MXPA04002190A

MXPA04002190A - Vacuna contra el virus de anemia de pollo a partir de la linea celular.

Info

Publication number: MXPA04002190A
Application number: MXPA04002190A
Authority: MX
Inventors: D Leonard Joan
Original assignee: Biomune
Priority date: 2001-09-05
Filing date: 2002-09-05
Publication date: 2005-03-07
Also published as: WO2003020308A1; US20050169939A1; BR0212279A; ZA200402352B; EP1436001A1; CA2477811A1; EP1436001A4

Abstract

Se proporciona una vacuna en contra del virus de la anemia infecciosa de los pollo (CIAV), que comprende el paso de la CIAV en las celulas MDCC-MSB-1 (MSB-1), en donde la vacuna no causa la Enfermedad de Marek. Tambien se proporciona una vacuna de ClAV que comprende un virus CIA que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1. Se proporciona un metodo para producir una vacuna de CIAV, que comprende cultivar el CIAV en Icelulas MSB-1, y eliminar o matar cualquier virus de la enfermedad de Marek presente en el cultivo de CIAV- que contiene MSB-1. Se proporciona un metodo para inmunizar a un pollo en contra de la infeccion de CIAV, que comprende la administracion al pollo de una cantidad de la vacuna de ClAV de la invencion, suficiente para inducir una respuesta inmune al CIAV.

Description

VACUNA CONTRA EL VIRUS DE ANEMIA DE POLLO A PARTIR DE LA LÍNEA CELULAR ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona generalmente a una vacuna para virus de anemia infecciosa de los pollos, métodos para realizar la vacuna y métodos de inmunización que utilizan la vacuna.

ANTECEDENTES El CIAV provoca enfermedad clínica y sub-clínica en pollos, y se reconoce como un importante patógeno aviar alrededor del mundo. En pollos jóvenes, el CIAV provoca una severa anemia temporaria debida a la destrucción de células eritoblastoides en la médula espinal e inmunodeficiencia debida a la reducción de timocitos corticales. La reducción de timocitos corticales se considera provoca una inmunodeficiencia temporaria que resulta en infecciones simultáneas mejoradas y a fracasos de vacunación. La destrucción de timocitos y más probablemente también de células eritoblastoides ocurre a través de apoptosis inducida por VIAC. CIAV es un virus pequeño de un tipo único de un diámetro de partícula de 23-25 nm y un genoma que consiste de un ADN de una sola hebra circular (hebra negativa). Este ADN se multiplica en células infectadas a través del intermediario replicativo de doble hebra circular. El CIAV no se relaciona a otros virus de ADN circulares de una sola hebra de animales conocidos, tales como circovirus porcino y virus de la enfermedad de pico de aves y plumas de psitaccine. La mayor transcripción a partir del genoma de CIAV es un ARNm policistrónico no empalmado de aproximadamente 2100 nucleótidos que codifican tres proteínas de 51.6 kDa (VP1), 24.0 kDa (VP2) y 13.6 kDa (VP3 o apoptina). Todas las tres proteínas se sintetizan en células infectadas con CAIV. Para reducir el daño económico provocado por la infección por CIAV, es necesario proporcionar una vacuna de costo efectiva contra CIAV. Intentos anteriores para proporcionar una vacuna contra CIAV han requerido el paso y propagación de CIAV en embriones de SPF susceptibles a CIAV (Véase Vielitz and Voss, International Symposium on Infectious Bursal Disease and Chicken Infectious Anemia, Rauischholzhausen, Germany, 21-24 June 19114). Intentos para producir CIAV en líneas celulares han sido problemáticos debido a la infección de líneas celulares susceptibles con virus de la enfermedad de Marek. De esta forma, existe una necesidad para una vacuna producida en células cultivadas que no provocará la enfermedad de Marek. La presente invención cumple las necesidades de este campo proporcionando una vacuna sin las desventajas del paso de embriones y sin las desventajas de la contaminación del virus de la enfermedad de Marek.

ARTE PREVIO DE LA INVENCIÓN De acuerdo con el o los propósitos de esta invención, como se manifiesta y ampliamente describe en la presente, esta invención, en un aspecto, se relaciona a una vacuna contra el virus de anemia infecciosa de pollo (CIAV), que comprende el CIAV activo trasladado en células M DCC-MSB-1 (MSB-1), en donde la vacuna no provoca la Enfermedad de Marek. En otro aspecto, la invención proporciona una vacuna contra CIAV que comprende un virus de CIA que tiene la secuencia de la SEC. DE I D E NT. NO: 1. En otro aspecto, la invención proporciona un método para realizar una vacuna contra CIAV, que comprende cultivar CIAV en células MSB-1, y remover o eliminar cualquier virus de la enfermedad de Marek en el cultivo MSB-1 que contiene CIAV. El método puede incluir someter el cultivo de célula MSB-1 que contiene CIAV en al menos 3 ciclos de congelamiento y descongelamiento, seguido por una etapa para mantener las células durante aproximadamente 3 días aproximadamente. Alternativamente, puede utilizarse filtración, o centrifugación seguida por tratamiento en aproximadamente 37°C. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para inmunizar un pollo contra infección de CIAV, que comprende administrar al pollo una cantidad de la vacuna contra CIAV de la invención, suficiente para inducir una respuesta inmune a CIAV. La invención tiene la ventaja que proporciona una vacuna contra CIAV que puede producirse en una linea celular y está libre de virus contaminantes. Ventajas adicionales de la invención se establecerán en parte en la descripción que sigue, y en parte será obvia a partir de la descripción, o puede aprenderse por la práctica de la invención. Las ventajas de la invención se realizarán y lograrán por medio de ' los elementos y combinaciones particularmente indicadas en las reivindicaciones anexas. Se entenderá que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son ejemplares y explicativas únicamente y no son restrictivas de la invención, como se reclama.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los dibujos anexos, que se incorporan en, y constituyen una parte de esta especificación, ilustran una o más modalidades de la invención y junto con la descripción sirven para explicar los principios de la invención. La Figura 1 muestra productos PCR (vacunas adaptadas y atenuadas de embriones de CIAV 1=marcador, 2 = Del Ros, 3 = lntervet, células 4 = 1:2, sobrenadante 5 = 1:2, células 6 = 1:10, sobrenadante 7 = 1:10, células 8 = MSB-1 únicamente).

La Figura 2 muestra análisis de enzima de restricción con Hindlll (1 =marcador, 2 = CIAV Del Ros sin cortar, 3= CIAV Del Ros Hindlll, CIAV 4 = lnterver sin cortar, CIAV 5 = lntervet Hindlll, CIAV 6 = 1:2 Intervet sin cortar, muestra de CIAV 7 = 1.2 Intervet Hindlll, CIAV 8 = 1:10 Intervet CIA V Hindlll). La Figura 3 muestra el efecto de congelamiento-descongelamiento en la viabilidad del MDV (virus de Rispen). A-NÚMERO DE PLACAS POR mi (log2); B-EFECTO DE CONGELAMIENTO-DESCONGELAMIENTO EN LA VIALIDAD DEL VIRUS DE RISPEN; C-CICLOS DE CONGELA IENTO-DESCONGELAMIENTO. La Figura 4 muestra el efecto de 37°C en la viabilidad de MDV (virus de Rispen) después de 3 ciclos de congelamiento-descongelamiento. D-NÚMERO DE PLACAS POR mi (log2); E-EFECTO DE 37°C EN LA VIABILIDAD DEL VIRUS DE RISPEN DESPUÉS DE 3 CICLOS DE CONGELAMIENTO-DESCONGELAMIENTO; F-DÍAS.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención puede entenderse más fácilmente por referencia a la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la invención y los Ejemplos incluidos en la presente y a las Figuras y su descripción anterior y siguiente. Como se utiliza en la especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen plurales referentes a menos que el contexto lo establezca de otra manera claramente. Los rangos pueden expresarse en la presente como de "aproximadamente" un valor particular, y/o a "aproximadamente" otro valor particular. Cuando tal rango se expresa, otra modalidad incluye de un valor particular y/o al otro valor particular.

Similarmente, cuando se expresan valores como aproximaciones, por el uso del antecedente "alrededor" o "aproximadamente", se entenderá que el valor particular forma otra modalidad. Se entenderá además que los puntos finales de cada uno de los rangos son significativos tanto en la relación al otro punto final, como independientemente del otro punto final. La invención proporciona una vacuna contra virus de anemia infecciosa de pollo (CIAV), que comprende CIAV activo trasladado en células MDCC-MSB-1 (MSB- ), en donde la vacuna no provoca la Enfermedad de Marek. La vacuna contra CIAV de la invención no produce lesiones totales en un número de embriones de pollo significativo.

La vacuna ha sido probada en embriones, y en estudios hechos, produce lesiones en menos del 10% de los embriones. Esto es en contraste a una vacuna contra CIAV diferente que se produce en embriones de pollo, y provoca lesiones significativas en los embriones. La vacuna contra CIAV de la invención no produce tampoco anemia significativa en embriones de pollo.

