respuesta inmune en el animal blanco. Los ejemplos de agentes de inactivación son: formalina, azido, libre de deshielo, sonicación, tratamiento al calor, goteo de presión repentino, detergente (especialmente detergentes no iónicos), lisozima, fenol, enzimas protectoras, propiolactona. Trimerosal (ver la Patente Norteamericana 5,338,543 Fitzgerald et al) y la etilenoimida binaria (ver la Patente Norteamericana N 5,565,205 Petersen et al).

Alternativamente, la vacuna CIAV puede atenuarse. El término "atenuado" también referido como "vida modificada" se intenta que se refiera a CIAV vivo que se ha atenuado (modificado) por cualquier número de métodos conocidos en la técnica incluyendo pero no limitados a pasaje en serie múltiple, atenuación sensible a la temperatura, mutación o los similares tales como la hebra resultante que es relativamente no patogénica a una especie aviar. La hebra viva modificada deberá ser capaz de replicación limitada en el animal vacunado y de inducir una respuesta inmune protectora que es protectora en contra de la enfermedad causada por el CIAV virulento o tipo salvaje.

El método de inmunización de la invención se extiende a la progenie de una gallina inmunizada. La respuesta inmune en la gallina produce anticuerpos en la gallina que se pasan al pollo a través del huevo. Los anticuerpos están en cantidad suficiente para protegerse contra la infección por CIAV de la progenie de gallinas inmunizadas. De este modo, la presente vacuna contra CIAV evita enfermedad clínica en la progenie de pollos inmunizados para evitar infecciones de CIAV en los polluelos de gallinas inmunizadas. La presente vacuna también puede administrarse directamente a los polluelos o embriones in ovo.

En el método de inmunización de la invención, se administra la vacuna a pollos antes del comienzo de la producción de huevos. Por ejemplo, un rango de tiempo válido para la mayoría, si no es que para todo tipo de pollos es de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 semanas de nacidos (y los días de intervención). El tiempo inferior es relevante con base al fenómeno de resistencia observado con CIAV. En polluelos de menos de 4 semanas de nacidos, aves Libres de Patógenos no Específicos (SPF) pueden usarse. Los poliuelos SPF no llevan anticuerpos maternos o anticuerpos para el virus CIAV y por lo tanto no pueden impactar negativamente cuando se exponen en una edad joven al virus de CIAV. Sin embargo, las aves no SPF o aves para asar comercialmente disponible, que llevan niveles variables de anticuerpos maternos de CIAV, pueden beneficiarse de la exposición a la vacuna CIAV ambos antes y después de 4 semanas (Ejemplos 11-13).

Específicamente, las aves que son más jóvenes de 18 días de edad pueden vacunarse con la vacuna CIAV. Estos polluelos muestran ganancia de peso mejorada, tiempo más corto para el mercado y una reducción en el número de libras de la carne de aves en demanda en la planta de procesamiento. Específicamente, la eficacia de la vacuna se midió mediante la reducción estadísticamente significante en la proporción de la censura, una viabilidad de unir el incremento estadísticamente significante y un decremento estadísticamente significante en libras de carne en demanda de las mediciones de la eficacia de las vacunas (Ejemplos 11-13). El hecho que las aves vacunadas jóvenes muestran mejora en la salud en la parvada confirma la seguridad de usar la vacuna CIAV en las aves jóvenes.

La vacuna CIAV también puede administrarse a embriones de pollo in ovo. La administración in ovo de la vacuna involucra la administración de la vacuna a los huevos. Existen numerosos métodos conocidos en la técnica para administrar una sustancia in ovo, que se describe posteriormente. Los huevos a los que se les administró la vacuna de la presente invención son huevos fértiles que de preferencia están en el cuarto cuarto de incubación. Los huevos de gallina se tratan en aproximadamente el quinceavo o décimo noveno día de incubación y más preferiblemente se tratan en el día décimo octavo o décimo noveno de incubación (el décimo octavo o décimo noveno día del desarrollo embrionario).

Los polluelos no SPF pueden vacunarse en cualquier edad dado que ellos tienen algo de resistencia con base en la presencia de anticuerpos a través de la exposición materna. De manera similar, para los tipos de pollos que desarrollan resistencia tardía, la vacuna puede administrarse exitosamente en cualquier momento después que se desarrolla la resistencia. Ya que la resistencia a la enfermedad de CIAV puede determinarse rutinariamente, por ejemplo, usando los métodos mostrados en los Ejemplos, este parámetro es rutinariamente ajustable, de manera que la invención no se limita a un límite inferior particular para inmunización.

El límite de tiempo superior es relevante con base a dos consideraciones generales: 1) la necesidad para inmunizar suficientemente de antemano en el inicio de la producción de huevos para permitir las cantidades suficientes de anticuerpos para desarrollarse en la gallina inmunizada; y 2) la necesidad para inmunizar suficientemente de antemano en el inicio de la producción de huevos para permitir la liberación del CIAV a partir de la gallina inmunizada. La edad de inicio de la producción de huevos varía entre los diferentes tipos de pollos. Así, mientras 24 semanas es el tiempo aproximado de inicio en los pollos probados, este parámetro no se limita a aquella edad particular, si no que se basa en la edad rutinariamente determinable del comienzo para una población dada de pollos.

En términos del desarrollo de cantidad suficiente de anticuerpos, esto se espera que varíe dentro de los parámetros determinables rutinariamente de pollo a pollo. Así, mientras 6 semanas antes del inicio de la producción de huevos se ha determinado que es suficiente en las cepas probadas, el marco de tiempo contemplado abarca cualquier tiempo que pueda determinarse para ser suficiente en la producción de anticuerpos, incluyendo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24 semanas (y días intermedios) en avance de la producción de huevos. Los métodos para medir las cantidades de anticuerpos y determinar la suficiencia para la inmunización protectora de la progenie son rutinarios y se proporcionan en los Ejemplos en este documento.

En términos del tiempo necesario para remover el virus antes de la producción de huevos, se espera que esto varíe dentro de los parámetros rutinariamente determinables de pollo a pollo. Para los pollos ejemplificados en este documento, se determinó que estas 12 semanas antes de la producción de huevos es suficiente para remover el virus. Debido a que este parámetro también se mide rutinariamente, el cuadro de tiempo contemplado abarca cualquier tiempo suficiente para remover el virus, incluyendo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24 semanas (y días intermedios) en avance de la producción de huevos. Los métodos para medir cantidades de virus y determinar la remoción del virus son rutinarios y se proporcionan en los Ejemplos en este documento.

También deberá observarse que los límites de tiempo superiores e inferiores para la administración de la vacuna no se basan necesariamente en el estado de producción del huevo, cantidad suficiente de anticuerpo o cantidad de anticuerpo de un pollo individual. Más bien, es el estado general del grupo (por ejemplo, población, cepa, etc.) de los pollos para inmunizarse que es relevante. De este modo, si un porcentaje suficiente de los pollos individuales dentro de un grupo se conocen o se esperan (por ejemplo, con base al conocimiento anterior del grupo) para estar en la edad apropiada para inmunización, la inmunización se considera exitosa.

La vacuna contra CIAV de la invención puede administrarse en combinación con la vacuna en contra de la enfermedad de Marek, la vacuna en contra de la enfermedad bursal infecciosa, la vacuna contra el reovirus, la vacuna en contra de la enfermedad de Newcastle, la vacuna en contra de la enfermedad de bronquitis infecciosa, la vacuna en contra del neumovirus y la vacuna en contra del virus de la influenza aviar. Dichas vacunas se conocen en la técnica. La vacunación por combinación puede estar en la forma de vacunación concurrente (o aproximadamente concurrente) con preparaciones de vacuna separadas o puede estar en la forma de una sola formulación que contiene todas las vacunas deseadas.

La vacuna contra CIAV de la invención puede administrarse usando cualesquiera de los métodos normales. Por ejemplo, un método ventajoso es administrar la vacuna bebiendo agua. Las características claves de la presente vacuna contra CIAV administrada con agua son: 1) la CIAV es apatogénica para el huésped y es suficientemente invasiva (una entrada aceptable) para inducir un nivel adecuado de anticuerpo, 2) el CIAV se demostró dispersarse, 3) el anticuerpo inducido evitará la transmisión vertical de un virus de estímulo, 4) el anticuerpo maternal se transfiere eficientemente a la progenie y es protector y 5) el anticuerpo resistirá durante un periodo de tiempo extendido. Los presentes datos, apoyan fuertemente la premisa de que el CIAV posee estas características clave.

A los animales se les puede administrar las vacunas de la presente invención mediante cualquier medio apropiado. La vacuna puede incluir portadores, espesantes, diluyentes, aglomerantes, preservativos, agentes activadores de la superficie y los similares en adición a la molécula de selección. La vacuna también puede incluir uno o más ingredientes activos tales como agentes antimicrobiales, agentes antiinflamatorios, anestésicos y los similares.

Cuando el animal a tratarse es un pájaro, el pájaro deberá ser un pájaro incubado, incluyendo una ave recién incubada (es decir, aproximadamente los primeros tres días después de la incubación), aves adolescentes y adultas. A las aves se les puede administrar la vacuna in ovo, como se describe en la Patente Americana No. 4,458,630 (la descripción de esta y todas las patentes de referencia citadas en este documento se incorporan en este documento como referencia).

A los huevos se les puede administrar la vacuna de la invención por cualquier medio que transporta el compuesto a través de la cascara. El método preferido de administración es, sin embargo, mediante inyección. El sitio de inyección de preferencia está dentro de la región definida por el amnios, incluyendo el fluido amniótico y el embrión en sí mismo, en el saco de la yema del huevo o en la célula de aire. Más preferiblemente, la inyección se hace en la región definida por el amnios. Mediante el inicio del cuarto cuarto de la incubación, el amnios es suficientemente alargado que la penetración por sí mismo se asegura cercanamente a todo el tiempo cuando la inyección se hace desde el centro del extremo alargado del huevo junto al eje longitudinal.

El mecanismo de inyección del huevo no es crítico, pero se prefiere que el método no dañe indebidamente los tejidos y los órganos del embrión o las membranas embrionarias circundándolo de manera que el tratamiento no disminuirá la proporción de incubación. Una jeringa hipodérmica ajustada con una aguja de aproximadamente un calibre de 18 a 22 es apropiada para este propósito. Para inyectar la célula de aire, la aguja solamente necesitará insertarse en el huevo por aproximadamente dos milímetros. En una aguja de una pulgada, cuando se inserta completamente desde el centro el extremo largo del huevo penetrará el cascarón, las membranas del cascarón internas y externas circundando la célula de aire y el amnios. Dependiendo del estado preciso de desarrollo y posición del embrión, una aguja de esta longitud terminará en el fluido cerca del polluelo o en el polluelo por sí mismo. Un agujero piloto puede pincharse o taladrarse a través del cascarón antes de la inserción de la aguja para prevenir el daño o embotamiento de la aguja. Si se desea, el huevo puede sellarse con un material de sello sustancialmente impermeable a las bacterias tal como cera o los similares para prevenir la entrada subsecuente de bacterias indeseables.

Se imagina que un sistema de inyección de huevos automatizado de alta velocidad para embriones aviarios será particularmente apropiado para la práctica de la presente invención. Numerosos de dichos dispositivos están disponibles, siendo ejemplarizadores aquellos descritos en la Patente Norteamericana No. 4,681 ,063, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,040,388; 4,469,047 y 4,593,646. Estos dispositivos comprenden un aparato de inyección para liberar las sustancias fluido en una pluralidad de huevos y el aparato de succión que simultáneamente acopla y levanta una pluralidad de huevos individuales de sus porciones de confrontación descendentes y coopera con los medios de inyección para inyectar los huevos mientras los huevos se acoplan por el aparato de succión.

Alternativamente, la administración puede ser tópica (incluyendo oftálmicamente, vaginalmente, rectalmente, intranasalmente), oralmente, mediante inhalación o parenteralmente, por ejemplo mediante gotas intravenosas, inyección subcutánea, intraperitoneal o intramuscular. La vacuna también puede administrarse subcutáneamente, intracavidad o transdérmicamente o mediante spray en aerosol (es decir, de cualquier membrana mucosa: nasal, faríngea, oral, ocular, intratraqueal, cloacal, etc.).

Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones no acuosas o acuosas estériles, suspensiones y emulsiones. Los ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y esteres orgánicos inyectables tal como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo medios salinos y estabilizados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, aceite de Ringer lactado o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reaprovisionamientos de nutrientes y fluidos, reaprovisionamientos de electrolitos (tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer) y los similares. Los preservativos y otros aditivos también pueden estar presentes tales como, por ejemplo antimicrobiales, anti-oxidantes, agentes de quelación y gases inertes y los similares.

Las formulaciones para la administración tópica pueden incluir ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, sprays, líquidos y polvos. Los portadores convencionales, acuosos, en polvo o bases aceitosas, espesantes y los similares pueden ser necesarios o deseables.

Las vacunas para la administración oral incluyen polvos o granulos, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, bolsitas o tabletas. Pueden ser deseables, los espesantes, saborizantes, diluyentes, emulsificadores, ácidos de dispersión o aglomerantes.

La invención proporciona un método para fabricar una vacuna en contra de CIAB en una línea celular oncogénica comprendiendo someter el virus de cultivo celular a más e un ciclo de congelación y descongelación, seguido mediante mantener las células por aproximadamente 3 días a aproximadamente 37°C, por medio de lo cual el virus de contaminación de la línea celular se muere. Existen numerosas líneas celulares oncogénicas que tienen características de crecimiento y otras caractepsticas que las hacen ventajosas para el crecimiento de CIAV. Sin embargo, debido a la existencia de algunas de estas líneas celulares de virus de contaminación (es decir, virus tumorales asociados con el tumor de la línea celular que se aisló), usándolos producen una vacuna de CIAV vivo que ha sido problemática. La invención se dirige a este problema mediante proporcionar métodos para inactivar el virus de contaminación sin matar el CIAV. Estos métodos se describen en los ejemplos y en otra parte en este documento. Además, la invención también proporciona una vacuna CIAV, comprendiendo CIAV vivo pasado en una línea celular oncogénica, en donde la vacuna no causa la enfermedad de Marek.

Los siguientes ejemplos se publican para proporcionar a aquellos expertos en la técnica con un descubrimiento y descripción completos de cómo los compuestos, composiciones, artículos, dispositivos y/o métodos reclamados en este documento se hacen evaluar, y se pretenden ser únicamente ejemplarizadores de la invención y no se pretenden limitar el alcance de la invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a números (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc), pero algunos errores y desviaciones deben ser considerados. A menos que se indique de otra manera, las partes son partes en peso, la temperatura está en °C o esta a temperatura ambiente, y la presión está a, o es casi atmosférica.

EJEMPLOS Ejemplo 1 : Etapas para fabricar la vacuna contra CIAV en células SB-1 Las células MSB-1 se mantienen en frascos congelados en nitrógeno líquido hasta que a tal tiempo necesiten expandirse en número significativo para la propagación del CIAV.

Las células MSB-1 se siembran como se describe en la literatura científica en varios recipientes de cultivo de tejido en medios RPMI-1640 suplementados con suero de ternera fetal. Se incuban las células a aproximadamente 41 °C. Estas células crecen rápidamente y pueden expandirse frecuentemente para mantener activamente el crecimiento de las células.

La vacuna se produce agregando el virus de CIAV a las células que han sido expandidas en nuevos medios de manera que la densidad celular es aproximadamente medio de 1 a 5x105 células/ml, y la entrada del virus es al menos aproximadamente medio de 1 x 105 TCID50/ml.

Las células infectadas se incuban con el virus en aproximadamente 41 °C durante 4 a 7 días. Se examinan microscópicamente las células para evidencia de muerte celular como la determinación del tiempo de cosecha.

Debe agregarse una etapa al procedimiento de cosecha de virus para asegurar la inactivación de cualquier virus de la enfermedad de Marek residual que pueda estar en las células MSB-1 que puedan estar libres de células. Un procedimiento efectivo comprobado es la filtración de las células y los medios a través de un cartucho Pall de 4.5 a 5 mieras para remover las células MSB-1 seguidas por tratamiento por temperatura del virus durante aproximadamente tres días a aproximadamente 37°C para asegurar la inactivación del virus de la enfermedad de Marek libre de células. Alternativamente, el virus puede congelarse y descongelarse tres veces para romper suficientemente las células MSB-1 para liberar e inactivar el virus de la enfermedad de Marek (un patógeno intracelular obligado). Entonces el fluido viral se somete a un tratamiento por temperatura de aproximadamente 37°C durante 3 días para asegurar la inactivación completa de cualquier virus de la enfermedad de Marek residual.

Ya que el CIAV es muy estable la vacuna puede suministrarse en una forma congelada o en forma líquida mantenida a una temperatura refrigerada de 2-7°C, o el virus puede secarse por congelamiento.

Ejemplo 2. PCR y Análisis De Restricción Preparación de la muestra de vacuna contra CIAV Intervet en células MSB-1. Debido a la incompatibilidad del tinte azul contenido en la muestra de vacuna adaptada y atenuada de embrión de pollo de CIAV Intervet (Intervet CIAV) y la prueba PCR, se pasó la muestra una vez en las células MSB-1. Se inocularon las células MSB-1 con 1 :2 y 1 :10 diluciones de virus, y se incubaron las células durante 96 horas antes de cosecharse. El medio de cultivo apareció aún azul debido al tinte en la muestra de vacuna de manera que las células se separaron a partir del sobrenadante por centrifugación y las células se lavaron dos veces con PBS. Tanto el sobrenadante como las células se almacenaron a menos 70°C.

PCR Se condujo el PCR CIAV siguiendo el protocolo of the Center for Veterinary Biologics Laboratory (CVLB) en Ames, IA en las siguientes muestras: 1) cepa CIAV, Del Ros 2) vacuna contra CIAV comercial adaptada de embrión Intervet (Intervet CIAV), no. de serie 2448003 3) células MSB-1 de paso 1 (P1) de CIAV Intervet trasladado a una dilución de 1 :2 4) Sobrenadante de P1 trasladado en una dilución de 1 :2 5) células MSB-1 de paso 1 (P1) de CIAV Intervet trasladado en una dilución 1 :10 6) Sobrenadante P1 trasladado a una dilución de 1 :10 7) células MSB-1 únicamente Los iniciadores son: 5' CTA/AGA/TCT/GCA/ACT/GCG/GA 3' y 5' CCT/TGG/AAG/CGG/ATA/GTC/AT 3' Análisis de enzima de restricción Parte del protocolo CVBL para verificar además CAV, usa el análisis de enzima de restricción con Hindlll, que establece que el producto PCR se retira una vez. Para análisis de enzima de restricción, los productos PCR se retiraron fuera del gel de agarosa y el ADN se purificó. Entonces los productos a partir de las muestras celulares se combinaron con las muestras de sobrenadante antes del corte con Hindlll. Los resultados pueden observarse en la Tabla 1.

Tabla 1. Amplificación de PCR y análisis de enzima de restricción.

Los iniciadores usados por CVBL se diseñaron para el Cuxhaven-1 aislado que amplifica una región 419pb que inicia en el nucleótido 654 y finaliza en el nucleótido 1072 de la hebra de ADN positivo genómico. Esta región traslapa 3 ORF de los cuales uno codifica para VP-1 , proteína capsida. Estos iniciadores amplifican la muestra. Sorprendentemente, la enzima de restricción que normalmente retira el producto PCR no retira esta muestra. Esto significa que la muestra es probablemente CAV debido a la amplificación de los iniciadores, pero es diferente de Del Ros (Delaware), CI-1 (Maryland), Cuxahven-1 (Alemania) y el Gifu-1 aislado (Japón). La diferencia en la secuencia de nucleótidos puede ser sólo un cambio de base en el sitio Hindlll de manera que el sitio de reconocimiento de la enzima se ha alterado. Las diferencias también pueden deberse a muchos cambios base, pero la secuenciación del ADN del producto PCR necesitaría determinar la similitud entre la cepa Del Ros y la muestra.

Ejemplo 3: Resultados de los Estudios en Aves CIAV-DR Evaluación de la patogenicidad de la cepa CIAV, Del Ros (CIAV-DR): Se usaron pollos SPF negativos de CAV, de 2 días ; 20 ¡nóculos, 10 controles negativos; 10 TCID50 de CIAV-DR en 0.2 ml; por os. Los resultados clínicos y serológicos pueden observarse en la Tabla 2.

Tabla 2. Evaluación de la Patogenicidad aSignifica valores de Hematocritos No específico Este estudio demostró que la cepa Del-Ros es de vilurencia baja debido al hecho de que tuvo poco o ningún impacto en la velocidad de crecimiento, anemia, mortalidad y lesiones totales cuando se administró a los pollos en edad más susceptible, pollos negativos al CIAV mediante una ruta natural (es decir, oral). Sin embargo, la cepa Del-Ros fue suficientemente invasiva para inducir una buena respuesta de anticuerpo (es decir, 100% de ELISA positiva; cantidades suficientes de VN que varían de 1 :256-1 :1024. Las lesiones totales observadas se restringieron a hemorragias de músculos y médula espina pálida.

Evaluación de patogenicidad de 3 cepas de CIAV; Del-Ros, CAV-9 y Texas: Se usaron pollos SPF negativos de CAV de 2 días ; 10 pollos por cepa de virus; 5 controles negativos; aproximadamente 105.7 TCID50 de virus en 0.2 ml; IA. Los resultados clínicos y serológicos pueden observarse en la Tabla 3.

Tabla 3. Evaluación de Patogenicidad *Significa valores Hematocritos Este estudio demostró que la cepa Texas de CIAV fue suficientemente virulenta para utilizarse como un virus de estímulo inoculado en los pollos susceptibles de 1 ó 2 días por una ruta parenteral (por ejemplo, intra-abdominal). Las lesiones totales observadas incluyeron: atrofia tímica, hemorragia subcutánea e intramuscular, médula espinal pálida, lóbulo de hígado congestionado y alargado y dermatitis gangrenosa.

Ejemplo 4: Estudio Llevado a cabo con Virus de la Anemia Infecciosa de Pollo, Cepa Del Ros, por Paso Posterior en Serie en Pollos SPF para Demostrar que el Virus no llega ser Virulento Se llevó a cabo un estudio de virulencia para reversión del animal huésped en el en el virus de anemia infecciosa de pollo, cepa Del Ros (CIAV-DR) por paso posterior en pollos SPF serológicamente negativos de CIAV.

La reversión potencial a vilurencia de la vacuna activa contra CIAV-DR por paso posterior serial en el animal huésped se evaluó por observaciones diarias mediante señales clínicas, las determinaciones del valor Hematocrito y los exámenes en la autopsia para lesiones totales características de CÍA.

Los pollos usados en la reversión del estudio de virulencia fueron CIAV-negativos, SPF de la raza leghorn comprados de SPAFAS, Storrs CT. Se suministraron a los pollos de tres semanas bandas para identificación y en ese tiempo todos se desangraron por serología CIAV para determinar el estado serológico de CIAV (Equipo ELISA; IDEXX CAV) de las aves. En pollos de cuatro semanas, de ocho a treinta (pasos posteriores 2-4) o veinticuatro a veintiocho (pasos posteriores 1 y 5) por pasos posteriores de virus se vacunaron con una dosis de 10 µl (1058 TCID50, 1er paso posterior; una suspensión de 20% de un homogenado de tejido común a partir del paso posterior precedente dado en una relación de 10 µl/ave, 2° a través del 5° paso posterior) a través de la ruta del tejido de las alas. Esta serie de cinco pasos posteriores ocurrió durante un periodo de ocho semanas.

El hígado, vaso y timo se removieron de ocho pollos sacrificados por paso posterior en siete días post-vacunación (DPV) para preparar una suspensión al 20% de un homogenado de tejido común (Waring Blender) en un medio RPMl 1640 conteniendo antibióticos, pero no suero y usado como la acción activa en la inoculación de los pollos para paso posterior y aislamiento del virus en células MSB-1 de acuerdo con el procedimiento de Yuasa et al. [Nati. Inst. Anim. Health Q (Tokyo) 23:75-77, 1983].

Todos los pollos de cada paso posterior se observaron diariamente para señales clínicas durante siete (pasos posteriores 2-4) o veintiún DPV y se registraron los hallazgos. Se recolectó la sangre de todos los pollos restantes en el paso posterior de uno y cinco a catorce y veintiún DPV para determinación del valor hematocrito. Los pollos sacrificados en siete y veintiún DPV se examinaron para lesiones totales caractepsticas de CÍA. Un análisis de estabilidad fenotípica se llevó a cabo en la forma de virus recuperado del quinto paso posterior en pollos cuando se compara por prueba de anticuerpo fluorescente indirecto estándar (IFA).

Los resultados obtenidos revelaron que CIAV-Dr no indujo morbilidad y mortalidad, anemia y lesiones totales características de CÍA cuando se sometieron a los cinco pasos posteriores en pollos. Adicionalmente, se demostró que el CIAV permaneció fenotípicamente estable en el proceso.

Los resultados de las muestras sanguíneas pre-experímentales del estado serológico CIAV, la recuperación de virus a partir de los hallazgos de los extractos homogenados de tejido y la autopsia y el valor hematocrito a siete, catorce y veintiún DPV para los cinco pasos posteriores se proporciona en las Tablas 4-8.

Un resumen de la recuperación del virus, valor hematocrito y resultados del examen en la autopsia se proporciona en la Tabla 9.

Esta reversión al estudio de virulencia se llevo a cabo con un CIAV-DR activo, administrado por el tejido de las alas a pollos de cuatro semanas, demostró que el virus no revirtió la virulencia cuando se sometió a cinco pasos posteriores seriales, en base a las observaciones clínicas y examenes en la autopsia.

Tabla 4. ELISA, Recuperación de Virus, Resultados hematocritos y autopsia durante el Primer Paso Posterior Serial Recuperación del Virus a partir del Homogenado de Tejido Común = Positivo *Relaciones S/N >0.6 = Negativo (Interpretación del Kiet IDEXX) ** Valor Hematocrito >25 = Negativo *** Lesiones totales Específicas Tabla 5: ELISA, Recuperación de Virus y Resultados autopsia durante el Segundo Paso Posterior serial.

Recuperación del Virus a partir del Homogenado de Tejido Común = Positivo *Relaciones S/N >0.6 = Negativo (Interpretación del Equipo IDEXX) ** Lesiones totales Específicas Tabla 6: ELISA, Recuperación del virus y Resultados autopsia durante el Tercer Paso Posterior Serial Recuperación del Virus a partir del Homogenado de Tejido Común = Positivo *Relaciones S/N >0.6 = Negativo (Interpretación del Equipo IDEXX) ** Lesiones totales Específicas Tabla 7: ELISA, Recuperación del Virus y Resultados de autopsia durante el cuarto Paso Posterior Serial.

Recuperación del Virus a partir del Homogenado de Tejido Común = Positivo *Relaciones S/N >0.6 = Negativo (Interpretación del Equipo IDEXX) ** Lesiones totales Específicas Tabla 8: Resumen de Hematocrito, Recuperación del Virus y Resultados de autopsia de Pollos.

*Número Positivo/Número en Grupo "Recuperación del Virus para un Homogenado de Tejido Común Tabla 9: ELISA, Recuperación del Virus, Resultados Hematocrito y Autopsia durante el Quinto Paso Posterior Serial.

Recuperación del Virus a partir del Homogenado de Tejido Común = Positivo *ReIación S/N >0.6 = Negativo (Interpretación del Equipo IDEXX) ** Valor Hematocrito > 25 = Negativo *** Lesiones totales Específicas Ejemplo 5: Resultados del Estudio de Transmisión Vertical y de Dispersión/Derramamiento Conducido en Pollos SPF siguiendo la Administración de Membrana del Ala de una Vacuna del Virus de Anemia de Pollo Vivo Se llevó a cabo un estudio de transmisión vertical y de dispersión/derramamiento del animal huésped en pollos con virus de anemia infecciosa (CIAV)-negativo, pollos SPF, en un virus de anemia infecciosa del pollo, de cepa Del Ros, (CIAV-DR) administrado por la ruta de la membrana del ala. Para evaluar el derramamiento y la dispersión de la vacuna viva de CIAV para los controles de contacto, los hisopos de cloaca se colectaron a partir de pollos control de contacto y vacunados durante un periodo de pos-vacunación (p.v.) de 4 semanas y se evaluaron por aislamiento de virus en células MSB-1. Para evaluar la transmisión vertical (es decir, p.v.) de vacuna activa contra CIAV, los grupos de hígados de embriones de 19 días derivados de huevos puestos por gallinas vacunadas se evaluaron por el virus mediante el aislamiento en células MSB-1 y por la detección de PCR.

Los métodos usados para determinar la transmisión vertical y dispersión/derramamiento de un nuevo virus de la semilla maestra CÍA se llevaron a cabo en pollos SPF, CIAV-negativos, vacunados a las 12 semanas. La dispersión y el derramamiento posibles de la vacuna CIAV administrada en la membrana del ala (virus activo) se evaluó recolectando hisopos de cloaca a partir de pollos de control vacunados y de contacto durante un periodo de 4 semanas p.v. seguidos por los intentos de aislamiento en células MSB-1. La posibilidad de transmisión vertical de la vacuna CIAV viva se examinó analizando los grupos de hígados de embriones de 19 días derivados de todos los huevos fértiles puestos por todas las gallinas vacunadas con el virus mediante el aislamiento en células MSB-1 y por detección de PCR. Los hígados de los embriones a partir de 3 puestas de huevos de las gallinas de control negativo se evaluaron en la misma manera.

Los pollos utilizados en el estudio de transmisión vertical y la dispersión/derramamiento fueron negativos de C1AV, de la raza leghorn SPF (aves SPF L103) compradas de SPAFAS. Se les colocaron banda a las aves para identificación. Diez pollos seleccionados aleatoriamente a 12 semanas de edad se desangraron por serología CIAV para confirmar el estado negativo (ELISA; equipo IDEXX CAV) de las aves. En el mismo día, treinta y siete pollos (30 hembras y 7 machos) se vacunaron con una dosis de 10 µl (104'3 TCID50) de la vacuna CIAV viva por la ruta del tejido de las alas. Quince hembras (misma fuente e incubación) se intermezclaron con las vacunas como controles de contacto. Los pollos de control negativo a partir de la misma fuente se mantuvieron en incubación. Los pollos de ambos grupos se observaron diariamente por morbilidad y mortalidad y se registraron los hallazgos por la duración del periodo de estudio.

Las colecciones de hisopos de cloaca a partir de los quince pollos vacunados aleatoriamente seleccionados y los quince controles de contacto se hicieron en 3-7 días de intervalos durante un periodo de 4 semanas p.v. Los hisopos de cloaca se agruparon por el reaislamiento de virus mediante combinación de los 3 grupos de 5 hisopos por tratamiento por tiempo de muestra. Se hicieron intentos de recuperación de virus en las células MSB-1 de acuerdo al procedimiento de Yuasa et al. [Nati. lnst. Anim. Health Q (Tokyo) 23:75-77, 1983].

Los hígados se recolectaron asépticamente a partir de embriones vivos y muertos (derivados de huevos fértiles puestos por gallinas vacunadas y de control negativo durante un periodo de 3 semanas p.v.) en 19 días de incubación y almacenado/empacado (-20°C). en grupos de 3-6 hígados para futuro procesamiento. Veinte por ciento (p/v) de las suspensiones de hígado (grupos) se prepararon en medio RPMl 1640 más 5% de FBS para reaislamiento del virus en células MSB-1 de acuerdo al procedimiento de Yuasa et al. [Nati. Inst. Anim. Health Q (Tokyo) 23:75-77, 1983]. Antes de iniciar el procedimiento de aislamiento CIAV en gallinas prueba, se llevo a cabo una evaluación de la sensibilidad del método de aislamiento CIAV subrayado en el "protocolo de transmisión vertical y derramamiento/dispersión". Brevemente, este procedimiento implicó cosechar hígados a partir de embriones SPF libres de anticuerpos CIAV a 19 días de incubación y preparando cuatro grupos de cinco hígados cada uno. Un grupo de hígado se mantuvo como un control negativo; los segundos, terceros y cuartos grupos se inocularon con 10, 100 y 1000 TCID50 de CIAV por gramo de tejido, respectivamente.

En adición a los ensayos de reaislamiento del virus conducido, se abordaron intentos para detectar CIAV por PCR de acuerdo al procedimiento de Taylor and Ryncarz (Center for Veterinary Biologics Laboratory, NVSL, VS, APHIS, USDA, Ames, IA).

Los resultados revelaron que 104,3 TCID50 del CIAV-DR administrado a reproductores a 12 semanas a través de la membrana del ala se derrama tanto como 21 días y que se dispersará para controles de contacto. Sin embargo, el virus no se transmitió verticalmente por reproductores en su progenie como se demuestra por el reaislamiento del virus y el análisis de PCR. Los reproductores no mostraron ningún efecto clínico adverso a partir de la administración de la vacuna.

Los resultados de ELISA en muestras sanguíneas pre-experimentales confirmaron que los pollos utilizados en este estudio fueron negativos a los anticuerpos CIAV (Tabla 10).

Los resultados de los intentos de reaislamiento del virus en grupos de hisopo cloacal de vacunas y controles de contacto se registran en la Tabla 2. Estos datos muestran que CIAV estuvo siendo derramado por vacunas tan pronto como 3 días p.v. y este derrame continuó hasta 21 días p.v., pero no 28 días p.v. Adicionalmente, los datos muestran que el derrame de CIAV fácilmente dispersó los controles de contacto quienes también derramaron el virus durante un periodo de tiempo similar.

Un resumen del reaislamiento del virus e intentos de detección PCR en suspensiones de hígado de embrión derivadas de los huevos fértiles de vacunas y controles negativos se dan en la Tabla 3. Estos datos revelan que el CIAV no podría aislarse a partir de las suspensiones del hígado de embriones de controles y vacunas negativas por paso en células MSB-1 o detectarse por PCR. Los resultados de la evaluación de la sensibilidad de aislamiento de CIAV en células MSB-1 demostró que los niveles variantes de CIAV (es decir, 10-1000 TCID50/gramos de tejido) se detectó por este método siguiendo varios pasos de cultivo celular (Tabla 4). Hubo correlación completa en los resultados obtenidos usando estos dos métodos en las muestras de prueba.

Este estudio de transmisión vertical y dispersión/derramamiento se basó en un esfuerzo para aislar y/o detectar CIAV activo en hisopos de cloaca y huevos fértiles (es decir, suspensiones de hígado de embrión) colectadas a partir de los tejidos de ala vacunado (104'3 TCID50/dosis) y gallinas de control negativas. Los resultados demuestran que el virus se derramó y dispersó durante un periodo de tiempo limitado (21 dpv) pero que ese virus no se transmitió verticalmente cuando se administró a 12 semanas.

Tabla 10: Resultados ELISA de la Muestra Sanguínea Pre-Experimental Negativo = Proporción S/N > 0.6 (Interpretación del Equipo IDEXX) Tabla 11: Dispersión/Derramamiento: Resumen del Reaislamiento del Virus a partir de Grupos de Hisopo Cloacal de Pollos Control de Contacto y Vacunados. aRecolección de Hisopo Cloacal (Días Pos Vacunación). bNegativo cPositivo = Característica CIAV CPOE Observadas Tabla 12: Transmisión Vertical: Resumen del Reaislamiento del Virus y Ensayos de Detección PCR en Suspensiones de Hígado de Embrión Derivadas de los Huevos Fértiles de Vacunas y Controles Negativos. aControles Negativos SPAFAS bNúmero Positivo/Total Probado °Vacunas - cuatro grupos (2a-2d) "Controles Positivos (MSB-1 Cepas Del-Ros y Texas Propagadas de CIAV) eControles Negativos (células MSB-1 y/o Mezcla Reactiva) Tabla 13: Resultados de Evaluación de Sensibilidad de Aislamiento CIAV aTCID50/Gramo de Tejido bNúmero Positivo (Característica de CIAV CPE Observada)/Total cControles No infectados Ejemplo 6: Estudio de Eficacia Conducido en la Progenie de Pollos SPF34 y 49 Semanas Siguiendo la Administración en la Membrana del Ala de una Vacuna contra Virus de Anemia de Pollo Vivo Un estudio para evaluar la eficacia y duración de la vacuna de inmunidad (DOl) a 34 y 49 semanas pos-vacunación de la membrana del ala se llevó a cabo por progenie de estímulo de un día de gallinas vacunadas con un virus de anemia infecciosa de pollo, cepa Del Ros (CIAV-DR). El estudio evaluó la protección del anticuerpo maternal CIAV (inmunidad pasiva) proporcionada a polluelos contra un estímulo con CIAV virulento.