La invención proporciona una vacuna contra CIAV que comprende cualquiera de las cepas reportadas (por ejemplo, cepa intervet, cepa Cux-1, cepa Texas, DRP5 (Del Ros después de 5 pasos), cepa CAV-15, etc.). Por ejemplo, la invención proporciona una vacuna contra CIAV que comprende un CIAV que tiene la secuencia de la SEC. DE IDENT. NO: 1. Esta es la secuencia de la cepa Del Ros. La invención también proporciona una vacuna contra CIAV que comprende cualquier cepa de CIAV que se aisla nuevamente o es una forma modificada de una cepa conocida. Se proporciona un método para realizar una vacuna contra CIAV, que comprende cosechar CIAV en MSB-1. Además de proporcionar un método para realizar CIAV cultivado de MSB-1 libre del virus de la enfermedad de Marek (MDV) (véase en los siguiente y el Ejemplo 1), el método puede también producir CIAV a una cantidad de sustancia de al menos 108'1. Esto es una cantidad más elevada que la normalmente obtenida para este virus en las células MSB-1. Se proporcionan los detalles de este proceso en el Ejemplo 1. Se reconoce que otros métodos para cultivar CIAV en células MSB-1 pueden desarrollarse y practicarse rutinariamente. Puede utilizarse el método para realizar una vacuna contra CIAV con cualquiera de las cepas CIAV reportadas (por ejemplo, cepa intervet, cepa Cux-1, cepa Texas, DRP5 (Del Ros después de 5 pasos), cepa CAV-15, etc.). Por ejemplo, el método para realizar una vacuna contra CIAV puede utilizar un CIAV que tiene la secuencia de la SEC. DE IDENT. NO: 1. El método para realizar una vacuna contra CIAV puede también utilizar cualquier cepa CIAV que se aisla recientemente o es una forma modificada de cepa conocida. El método para realizar una vacuna contra CIAV puede comprender además la etapa de separar el CIAV cultivado de las células MSB-1, que normalmente contiene MDV. El CIAV se segrega en el medio de cultivo, permitiendo así una variedad de etapas para separar el CIAV a partir de las células MSB-1. Por ejemplo, el método para realizar una vacuna contra CIAV puede comprender una etapa para someter el CIAV en al menos 3 ciclos de congelamiento y descongelamiento. Esto interrumpe las células e inactiva una cantidad sustancial del MDV (un patógeno intracelular obligado). Esta etapa se sigue usualmente con una etapa para mantener las células durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 37°C. Eso inactiva cualquier MDV restante. Un método para realizar el cultivo de CIAV en células MSB-1 libres de MDV pueden comprender la etapa de filtrar las células MSB-1 que contiene el virus a través de un filtro de 5 mieras. El filtrado puede penetrar a través de las células debido a que son frágiles, y también se remueve cualesquiera células intactas. Ejemplos de estos procesos para remover MDV a partir de la vacuna contra CIAV y para eliminar cualquier MDV en el cultivo de CIAV se proporcionan en el Ejemplo 1 y el Ejemplo 9). Se reconoce que otros métodos para obtener la vacuna contra CIAV a partir de células MSB-1 que está libre de MDV puede desarrollarse y practicarse rutinariamente. Por ejemplo, un proceso para centrifugar las células MSB-1 infectadas con CIAV para remover células y la mayoría de los MDV, seguido por ciclos de congelamiento-descongelamiento del sobrenadante y mantenimiento a 37°C para eliminar cualquier MDV restante es también efectivo. De este modo, los métodos para realizar la vacuna contra CIAV proporcionados en la presente, producen una vacuna que no provoca la enfermedad de Marek en pollos inmunizados con la vacuna. La invención proporciona un método para inmunizar un pollo contra infección de CIAV, que comprende administrar al pollo una cantidad de la vacuna contra CIAV de la invención lo suficiente para inducir una respuesta inmune a CIAV. De este modo, la respuesta inmune es también protectora contra enfermedad clínica provocada por la infección CIAV. Aunque la vacuna contra CIAV presente no se atenúa a pollos inmunizados (por ejemplo, gallinas) no se enferman normalmente, debido a la resistencia reconocida de este virus. El método de inmunización de la invención se extiende a la progenie de una gallina inmunizada. La respuesta inmune en la gallina produce anticuerpos en la gallina que se pasan al pollo a través del huevo. Los anticuerpos están en cantidad suficiente para protegerse contra infección por CIAV de la progenie de gallinas inmunizadas. De este modo, la presente vacuna contra CIAV evita enfermedad clínica en la progenie de pollos inmunizados para evitar infecciones de CIAV en los polluelos de gallinas inmunizadas. En el método de inmunización de la invención, se administra la vacuna a pollos antes del comienzo de la producción de huevos. Por ejemplo, un rango de tiempo válido para la mayoría, si no es que todo tipo de pollos es de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 semanas. El tiempo inferior es relevante en base al fenómeno de resistencia observado con CIAV. Aunque la edad exacta puede diferir entre los diferentes tipos de pollos, en las cepas de pollos se presenta la resistencia probada tan joven como aproximadamente 4 semanas. Se reconoce que en pollos que desarrollan resistencia en una edad temprana, la vacuna puede exitosamente administrarse antes de las 4 semanas (es decir momento después de que se desarrolla la resistencia). De manera similar, para los tipos de pollos que desarrollan resistencia tardía, la vacuna puede administrarse exitosamente cualquier tiempo después que se desarrolla la resistencia. Ya que la resistencia a la enfermedad de CIAV puede determinarse rutinariamente, por ejemplo, utilizando los métodos mostrados en los Ejemplos, este parámetro es ajustable rutinariamente, de manera que la invención no se limita a un límite inferior particular para inmunización. El límite de tiempo superior es relevante en base a dos consideraciones generales: 1) la necesidad para inmunizar suficientemente de antemano en el comienzo de la producción de huevos para permitir las cantidades suficientes de anticuerpo para desarrollarse en la gallina inmunizada; y 2) la necesidad para inmunizar suficientemente de antemano del comienzo de la producción de huevos para permitir la liberación del CIAV a partir de la gallina inmunizada. La edad del comienzo de la producción de huevos varía entre los diferentes tipos de pollos. Así, mientras 24 semanas es el tiempo aproximado de comienzo en los pollos probados, este parámetro no se limita a aquella edad particular, si no que se basa en la edad determinable rutinariamente del comienzo para una población dada de pollos. En términos del desarrollo de cantidad suficiente de anticuerpos, esto se espera para variar dentro de los parámetros determinables rutinariamente de pollo a pollo. Así, mientras 6 semanas antes del comienzo de la producción de huevos se ha determinado que es suficiente en las cepas probadas, el marco de tiempo contemplado abarca cualquier tiempo que pueda determinarse ser suficiente para la producción de anticuerpos, incluyendo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24 semanas (y días intermedios) en avance de la producción de huevos. Los métodos para medir cantidades de anticuerpo y determinar suficiencia para inmunización protectora y progenie son rutinarios y se proporcionan en los Ejemplos en la presente. En términos del tiempo necesario para remover el virus antes de la producción de huevos, se espera esto para variar dentro de los parámetros determinables rutinariamente de pollo a pollo. Para los pollos ejemplificados en la presente, se determinó que estas 12 semanas antes de la producción de huevos es suficiente para remover el virus. Debido a que este parámetro es también medido rutinariamente, el cuadro de tiempo contemplado abarca cualquier tiempo suficiente para remover el virus, incluyendo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24 semanas (y días intermedios) en avance de la producción de huevos. Los métodos para medir cantidades de virus y determinar la remoción del virus son rutinarios y se proporcionan en los Ejemplos en la presente. Se debe observar también que los límites de tiempo superiores e inferiores para la administración de la vacuna no se basan necesariamente en el estado de producción del huevo, cantidad suficiente de anticuerpo o cantidad de anticuerpo de un pollo individual. Más bien, es el estado general del grupo (por ejemplo, población, cepa, etc.) de los pollos para inmunizarse que es relevante. De este modo, si un porcentaje suficiente de los pollos individuales dentro de un grupo se conocen o se esperan (por ejemplo, en base al conocimiento anterior del grupo) para estar en la edad apropiada para inmunización, la inmunización se considera exitosa. La vacuna contra CIAV de la invención puede administrarse utilizando cualesquiera de los métodos normales. Por ejemplo, un método ventajoso es administrar la vacuna bebiendo agua. Las características claves de la presente vacuna contra CIAV administrada con agua son: 1) la CIAV es apatogénica para el huésped y es suficientemente invasiva (una entrada aceptable) para inducir un nivel adecuado de anticuerpo. 2) El CIAV se demostró dispersarse. 3) El anticuerpo inducido evitará la transmisión vertical de un virus de estímulo. 4) El anticuerpo maternal se transfiere eficientemente a la progenie y es protector. 5) El anticuerpo resistirá durante un periodo de tiempo extend ido. Los presentes datos, apoyan fuertemente la premisa de que el CIAV posee estas características clave. La vacuna puede, alternativamente, administrarse parenteralmente, incluyendo por inyección o por rocío por aerosol (por ejemplo, de cualquier membrana mucosa: nasal, faringeal, oral, ocular, ¡ntratraq ueal , cloacal, ec). La invención proporciona un método para realizar una vacuna contra CIAV en una línea celular oncogénica que comprende someter el virus cultivado celular a más de un ciclo de congelamiento y descongelamiento, seguido manteniendo las células durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 37°C, por lo que el virus contaminante a partir de la línea celular se elimina. Existen numerosas líneas celulares oncogénicas que tienen características de crecimiento y otras características que las hacen ventajosas para CIAV de cultivo. Sin embargo, debido a la existencia en algunas de estas líneas celulares de virus contaminantes (por ejemplo, el virus de tumor asociado con el tumor a partir del cual la línea celular se aisló), utilizándolas para producir una vacuna contra CIAV activo ha sido problemático. La invención dirige este problema proporcionando métodos para inactivar el virus contaminante sin eliminar los CIAV. Estos métodos se describen en los Ejemplos y por otra parte en la presente. De este modo, la invención también proporciona una vacuna contra CIAV, que comprende CIAV activo trasladado en una línea celular oncogénica, en donde la vacuna no provoca la Enfermedad de Marek.

Experimental Los siguientes ejemplos se publican para proporcionarse por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica con un descubrimiento y descripción completos de cómo los compuestos, composiciones, artículos, dispositivos y/o métodos reclamados en la presente se hacen evaluar, y se pretenden ser únicamente ejemplares de la invención y no se pretenden limitar el alcance de la invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a números (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc), pero algunos errores y desviaciones deben ser considerados. A menos que se indique de otra manera, las partes son partes en peso, la temperatura está en °C o esta a temperatura ambiente, y la presión está a, o es casi atmosférica.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 ETAPAS PARA REALIZAR LA VACUNA CONTRA CIAV EN CELULAS MSB-1 Se mantienen células MSB-1 en frascos congelados en nitrógeno líquido hasta que a tal tiempo necesiten expandirse en número significativo para la propagación del CIAV. Las células MSB-1 se siembran como se describe en la literatura científica en varios recipientes de cultivo de tejido en medios RPMI-1640 suplementados con suero de ternera fetal. Se incuban células a aproximadamente 41°C. Estas células crecen rápidamente y pueden expandirse frecuentemente para mantener activamente el crecimiento de las células. La vacuna se produce agregando el virus de CIAV a células que han sido expandidas en nuevos medios de manera que la densidad celular es aproximadamente medios de 1 a 5x105 células/ml, y la entrada de virus es al menos aproximadamente medios de 1 x 105 TCID50/ml. Se incuban células infectadas con virus en aproximadamente 41°C durante 4 a 7 días. Se examinan microscópicamente células para evidencia de muerte celular como la determinación del tiempo de cosecha.

Debe agregarse una etapa al procedimiento de cosecha de virus para asegurar la inactivación de cualquier virus de la enfermedad de Marek residual que pueda estar en las células MSB-1 que puedan ser libres de células. Un procedimiento efectivo comprobado es la filtración de las células y los medios a través de un cartucho Pall de 4.5 a 5 mieras para remover las células MSB-1 seguidas por tratamiento por temperatura del virus durante aproximadamente tres días a aproximadamente 37°C para asegurar la inactivación del virus de la enfermedad de Marek libre de célula. Alternativamente, el virus puede congelarse y descongelarse tres veces para romper suficientemente las células MSB-1 para liberar e inactivar el virus de la enfermedad de Marek (y patógeno intracelular obligado). Entonces el fluido viral se somete a un tratamiento por temperatura de aproximadamente 37°C durante 3 días para asegurar la inactivación completa de cualquier virus de la enfermedad de Marek residual. Ya que el CIAV es muy estable la vacuna puede suministrarse en una forma congelada o en forma líquida mantenerse a temperatura refrigerada de 2-7°C, o el virus puede secarse por congelamiento.

EJEMPLO 2 PCR Y ANALISIS DE RESTRICCION Preparación de la muestra de vacuna contra CIAV Intervet en células MSB-1. Debido a la incompatibilidad del tinte azul contenido en la muestra de vacuna adaptada y atenuada de embrión de pollo de CIAV Intervet (Intervet CIAV) y la prueba PCR, se pasó la muestra una vez en las células MSB-1. Se inocularon las células MSB-1 con 1:2 y 1:10 diluciones de virus, y se incubaron las células durante 96 horas antes de cosecharse. El medio de cultivo apareció aún azul debido al tinte en la muestra de vacuna de manera que las células se separaron a partir del sobrenadante por centrifugación y las células se lavaron dos veces con PBS. Tanto el sobrenadante como las células se almacenaron a menos 70°C. PCR. Se condujo el PCR CIAV siguiendo el protocolo of the Center for Veterinary Biologics Laboratory (CVLB) en Ames, IA en las siguientes muestras: 1) cepa CIAV, Del Ros 2) vacuna contra CIAV comercial adaptada de embrión Intervet (Intervet CIAV), no. de serie 2448003 3) células MSB-1 de paso 1 (P1) de CIAV Intervet trasladado a una dilución de 1:2 4) Sobrenadante de P1 trasladado en una dilución de 1:2 5) células MSB-1 de paso 1 (P1) de CIAV Intervet trasladado en una dilución 1:10 6) Sobrenadante P1 trasladado a una dilución de 1:10 7) células MSB-1 únicamente Los cebadores son: 5' CTA/AGA/TCT/GCA/ACT/GCG/GA 3' y 5' CCT/TGG/AAG/CGG/ATA/GTC/AT 3' Restricción de análisis de enzima. Parte del protocolo de CVBL para verificar además CAV, utiliza análisis de enzima de restricción con Hindlll, que establece que el producto PCR se retira una vez. Para análisis de enzima de restricción, los productos PCR se retiraron fuera del gel de agarosa y el ADN se purificó. Entonces los productos a partir de las muestras celulares se combinaron con las muestras de sobrenadante antes de retirarse con Hindl II.

Resultados. Tabla 1. Amplificación de PCR y análisis de enzima de restricción. M uestra PCR Hindlll Positivo/negativo fragmentos (Pb) CIAV, cepa Del Ros positivo (419pb) 281 y 139 pb CIAV Intervet positivo (419pb) 419pb Dilución 1:2 de células P1 positivo (419pb) 419pb Dilución 1:2 del sobrenadante P1 positivo (419pb) Dilución 1:10 de células P1 positivo (419pb) 419pb Dilución 1:10 de sobrenadante P1 positivo (419pb) Células MSB-1 únicamente Negativo N/A Discusión: Los cebadores utilizados por CVBL se diseñaron para el Cuxhaven-1 aislado que amplifica una región 419pb que inicia en el nucleótido 654 y finaliza en el nucleótido 1072 de la hebra de ADN positiva genómica. Esta región traslapa 3 ORF de los cuales uno codifica para VP-1, proteína capsida. Estos cebadores amplifican la muestra. Sorprendentemente, la enzima de restricción que normalmente retira el producto PCR no retira esta muestra. Esto significa que la muestra es probablemente CAV debido a la amplificación de los cebadores, pero es diferente de Del Ros (Delaware), CI-1 (Maryland) , Cuxahven-1 (Alemania) y el Gifu-1 aislado (Japón). La diferencia en la secuencia de nucleótido puede ser sólo un cambio de base en el sitio Hindlll de manera que el sitio de reconocimiento de enzima se ha alterado. Las diferencias pueden también deberse a muchos cambios base, pero la secuenciación del ADN del producto PCR necesitaría determinar la similaridad entre la cepa Del Ros y la muestra.