La eficacia y duración de la inmunidad de los estudios que se llevaron a cabo en la progenie de pollos SPF, negativos de CIAV, del membrana dos a 9 semanas con vacuna CIAV administrada a través de la ruta del tejido de las alas. La duración de la inmunidad se evaluó estimulando la progenie, empollada a partir de huevos fértiles puestos por gallinas a las 34 y 49 semanas pos-vacunación, seguido por observaciones para señales clínicas, determinaciones de valor Hematocrito y exámenes de autopsia durante las lesiones totales caractepsticas de CÍA.

Los pollos usados en este estudio fueron CIAV-negativos, de la raza leghorn SPF adquiridos de SPAFAS. A las aves se les colocó una banda en las alas para identificación. Diez pollos seleccionados aleatoriamente de 9 semanas se sangraron por serología CIAV para confirmar el estado serológico negativo (ELISA, Equipo IDEXX CAV) de las aves. En el mismo día, 70 pollos (60 hembras y 10 machos) se vacunaron con una dosis de 10 µl (104'2 TCID50) de la vacuna CIAV viva por la ruta del tejido de las alas. Se mantuvieron los pollos de control negativos a partir de la misma fuente y empollando. La dosis se determinó como el promedio de cantidades suficientes de 5 replicados conducidos inmediatamente después de la vacunación. Los pollos de ambos grupos se observaron diariamente para morbilidad y mortalidad y se registraron los hallazgos durante la duración del periodo de estudio.

Una recolección de una semana de huevos a partir de 52 gallinas vacunadas (43 semanas) se usaron para evaluar la progenie de reproductores a 34 semanas pos-vacunación CIAV (DOl Prueba 2). Una segunda semana de recolección de huevos de 48 gallinas vacunadas (58 semanas para evaluar la progenie de reproductores a 49 semanas pos-vacunación CIAV (DOl Prueba 3).

Polluelos de cuarenta días, cada uno a partir de reproductores vacunados y sin Vacunar contra CIAV se estimularon con el extracto de homogenado de hígado derivado de polluelos inoculados con un aislado de campo Texas de CIAV. Cada polluelo se inoculó intra-abdominalmente con aproximadamente 1026 CID50 por 0.2 ml. Los grupos de control negativos consistieron de 25 polluelos.

Los polluelos de todos los grupos de tratamiento se mantuvieron en aisladores de presión negativa, de aire filtrado por separado, y se observaron diariamente por depresión, plumas enredadas y mortalidad. Se recolectaron muestras sanguíneas a partir de todos los polluelos en 14 y 21-22 días de la pos-estimulación para determinaciones del valor hematocrito como una medición de anemia. El procedimiento usado para determinar los valores hematocritos fue aquel de Rosenberger and Cloud (Avian Dis. 33:753-759, 1989). Adicionalmente, los polluelos de todos los grupos de tratamiento se examinaron por lesiones totales características de CÍA (es decir, médula ósea pálida, edema y decoloración del hígado y bazo y lesiones hemorrágicas en la piel y los músculos) en 21-22 días posestimulación. Las comparaciones de tratamiento se basaron en el número de individuos dentro de un tratamiento (por examinado total) exhibiendo lesiones totales específicas de CÍA.

Los resultados de las dos pruebas de estímulo DOT, reportadas en este documento, demuestran que 104'2 TCID50 de virus administrado a los reproductores a 9 semanas de edad a través de la membrana del ala protegen a la progenie en contra de la morbilidad y mortalidad, anemia y lesiones totales características de CÍA a través de 49 semanas pos vacunación como se determinó por la evaluación estadística.

Se encontraron los resultados ELISA de la muestra sanguínea del pre-estudio para confirmar el estado negativo de CIAV de los pollos semi-maduros adquiridos a partir de SPAFAS para el uso en este estudio y los cuales se presentan en la tabla 14.

Los resultados de las determinaciones de valor hematocrito, los hallazgos de signos clínicos y exámenes de autopsia de polluelos de un día estimulados y no estimulados con CIAV se registraron en las tablas 15, 16 y 17 (Prueba 2 DOl) y 20, 21 y 22 (Prueba 3 DOl); las tablas 18 y 23, respectivamente, resumen esta información. Los polluelos con lesiones totales clasifican > 1 , para cualquiera de los tejidos examinados (es decir, hígado, músculo, médula ósea y timo), se registraron como CÍA positivo (tablas 18 y 23). La muerte de los polluelos (tabla 15; derivada de reproductores vacunados contra CIAV) numerados 3, 8, 22, 26, 27 y 40 en prueba 2 DOl resultaron de sofocación en un guante protector. Las evaluaciones estadísticas (prueba de Probabilidad Exacta Fisher; tablas 19 y 24) de valores hematocritos y señales clínicas de los polluelos de Prueba 2 y 3 revelaron que la progenie de CIAV reproductores vacunados contra CIAV sin vacunar se protegieron contra anemia y mortalidad en un nivel estadísticamente significativo (p O.001 ) cuando se estimularon con un aislamiento de campo virulento de CIAV. Una diferencia estadísticamente significativa (p = 0.027) en morbilidad se demostró entre la progenie estimulada en la Prueba 3 DOl. La evaluación estadística (Prueba Mann-Whitney; tablas 20 y 25) de los resultados de lesión total revelaron hallazgos similares como aquellos reportados anteriormente, es decir, una diferencia estadísticamente significante y en la médula espinal (p <0.001 y p = 0.021, respectivamente) y timo (p <0.001) resultados de lesión total de progenie derivada de reproductores vacunados y sin vacunar. No se demostraron diferencias significativas para lesiones de hígado y músculo entre la progenie estimulada.

Esta evaluación de la eficiencia de la vacuna y la duración de inmunidad se basó en un estímulo intra abdominal de un día de la progenie derivada de los reproductores vacunados a 9 semanas con vacuna CIAV-DR de hígado administrada por la ruta de la membrana del ala. Los resultados revelaron que la vacuna de CIAV indujo anticuerpos maternales que protegieron a los polluelos en una diferencia estadísticamente significativa de p <0.05, contra un estímulo virulento con una cepa de campo de CIAV, basada en la evidencia de la anemia en 14 y 21 días pos-estímulo, señales clínicas y lesiones totales de la médula espinal y timo cuando se comparan a los pollos de control de estímulo.

Tabla 14: Resultados ELISA de Muestra Sanguínea Pre-Experimental de Pollos de 9 Semanas de Edad Antes de la Vacunación con CIAV Administrada en la Membrana del ala para Confirmar el Estado Serológico Negativo Ave No. Banda No. Relación S/N CIAV Estado Serológico3 1 602 0.88 Negb 2 608 0.84 Neg 3 616 0.9 Neg 4 620 0.81 Neg 5 621 0.78 Neg 6 627 0.85 Neg 7 631 0.87 Neg 8 634 0.82 Neg 9 644 0.85 Neg 10 661 0.7 Neg aEstado Serológico de CIAV "Negativo = Relaciones S/N >0.6 (Interpretación de Equipo IDEXX) Tabla 15: Valores Hematocritos de la Prueba 2, Señales Clínicas y Resultados de Lesión Total CÍA de Polluelos Estimulados en las 34 semanas Después de la Vacuna CÍA Administrada a la Membrana del ala. - Valores Hematocritos Señales Clínicas3 Resultado de Les ion Total Ave No. 14 Días 21 Días Mor./ ort.c Hipado BMd Timo Músculo pe 1 28 35 N/N Oe 0 0 0 2 33 32 N/N 0 0 0 0 3 35 NDf N NCAM£ 0 0 0 0 4 32 39 N/N 0 0 0 0 5 32 34 N/N 0 0 0 0 6 26 27 N/N 0 0 0 0 7 28 32 N/N 0 0 0 0 8 32 ND N NCAM 0 0 0 0 9 32 33 N/N 0 0 0 0 10 32 24" N/N 0 2 1 1 1 1 26 12 P/N¡ 0 2 2 0 12 33 26 N/N 0 2 2 0 13 27 31 N/N 0 0 0 0 14 32 35 N/N 0 0 0 0 15 33 32 N/N 0 0 0 0 16 60 39 N/N 0 0 0 0 17 58 37 N/N 0 0 0 0 18 30 24 N/N 0 1 2 0 19 33 34 N/N 0 0 0 0 20 21 17 N N0 0 3 2 0 21 58 35 N/N 0 0 0 0 22 32 ND N/NCAM 0 0 0 0 23 33 37 N/N 0 2 1 0 24 34 36 N/N 0 0 0 0 25 29 33 N/N 0 0 0 0 Continúa en la siguiente página Tabla 15. (continuación) Valores Hematocrítos de Prueba 2, Señales Clínicas y Resultados de Lesión Total de CÍA de Pollos Estimulados a 34 Semanas Después de la Vacuna CÍA Administrada en la Membrana del ala.

Valores Hematocritos Señales Clínicas9 Resultado de Lesión Total Ave No. 14 Días 21 Días Mor./Mort.c Hígado BMd Timo Músculo B¿ pe 26 30 NDf N/NCAMe O' 0 0 0 27 34 ND N/NCAM 0 0 0 0 28 35 32 N/N 0 0 0 0 29 35 27 N/N 0 0 0 0 30 28 23h N/N 0 1 2 0 31 30 31 N/N 0 0 0 0 32 ND ND N P¡ 0 0 0 0 33 33 35 N/N 0 0 0 0 34 34 41 N/N 0 0 0 0 35 27 36 N/N 0 0 0 0 36 32 34 N/N 0 0 0 0 37 30 21 N/N 0 0 0 0 38 33 36 N/N 0 0 0 0 39 31 34 N/N 0 0 0 0 40 30 ND N/NCAM 0 0 0 0 Pos./Tot.j 1/39 6/33 1/40 / 1/34 0/40 7/40 7/40 1/40 Señales Clínicas bPost Estímulo "Morbilidad (Depresión y/o Plumas Enredadas)/Mortalidad "Médula Espinal e0 = Normal; 1 = Ligera; 2 = Moderado; 3 = Intenso No hecho fNo Hecha "Mortalidad Asociada Negativa/Sin CIAV Valores Hematocritos de <25 = Anemia 'Negativo/Positivo (Mortalidad Asociada con CIAV) JNúmero Positivo/Total Tabla 16: Valores Hematocritos de la Prueba 2, Señales Clínicas y Resultados de Lesión Total CÍA de Polluelos Estimulados a partir de Reproductores Sin Vacunar.

Valores Hematocritos Señales Clínicas" Resultado de Lesión Total Ave No. 14 Días 21 Días Mon/ ort." Hígado BMd Timo Músculo Day pe 1 23e NDr N/Pg oh 2 3 1 2 18 ND N/P 0 2 2 0 3 29 22 N/N 0 0 0 0 4 26 20 P/N 0 0 3 0 5 20 ND N/P 0 3 2 1 6 28 26 N/N 0 0- 0 0 7 21 57 N/N 0 0 3 0 8 20 ND N/P 0 3 3 0 9 21 21 N/N 0 2 2 0 10 18 ND N/P 0 3 3 2 11 32 24 N/N 0 2 1 0 12 21 ND N/P 0 3 3 1 13 26 24 N/N 0 0 0 0 14 25 19 N/N 0 0 1 0 15 25 45 N/N 0 2 1 0 16 28 30 N/N 0 2 3 0 17 27 10 P/N 0 3 3 0 18 16 ND P/P 0 2 2 0 19 22 25 N/N 0 0 0 0 20 18 24 N/N 0 0 2 2 21 20 ND N/P 0 3 2 1 22 28 20 N/N 0 1 3 0 23 26 15 P/N 0 2 1 0 24 22 28 N/N 0 0 0 0 25 17 ND P/P 2 3 3 2 Continúa en la siguiente página Tabla 16: (continuación) Valores Hematocritos de la Prueba 2, Señales Clínicas y Resultados de Lesión Total CÍA de Polluelos Estimulados a partir de Reproductores Sin Vacunar.

Valores Hematocritos Señales Clínicas3 Resultado de Lesión Total Ave No. 14 Días 21 Días Mor./Mort.c Hígado BMd Timo Músculo pe 1 26 24e 30 N/N Oh 0 2 0 27 40 56 N N 0 2 2 0 28 30 15 N/N 0 2 "2 0 29 29 29 • N/N 0 0 .0 0 30 : 31 27 N/N 0 1 .2 0 31 25 32 N/N 0 1 2 0 32 25 13 P/N 0 3 3 0 33 21 27 N/N 0 0 0 0 34 28 21 N/N 0 2 2 0 35 30 28 N/N 0 0 ,0 0 36 30 NDf N/Pe 0 3 '3 1 37 28 23 N/N 0 0 O 0 38 70 13 N/N 0 2 1 0 39 23 25 N/N 0 0 1 0 40 25 27 N/N 0 - 0 0 0 Pos/To..1 _ 22/40 17/30 6/40/ 10/40 1/40 24/40 30/40 8/40 aSeñales Clínicas Post Estímulo °Morb¡Iidad (Depresión y/o Plumas Enredadas)/Mortalldad dMédula Espinal eValores Hematocritos < 25 = Anemia fNinguno 9Negativo/Positivo (Mortalidad Asociada con CIAV) h0 = Normal; 1 = Ligero; 2 = Moderado; 3 = Intenso 'Número Positivo/Total Tabla 17: Valores Hematocritos de la Prueba 2, Señales Clínicas y Resultados de Lesión Total CÍA de Polluelos a partir de Reproductores Sin Vacunar; No estimulados. Valores Hematocritos Señales Clínicas3 Resultado de Lesión Total Ave No. 14 Días 21 Días Mor./Mort.c Hígado BM° Timo Músculo pe 1 37 38 N/Nc 0f 0 0 0 2 38 35 N/N 0 0 0 0 3 35 30 N/N 0 0 0 0 4 40 35 N/N 0 0 0 0 5 36 37 N/N 0 0 0 0 6 38 36 N/N 0 0 0 0 7 35 36 N/N 0 0 0 0 8 28 38 N/N 0 0 0 0 9 NSE 35 N/N 0 0 0 0 10 31 NS N/N 0 0 0 0 11 36 36 N/N 0 0 0 0 12 37 35 N/N 0 0 0 0 13 36 33 N/N 0 0 0 0 14 31 42 N/N 0 0 0 0 15 39 40 N/N 0 0 0 0 16 35 37 N/N 0 0 0 0 17 40 36 N/N 0 0 0 0 18 35 33 N/N 0 0 0 0 19 32 35 N/N 0 0 0 0 20 33 35 N/N 0 0 0 0 21 30 45 N/N 0 0 0 0 22 39 39 N/N 0 0 0 0 Tabla 17 continua en la próxima página Valor es Hemat ocntos Señales Clínicas Resultado de Lesión Total Ave No. 14 Días 21 Días Mor./Mort.<= Hígado BM' 1 Timo Músculo B¿ pe 23 34 40 N/N 0 0 0 0 24 33 38 N/N : 0 0 Ó 0 25 35 27 N/N 0 0 0 0 Pos./Tot.h 0/24 0/24 0/25 /0/25 0/25 0/25 0/25 0/25 aSeñaIes Clínicas b P? ost Estímulo cMorbilidad (Depresión y/o Plumas Enredadas)/Mortalidad dMédula Espinal eNegativo /Negativo f0 = Normal; 1 = Ligero; 2 = Moderado; 3 = Intenso 9Sin muestra hNúmero Positivo/Total Tabla 18: Resumen de la Morbilidad, Mortalidad Hematocrítica de la Prueba 2 y Resultados de lesión total CÍA de Polluelos Estimulados y no Estimulados. Grupo de Prueba Hematocrito Morbilidad Mortalidad PMJ CIAV Vacunado0 6/39 (15%)° 1/40 (3%) 1/34 (3%) 7/40 (18%)° Sin Vacunar0 33/40 (83%) 6/40 (15%) 10/40 (25%) 30/40 (75%) Control Negativo 0/25 0/25 0/25 0/25 aResultados de lesión total CÍA Autopsia °Grupo de Estímulo cNúmero Positivo de Polluelos/Total dPolIuelos Positivos = Resultados de lesión total > 1 Tabla 19: Evaluación Estadística de los Valores Hematocritos de la Prueba 2 y Señales Clínicas de CÍA de Polluelos Estimulados Utilizando Prueba de Probabilidad Exacta de Fisher Valores Hematocritos Señales Clínicas Grupo de Prueba 14 Días oca 21 días pe Morbilidad Mortalidad Combinado CIAV Vacunado 1/39 6/33 1/40 1/34 6/40° No Vacunado 22/40 17/30 6/40 10/40 34/40 Valor p O.001 0.002 0.054 0.007 <0.001 'Post Estímulo Valores Hematocritos Combinados y Señales Clínicas Tabla 20. Evaluación Estadística de las Resultados de Lesión Total de CÍA de la Prueba 2 de Polluelos Estimulados a partir de Reproductores Vacunados y Sin Vacunar utilizando la Prueba de Mann-Whitney.

Resultados de lesión total3 Hígado BM° Timo Músculo Combinado0 Valor p 0.847 O.001 <0.001 0.173 O.001 aDatos naturales Encontrados en las Tablas 2 y 3 bMédula Espinal cResultados de Lesión Total Combinada Tabla 21: Valores Hematocritos de la Prueba 3, Señales Clínicas y Resultados de Lesión Total de CÍA de Polluelos Estimulados a 49 Semanas después de la Vacuna de CÍA Administrada en la Membrana del Ala.

Valores Hematocritos Señales Clínicas a Resultado de Lesión Total Ave No. 14 Días 21 Días Mor./Mort.c Híqa o BMd Timo Músculo 1 31 45 N/N' or 0 0 0 2 30 32 N/N 0 0 0 0 3 34 34 N/N 0 0 0 0 4 28 28 N/N 0 0 0 0 5 33 23g N/N 0 0 0 0 6 32 30 N/N 0 0 0 0 7 24 36 N/N 0 0 0 0 8 49 32 N/N 0 0 0 0 9 35 30 N/N 0 0 0 0 10 31 31 N/N 0 0 0 0 11 34 27 N/N 0 0 0 0 12 33 35 N/N 0 0 0 0 13 43 27 N/N 0 0 0 0 14 41 33 N/N 0 0 0 0 15 25 30 N/N 0 0 0 0 16 35 31 N/N 0 0 0 0 17 30 32 N/N 0 0 0 0 18 32 35 N/N 0 0 0 0 19 30 33 N/N 0 0 0 0 20 32 28 N/N 0 0 0 0 21 33 32 N/N 0 0 0 0 22 34 33 N/N 0 0 0 0 23 29 30 N/N 0 0 0 0 24 30 27 N/N 0 0 2 0 25 29 30 N/N 0 0 0 0 Continúa en la siguiente página Tabla 21: (continuación) Valores Hematocritos de la Prueba 3, Señales Clínicas y Resultados de Lesión Total de CÍA de Polluelos Estimulados a 49 Semanas Después de la Vacuna de CÍA Administrada en la Membrana del ala.

Valores Hematocritos Señales Clínicas" Resultado de Lesión Total Ave No. 14 Días 21 Días Mor./Mort.c Hígado BMd Timo Músculo 26 30 28 N/W 0r 0 0 0 27 52 30 N/N 0 0 0 0 28 35 35 N/N 0 0 0 0 29 30 27 N/N 0 0 0 0 30 50 26 N/N 0 0 1 0 31 35 31 N/N 0 0 0 0 32 35 34 N/N 0 0 0 0 33 20s 30 N/N 0 0 0 0 34 31 30 N/N 0 0 0 0 35 32 28 N/N 0 0 0 0 36 30 37 N/N 0 0 0 0 37 35 38 N/N 0 0 0 0 38 34 32 N/N 0 0 0 0 39 35 30 N/N 0 0 0 0 40 31 32 N/N Pos./Tot.h 3/40 1/40 0/40/0/40 0/40 0/40 2/40 0/40 aSeñales Clínicas °Post Estímulo °Morbilidad (Depresión y/o Plumas Enredadas )/Mortalidad dMédula Espinal eNegativo/Negativo f0 = Normal; 1 = Ligero; 2 = Moderado; 3 = Intenso 9Valores Hematocritos de < 25 = Anemia hNúmero Positivo/Total Tabla 22: Valores Hematocritos de la Prueba 3, Señales Clínicas y Resultados de Lesión Total de CÍA de Polluelos Estimulados a partir de Criadores Sin Vacunar. Valores Hematocritos Señales Clínicas3 Resultado de Lesión Total Ave No. 14 Días 21 Días Mor./Mort.c Hígado BMd Timo Músculo 1 19e ND( N/Pe 2h 2 3 2 2 22 32 N/N 0 0 0 0 3 50 ND P/P 0 0 3 0 4 32 28 N/N 0 0 2 0 5 31 27 N/N 0 2 0 0 6 32 29 N/N 0 0 0 0 7 26 19 N/N 0 0 2 0 8 30 27 N/N 0 0 0 0 9 23 ND P/P 0 2 2 0 10 17 29 N/N 0 0 0 0 11 23 35 N/N 0 0 0 0 12 20 ND N/P 0 3 3 0 13 18 ND P/P 0 0 2 0 14 22 ND N/P 0 2 3 1 15 44 13 N/N 0 2 2 0 16 30 32 N/N 0 0 1 0 17 14 ND N/P 0 0 3 0 18 31 26 N/N 0 0 1 0 19 20 ND N/P 0 2 3 0 20 23 10 N/N 0 2 2 0 21 33 20 N/N 0 0 2 0 22 23 ND P/P 0 0 3 0 23 22 ND N/P 0 0 3 0 24 29 27 N/N 0 2 2 0 25 30 15 N/N 0 0 1 0 Continúa en la siguiente página Tabla 22: (continuación) Los valores Hematocritos de la Prueba 3, Señales Clínicas y Resultados de lesión total de CÍA de Polluelos Estimulados a partir de Reproductores Sin Vacunar.

Valores Hematocritos Señales Clínicas9 Resultado de Lesión Total Ave No. 14 Días 21 Días Mor./Mort.c Hígado BM Timo Músculo 26 29 35 N/IN 0h 0 0 0 27. 24e 33 Ñ/N 0 0 0 0: 28 27 20 N/N 0 0 0 0 29 32 19 NVN 0 2 1 0 30 25 NDf P/P 2 0 3 1 31 22 18 N/N 0 1 2 0 32 33 34 N/N 0' 0 0 0 33 23 ND N/Ps 0 2 3 0 34 25 35 N/N 0 0: 0; 0 35 I6 ND N/P 0 o' 3 0 36 28 15 N/N 0 0 0 0 37 29 25 N/N 0 0 0 0 38 30 32 N/N 0 0 0 o- 39 29 25 N/N 0 0 2 o' 40 3'1 23 N7N 0 0 0 0 I Pos/Toe' 19/40 12/27 5/4013/40 2/40 12/40 25/40 3/40 aSeñales Clínicas °Post Estímulo cMorbilidad (Depresión y/o Plumas Enredadas)/Mortalidad dMédula Espinal Valores Hematocritos < 25 = Anemia fNo hecho gNegativo/Positivo (Mortalidad Asociada con CIAV) h0 = Normal; 1 = Ligera; 2 = Moderada; 3= Intensa 'Número Positivo/Total Tabla 22: Valores Hematocritos de la Prueba 3, Señales Clínicas y Resultados de lesión total de Cia de Polluelos a partir de Reproductores Sin Vacunar, No Estimulados. Valores Hematocritos Señales Clínicas3 Resultado de Lesión Total Ave No. 14 Días 21 Días Mor./Mort.c Hígado BM" Timo Músculo 1 35 34 N/Ne Of 0 0 0 2 39 35 N N 0 0 0 0 3 33 34 N/N 0 0 0 0 4 37 35 N/N 0 0 0 0 5 38 33 N/N 0 0 0 0 6 32 35 N/N 0 0 0 0 7 35 37 N/N 0 0 0 0 8 29 39 N/N 0 0 0 0 9 35 36 N/N 0 0 0 0 10 32 37 N/N 0 0 0 0 11 33 38 N/N 0 0 0 0 12 33 34 N/N 0 0 0 0 13 31 35 N/N 0 0 0 0 14 30 35 N/N 0 0 0 0 15 36 40 N/N 0 0 0 0 16 30 39 N/N 0 0 0 0 17 30 38 N/N 0 0 0 0 18 30 36 N/N 0 0 0 0 19 40 35 N/N 0 0 0 0 20 35 35 N/N 0 0 0 0 21 35 35 N/N 0 0 0 0 22 35 33 N/N 0 0 0 0 23 34 41 N/N 0 0 0 0 24 28 41 N/N 0 0 0 0 25 32 38 N/N 0 0 0 0 Pos.Toc* 0/25 0/25 0/25 / 0/25 0/25 0/25 0/25 0/25 aSeñales Clínicas bPost Estimulación °Morbilidad (Depresión y/o Plumas Enredadas)/MortaIldad dMédula Espinal eNegativa/Negativa f0 = Normal; 1 = Ligera; 2 = Moderada; 3 = Severa 9Número Positivo/Total Tabla 23: Resumen del Hematocrito de la Prueba 3, Morbilidad, Mortalidad y Lesión Total de Polluelos Estimulados y No Estimulados.