EJEMPLO 3 RESULTADOS DE ESTUDIOS EN AVES CIAV-DR Evaluación de patogeneicidad de la cepa CIAV, Del Ros (CIAV-DR): 1) pollos SPF negativos de CAV, de 2 días ; 20 inóculos, 10 controles negativos; 106 9 TCID50 de CIAV-DR en 0.2 mi; por os. 2) Los resultados clínicos y serológicos fueron como siguen: Tratamiento Semana p.i/% Día p.i. (dpi) Val. Hemat. % de % de Día p . i . / Peso Reducción Mortalidad Les. Graves ELISA (total) 1 2 3 14 21 28 28 35 Negativo 0 0 0 39 35 36a 40(NSb) 0 1/6 0/6 Control CAV 0 9 0 32 31 34 0 30 19/20 20/20 Del-Ros aSignifica valores de Hematocritos bNo específico Este estudio demostró que la cepa Del-Ros es de vilurencia baja debido al hecho que tuvo poco o ningún impacto en la velocidad de crecimiento, anemia, mortalidad y lesiones totales cuando se administró a los pollos de edad más susceptible, negativos CIAV mediante una ruta natural (es decir, oral). Sin embargo, la cepa Del-Ros fue suficientemente invasiva para inducir una buena respuesta de anticuerpo (es decir, 100% de ELISA positiva; cantidades suficientes de VN que varían de 1:256-1:1024. Las lesiones totales observadas se restringieron a hemorragias de músculos y médula espina pálida. Evaluación de patogeneicidad de 3 cepas de CIAV; Del-Ros, CAV-9 y Texas: 1) pollos SPF negativos de CAV de 2 días ; 10 pollos por cepa de virus; 5 controles negativos; aproximadamente 105.7 TCID50 de virus en 0.2 mi; IA. 2) Los resultados clínicos y serológicos son como siguen: Tratamiento Semana p.i/% Día p.i. (dpi) Val. Hemat. % de % de Día p . i . / Peso Reducción Mortalidad Les. Graves ELiSA (total) 1 2 3 14 21 28 28 Control 0 0 0 37 33 33* 0 0 0/5 Del-Ros 0 9 0 32 31 34 0 30 9/10 CAV-9 32 0 4 29 28 30 50 70 5/5 Texas 29 0 1 24 25 34 70 70 3/3 *Signif¡ca valores Hematocritos Este estudio demostró que la cepa Texas de CIAV fue suficientemente virulenta para utilizarse como un virus de estímulo inoculado en los pollos susceptibles de 1 ó 2 días por una ruta parenteral (por ejemplo, intra-abdominal). Las lesiones totales observadas incluyeron: atrofia tímica, hemorragia subcutánea e intramuscular, médula espinal pálida, lóbulo de hígado congestionado y alargado y dermatitis gangrenosa.

EJEMPLO 4 UN ESTUDIO CONDUCIDO CON VIRUS DE LA ANEMIA INFECCIOSA DE POLLO, CEPA DEL ROS, POR PASO POSTERIOR DE SERIE EN POLLOS SPF PARA DEMOSTRAR QUE EL VIRUS NO LLEGA SER VIRULENTO INTRODUCCIÓN Se condujo una reversión del animal huésped al estudio de virulencia en el virus de anemia infecciosa de pollo, cepa Del Ros (CIAV-DR) por paso posterior en pollos SPF serológicamente negativos de CIAV: PROCEDIMIENTO La reversión potencial a vilurencia de la vacuna activa contra CIAV-DR por paso posterior serial en el animal huésped se evaluó por observaciones diarias por señales clínicas, las determinaciones del valor Hematocrito y examinaciones en la autopsia para lesiones totales características de CIA. Los pollos utilizados en la reversión del estudio de virulencia fueron CIAV-negativos, SPF de la raza leghorn comprados de SPAFAS, Storrs CT. Se suministraron a los pollos de tres semanas bandas para identificación y en ese tiempo todos se desangraron por serología CIAV para determinar el estado serológico de CIAV (Equipo ELISA; IDEXX CAV) de las aves. En pollos de cuatro semanas, de ocho a treinta (pasos posteriores 2-4) o veinticuatro-veintiocho (pasos posteriores 1 y 5) por pasos posteriores de virus se vacunaron con una dosis de 10 µ? (105·8 TCID50, 1er paso posterior; una suspensión de 20% de un homogenado de tejido común a partir del paso posterior precedente dado en una relación de 10 µ?/ave, 2o a través del 5o paso posterior) a través de la ruta del tejido de las alas. Esta serie de cinco pasos posteriores ocurrió durante un periodo de ocho semanas. El hígado, vaso y timo se removieron de ocho pollos sacrificados por paso posterior en siete días pos vacunación (DPV) para preparar una suspensión del 20% de un homogenado de tejido común (Waring Blender) en un medio RPMI 1640 conteniendo antibióticos, pero no suero y utilizado como la acción activa en la inoculación de pollos para paso posterior y aislamiento del virus en células MSB- de acuerdo con el procedimiento de Yuasa et al. [Nati. Inst. Anim. Health Q (Tokyo) 23:75-77, 1983].

Todos los pollos de cada paso posterior se observaron diariamente para señales clínicas durante siete (pasos posteriores 2-4) o veintiún DPV y se registraron los hallazgos. Se recolectó sangre a partir de todos los pollos restantes en el paso posterior de uno y cinco a catorce y veintiún DPV para determinación de valor Hematocrito. Los pollos sacrificados en siete y veintiún DPV se examinaron para lesiones totales características de CIA. Un análisis de estabilidad fenotípica se condujo en la forma de virus recuperada el quinto paso posterior en pollos cuando se compara por ensayo de anticuerpo fluorescente indirecto estándar (IFA).

RESULTADOS Los resultados obtenidos revelaron que CIAV-Dr no indujo morbilidad y mortalidad, anemia y lesiones totales características de CIA cuando se sometieron a los cinco pasos posteriores en pollos. Adicionalmente, se demostró que el CIAV permaneció fenotípicamente estable en el proceso. Los resultados de las muestras sanguíneas pre-experimentales del estado serológico CIAV, recuperación de virus a partir de los hallazgos de los SÍNTESISs homogenados de tejido y la autopsia y valor Hematocrito a siete, catorce y veintiún DPV para los cinco pasos posteriores se da en las tablas 1-5. Un resumen de la recuperación del virus, valor Hematocrito y resultados de la examinación en la autopsia se dan en la tabla 6.

ARTE PREVIO Esta reversión al estudio de virulencia se condujo con un CIAV-DR activo, administrado por el tejido de las alas a pollos de cuatro semanas, demostró que el virus no revirtió la virulencia cuando se sometió a cinco pasos posteriores seríales, en base a las observaciones clínicas y examinaciones en la autopsia.

Tabla 1. ELISA, Recuperación de Virus, Resultados Hematocritos y autopsia durante el Primer Paso Posterior Serial Hematocríto Ave No. Banda No. ELISA S/N 14d/21d CIAV SGL — 1 1 1.09* 35 /30** Ninguno 2 2 1.15 29/31 Ninguno 3 3 1.13 30/30 Ninguno 4 4 1.16 30/33 Ninguno 5 5 1.25, NA /NA Ninguno 6 6 1.24 35/36 Ninguno 7 7 1.31 NA /NA Ninguno 8 8 0.91 NA / NA Ninguno 9 9 0.77 34/29 Ninguno 10 10 1.06 30/31 Ninguno 11 11 1.14 34/32 Ninguno 12 12 1.25 30/31 Ninguno 13 14 1.32 NA /NA Ninguno 14 15 1.13 34/37 Ninguno 15 16 0.95 31 /27 Ninguno 16 17 1.08 NA / NA Ninguno 17 18 1.14 32/30 Ninguno 18 19 1.2 32/34 Ninguno 19 20 1.3 34/31 Ninguno 20 21 1.35 NA./ NA Ninguno 21 22 1.41 NA / NA Ninguno 22 23 0.96 NA / NA Ninguno 23 25 1.1 30/28 Ninguno 24 26 1.18 34/32 Ninguno 25 27 1.29 32/32 Ninguno 26 29 1.39 29/30 Ninguno 27 30 1.38 35 / 34 Ninguno 28 31 1.04 32/33 Ninguno Recuperación del Virus a partir del Homogenado de Tejido Común = Positivo *Relaciones S/N >0.6 = Negativo (Interpretación del Kiet IDEXX) ** Valor Hematocrito >25 = Negativo *** Lesiones totales Específicas Tabla 2: ELISA, Recuperación de Virus y Resultados autopsia durante el Segundo Paso Posterior serial.

Ave No. Banda No. ELISA S/N CIAV SGL** 1 32 1.06* Ninguno 2 33 1.1 Ninguno 3 34 1.02 Ninguno 4 35 0.93 Ninguno 5 36 1.01 Ninguno 6 37 0.98 Ninguno 7 38 1.03 Ninguno 8 39 1 Ninguno 9 40 0.97 Ninguno 10 41 0.99 Ninguno 11 42 1 Ninguno 12 43 0.96 Ninguno 13 44 0.93 Ninguno Rcuperación de Virus a partir de Homogenado de Tejido Agrupado = Positivo *ReIaciones S/N >0.6 = Negativo (Interpretación del Equipo IDEXX) ** Lesiones totales Específicas Tabla 3: ELISA, Recuperación del virus y Resultados autop durante el Tercer Paso Posterior Serial Ave No. Banda No. ELISA S/N CIAV SGL** 1 45 Ó.9*~ Ninguno 2 46 0.94 Ninguno 3 47 0.61 Ninguno 4 48 0.78 Ninguno 5 49 0.7 Ninguno 6 50 0.84 Ninguno 7 51 0.83 Ninguno 8 52 0.97 Ninguno 9 53 0.88 Ninguno 10 54 0.81 Ninguno 11 55 0.78 Ninguno 12 56 0.83 Ninguno 13 57 0.85 Ninguno Rcuperación de Virus a partir de Homogenado de Tejido Agrupado = Positivo *Relación S/N >0.6 = Negativo (Interpretación del Equipo IDEXX) ** Lesiones totales Específicas Tabla 4: ELISA, Recuperación del Virus y Resultados de autopsia durante el cuarto Paso Posterior Serial.

Ave No. Banda No. ELISA S/N CIAV SGL* 1 59 0.93* Ninguno 2 60 0.9 Ninguno 3 61 0.86 Ninguno 4 62 0.9 Ninguno 5 63 0.88 Ninguno 6 64 0.87 Ninguno 7 67 0.83 Ninguno 8 70 0.95 Ninguno Rcuperación de Virus a partir de Homogenado de Tejido Agrupado = Positivo *Relación S/N >0.6 = Negativo (Interpretación del Equipo IDEXX) ** Lesiones totales Específicas Tabla 6: Resumen de Hematocrito, Recuperación del Virus y Resultados de autopsia de Pollos.

Recuperación Paso Posterior Hematocrito del Virus Autopsia 1 0/20* 1/1** 0/28 2 1/1 0/13 3 1/1 0/13 4 1/1 0/8 5 0/16 1/1 0/24 *Número Positivo/Número en Grupo **Recuperación del Virus para un Homogenado de Tejido Común Tabla 5: ELISA, Recuperación del Virus, Resultados Hematocrito y Autopsia durante el Quinto Paso Posterior Serial. Hematocrito Ave No. Banda No. ELISA S/N 1 d/21d CIAV SGL*** 1 2 0.81* NA /NA Ninguno 2 3 0.61 32 / 34** Ninguno 3 4 0.72 36/31 Ninguno 4 5 0.79 33/32 Ninguno 5 6 0.87 32/35 Ninguno 6 7 1.09 NA /NA Ninguno 7 9 0.7 34/35 Ninguno 8 10 0.79 NA / NA Ninguno 9 11 0.9 NA / NA Ninguno 10 13 0.93 31 / 33 Ninguno 11 14 1.03 NA / NA Ninguno 12 15 0.97 32/35 Ninguno 13 18 0.8 26/30 Ninguno 14 19 0.84 35/33 Ninguno 15 20 0.92 33/33 Ninguno 16 21 0.91 26/32 Ninguno 17 23 1.05 29/35 Ninguno 18 24 0.61 NA /NA Ninguno 19 25 0.89 28/35 Ninguno 20 26 0.92 30/30 Ninguno 21 28 0.97 NA / NA Ninguno 22 29 0.96 33/35 Ninguno 23 30 0.99 32/35 Ninguno 24 31 0.95 NA / NA Ninguno Rcuperación de Virus a partir de Homogenado de Tejido Agrupado = Positivo *Relación S/N >0.6 = Negativo (Interpretación del Equipo IDEXX) ** Valor Hematocrito > 25 = Negativo *** Lesiones totales Específicas EJEMPLO 5 RESULTADOS DEL ESTUDIO DE TRANSMISIÓN VERTICAL Y DE DISPERSIÓN/DERRAMAMIENTO CONDUCIDO EN POLLOS PF SIGUIENDO LA ADMINISTRACIÓN DE MEMBRANA DEL ALA DE UNA VACUNA DEL VIRUS DE ANEMIA DE POLLO VIVO INTRODUCCIÓN Se condujo un estudio de transmisión vertical y de dispersión/derramamiento del animal huésped en pollos SPF, virus de anemia infecciosa de pollo (CIAV)-negativo, un virus de anemia infecciosa del pollo, de raza Del Ros, (CIAV-DR) administrado por la ruta de la membrana del ala. Para evaluar derramamiento y dispersión de la vacuna viva de CIAV en los en los controles de contacto, los hisopos de cloaca se colectaron a partir de pollos control de contacto y vacunados durante un periodo de pos-vacunación (p.v.) de 4 semanas y se evaluaron por aislamiento de virus en células MSB- . Para evaluar la transmisión vertical (es decir, p.v.) de vacuna activa contra CIAV, los grupos de hígados de embriones de 19 días derivados de huevos puestos por gallinas vacunadas se evaluaron por el virus mediante el aislamiento en células MSB-1 y por la detección de PCR.

PROCEDIMIENTO Los métodos utilizados para determinar la transmisión vertical y dispersión/derramamiento de un nuevo virus de la semilla maestra CIA se condujeron en pollos SPF, CIAV-negativos, vacunados a las 12 semanas. La dispersión y derramamiento posibles de la vacuna CIAV administrada en la membrana del ala (virus activo) se evaluó recolectando hisopos de cloaca a partir de pollos de control vacunados y de contacto durante un periodo de 4 semanas p.v. seguidos por los intentos de aislamiento en células MSB-1. La posibilidad de transmisión vertical de la vacuna CIAV viva se examinó analizando grupos de hígados de embriones de 19 días derivados de todos los huevos fértiles puestos por todas las gallinas vacunadas por virus mediante el aislamiento en células MSB-1 y por detección de PCR. Los hígados de los embriones a partir de 3 puestas de huevos de las gallinas de control negativo se evaluaron en la misma manera. Los pollos utilizados en el estudio de transmisión vertical y la dispersión/derramamiento fueron negativos de CIAV, de la raza leghorn SPF (aves SPF L103) compradas de SPAFAS. Se les colocaron banda a las aves para identificación. Diez pollos seleccionados aleatoriamente a 12 semanas de edad se desangraron por serología CIAV para confirmar el estado negativo (ELISA; equipo IDEXX CAV) de las aves. En el mismo día, treinta y siete pollos (30 hembras y 7 machos) se vacunaron con una dosis de 10 pl (104'3 TCID50) de la vacuna CIAV viva por la ruta del tejido de las alas. Quince hembras (misma fuente e incubación) se intermezclaron con las vacunas como controles de contacto. Los pollos de control negativo a partir de la misma fuente e incubación se mantuvieron. Los pollos de ambos grupos se observaron diariamente por morbilidad y mortalidad y se registraron los hallazgos por la duración del periodo de estudio. Las colecciones de hisopos de cloaca a partir de los quince pollos vacunados aleatoriamente seleccionados y los quince controles de contacto se hicieron en 3-7 días de intervalos durante un periodo de 4 semanas p.v. Los hisopos de cloaca se agruparon por el reaislamiento de virus combinando 3 grupos de 5 hisopos por tratamiento por tiempo de muestra. Se hicieron intentos de recuperación de virus en células MSB-1 de acuerdo al procedimiento de Yuasa et al. [Nati. Inst. Anim. Health Q (Tokyo) 23:75-77, 1983]. Los hígados se recolectaron asépticamente a partir de embriones vivos y muertos (derivados de huevos fértiles puestos por gallinas vacunadas y de contro.l negativo durante un periodo de 3 semanas p.v.) en 19 días de incubación y almacenado/empacado (-20°C) en grupos de 3-6 hígados para futuro procesamiento. Veinte por ciento (p/v) de las suspensiones de hígado (grupos) se prepararon en medio RPMI 1640 más 5% de FBS para reaislamiento de virus en células MSB-1 de acuerdo al procedimiento de Yuasa et al. [Nati. Inst. Anim. Health Q (Tokyo) 23:75-77, 1983]. Antes de iniciar el procedimiento de aislamiento CIAV en gallinas prueba, se condujo una evaluación de la sensibilidad del método de aislamiento CIAV subrayado en el "protocolo de transmisión vertical y derramamiento/dispersión". Brevemente, este procedimiento implicó cosechar hígados a partir de embriones SPF libres de anticuerpos CIAV a 19 días de incubación y preparando cuatro grupos de cinco hígados cada uno. Un grupo de hígado se mantuvo como un control negativo; los segundos, terceros y cuartos grupos se inocularon con 10, 100 y 1000 TCID5o de CIAV por gramo de tejido, respectivamente.

En adición a los ensayos de reaislamiento del virus conducidos, se abordaron intentos para detectar CIAV por PCR de acuerdo al procedimiento de Taylor and Ryncarz (Center for Veterinary Biologics Laboratory, NVSL, VS, APHIS, USDA, Ames, IA).

RESULTADOS Los resultados revelaron que 104 3 TCID50 del CIAV-DR administrado a reproductores a 12 semanas a través de la membrana del ala se derrama tanto como 21 días y que se dispersará para controles de contacto. Sin embargo, el virus no se transmitió vertica Imente por reproductores en su progenie como se demuestra por el reaislamiento del virus y análisis de PCR. Los reproductores no mostraron ningún efecto clínico adverso a partir de la administración de la vacuna. Los resultados de ELISA en muestras sanguíneas pre-experimentales confirmaron que los pollos utilizados en este estudio fueron negativos de anticuerpos CIAV (tabla 1). Los resultados de los intentos de reaislamiento del virus en grupos de hisopo cloacal de vacunas y controles de contacto se registran en la tabla 2. Estos datos muestran que CIAV estuvo siendo derramado por vacunas tan pronto como 3 días p.v. y este derrame continuó hasta 21 días p.v., pero no 28 días p.v. Adicionalmente, los datos muestran que el derrame de CIAV fácilmente dispersó los controles de contacto quienes también derramaron el virus durante un periodo de tiempo similar. Un resumen del reaislamiento del virus e intentos de detección PCR en suspensiones de hígado de embrión derivadas de los huevos fértiles de vacunas y controles negativos se dan en la tabla 3. Estos datos revelan que CIAV no podría aislarse a partir de las suspensiones del hígado de embriones de controles y vacunas negativas por paso en células MSB- o detectarse por PCR. Los resultados de la evaluación de la sensibilidad de aislamiento de CIAV en células MSB-1 demostró que los niveles variantes de CIAV (es decir, 10-1000 TCID50/gramos de tejido) se detectó por este método siguiendo diversos pasos de cultivo celular (tabla 4). Hubo correlación completa en los resultados obtenidos utilizando estos dos métodos en las muestras de prueba.

SÍNTESIS Este estudio de transmisión vertical y dispersión/derramamiento se basó en un esfuerzo para aislar y/o detectar CIAV activo en hisopos de cloaca y huevos fértiles (es decir, suspensiones de hígado de embrión) recolectadas a partir de los tejidos de ala vacunado (104 3 TCI Dso/dosis) y gallinas control negativas. Los resultados demuestran que el virus se derramó y dispersó durante un periodo de tiempo limitado (21 dpv) pero que ese virus no se transmitió verticalmente cuando se administró a 12 semanas.

Tabla 1: Resultados ELISA de la Muestra Sanguínea Pre-Experimental CIAV Estado Ave No. Banda No. Relación S/N Serológico 1 554 0.91 Nega 2 557 0.93 Neg. 3 565 0.92 Neg. 4 566 0.96 Neg. 5 574 0.96 Neg. 6 579 1 Neg. 7 584 1 Neg. 8 585 1 Neg. 9 731 0.99 Neg. 10 740 0.99 Neg. 1 Negativo = Relación S/N > 0.6 (IDEXX Equipo de Interpretación) Tabla 2: Dispersión/Derramamiento: Resumen del Reaislamiento del Virus a partir de Grupos de Hisopo Cloacal de Pollos Control de Contacto y Vacunados. Hisopo Grupos de Hisopo Control en Contacto del Cloacal (dpy)' Cloacal Vacunados Grupo de Hisopo Cloacal 1 2 3 I 2 J 3 N pe N N N P 7 P P P P P P 12 N P N N P N 16 P P N N N P 21 P P P P N N 28 N N N N N N aRecolección de Hisopo Cloacal (Días Pos Vacunación). bNegativo cPositivo = Característica CIAV CPOE Observadas Tabla 3: Transmisión Vertical: Resumen del Reaislamiento del Virus y Ensayos de Detección PCR en Suspensiones de Hígado de Embrión Derivadas de los Huevos Fértiles de Vacunas y Controles Negativos .

Tratamiento Reaislamiento de Virus Detección PCR Ia 0/12b 0/12 2ac 0/17 0/17 2b 0/15 0/15 2c 0/19 0/19 2d 0/18 0/18 Pos. Con.d 6/6 5/6 Neg. Con.6 0/6 0/6 aControles Negativos SPAFAS bNúmero Positivo/Total Probado °Vacunas - cuatro grupos (2a-2d) dControles Positivos (MSB-1 Cepas Del-Ros y Texas Prop de CIAV) eControles Negativos (células MSB-1 y/o Mezcla Reactiva) Tabla 4: Resultados de Evaluación de Sensibilidad de Aislamiento CIAV Pasajes MSB-1 Tratamiento 1 2 3 4 5 6 10 TClDso" 0/5b 0/5 0/5 0/5 0/5 5/5 100TC1D™ 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 5/5 1000 TClDo 0/5 0/5 0/5 0/5 3/5 5/5 Uninf. Cont.c 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 aTCID50/Gramo de Tejido "Número Positivo (Característica de CIAV CPE Observada)/Total °Controles No infectados EJEMPLO 6 ESTUDIO DE EFICACIA CONDUCIDO EN LA PROGENIE DE POLLOS SPF 34 Y 49 SEMANAS SIGUIENDO LA ADMINISTRACION EN LA MEMBRANA DEL ALA DE UNA VACUNA CONTRA VIRUS DE ANEMIA DE POLLO VIVO INTRODUCCIÓN Un estudio para evaluar la eficacia y duración de la vacuna de inmunidad (DOl) a 34 y 49 semanas pos vacunación de la membrana del ala se condujo por progenie de estímulo de un día de gallinas vacunadas con un virus de anemia infecciosa de pollo, cepa Del Ros (CIAV-DR). El estudio evaluó la protección del anticuerpo maternal CIAV (inmunidad pasiva) proporcionada a polluelos contra un estímulo con CIAV virulento.