Grupo de Prueba Hermatocrito Morbilidad Mortalidad PMa CIAV Vacunado" 4/40 (10%)c 0/40 0/40 2/40 (5%)" Sin Vacunar 29/40 (73%) 5/40 (13%) 13/40 (33%) 26/40 (65%) Control Negativo 0/25 0/25 0/25 0/25 aResultados de Lesión Total de CÍA de Autopsia °Grupo Estimulado °Número Positivo/Total dPolluelos Positivos = Resultados de lesión total > 1 Tabla 24: Evaluación Estadística de Valores Hematocritos de la Prueba 3 y Señales Clínicas de Polluelos Estimulados utilizando Prueba de la Probabilidad Exacta Fisher Valores Hematocritos Señales Clínicas Grupo de Prueba 14 Días pca 21 Días pe Morbilidad Mortalidad Combinado CIAV Vacunado 3/40 1/40 0/40 0/40 4/40" Sin Vacunar 19/40 12/27 5/40 13/40 30/40 Valor positivo <0.001 <0.001 0.027 <0.001 <0.001 Pos Estímulo Valores Hematocritos Combinados y Señales Clínicas Tabla 25: Evaluación Estadística de los Resultados de Lesión Total de CÍA de la Prueba 3 de Polluelos Estimulados a partir de Reproductores Vacunados y Sin Vacunar utilizando la Prueba Mann-Whitney Resultados de lesión total Hígado BBMM°° TTiimmo Músculo Combinado0 Valor p 07 0.021 <0.001 0.5637 <0.001 Datos Naturales Encontrados en las Tablas 8 y 9 "Médula Espinal °Resultados de Lesión Total Combinada Ejemplo 7: Eficacia de una Vacuna contra el Virus de Anemia de Pollo Evaluada por Protección de Anticuerpo Materno de Progenie a Partir de Pollos de 27 y 37 Semanas Después de la Administración de la Vacuna con Agua Estudios de duración de inmunidad y eficacia en el animal huésped se llevaron a cabo en pollos estimulados por progenie de un día a partir de gallinas de 27 y 37 semanas, que se vacunaron previamente con vacuna contra virus de anemia infecciosa de pollo, cepa Del Ros (CIAV-DR) a 9 semanas por consumo de agua. El procedimiento de estímulo y progenie y parámetros de medida de eficacia por protección de anticuerpo materno (inmunidad pasiva) proporcionada por gallinas vacunadas en la toma de agua fueron las mismas como para vacuna de virus de anemia de pollo administrada por la ruta de la membrana del ala (véase Ejemplo 6).

La progenie se incubó a partir de huevos fértiles puestos en las 18 y 28 semanas pos-vacunación cuando las gallinas tuvieron 27 y 37 semanas, respectivamente. El estímulo intra-abdominal de la progenie de un día se utilizó para evaluar la protección del anticuerpo materno proporcionado por CIAV-DR después de la vacunación por toma de agua de pollos SPF de negativos a CIAV de 9 semanas. Las observaciones pos-estímulo de progenie a través de 21 días incluyen señales clínicas, determinaciones de valor hematocrito y exámenes de autopsia durante las lesiones totales características de anemia infecciosa de pollo (CÍA).

Los pollos usados para vacunación en este estudio fueron de la raza leghorn SPF, negativo a CIAV, adquiridos de SPAFAS, Inc. A las aves se les colocó una banda en las alas para identificación a su llegada. Veinte pollos aleatoriamente seleccionados de 9 semanas se sangraron para serología de CIAV para confirmar el estado de serología negativo utilizando el Equipo IDEXX ELISA CIAV. En el mismo día, 40 hembras y 5 machos designados como vacunados sedientos se les permitió tomar agua que contiene vacuna CIAV-DR. El promedio de cinco cantidades de replicado de la vacuna CIAV conducido después de la vacunación en células MSB-1 determinó una dosis que contiene 1055 TCID50. Los polluelos del reproductor de control negativo a partir de la misma fuente y fecha de incubado se mantuvieron. Dos estudios de eficacia/duración de inmunidad identificados como Estudio 1 y Estudio 2 se condujeron en la progenie a partir de gallinas de 27 y 37 semanas, respectivamente.

Los polluelos se estimularon en el día uno con CIAV. El virus estimulado fue extracto homogenado de hígado derivado de polluelos inoculados con un aislado de campo Texas de CIAV. Cada polluelo se inoculó intra-abdominalmente con aproximadamente 102'6 CID50 por 0.2 ml.

Cada estudio consiste de un grupo de progenie de gallinas no vacunadas mantenidas como controles negativos no estimulados, un grupo de progenie estimulado con CIAV a partir de gallinas no vacunadas que sirven como controles positivos, y un grupo de progenie estimulada con CIAV a partir de gallinas vacunadas. Los polluelos de todos los grupos de tratamiento se mantuvieron en aire filtrado, unidades de aislamiento de presión negativa y se observaron 21 días para depresión, plumas enredadas y mortalidad. Se recolectaron muestras sanguíneas a partir de todos los polluelos en 14 y 21 días después del estímulo (dpc) para determinaciones de valor hematocrito como una medida de anemia. El procedimiento usado para determinar valores hematocritos fue aquel de Rosenberger and Cloud (Avian Dis. 33:753-759, 1989). Un polluelo con un valor hematocrito de <25 se consideró estar anémico. Adicionalmente, los polluelos de todos los tratamientos se examinaron a 21 dpc para lesiones totales características de CÍA incluyendo médula espinal pálida, expansión y decoloración del hígado y bazo, y lesiones de hemorragia en la piel y músculos. Se basaron las comparaciones del tratamiento en el número de Individuos dentro de un tratamiento (por examinado total) exhibiendo lesiones totales específicas de CÍA. Los datos se analizaron estadísticamente usando ia Prueba de Probabilidad Exacta de Fisher y Prueba Mann-Whitney.

Las muestras de suero de pre-vacunación serológica que usan el Equipo ELISA IDEXX confirmaron el estado negativo de CIAV de los pollos de 9 semanas a partir de SPAFAS, Inc., que se usaron en este estudio. Los resultados de ELISA se dan en la Tabla 26.

Los resultados de los dos estudios reportados en este documento demuestran que 105'5 TCID50 de vacuna CIAV-DR administrada por toma de agua a pollos de 9 semanas protegieron significativamente la progenie a p<0.05 a través de 37 semanas (es decir, 28 semanas pos vacunación) cuando se compara la progenie a partir de gallinas no vacunadas. Un resultado de lesión total > 1 por cualquiera de los tejidos examinados (es decir, hígado, médula espinal, timo y músculo) se registró como un polluelo positivo a CÍA. Hubo una diferencia significante en p<0.05 en la progenie de gallinas vacunadas comparadas a gallinas no vacunadas en el Estudio 1 y Estudio 2 contra morbilidad y mortalidad, anemia, y lesiones totales características de CÍA.

Resultados del Estudio 1 Polluelos de cuarenta días a partir de los reproductores sin vacunar estimulados con CIAV se evaluaron en este estudio como el grupo de control positivo. La muerte de uno de los 25 polluelos del grupo control negativo no estimulado ocurrió antes en el periodo de prueba y no puede atribuirse a ninguna causa específica. Veinticuatro controles negativos permanecieron para la evaluación. Una pausa de poder en el aislamiento para mantener 40 polluelos estimulados a partir de gallinas vacunadas con CIAV en 3 dpc resultó en la muerte de 15 de los 40 polluelos dejando 25 polluelos de este grupo de tratamiento para evaluación en este estudio (véase Tabla 29). Un polluelo del grupo vacunado contra CIAV murió a 5 dpc. El polluelo no tuvo lesiones totales o señales clínicas de CIAV. Por lo tanto, la mortalidad se determinó debido a causas no relacionadas con CIAV.

Los 24 polluelos de control negativo no estimulados no mostraron morbilidad, mortalidad o lesiones totales de CÍA. Una de las 22 muestras de suero recolectadas de polluelos en 21 dpc tuvo un valor hematocrito de 23, pero el polluelo no tuvo otra señal característica de CÍA. Los resultados se proporcionan en la Tabla 27.

El procedimiento de estímulo indujo CÍA en la progenie a partir de los reproductores sin vacunar. Los valores hematocritos <25 en cualquiera de 14 ó 21 dpc se demostraron en 36 de 40 (90%) de los polluelos de control positivo. La morbilidad se observó en 5 de 40 polluelos (12.5%), mientras que la mortalidad se experimentó en 10 de 40 (25%) de polluelos. Las lesiones totales se evidenciaron en 33 de 40 (82.5%) de polluelos. Los resultados se proporcionan en la Tabla 28.

Las evaluaciones estadísticas por Prueba de Probabilidad Exacta de Fisher de valores hematocritos demostraron que hubo una diferencia significante en p<0.001 en contra de la anemia, una diferencia significante en p=0.012 contra morbilidad y mortalidad combinada, y una diferencia significante de p<0.001 en el número de aves con resultados de lesión total de CÍA en la progenie a partir de reproductores vacunados comparada a la progenie de reproductores sin vacunar. El análisis estadístico de los resultados de lesión total por Prueba Mann-Whitney demostraron una diferencia significante de p<0.001 en la médula espinal y el timo. Hubo una diferencia significante en p<0.001 por Prueba Exacta de Fisher del número de aves con lesiones totales de progenie a partir de reproductores vacunados comparados a la progenie de reproductores sin vacunar. Los resultados y evaluaciones estadísticas se proporcionan en las Tablas 29, 30, 31 y 32.

Resultados del Estudio 2 Los grupos del estudio 2 consistieron de controles negativos no estimulados a partir de gallinas no vacunadas (n=25), controles estimulados con CIAV a partir de gallinas no vacunadas (n=40) y progenie estimulada con CIAV a partir de gallinas de reproductor vacunadas contra CIAV de 37 semanas (n=40). A través de los 21 días de prueba, los pollos de control negativo permanecieron libres de anemia como se determina por los valores hematocritos, morbilidad, mortalidad y resultados de lesión total, asociados con CÍA. Los resultados se proporcionan en la Tabla 33.

Los polluelos de control positivo a CIAV mostraron valores hematocritos inferiores, señales clínicas y lesiones totales normales de CÍA. Los valores hematocritos <25 en cualquiera de 14 ó 21 dpc se demostraron en 32 de 39 (82.1%) de polluelos de control positivo. La morbilidad se observó en 6 de 40 (15.0%) de los polluelos, y la mortalidad se experimentó en 12 de 40 (30.0%) de los polluelos. Las lesiones totales son evidentes en la autopsia en 24/40 (60.0%) de los polluelos. Los resultados se proporcionan en la Tabla 34.