PROCEDIMIENTO La eficacia y duración de la inmunidad de los que se condujeron en la progenie de pollos SPF, negativos de CIAV, del membrana dos a 9 semanas con vacuna CIAV administrada a través de la ruta del tejido de las alas. La duración de la inmunidad se evaluó estimulando la progenie, empollada a partir de huevos fértiles puestos por gallinas a las 34 y 49 semanas posvacunación, seguido por observaciones para señales clínicas, determinaciones de valor Hematocrito y exanimaciones de autopsia durante las lesiones totales características de CIA. Los pollos utilizados en este estudio fueron CIAV-negativos, de la raza leghorn SPF adquiridos de SPAFAS. A las aves se les colocó una banda en las alas para identificación. Diez pollos seleccionados aleatoriamente de 9 semanas se sangraron por serología CIAV para confirmar el estado serológico negativo (ELISA, Equipo IDEXX CAV) de las aves. En el mismo día, 70 pollos (60 hembras y 10 machos) se vacunaron con una dosis de 10 µ?4'2 TCID50) de la vacuna CIAV viva por la ruta del tejido de las alas. Se mantuvieron los pollos de control negativos a partir de la misma fuente y empollada. La dosis se determinó como el promedio de cantidades suficientes de 5 replicados conducidos inmediatamente después de la vacunación. Los pollos de ambos grupos se observaron diariamente para morbilidad y mortalidad y se registraron los hallazgos durante la duración del periodo de estudio.

Una recolección de una semana de huevos a partir de 52 gallinas vacunadas (43 semanas) se utilizaron para evaluar la progenie de reproductores a 34 semanas pos vacunación CIAV (DOI Prueba 2). Una segunda semana de recolección de huevos de 48 gallinas vacunadas (58 semanas para evaluar la progenie de reproductores a 49 semanas pos vacunación CIAV (DOI Prueba 3). Polluelos de cuarenta días, cada uno a partir de reproductores vacunados y Sin Vacunar contra CIAV se estimularon con SÍNTESIS de homogenado de hígado derivado de polluelos inoculados con un aislado de campo Texas de CIAV. Cada polluelo se inoculó intra-abdominalmente con 102·6 CID50 aproximadamente por 0.2 mi. Los grupos control negativos consistieron de 25 polluelos. Los polluelos de todos los grupos de tratamiento se mantuvieron en aisladores de presión negativa, de aire filtrado por separado, y se observaron diariamente por depresión, plumas enredadas y mortalidad. Se recolectaron muestras sanguíneas a partir de todos los polluelos en 14 y 21-22 días de la posestimulación para determinaciones de valor Hematocrito como una medición de anemia. El procedimiento utilizado para determinar los valores Hematocritos fue aquel de Rosenberger and Cloud (Avian Dis. 33:753-759, 1989). Adicionalmente, los polluelos de todos los grupos de tratamiento se examinaron por lesiones totales de hígado y bazo y lesiones hemorrágicas en la piel y los músculos) en 21-22 días pos-estimulación. Las comparaciones de tratamiento se basaron en el número de individuos dentro de un tratamiento (por examinado total) exhibiendo lesiones totales específicas de CIA.

RESULTADOS Los resultados de las dos pruebas de estímulo DOT, reportadas en la presente, demuestran que 104'2 TCID50 de virus administrado a los reproductores a 9 semanas de edad a través de la progenie protegida de la membrana del ala contra la morbilidad y mortalidad, anemia y lesiones totales características de CIA a través de 49 semanas pos vacunación como se determinó por evaluación estadística. Se encontraron los resultados ELISA de la muestra sanguínea del pre-estudio para confirmar el estado negativo de CIAV de los pollos semi-maduros adquiridos a partir de SPAFAS para el uso en este estudio y se presentan en la tabla 1. Los resultados de las determinaciones de valor Hematocrito, hallazgos de signos clínicos y exanimaciones de autopsia de polluelos de un día estimulados y no estimulados con CIAV se registraron en las tablas 2, 3 y 4 (Prueba 2 DOI) y 8, 9 y 10 (Prueba 3 DOI); las tablas 5 y 11, respectivamente, resumen esta información. Los polluelos con lesiones totales clasifican >_ 1, para cualquiera de los tejidos examinados (es decir, hígado, músculo, médula ósea y timo), se registraron como CIA positivo (tablas 5 y 11). La muerte de los polluelos (tabla 2; derivada de reproductores vacunados contra CIAV) numerados 3, 8, 22, 26, 27 y 40 en prueba 2 DOI resultaron de sofocación en un guante protector. Las evaluaciones estadísticas (prueba de Probabilidad Exacta Fisher; tablas 6 y 12) de valores Hematocritos y señales clínicas de los polluelos de Prueba 2 y 3 revelaron que la progenie de CIAV reproductores vacunados contra Sin Vacunar se protegieron contra anemia y mortalidad en un nivel estadísticamente significativo (p <0.001) cuando se estimularon con un aislamiento de campo virulento de CIAV. Una diferencia estadísticamente significativa (p = 0.027) en morbilidad se demostró entre la progenie estimulada en la Prueba 3 DOI. La evaluación estadística (Prueba Mann-Wh itney; tablas 7 y 13) de los resultados de lesión total revelaron hallazgos similares como aquellos reportados anteriormente, es decir, una diferencia significante y en la médula espinal (p <0.001 y p = 0.021, respectivamente) y timo (p <0.001) resultados de lesión total de progenie derivada de reproductores vacunados y Sin Vacunar. No se demostraron diferencias significativas para lesiones de hígado y músculo entre la progenie estimulada.

SÍNTESIS Esta evaluación de la duración de eficacia e inmunidad de la vacuna se basó en un estímulo intra abdominal de un día de la progenie derivada de los reproductores vacunados a 9 semanas con vacuna CIAV-DR de hígado administrada por la ruta de la membrana del ala. Los resultados revelaron que la vacuna de CIAV Indujo anticuerpos maternales que protegieron a los polluelos en una diferencia estadísticamente significativa de p <0.05, contra un estímulo virulento con una cepa de campo de CIAV, basada en la evidencia de la anemia en 14 y 21 días postestímulo, señales clínicas y lesiones totales de la médula espinal y timo cuando se comparan a los pollos de control de estímulo.

Tabla 1: Resultados ELISA de Muestra Sanguínea Pre-Experimental de Pollos de 9 Semanas de Edad Antes de la Vacunación con CIAV Administrada en la Membrana del ala para Confirmar el Estado Serológico Negativo Ave No. Banda No. Relación S/N CIAV Estado Serolóqico3 1 602 0.88 Negb 2 608 0.84 Neg 3 616 0.9 Neg 4 620 0.81 Neg 5 621 0.78 Neg 6 627 0,85 Neg 7 631 0.87 Neg 8 634 0.82 Neg 9 644 0.85 Neg 10 661 0.7 Neg Estado Serológico de CIAV Negativo = Relaciones S/N >0.6 (Interpretación de Equipo IDEXX) Tabla 2: Valores Hematocritos de la Prueba 2, Señales Clínicas y Resultados de Lesión Total CIA de Polluelos Estimulados en las 34 semanas Después de la Vacuna CIA Administrada a la Membrana del ala.

Valores He mato c ritos Señales Clínicas3 Resultado de Lesión Total Ave No. 14 Días 21 Días Mor./Mort.c Hígado BMd Timo Músculo pe 1 28 35 N/N oc 0 0 0 2 33 32 N/N 0 0 0 0 3 35 NDf N/NCAM£ 0 0 0 0 4 32 39 N/N 0 0 0 0 5 32 34 N/N 0 0 0 0 6 26 27 N/N 0 0 0 0 7 28 32 N/N 0 0 0 0 8 32 D N/NCA 0 0 0 0 9 32 33 N/N 0 0 0 0 10 32 24" N/N 0 2 1 1 11 26 12 P/N' 0 2 2 0 12 33 26 N/N 0 2 2 0 13 27 31 N/N 0 0 0 0 14 32 35 N/N 0 0 0 0 15 33 32 N/N 0 0 0 0 16 60 39 N/N 0 0 0 0 17 58 37 N/N 0 0 0 0 18 30 24 N/N 0 1 2 0 19 33 34 N/N 0 0 0 0 20 21 17 N7N0 0 3 2 0 21 58 35 N/N 0 0 0 0 22 32 ND N/NCAM 0 0 0 0 23 33 37 N/N 0 2 1 0 24 34 36 N/N 0 0 0 0 25 29 33 N/N 0 0 0 0 Continúa en la siguiente página Tabla 2. (continuación) Valores Hematocrítos de Prueba 2, Señales Clínicas y Resultados de Lesión Total de CIA de Pollos Estimulados a 34 Semanas Después de la Vacuna CIA Administrada en la Membrana del ala.

Valores Hematocrítos Señales Clínicas9 Resultado de Lesión Total Ave No. 14 Días 21 Días Mor./Mort.° Hígado BMd Timo Músculo ES. pe 26 30 NDf N/NCAM6 Oe 0 0 0 27 34 ND N/NCAM 0 0 0 0 28 35 32 N/N 0 0 0 0 29 35 27 N/ 0 0 0 0 30 28 23h N/N 0 1 2 0 31 30 31 N/N 0 0 0 0 32 ND ND N/P 0 0 0 0 33 33 35 N/N 0 0 0 0 34 34 41 N/N 0 0 0 0 35 27 36 N/N 0 0 0 0 36 32 34 N/N 0 0 0 0 37 30 21 N/N 0 0 0 0 38 33 36 N/N 0 0 0 0 39 31 34 N/N 0 0 0 0 40 30 ND N/NCAM 0 0 0 0 Pos./Tot.j 1/39 6/33 1/40/1/34 0/40 7/40 7/40 1/40 Señales Clínicas Post Estímulo Morbilidad (Depresión y/o Plumas Enredadas)/Mortalidad Médula Espinal 0 = Normal; 1 = Ligera; 2 = Moderada; 3 = Intensa No hecha fNo Hecha 9Mortalidad Asociada Negativa/Sin CIAV hVaiores Hematocritos de ±25 = Anemia 'Negativo/Positivo (Mortalidad Asociada con CIAV) 'Número Positivo/Total Tabla 3: Valores Hematocritos de la Prueba 2, Señales Clínicas y Resultados de Lesión Total CIA de Poliuelos Estimulados a partir de Reproductores Sin Vacunar.

Valores Hematocritos Señales Clínicas" Resultado de Lesión Total Ave No. 14 Días 21 Días or./ ort.= Hígado Timo Músculo E¿ Day pe 1 23c NDf N/Pe 0" 2 3 1 2 18 ND NP 0 2 2 0 3 29 22 N/N 0 0 0 0 4 26 20 PN 0 0 3 0 5 20 ND NP 0 3 2 1 6 28 26 NN 0 0- 0 0 7 21 57 N/N 0 0 3 0 8 20 ND N/P 0 3 3 0 9 21 21 N/N 0 2 2 0 10 18 ND N/P 0 3 3 2 11 32 24 N/N 0 2 1 0 12 21 ND N/P 0 3 3 1 13 26 24 N/N 0 0 0 0 14 25 19 N/N 0 0 1 0 15 25 45 N/N 0 2 1 0 16 28 30 N/N 0 2 3 0 17 27 10 PN 0 3 3 0 18 16 ND P/P 0 2 2 0 19 22 25 N/N 0 0 0 0 20 18 24 N/N 0 0 2 2 21 20 ND N/P 0 3 2 1 22 28 20 N/N 0 1 3 0 23 26 15 P/N 0 2 1 0 24 22 28 N/N 0 0 0 0 25 17 ND P/P 2 3 3 n Continúa en la siguiente página Tabla 3: (continuación) Valores Hematocritos de la Prueba 2, Señales Clínicas y Resultados de Lesión Total CIA de Polluelos Estimulados a partir de Reproductores Sin Vacunar.

Valores Hematocritos Señales clínicas9 Resultado de Lesión Total Ave No. 14 Días 21 Días Mor./ ort.c Hígado BMd Timo Músculo pe 1 26 24c 30 N/N oh 0 2 0 27 40 56 N/N 0 2 2 0 28 30 15 N/N 0 2 2 0 29 29 29 N/N 0 0 .0 0 30 27 N/N 0 1 2 0 31 25 32 N/N 0 1 2 0 32 25 13 P/N 0 3 3 0 33 21 27 N/N 0 0 0 0 34 28 21 N/N 0 2 2 0 35 30 28 N/N 0 0 ,0 0 36 30 NDf N/Pg 0 3 '3 1 37 28 23 N/N 0 0 0 0 38 70 13 N/N 0 2 1 0 39 23 25 N/N 0 0 1 0 40 25 27 N/N 0 0 0 0 Pos.Tot.' 22/40 17/30 6/40/ 10/40 1/40 24/40 30/40 8/40 'Señales' Clínicas 'Post Estímulo 'Morbilidad (Depresión y/o Plumas Enredadas)/Mortalidad 'Médula Espinal Valores Hematocritos <_ 25 = Anemia Ninguno 'Negativo/Positivo (Mortalidad Asociada con CIAV) ? = Normal; 1 = Ligero; 2 = Moderno; 3 = Intensa Número Positivo/total Tabla 4: Valores Hematocritos de la Prueba 2, Señales Clínicas y Resultados de Lesión Total CIA de Polluelos a partir de Reproductores Sin Vacunar; No estimulados. Valores Hematocritos Señales clínicas8 Resultado de Lesión Total Ave No. 14 Días 21 Días Mor./Mort.c Hígado BMD Timo Músculo ES! pe 1 37 38 NNc 0r 0 0 0 2 38 35 N/N 0 0 0 0 3 35 30 N/N 0 0 0 0 4 40 35 N/N 0 0 0 0 5 36 37 N/N 0 0 0 0 6 38 36 NN 0 0 0 0 7 35 36 NN 0 0 0 0 8 28 38 N/N 0 0 0 0 9 NSC 35 N/N 0 0 0 0 10 31 NS N/N 0 0 0 0 11 36 36 N/N 0 0 0 0 12 37 35 N/N 0 0 0 0 13 36 33 N/N 0 0 0 0 14 31 42 N/N 0 0 0 0 15 39 40 N/N 0 0 0 0 16 35 37 N/N 0 0 0 0 17 40 36 N/N 0 0 0 0 18 35 33 N/N 0 0 0 0 19 32 35 N/N 0 0 0 0 20 33 35 N/N 0 0 0 0 21 30 45 N/N 0 0 0 0 22 39 39 N/N 0 0 0 0 Tabla 4 continúa en la siguiente página Valores Hematocritos Señales Clínicas3 Resultado de Lesión Total Ave No. 14 Días 21 Días Mor./Mort.^ Hígado BMd Timo Músculo B¿ pe 23 34 40 N/N 0 0 0 0 24 33 38 ' N/N 0 0 0 0 25 35 27 N/N 0 0 0 0 Pos./Toc.h 0/24 0/24 0/25/0/25 0/25 0/25 0/25 0/25 aSeñales Clínicas bPost Estímulo cMorbilidad (Depresión y/o Plumas Enredadas)/Mortalidad dMédula Espinal eNegativo /Negativo f0 = Normal; 1 = Ligero; 2 = Moderado; 3 = Intenso 9Sin muestra hNúmero Positivo/Total Tabla 5: Resumen de la Morbilidad, Mortalidad Hematocrítica de la Prueba 2 y Resultados de lesión total CIA de Polluelos Estimulados y no Estimulados.

Grupo de Hematocrito Morbilidad Mortalidad PMJ Prueba CIAV 6/39 (15%)c 1/40 (3%) 1/34 (3%) 7/40 (18%)d Vacunado13 Sin 33/40 (83%) 6/40 (15%) 10/40 (25%) 30/40 (75%) Vacunar13 Control 0/25 0/25 0/25 0/25 Negativo aResultados de lesión total CIA Autopsia bGrupo de Estímulo cNúmero Positivo de Polluelos/Total dPolluelos Positivos = Resultados de lesión total >_ 1 Tabla 6: Evaluación Estadística de los Valores Hematocritos de la Prueba 2 y Señales Clínicas de CIA de Polluelos Estimulados Utilizando Prueba de Probabilidad Exacta de Fisher Valores Hematocritos Señales Clínicas Grupo de 14 Días p c a 21 días pe Morbilidad Mortalidad Combinado Prueba CIAV 1/39 6/33 1/40 1/34 6/40 Vacunado No 22/40 17/30 6/40 10/40 34/40 Vacunado Valor p <0.001 0.002 0.054 0.007 <0.001 aPost Estímulo Valores Hematocritos Combinados y Señales Clínicas Tabla 7. Evaluación Estadística de las Resultados de Lesión Total de CIA de la Prueba 2 de Polluelos Estimulados a partir de Reproductores Vacunados y Sin Vacunar utilizando la Prueba de Mann-Whitney.

Resultados de lesión total3 Hígado BMb Ti mo Músculo Combinado0 Valor p 0.847 <0.001 <0.001 0.173 <0.001 aDatos naturales Encontrados en las Tablas 2 y 3 "Médula Espinal °Resultados de Lesión Total Combinada Tabla 8: Valores Hematocritos de la Prueba 3, Señales Clínicas y Resultados de Lesión Total de CIA de Polluelos Estimulados a 49 Semanas después de la Vacuna de CIA Administrada en la Membrana del ala.

Valores Hematocritos Señales Clínicas3 Resultado de Lesión Total Ave No. 14 Días 21 Días Mor.JW1ort.= Hipado BMd Timo Músculo 1 31 45 N/Nc o' 0 0 0 2 30 32 N/N 0 0 0 0 3 34 34 N/N 0 0 0 0 4 28 28 N/N 0 0 0 0 5 33 23g N/N 0 0 0 0 6 32 30 N/N 0 0 0 0 7 24 36 N/N 0 0 0 0 8 49 32 N/N 0 0 0 0 9 35 30 N/N 0 0 0 0 10 31 31 N/N 0 0 0 0 11 34 27 N/N 0 c 0 0 12 33 35 N/N 0 0 0 0 13 43 27 N/N 0 0 0 0 14 41 33 N/N 0 0 0 0 15 25 30 N/N 0 0 0 0 16 35 31 N/N 0 0 0 0 17 30 32 N/N 0 0 0 0 18 32 35 N/N 0 0 0 0 19 30 33 N/N 0 0 0 0 20 32 28 N/N 0 0 0 0 2] 33 32 N/N 0 0 0 0 22 34 33 N/N 0 0 0 0 23 29 30 N/N 0 0 0 0 24 30 27 N/N 0 0 2 0 25 29 30 N/N 0 0 0 0 Continúa en la siguiente página Tabla 8: (continuación) Valores Hematocritos de la Prueba 3, Señales Clínicas y Resultados de Lesión Total de CIA de Pollueios Estimulados a 49 Semanas Después de la Vacuna de CIA Administrada en la Membrana del ala.

Valores Hematocritos Señales Clínicas9 Resultado de Lesión Total Ave No. 14 Días 21 Días Mor./Mort.c Híqado BMd Timo Músculo 26 30 28 N/N1 0f 0 0 0 27 52 30 N/N 0 0 0 0 28 35 35 N/N 0 0 0 0 29 30 27 N/N 0 0 0 0 30 50 26 N/N 0 0 1 0 31 35 31 N/N 0 0 0 0 32 35 34 N/N 0 0 0 0 33 20B 30 N/N 0 0 0 0 34 31 30 N/N 0 0 0 0 35 32 28 N/N 0 0 0 0 36 30 37 N/N 0 0 0 0 37 35 38 N/N 0 0 0 0 38 34 32 N/N 0 0 0 0 39 35 30 N/N 0 0 0 0 40 31 32 N/N 0 0 0 0 Pos/Tot.h 3/40 1/40 0/40/0/40 _0/40 0/40 2/40 0/40 aSeñaies Clínicas Post Estímulo cMorbilidad (Depresión y/o Plumas Enredadas)/MortaIidad dMédula Espinal eNegativo/Negativo f0 = Normal; 1 = Ligero; 2 = Moderado; 3 = Intenso gValores Hematocritos de £ 25 = Anemia hNúmero Positivo/Total Tabla 9: Valores Hematocritos de la Prueba 3, Señales Clínicas Resultados de Lesión Total de CIA de Polluelos Estimulados a partir de Criadores Sin Vacunar.

Valores Hematocritos Señales Clínicas" Resultado de Lesión Total Ave No. 14 Días 21 Días Mor./Mort= Híflado BMd Timo Músculo 1 ¡9e NDf N/P5 2h 2 3 2 22 32 N/N 0 0 0 0 3 50 ND P/P 0 0 3 0 4 32 28 N/N 0 0 2 0 5 31 27 N/N 0 2 0 0 6 32 29 N/N 0 0 0 0 7 26 19 N/N 0 0 2 0 8 30 27 N/N 0 0 0 0 9 23 ND P/P 0 2 2 0 10 17 29 N/N 0 0 0 0 11 23 35 N/N 0 0 0 0 12 20 ND N/P 0 3 3 0 13 18 ND P/P 0 0 2 0 14 22 ND N/P 0 3 1 15 44 13 N/N 0 2 2 0 16 30 32 N/N 0 0 1 0 17 14 ND N/P 0 0 3 0 18 31 26 N/N 0 0 1 0 19 20 ND N/P 0 2 3 0 20 23 10 N/N 0 2 2 0 21 33 20 N/N 0 0 2 0 22 23 ND P/P 0 0 3 0 23 22 ND N/P 0 0 3 0 24 29 27 N/N 0 2 2 0 25 30 15 N/N 0 0 1 0 Continúa en la siguiente página Tabla 9: (continuación) Los valores Hematocritos de la Prueba 3, Señales Clínicas y Resultados de lesión total de CIA de Polluelos Estimulados a partir de Reproductores Sin Vacunar. Valores Hematocritos Señales Clínicas3 Resultado de Lesión Total Ave No. 14 Días 21 Días MorJMort." Hígado BM! Timo Músculo 26 29 35 N/IN 0H 0 0 0 27 24' 33 tf/N 0 0 0 0 28 27 20 N/N 0 0 0 0 29 32 19 N7 0 2 1 0 30 25 NDF P/P 2 0 3 1 31 22 18 N/N 0 1 2 0 32 33 34 N/N 0 0 0 0 33 23 ND N/PE 0 2 3 0 34 25 35 N/N 0 0 0 0 35 16 ND N/P 0 o' 3 0 36 28 15 N/N 0 0 0 0 37 29 25 N/N 0 0 0 0 38 30 32 N/N 0 0 0 0 39 29 25 N;/N 0 0 2 0 40 3'1 23 N7N 0 0 0 0 Pos./Tot.1 19/40 12/27 5/40 13/40 2/40 12/40 25/40 3/40 aSeñales Clínicas bPost Estímulo cMorbilidad (Depresión y/o Plumas Enredadas)/Mortalidad dMédula Espinal eValores Hematocritos <_ 25 = Anemia fNo hecho 9Negativo/Positivo (Mortalidad Asociada con CIAV) h0 = Normal; 1 = Ligera; 2 = Moderada; 3= Intensa 'Número Positivo/Total Tabla 10: Valores Hematocritos de la Prueba 3, Señales Cl Resultados de lesión total de Cia de Polluelos a partir de Reproductores Sin Vacunar; No Estimulados. Valores Hematocritos Señales Clínicas* Resultado de Lesión Total Ave No. 14 Días 21 Días Mor./Mart Hígado BMd Timo Músculo 1 35 34 N/Nc Or 0 0 0 2 39 35 N N 0 0 0 0 3 33 34 N/N 0 0 0 0 4 37 35 N/N 0 0 0 0 5 38 33 N/N 0 0 0 0 6 32 35 N/N 0 0 0 0 7 35 37 N/N 0 0 0 0 8 29 39 N/N 0 0 0 0 9 35 36 N/N 0 0 0 0 10 32 37 N/N 0 0 0 0 11 33 38 N/N 0 0 0 0 12 33 34 N/N 0 0 0 0 13 31 35 N/N 0 0 0 0 14 30 35 N/N 0 0 0 0 15 36 40 N/N 0 0 0 0 16 30 39 N/N 0 0 0 0 17 30 38 N/N 0 0 0 0 18 30 36 N/N 0 0 0 0 19 40 35 N/N 0 0 0 0 20 35 35 N/N 0 0 0 0 21 35 35 N/N 0 0 0 0 22 35 33 N/N 0 0 0 0 23 34 41 N/N 0 0 0 0 24 28 41 N/N 0 0 0 0 25 32 38 N/N 0 0 0 0 Pos. Tot.8 0/25 0/25 0/25 / 0/25 0/25 0/25 0/25 0/25 aSeñales Clínicas bPost Estimulación C o rb i I i d ad (Depresión y/o Plumas Enredadas)/Mortalidad dMédula Espinal eNegativa/Negativa f0 = Normal; 1 = Ligera; 2 = Moderada; 3 = Severa 9Número Positivo/Total Tabla 11: Resumen del Hematocrito de la Prueba 3, Morbilidad, Mortalidad y Lesión Total de Polluelos Estimulados y No Estimulados. Grupo de Prueba Hermatocrito Morbilidad Mortalidad PMa CIAV Vacunado» 4/40 (10%)c 0/40 0/40 2/40 (5%)d Sin Vacunar" 29/40 (73%) 5/40(13%) 13/40(33%) 26/40(65%) Control Negativo 0/25 0/25 0/25 0/25 aResultados de Lesión Total de CIA de Autopsia bGrupo Estimulado °Número Positivo/Total dPolluelos Positivos = Resultados de lesión total >_ 1 Tabla 12: Evaluación Estadística de Valores Hematocritos de la Prueba 3 y Señales Clínicas de Polluelos Estimulados utilizando Prueba de la Probabilidad Exacta Fisher Valores Hematocritos Señales Clínicas Grupo de Prueba 14 Días pea 21 Días pe Morbilidad Mortalidad Combinado CIAVVacunado 3/40 1/40 0/40 0/40 4/40b Sin Vacunar 19/40 12/27 5/40 13/40 30/40 Valor positivo <0.001 <0.001 0.027 <0.001 <0.001 aPos Estímulo bValores Hematocritos Combinados y Señales Clínicas Tabla 13: Evaluación Estadística de los Resultados de Lesión Total de CIA de la Prueba 3 de Polluelos Estimulados a partir de Reproductores Vacunados y Sin Vacunar utilizando la Prueba Mann-Whitney Resultados de lesión total3 Hígado BMb Timo Músculo Combinado0 Valor p 0.7 0.021 <0.001 0.5637 <0.001 aDatos Naturales Encontrados en las Tablas 8 y 9 bMédula Espinal °Resultados de Lesión Total Combinada EJEMPLO 7 EFICACIA DE UNA VACUNA CONTRA EL VIRUS DE ANEMIA DE POLLO EVALUADA POR PROTECCIÓN DE ANTICUERPO MATERNO DE PROGENIE A PARTIR DE POLLOS DE 27 Y 37 SEMANAS DESPUÉS DE LA ADMINISTRACIÓN DE LA VACUNA CON AGUA INTRODUCCIÓN La eficacia y duración del animal huésped de estudios de inmunidad se condujeron en pollos estimulados por progenie de un día a partir de gallinas de 27 y 37 semanas, que se vacunaron previamente con vacuna contra virus de anemia infecciosa de pollo, cepa Del Ros (CIAV-DR) a 9 semanas por consumo de agua. El procedimiento de estímulo y progenie y parámetros de medida de eficacia por protección de anticuerpo materno (inmunidad pasiva) proporcionada por gallinas vacunadas en la toma de agua fueron las mismas como para vacuna de virus de anemia de pollo administrada por la ruta de la membrana del ala (véase Ejemplo 6)· PROCEDIMIENTO La progenie se incubó a partir de huevos fértiles puestos 18 y 28 semanas pos-vacunación cuando las gallinas tuvieron 27 y 37 semanas, respectivamente. El estímulo intra-abdominal de la progenie de un día se utilizó para evaluar la protección del anticuerpo materno proporcionado por CIAV-DR después de la vacunación por toma de agua de pollos SPF de negativos a CIAV de 9 semanas. Las observaciones pos-estímulo de progenie a través de 21 días incluyen señales clínicas, determinaciones de valor Hematocrito y examinaciones de autopsia durante las lesiones totales características de anemia infecciosa de pollo (CIA).