Siguiendo el estímulo de CIAV una diferencia significante en p<0.05 se demostró en la progenie de gallinas vacunadas con CIAV comparada a la progenie a partir de gallinas no vacunadas en valores hematocritos a 14 y 21 dpc, en morbilidad y mortalidad, y en resultados de lesiones totales. La Prueba de Probabilidad Exacta de Fisher de valores hematocritos demostró una diferencia significante a p<0.001 contra anemia, una diferencia significante en p<0.001 contra morbilidad y mortalidad, y una diferencia significante en p<0.001 en el número de aves con resultados de lesiones totales de CÍA. Los resultados y evaluaciones estadísticas se dan en las Tablas 10, 11, 12 y 13. Observe que un polluelo del grupo vacunado contra CIAV murió 3 dpc y otro en 8 dpc. Los polluelos no tuvieron lesiones totales o señales clínicas de CIAV. Por lo tanto, la mortalidad se determinó debido a causas no relacionadas con CIAV.

Estos estudios demostraron que el anticuerpo materno de CIAV proporcionó protección significativa contra CÍA en p<0.05 para la progenie de pollos de la raza de tipo leghorn blanco SPF, que se vacunaron previamente a 9 semanas con la vacuna contar virus de anemia infecciosa de pollo activo administrada a través de la toma de agua. Se evaluó la protección en la base de las señales clínicas, morbilidad/mortalidad y lesiones específicas de CIAV en necropsia. Estos estudios demostraron que la protección de anticuerpo materno se proporciono a polluelos por gallinas a través de al menos 37 semanas (28 semanas pos-vacunación).

Tabla 26: Resultados Serológicos de Pre-vacunación de ELISA de Polluelos SPF de 9 semanas para Confirmar Estados Serológicos Negativos antes de la Vacunación con Vacuna de CIAV Administrado por Agua. aNegativo = Relación S/N > 0.6 (IDEXX Equipo de interpretación) Tabla 27. Valores de Hematocrito del Estudio 1 , Signos Clínicos y Resultados de Lesión Total CÍA de Pollos no Estimulados de Pollos Reproductores No Vacunados de 27 semanas (Controles Negativos) Tabla 27 Continúa en la siguiente página aDías post estímulo °Sin muestra °N = negativo Lesiones totales 0 = normal, 1 = ligera, 2 = moderada, 3 = intensa asociada con CÍA Tabla 28: Valores Hematocritos del Estudio 1 , Señales Clínicas, Mortalidad y Resultados de lesión total CÍA de Polluelos a partir de Pollos de Reproductores Sin Vacunar de 27 semanas Estimulados al Día con CIAV (Controles Positivos).

Tabla 28 Continúa en la siguiente página aDias post estímulo Valores Hematocritos <25 = anemia °No hecho dN = negativo eP = positivo para señales clínicas o mortalidad por CIAV f0 = normal, 1 = ligera, 2 = moderada, 3 = Lesiones totales intensas asociadas con CÍA 9S¡n muestra Tabla 29: Valores Hematocritos del Estudio 1 , Señales Clínicas, Resultados de Mortalidad y Lesión total por CÍA de Polluelos con Anticuerpo Materno a partir de Pollos de Reproductor Vacunados contra CIAV de 27 Semanas, Estimulados al Día de Edad con CIAV.

La Tabla 29 continua en la siguiente página aDías post estímulo Valores Hematocritos <25 = anemia °N = negativo dNo hecho eQ = sin mortalidad asociada con CIAV fSin suero 90 = normal, 1 = ligera, 2 = moderada, 3 = Lesiones totales intensas asociadas con CÍA hP = positivo para señales clínicas o mortalidad por CIAV Tabla 30: Resumen del Estudio de Valores Hematocritos de Polluelos Estimulados con CIAV a partir de Pollos de Criadero Vacunados y Sin Vacunar de 27 semanas. aDiferencia estadística por Prueba Exacta Fisher en p<0.001 entre controles positivos y progenie a partir de pollos de reproductor vacunados contra CIAV.

Tabla 31: Resumen del Estudio 1 de Señales Clínicas y Mortalidad de Polluelos Estimulados con CIAV de Pollos de Reproductor Vacunados y Sin Vacunar de 27 semanas. aDiferencia Estadística por Prueba Exacta Fisher a p<0.05 entre el Grupo de control positivo y Progenie de Pollos de Reproductor Vacunados contra CIAV.

Tabla 32: Resumen del Estudio 1 de los Resultados de Lesión Total CÍA de Progenie Estimulada por CIAV a partir de Pollos de Reproductor Vacunados y Sin Vacunar CIAV de 27 semanas aDiferencia estadística a p<0.001 entre el grupo de control positivo y la progenie a partir de gallinas vacunadas contra CIAV por Prueba Mann-Whitney. bNo aplicable °Diferencia estadística a p<0.001 entre grupo de control positivo y progenie a partir de gallinas vacunadas contra CIAV por Prueba Exacta Fisher.

Tabla 33: Valores Hematocritos del Estudio 2, Señales Clínicas, Resultados de Mortalidad y Lesión Total de CÍA de Polluelos No Estimulados a partir de Pollos de Reproductor Sin Vacunar de 37 semanas (Controles Negativos). aDías post estímulo °N = negativo °0 = normal, 1 = ligera, 2 = modera, 3 =Lesiones Totales Intensas con CÍA dSin muestra Tabla 34: Valores Hematocritos del Estudio 2, Señales Clínicas, Resultados de Mortalidad y Lesión total de CÍA de Polluelos a partir de Pollos de Reproductor Sin Vacunar de 37 semanas Estimulados al Día de Edad con CIAV (Control Positivo).

La Tabla 34 continua en la siguiente página aDías post estímulo °N = negativo "Valores Hematocritos <25 = anemia dSin muestra eNo hecho P = positiva para señales clínicas o mortalidad CIAV 90 = normal, 1 = ligera, 2 = moderada, 3 =Lesiones totales Intensas asociadas con CÍA Tabla 35: Valores Hematocritos del Estudio 2, Señales Clínicas, Resultados de Mortalidad y Lesión total de CÍA de polluelos con Anticuerpo Materno a partir de Pollos de Reproductor Vacunados contra CIAV de 37 semanas Estimulados al día de Edad con CIAV.

Tabla 35 continua en la siguiente página aDías post estímulo °Sin suero CN = negativo dNo hecho eP = positivo para señales clínicas y mortalidad de CIAV f0 = normal, 1 = ligera, 2 = moderada, 3 = lesiones totales intensas asociadas con CÍA. 9Valores Hematocritos <25 = anemia Q = sin mortalidad asociada a CIAV.

Tabla 36. Resumen del Estudio 2 de Valores Hematocritos de Polluelos Estimulados con CIAV a partir de Pollos de Reproductor Vacunados y Sin Vacunar de 37 semanas. aDiferencia estadística por Prueba Exacta Fisher en p<0.001 entre controles positivos y progenie a partir de pollos de reproductor vacunados contra CIAV.

Tabla 37: Resumen del Estudio 2 de Señales Clínicas y Mortalidad de Pollos Estimulados con CIAV a partir de Pollos de Reproductor Vacunados y Sin Vacunar de 37 semanas. aDiferencia estadística por Prueba Exacta Fisher a p<0.05 entre el grupo de control positivo y progenie a partir de pollos de reproductor vacunados contra CIAV.

Tabla 37: Resumen del Estudio 2 de los Resultados de lesión total de CÍA de Progenie Estimulada con CIAV a partir de Pollos de Reproductor Sin Vacunar contra CIAV de 37 semanas. aDiferencia estadística a p<0.001 entre el grupo de control positivo y progenie a partir de gallinas vacunadas contra CIAV por prueba Mann-Whitney. bNo aplicable. °D¡ferencia estadística a p<0.001 entre el grupo de control positivo y progenie de gallinas vacunadas contra CIAV por Prueba Exacta Fisher.

Ejemplo 8: Evaluación De Tumorigenicidad en Pollos siguiendo Varios Tratamientos en Células MDCC-MSB-1 Para Inactivar el Virus Marek Se llevó a cabo un estudio de tumorigenicidad en el sustrato de la línea celular MDCC-MSB-1 usando para propagación de la cepa Del-Ros de CIAV. El objeto de este estudio fue demostrar que un fluido supernadante libre celular derivado del crecimiento activo de cultivos celulares carece de la capacidad para inducir tumores de la Enfermedad de Marek (MD) cuando se inocula en pollos susceptibles.

Grupos de 25 a 36, polluelos leghorn blancos SPF de 1-5 días se inocularon con varios inóculos como se muestra en la Tabla 39.

Los polluelos de ambas muestras se observaron diariamente para señales clínicas de MD, y las aves muertas se necropsiaron y examinaron por lesiones totales de MD durante un periodo de observación de 8 semanas. En el final del periodo de observación, todas las aves restantes (incluyendo los controles negativos) se sacrificaron con C02 y se examinaron por lesiones totales relacionadas con MD. Las muestras de lesiones cuestionables o sospechosas se recolectaron en 10% de solución de formaldehído por examinación histopatológica.

Las células MSB-1 sin una etapa del procesamiento adicional en una dosis de 1x106 de células viables indujo tumores en 2 de los 36 pollos. Sin embargo, los medios libres celulares adicionalmente procesados no indujeron tumores en los pollos. Los resultados se resumen en la Tabla 40.

Los datos obtenidos de este estudio indican que si las células MSB-1 se usan como el sustrato para producción del virus tal como para CIAV, es necesario remover células MSB-1 a partir del virus cultivado para evitar la enfermedad de Marek potencial en pollos que reciben la vacuna contra CIAV. La remoción de las células puede lograrse filtrando las células infectadas con el virus MSB-1 a través de un filtro tosco (5 µ de tamaño Millporo) para remover las células. El fluido de células libres de virus sería seguro para administrarse a pollos.

Los resultados de este estudio demostraron que las etapas de procesamiento adicionales del virus activo (es decir, sedimentación natural seguida por filtración a través de 5 µ de filtro Miliporo) de las células MSB-1 elimina la posibilidad de una vacuna producida en esta línea celular induciendo cualesquiera de los tumores relacionados con MD en pollos.

Los resultados sugieren que la filtración del fluido sobrenadante del virus de anemia en pollo producidos en células MSB-1 evitará el riesgo asociado de la formación del tumor MD cuando se administra en pollos.

Tabla 39: Diseño Experimental para la prueba de tumorigenicidad in-vivo de MSB-1 : No. Total Dosis de No. de Ruta de Tratamientos de Inoculo/ Grupo Inoculación polluelos Polluelo 1. -1.0x106 células viables MSB-1 crecidas en medio RPMl 36 SQa 0.2 ml 1640 suplementado con FBS. 2. Supernadante a partir de una suspensión celular de MSB-1 35 SQ 0.2 ml (2000 rpm durante 10 minutos) centrifugada 3. Medio RPMl 1640 suplementado con FBS (control medio) 25 SQ 0.2 ml 3.0 x 105 células/ml viables MSB-1 , permitidas para 35 SQ 0.2 ml sedimento naturalmente durante la noche y el supernadante resultante se filtro entonces a través de 5 µ de filtro Miliporo, y finalmente tratado a 41 °C durante 24 horas antes de utilizarse para inoculación de polluelos 3.0 x 105 células/ml viables de MSB-1, permitidas para 35 SQ 0.2 ml sedimento naturalmente durante la noche y el supernadante resultante se filtró entonces a través de filtro Miliporo 5 µ antes de utilizarse para inoculación de polluelos 3.0 x 105 células/ml viables, congeladas y descongeladas 3 35 SQ 0.2 ml veces a -20°C y luego centrifugadas a 2000 rpm durante 15 minutos, el supernadante resultante se filtró a través del filtro 5 µ Miliporo, y finalmente el filtrado se expuso a 41 °C durante 24 horas antes de utilizarse para inoculación de polluelos 7.-- Controles Negativos 35 ND ND Subcutáneas Tabla 40 Resultados de prueba de tumorigenicldad de células MDCC-MSB-1 Ejemplo 9: Los Efectos del Congelamiento-Descongelamiento e Incubación A 37°C en la Viabilidad del Virus de Enfermedad de Marek La congelación-descongelación de 3 ciclos no pudo completar el virus de enfermedad Marek inactivada (MDV) en el medio de cultivo de tejido, pero redujo el número de placas significativamente. Sin embargo, siguiendo 3 congelamientos-descongelamientos y luego la incubación de 3 días a 37°C, no hubo virus del serotipo 1 MDV detectado por IFA.