Los pollos utilizados para vacunación en este estudio fueron de la raza leghorn SPF, negativo a CIAV, adquiridos de SPAFAS, Inc. Se les colocó una banda a las alas de las aves para identificación a su llegada. Veinte pollos aleatoriamente seleccionados de 9 semanas se sangraron para serología de CIAV para confirmar el estado de serología negativo utilizando el Equipo IDEXX ELISA CIAV. En el mismo día, 40 hembras y 5 machos designados como vacunados sedientos se les permitió tomar agua que contiene vacuna CIAV-DR. El promedio de cinco cantidades de replicado de la vacuna CIAV conducido después de la vacunación en células MSB-1 determinó una dosis que contiene 105 5 TCID50. Los polluelos del reproductor control negativo a partir de la misma fuente y fecha de incubado se mantuvieron. Dos estudios de eficacia/duración de inmunidad identificados como Estudio 1 y Estudio 2 se condujeron en la progenie a partir de gallinas de 27 y 37 semanas, respectivamente. Los polluelos se estimularon en el día uno con CIAV. El virus estimulado fue SÍNTESIS homogenado de hígado derivado de polluelos inoculados con un aislado de campo Texas de CIAV. Cada polluelo se inoculó intra-abdominalmente con aproximadamente 102 6 CID50 por 0.2 mi. Cada estudio consiste de un grupo de progenie de gallinas no vacunadas mantenidas como controles negativos no estimulados, un grupo de progenie estimulado con CIAV a partir de gallinas no vacunadas que sirven como controles positivos, y un grupo de progenie estimulada con CIAV a partir de gallinas vacunadas. Los polluelos de todos los grupos de tratamiento se mantuvieron en aire filtrado, unidades de aislamiento de presión negativa y observaron 21 días para depresión, plumas enredadas y mortalidad. Se recolectaron muestras sanguíneas a partir de todos los polluelos en 14 y 21 días después del estímulo (dpc) para determinaciones de valor Hematocrito como una medida de anemia. El procedimiento utilizado para determinar valores Hematocritos fue aquel de Rosenberger and Cloud (Avian Dis. 33:753-759, 1989). Un polluelo con un valor Hematocrito de ^25 se consideró estar anémico. Adicionalmente, los polluelos de todos los tratamientos se examinaron a 21 dpc para lesiones totales características de CIA incluyendo médula espinal pálida, expansión y decoloración del hígado y bazo, y lesiones de hemorragia en la piel y músculos. Se basaron las comparaciones de tratamiento en el número de individuos dentro de un tratamiento (por examinado total) exhibiendo lesiones totales específicas de CIA. Los datos se analizaron estadísticamente utilizando Prueba de Probabilidad Exacta de Fisher y Prueba Mann-Whitney.

RESULTADOS Las muestras de suero de pre-vacunación serológicas que utilizan el Equipo IDEXX ELISA confirmaron el estado negativo de CIAV de los pollos de 9 semanas a partir de SPAFAS, Inc., que se utilizaron en este estudio. Los resultados de ELISA se dan en la Tabla . Los resultados de los dos estudios reportados en la presente demuestran que 105 5 TCID50 de vacuna CIAV-DR administrada por toma de agua a pollos de 9 semanas protegieron significativamente la progenie a p<0.05 a través de 37 semanas (es decir, 28 semanas pos vacunación) cuando se compara la progenie a partir de gallinas no vacunadas. Un resultado de lesión total >_ 1 por cualquiera de los tejidos examinados (es decir, hígado, médula espinal, timo y músculo) se registró como un polluelo positivo a CIA. Hubo una diferencia significante a p<0.05 en progenie de gallinas vacunadas comparadas a gallinas no vacunadas en el Estudio 1 y Estudio 2 contra morbilidad y mortalidad, anemia, y lesiones totales características de CIA.

Resultados del Estudio 1 Polluelos de cuarenta días a partir de los reproductores sin vacunar estimulados con CIAV se evaluaron en este estudio como el grupo de control positivo. La muerte de uno de los 25 polluelos del grupo control negativo no estimulado ocurrió antes en el periodo de prueba y no puede atribuirse a ninguna causa específica. Veinticuatro controles negativos permanecieron para la evaluación. Una pausa de poder en el aislamiento para mantener 40 polluelos estimulados a partir de gallinas vacunadas con CIAV en 3 dpc y resultó en la muerte de 15 de los 40 polluelos dejando 25 polluelos de este grupo de tratamiento para evaluación en este estudio (véase Tabla 4). Un polluelo del grupo vacunado contra CIAV murió a 5 dpc. El polluelo no tuvo lesiones totales o señales clínicas de CIAV. Por lo tanto, la mortalidad se determinó debido a causas no relacionadas con CIAV. Los 24 polluelos de control negativo no estimulados no mostraron morbilidad, mortalidad o lesiones totales de CIA. Una de las 22 muestras de suero recolectadas de polluelos en 21 dpc tuvo un valor hematocrito de 23, pero el polluelo no tuvo otra señal característica de CIA. Los resultados se dan en la Tabla 2. El procedimiento de estímulo indujo CIA en progenie a partir de los reproductores sin vacunar. Los valores hematocritos <25 en cualquiera de 14 ó 21 dpc se demostraron en 36 de 40 (90%) de los polluelos de control positivo. La morbilidad se observó en 5 de 40 polluelos (12.5%), mientras que la mortalidad se experimentó en 10 de 40 (25%) de polluelos. Las lesiones totales se evidenciaron en 33 de 40 (82.5%) de polluelos. Los resultados se dan en la Tabla 3. Las evaluaciones estadísticas por Prueba de Probabilidad Exacta de Fisher de valores hematocritos demostraron que hubo una diferencia significante en p<0.001 contra anemia, una diferencia significante en p = 0.012 contra morbilidad y mortalidad combinada, y una diferencia significante de p<0.001 en el número de aves con resultados de lesión total de CIA en progenie a partir de reproductores vacunados comparada a la progenie de reproductores sin vacunar. El análisis estadístico de los resultados de lesión total por Prueba Mann-Whitney demostraron una diferencia significante de p<0.001 en la médula espinal y el timo. Hubo una diferencia significante en p<0.001 por Prueba Exacta de Fisher del número de aves con lesiones totales de progenie a partir de reproductores vacunados comparados a la progenie de reproductores sin vacunar. Los resultados y evaluaciones estadísticas se dan en las Tablas 4, 5, 6 y 7.

Resultados del Estudio 2 Los' grupos del estudio 2 consistieron de controles negativos no estimulados a partir de gallinas no vacunadas (n = 25), controles estimulados con CIAV a partir de gallinas no vacunadas (n=40) y progenie estimulada con CIAV a partir de gallinas de reproductor vacunadas contra CIAV de 37 semanas (n=40). A través de los 21 días de prueba, los pollos de control negativo permanecieron libres de anemia como se determina por los valores hematocritos , morbilidad, mortalidad y resultados de lesión total, asociados con CIA. Los resultados se dan en la Tabla 8. Los polluelos de control positivo a CIAV mostraron valores hematocritos inferiores, señales clínicas y lesiones totales normales de CIA. Los valores hematocritos 25 en cualquiera de 14 o 21 dpc se demostraron en 32 de 39 (82.1 %) de polluelos de control positivo. La morbilidad se observó en 6 de 40 (15.0%) de los polluelos, y la mortalidad se experimentó en 12 de 40 (30.0%) de los polluelos. Las lesiones totales son evidentes en la autopsia en 24/40 (60.0%) de los polluelos. Los resultados se dan en la Tabla 9. Siguiendo el estímulo de C1AV una diferencia significante en p<0.05 se demostró en progenie de gallinas vacunadas con CIAV comparada a la progenie a partir de gallinas no vacunadas en valores hematocritos a 14 y 21 dpc, en morbilidad y mortalidad, y en resultados de lesiones totales. La Prueba de Probabilidad Exacta de Fisher de valores hematocritos demostró una diferencia significante a p<0.001 contra anemia, una diferencia significante en p<0.001 contra morbilidad y mortalidad, y una diferencia significante en p<0.001 en el número de aves con resultados de lesiones totales de CIA. Los resultados y evaluaciones estadísticas se dan en las Tablas 10, 11, 12 y 13. Observe que un polluelo del grupo vacunado contra CIAV murió 3 dpc y otro en 8 dpc. Los polluelos no tuvieron lesiones totales o señales clínicas de CIAV. Por lo tanto, la mortalidad se determinó debido a causas no relacionadas con CIAV.

SÍNTESIS Estos estudios demostraron que el anticuerpo materno de CIAV proporciona protección significativa contra CIA en p<0.05 a progenie de pollos de la raza de tipo leghorn blanco SPF, que se vacunaron previamente a 9 semanas con la vacuna contar virus de anemia infecciosa de pollo activo administrada a través de la toma de agua. Se evaluó la protección en la base de las señales clínicas, morbilidad/mortalidad y lesiones específicas de CIAV en necropsia. Estos estudios demostraron que la protección de anticuerpo materno se proporciono a polluelos por gallinas a través de al menos 37 semanas (28 semanas pos-vacunación).