El virus de la enfermedad de Marek y el virus del herpes de pavo (HVT) existe en cualesquiera de los estados libres celulares o asociados con células que tienen propiedades de sobrevivencia grandemente diferentes. La inefectividad de la existencia de virus asociada con las células se relaciona directamente a la viabilidad de las células que contienen el virus. Se investigó la inefectividad de la preparación de células libre de virus se reportó ser sensible a diferentes pH y temperaturas. La viabilidad de MDV, cepa de Rispen, bajo congelamiento-descongelamiento y tratamientos de incubación a 37°C.

Materiales y Métodos Células: Las células CEF (CEF primaria en botella cilindrica, CEF secundaria en placas 60 mm de cultivo de tejido) se prepararon a partir de embriones de pollos SPF de 9 a 11 días (SPAFAS).

Virus: El efecto de congelamiento-descongelamiento en la viabilidad del virus Rispen se investigó conduciendo un estudio de inactivación (eliminación). Las células CEF infectadas de Rispen activas se cultivaron a 43 hpi. Se volvieron a suspender las células infectadas en medio esencial mínimo (MEM) suplementado con suero fetal y suero de ternera y caldo de fosfato de triptosa, y se llenaron en 20 tubos. La concentración de las células fue 36 x 106 células por ml. Las muestras se trataron por congelamiento a -70°C seguido por descongelamiento a temperatura ambiente, de hasta uno hasta tres ciclos, luego se incubaron a 37°C de uno hasta 15 días. Las muestras, con o sin dilución, se inocularon en monocapa de CEF secundaria en 60 mm de placas de cultivo de tejido en duplicado, e se incubaron a 37°C por 4-5 días. Las cantidades se clasificaron por conteo de placas bajo un microscopio con y sin cepa IFA con anticuerpo 2BN90 monoclonal específico de serotipo 1.

Resultados Se enumeraron y reportaron placas MDV como la placa promedio que forma la unidad (pfu) por ml. Los resultados indicaron que hasta 3 ciclos de congelamiento-descongelamiento no inactivaron completamente la cepa de Rispen de MDV en el medio de cultivo de tejido, pero el número de placas que indicó evidencia de virus viable se redujo significativamente. Sin embargo, con 3 o más días de incubación a 37°C después de los 3 ciclos de congelamiento-descongelamiento, no hubo placas detectadas por IFA (Tabla 41 y Figuras 3 y 4), sugieren combinar 3 ciclos de congelamiento-descongelamiento con una incubación de 3 días a 37°C pueden destruir completamente la inefectividad de MDV en el medio libre celular.

Tab l a 41 . Las p l acas d e M DV p ro m ed io res u lta n d es p u és d e cad a tratam iento Tratamiento Resultados Título inicial antes del congelamiento-descongelamiento: ( 5.4 x 106 pfu/ml Congelamiento-descongelamiento una vez: 3x104 pfu/ml Congelamlento-descongelamlento dos veces: 3x103 pfu/ml (por IFA) Congelamiento-descongelamineto 3 veces: 800 pfu/ml (por IFA) Congelamiento-descongelamiento 3 veces + 37°C 1 día: 70 pfu/ml (por IFA) Congelamiento-descongelamiento 3 veces + 37°C 2 días: 25 pfu/ml (por IFA) Congelamiento-descongelamiento 3 veces + 37°C 3 días: 0 Congelamiento-descongelamiento 3 veces + 37°C 4 días: 0 Congelamiento-descongelamiento 3 veces + 37°C 5 días: 0 Congelamiento-descongelamiento 3 veces + 37°C 7 días: 0 Congelamiento-descongelamiento 3 veces + 37°C 9 días: 0 Congelamiento-descongelamiento 3 veces + 37°C 11 días: 0 Congelamiento-descongelamiento 3 veces + 37°C 13 días: 0 Congelamiento-descongelamiento 3 veces + 37°C 15 días: 0 Ejemplo 10: Comparación de Secuencias por Cepas CIAV Existen numerosas cepas reportadas de CIAV. Algunas de estas han sido secuenciadas y sus secuencias depositadas. Una gráfica que compara la secuencia de aminoácidos de varias de las cepas conocidas se proporciona en la Tabla 42. Se basa en una pila de secuencias obtenidas a partir de la base de datos NCBI.

Tabla 42. Cambios de los Aminoácidos Específicos en VP1 , VP2 y VP3 de Varios Aislados CAV Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para la cepa Del Ros se proporcionan en la lista de Secuencias y también en NCBl No. de acceso AF313470. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para otras cepas adicionales de CIAV pueden encontrarse como sigue: intervet - NCBl No. de acceso DI00068; Cuxhaven-1 - NCBl No. de acceso. NC001427; y CAV-15 - NCBl No. de acceso AF372658. Una comparación de nucleótido por nucleótido o aminoácido por aminoácido de estas y otras secuencias pueden hacerse rutinariamente.

Ejemplo 11. Uso de una Vacuna de Virus de Anemia Infecciosa en Pollos Activa Mejora el Funcionamiento del Peso de los Pollos para Asar sin Asuntos de Seguridad Adversos Evaluación y Resultados La vacuna de anemia en pollos activa se usa en pollos para asar de 18 días en una granja de 119,800 pollos de tipo comestible. Esta granja ha experimentado una tendencia a la baja en el funcionamiento, como se mide por la proporción de kilogramos censurados de carne debido a problemas relacionados con la salud. Los pollos se vacunan en el agua para beber a los 18 días de nacidos y la parvada de 113,453 pollos se envía a la planta de procesamiento a los 41 días de nacidos. La salud, el peso de las aves y el número de kilogramos de carne censurada por los inspectores se evaluaron en contra de la parvada de edad similar procesada a la misma semana. El término "censurada" como se usa en este documento, significa que un inspector de aves juzga que la carne no reúne los requisitos para el consumo humano. Los resultados del funcionamiento de la parvada se encuentran en la Tabla 43.

Tabla 43: Resultados de Funcionamiento de la Parvada La salud de los pollos vacunados fue mejor que la de los pollos no vacunados y también se demostró que la vacuna fue más segura para usarse. La diferencia en el peso de 0.056 kilogramos fue altamente significativa porque demuestra que los vacunados tienen un tiempo reducido en el mercado mediante lograr mayor peso en menos tiempo. No hubo una mejora en el % de kilogramos comparado con otras parvadas que habían sido procesadas esa semana, pero fue una mejora significante comparada con las parvadas previas de esta misma granja como se detalla en el Ejemplo 12.

Ejemplo 12: Uso de la Vacuna de Anemia Infecciosa de Pollos Activa para Reducir las Censuras Relacionadas con la Salud en una Granja de Pollos para Asar Evaluación y Resultados: La granja como se describió en el Ejemplo 11 , tuvo una historia pasada de altas proporciones de kilogramos censurados de carne debido a los problemas relacionados con la salud. Una comparación se hace en la incidencia de kilogramos de carne censurada cuando las parvadas criadas en esta granja se procesaron con y sin la vacuna del virus de la anemia infecciosa de pollos activa. Los resultados se encuentran en la Tabla 44.

Tabla 44: Comparación de Kilogramos de Carne Censurada Los resultados muestran que como se uso una vacuna de anemia infecciosa en pollos en esta granja existieron menos kilogramos censurados de carne debido a los problemas relacionados de salud incluso cuando la parvada del 100% vacunada fue criada en los meses de invierno cuando los problemas de salud son los más altos.

Ejemplo 13: Una Reducción en los Kilogramos de Carne Censurada Cuando se Usa la Vacuna de Anemia Infecciosa de Pollos Evaluación y Resultados: Una granja con capacidad de 48,000 pollos para asar exhibió el mismo funcionamiento como la granja descrita en el Ejemplo 11. Los datos de funcionamiento en el procesamiento se evaluaron para las tres parvadas, como se muestra en la Tabla 45.

Tabla 45: Datos de Funcionamiento en el Procesamiento De las tres parvadas consecutivas en esta granja, la parvada que fue vacunada al 50% fue criada en el periodo de invierno en donde la enfermedad es más severa y tuvo un funcionamiento de crecimiento superior. Los beneficios de funcionamiento se realizaron en salud significativamente incrementada y kilogramos reducidos de carne censurada que se correlaciona directamente con los problemas de salud disminuidos comparados con las parvadas no vacunadas previas en la misma granja.

A través de esta solicitud se hace referencia a varias publicaciones. Las descripciones de estas publicaciones en sus totalidades se incorporan en este documento como referencia para describir más completamente el estado de la técnica a la cual esta invención pertenece.

Será aparente para aquellos expertos en la técnica que varias modificaciones y variaciones pueden hacerse en la presente ¡nvención sin apartarse del alcance o espíritu de la invención. Otras modalidades de la invención serán aparentes por aquellos expertos en la técnica a partir de la consideración de la especificación y práctica de la invención descrita en la presente. Se pretende que la especificación y ejemplos se consideren como ejemplares únicamente, con un alcance y espíritu verdadero de la invención que se indica por las siguientes reivindicaciones.

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES 1. Una vacuna contra el virus de anemia infecciosa de pollo (CIAV), que comprende el paso de CIAV activo en células MDCC-MSB-1 (MSB-1), en donde la vacuna no provoca la Enfermedad de Marek.
2. 2. La vacuna contra CIAV de conformidad con la reivindicación 1, en donde la vacuna no produce lesiones totales en embriones de pollo.
3. 3. La vacuna contra CIAV de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la vacuna no produce anemia en embriones de pollo.
4. 4. La vacuna contra CIAV de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la vacuna puede administrarse seguramente a los pollos de menos de 28 días de nacidos.
5. 5. La vacuna contra CIAV de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la vacuna puede administrarse seguramente a los pollos de más de 28 días de nacidos.
6. 6. La vacuna contra CIAV de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la vacuna puede administrarse seguramente a embriones de pollo in ovo.
7. 7. La vacuna contra CIAV de conformidad con la reivindicación 6, en donde los embriones de pollo están entre 16 y 20 días de incubación.
8. 8. La vacuna contra CIAV de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la vacuna está inactiva.
9. 9. Un método para realizar una vacuna contra CIAV, que comprende cultivar CIAV en células MSB-1 y remover o eliminar cualquier virus de la enfermedad de Marek presente en el cultivo de célula MSB-1 que contiene CIAV.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, que comprende someter al cultivo de célula MSB-1 que contiene CIAV a al menos 3 ciclos de congelamiento y descongelamiento, seguido por una etapa para mantener las células durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 37°C.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 9, que comprende la etapa de filtrar el cultivo de célula MSB-1 a través de un filtro de 5 mieras.
12. 12. El método de conformidad con las reivindicaciones 10 ó 11 , en donde el método realiza una vacuna que no provoca la enfermedad de Marek en pollos inmunizados con la vacuna.
13. 13. Un método para inmunizar un pollo en contra de la infección CIAV, que comprende administrar al pollo una cantidad de la vacuna contra VIAC de conformidad con la reivindicación 1 , suficiente para inducir una respuesta inmune a CIAV.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde la respuesta inmune es protectora en contra de la infección por CIAV.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde la respuesta inmune es protectora en contra de la enfermedad clínica provocada por la Infección de CIAV.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde la respuesta inmune produce anticuerpos que son protectores en contra de la infección de CIAV en la progenie de pollos inmunizados.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde la vacuna se administra a pollos a partir de aproximadamente las 4 a 12 semanas de nacidos.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde la vacuna puede administrarse en combinación con la vacuna de la enfermedad de Marek, la vacuna de la enfermedad bursal infecciosa, la vacuna contra el reovirus, la vacuna en contra de la enfermedad de Newcastle, la vacuna en contra de la enfermedad de bronquitis infecciosa, la vacuna en contra del neumovlrus y la vacuna en contra del virus de la influenza aviar.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde la vacuna se administra en agua para beber.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde la vacuna se administra parenteralmente.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde la vacuna se administra por aspersión.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde la vacuna se administra por inyección.