Tabla 1: Resultados Serologicos de Pre-vacunación por ELISA de Polluelos SPF de 9 semanas para Confirmar Estados Serologicos Negativos antes de la Vacunación con Vacuna de CIAV Administrado por Agua. aNegat¡vo = Relación S/N > 0.6 (IDEXX Equipo de interpretación) Señales Valores Hematocritos Clínicas Resultados de Lesión Total Morbilidad / Médula Ave No. 14 dpca 21 dpc Mortalidad Hígado Espinal Timo Músculo 7 33 33 N/N 0 0 0 0 8 37 NS N/N 0 0 0 0 9 27 30 N/N 0 0 0 0 10 28 32 N/N 0 0 0 0 ]] 34 27 N/N 0 0 0 0 12 31 40 N/N 0 0 0 0 13 34 26 N/N 0 0 0 0 14 26 25 N/N 0 0 0 0 15 28 31 N/N 0 0 0 0 16 32 33 N/N 0 0 0 0 17 35 34 N/N 0 0 0 0 18 32 29 N/N 0 0 0 0 19 35 32 N/N 0 0 0 0 20 NS 34 N/N 0 0 0 0 21 35 33 N/N 0 0 0 0 22 28 23 N/N 0 0 0 0 Tabla 2 Continua en la siguiente página Días post estímulo Sin muestra CN = negativo dLesiones totales 0 = normal, 1 = ligera, 2 = moderada, 3 = intensa asociada con CIA Tabla 3: Valores Hematocritos del Estudio 1, Señales Clínicas, Mortalidad y Resultados de lesión total CIA de Polluelos a partir de Pollos de Reproductores Sin Vacunar de 27 semanas Estimulados al Día con CIAV (Controles Positivos).

Tabla 3 continua en la siguiente página Valores Hematocritos Señales Resultados de Lesión Total Clínicas Ave No. 14 dpc3 21 dpc Morbilidad / Hígado Médula Timo Mortalidad Espinal 22 25 31 N/N 0 0 0 0 23 23 13 P/N 2 3 3 2 24 44 20 N/N 0 2 1 0 25 21 N/N 0 0 2 0 26 35 23 N/N 0 0 1 0 27 12 20 N/N 0 2 2 1 28 30 24 N/N 0 0 0 0 29 33 18 N/N 0 2 2 0 25 39 N/N 0 0 0 0 31 25 ND P/P 0 2 2 1 32 22 ND N/P 0 1 2 0 33 26 ND N/P 0 3 3 0 34 20 25 N/N 0 1 1 0 17 15 N/N 0 1 2 0 36 33 28 N/N 0 0 0 0 37 31 15 N/N 0 2 2 0 38 25 ND N/P 0 0 2 0 39 NS 27 N/N 0 0 1 0 40 30 24 N/N 0 1 0 0 No. 23/38 23/30 5/40/ 4/40 28/40 31/40 8/40 Positivo 10/40 No. de Aves con No. de Muerte o No. de Aves con No. de Aves Positivos Hematocríto Positivo de CIA Mórbido = 14/40 Resultados de lesión CIA/Total=38/40 Valoresb/Total=36/40 (35.0%) Total =!/ (95.0%) (90.0%) Total=33/40 (82.5%) uias post estimulo bValores Hematocritos <25 = anemia cNo hecho dN = negativo eP = positivo para señales clínicas o mortalidad por CIAV O = normal, 1 = ligera, 2 = moderada, 3 = Lesiones totales intensas asociadas con CIA 9Sin muestra Tabla 4: Valores Hematocritos del Estudio 1, Señales Clínicas, Resultados de Mortalidad y Lesión total por CIA de Poiluelos con Anticuerpo Materno a partir de Pollos de Reproductor Vacunados contra CIAV de 27 Semanas, Estimulados al Día de Edad con CIAV.

Tabla 4 continua en ia página siguiente Tabla 4 continua en la página siguiente aDías post estímulo bValores Hematocrítos 25 = anemia CN = negativo dNo hecho eQ = sin mortalidad asociada con CIAV fSin suero 90 = normal, 1 = ligera, 2 = moderada, 3 intensas asociadas con CIA hP = positivo para señales clínicas o mortalidad Tabla 5: Resumen del Estudio de Valores Hematocrítos de Polluelos Estimulados con CIAV a partir de Pollos de Criadero Vacunados y Sin Vacunar de 27 semanas. aDiferencia estadística por Prueba Exacta Fisher en p<0.001 entre controles positivos y progenie a partir de pollos de reproductor vacunados contra CIAV.

Tabla 6: Resumen del Estudio 1 de Señales Clínicas y Mortalidad de Polluelos Estimulados con CIAV de Pollos de Reproductor Vacunados y Sin Vacunar de 27 semanas. aDiferencia Estadística por Prueba Exacta Fisher a p<0.05 entre el Grupo de control positivo y Progenie de Pollos de Reproductor Vacunados contra CIAV.

Tabla 7: Resumen del Estudio 1 de los Resultados de Lesión Total CIA de Progenie Estimulada por CIAV a partir de Pollos de Reproductor Vacunados y Sin Vacunar CIAV de 27 semanas No. de Aves con Resultados de lesión total >_ 1 (GLS)/No. Total de Aves en Autopsia Grupo Hígado Médula Timo Músculo No. de Espinal Aves con GLS > 1/Total Control 0/24 0/24 0/24 0/24 0/24 Negativo Control Positivo 4/40 28/40 31/40 8/40 33/40 ( 0.0%) (70.0%) (77.5%) (20.0%) (82.5%) Progenie a 0/25 3/25 3/25 1/25 3/25 partir de (12.0%) (12.0%) (4.0%) (12.0%) Gallinas Vacunadas contra CIAV Prueba ann 0.5 <0.001a <0.001a 0.29 <0.001d Whitney p = Prueba Exacta NAb NA NA NA <0.001'; Fisher p = aDiferencia estadística a p<0.001 entre el grupo de control positivo y la progenie a partir de gallinas vacunadas contra CIAV por Prueba Mann-Whitney. bNo aplicable °Diferencia estadística a p<0.001 entre grupo de control positivo y progenie a partir de gallinas vacunadas contra CIAV por Prueba Exacta Fisher.

Tabla 8: Valores Hematocritos del Estudio 2, Señales Clínicas, Resultados de Mortalidad y Lesión Total de CIA de Polluelos No Estimulados a partir de Pollos de Reproductor Sin Vacunar de 37 semanas (Controles Negativos). aDías post estímulo bN = negativo °0 = normal, 1 = ligera, 2 = modera, 3 =Lesiones Totales Intensas con CIA dSin muestra Tabla 9: Valores Hematocritos del Estudio 2, Señales Clínicas, Resultados de Mortalidad y Lesión total de CIA de Polluelos a partir de Pollos de Reproductor Sin Vacunar de 37 semanas Estimulados al Día de Edad con CIAV (Control Positivo).

Tabla 9 continua en la siguiente página aDías post estímulo bN = negativo cVaIores Hematocritos <_25 = anemia dSin muestra eNo hecho P = positiva para señales clínicas o mortalidad CIAV g0 = normal, 1 = ligera, 2 = moderada, 3 =Lesiones totales Intensas asociadas con CIA Tabla 10: Valores Hematocritos del Estudio 2, Señales Clínicas, Resultados de Mortalidad y Lesión total de CIA de polluelos con Anticuerpo Materno a partir de Pollos de Reproductor Vacunados contra CIAV de 37 semanas Estimulados al día de Edad con CIAV.

Tabla 10 continua en la siguiente página aDías post estímulo bSin suero °N = negativo dNo hecho eP = positivo para señales clínicas y mortalidad de CIAV f0 = normal, 1 = ligera, 2 = moderada, 3 = lesiones totales intensas asociadas con CIA. 9Valores Hematocritos <25 = anemia hQ = sin mortalidad asociada a CIAV.

Tabla 11. Resumen del Estudio 2 de Valores Hematocritos de Polluelos Estimulados con CIAV a partir de Pollos de Reproductor Vacunados y Sin Vacunar de 37 semanas. aDiferencia estadística por Prueba Exacta Fisher en p<0.001 entre controles positivos y progenie a partir de pollos de reproductor vacunados contra CIAV.

Tabla 12: Resumen del Estudio 2 de Señales Clínicas y Mortalidad de Pollos Estimulados con CIAV a partir de Pollos de Reproductor Vacunados y Sin Vacunar de 37 semanas.

Grupo No. con Señales No. de No. con Señales Clínicas/Total Muertes/Total Clínicas o Muerte/Total Control Negativo 0/25 0/25 0/25 Control Positivo 6/40 (15%) 12/40 (30%) 16/40 (40.0%) Progenie de 0/40 3740 (7.5%) 3/40 (7.5%) Gallinas Vacunadas contra CIAV Prueba Exacta 0.013a 0.010a <o.or Fisher p = aD¡ferencia estadística por Prueba Exacta Fisher a p<0.05 entre el grupo de control positivo y progenie a partir de pollos de reproductor vacunados contra CIAV.

Tabla 13: Resumen del Estudio 2 de los Resultados de lesión total de CIA de Progenie Estimulada con CIAV a partir de Pollos de Reproductor Sin Vacunar contra CIAV de 37 semanas. aDiferencia estadística a p<0.001 entre el grupo de control positivo y progenie a partir de gallinas vacunadas contra CIAV por prueba Mann-Whitney. bNo aplicable. cDiferencia estadística a p<0.001 entre el grupo de control positivo y progenie de gallinas vacunadas contra CIAV por Prueba Exacta Fisher.

EJEMPLO 8 EVALUACIÓN DE TUMO RIGEN ICI DAD EN POLLOS SIGUIENDO VARIOS TRATAMIENTOS EN CÉLULAS MDCC-MSB-1 PARA I N ACTIVAR VIRUS MAREK INTRODUCCIÓN Se condujo un estudio de tumorigenicidad en el sustrato de línea celular MDCC-MSB-1 utilizado para propagación de la cepa Del-Ros de CIAV. El objeto de este estudio fue para demostrar que un fluido supernadante libre de célula derivado a partir del crecimiento activo de cultivos celulares carentes de la capacidad para inducir tumores de la Enfermedad de Marek (MD) cuando se inocula en pollos susceptibles.

MATERIALES Y MÉTODOS Grupos de 25 a 36, polluelos leghorn blancos SPF de 1-5 días se inocularon con varios inóculos como se muestra en la Tabla 1. Los polluelos de ambas muestras se observaron diariamente para señales clínicas de MD, y las aves muertas se necropsiaron y examinaron por lesiones totales de MD durante un periodo de observación de 8 semanas. En el final del periodo de observación, todas las aves restantes (incluyendo los controles negativos) se sacrificaron con CO2 y examinaron por lesiones totales relacionadas con MD. Las muestras de lesiones cuestionables o sospechosas se recolectaron en 10% de solución de formaldehído por examinación histopatológica.

RESULTADOS Las células MSB-1 sin una etapa del procesamiento adicional en una dosis de 1x106 de células viables indujo tumores en 2 de 36 pollos. Sin embargo, los medios libres de célula adicionalmente procesados no indujeron tumores en pollos. Los resultados se resumen en la Tabla 2.

SÍNTESIS Los datos obtenidos a partir de este estudio indican que si las células MSB-1 se utilizan como el sustrato para producción de virus tal como para CIAV, es necesario remover células MSB-1 a partir del virus cultivado para evitar la enfermedad de Marek potencial en pollos que reciben la vacuna contra CIAV. La remoción de las células puede lograrse filtrando células infectadas con el virus MSB-1 a través de un filtro tosco (5 µ de tamaño Miliporo) para remover las células. El fluido de células libre de virus sería seguro para administrarse a pollos. Los resultados de este estudio demostraron que las etapas de procesamiento adicionales del virus activo (es decir, sedimentación natural seguida por filtración a través de 5 µ de filtro Miliporo) de las células MSB-1 elimina la posibilidad de una vacuna producida en esta línea celular induciendo cualesquiera tumores relacionados con MD en pollos. Los resultados sugieren que la filtración del fluido sobrenadante del virus de anemia de pollo producidos en células MSB-1 evitará el riesgo asociado de la formación de tumor MD cuando se administra en pollos.

Tabla 1: Diseño Experimental para la prueba de tumorigenicidad in-vivo de MSB-1 : No. de Tratamientos No. Total Ruta de Dosis de Grupo de Inoculación Inoculo/ polluelos Polluelo 1. -1.0x106 células viables MSB-1 36 SQa 0.2 mi crecidas en medio RPMI 1640 suplementado con FBS. 2. Supernadante a partir de una 35 SQ 0.2 mi suspensión celular de MSB-1 (2000 rpm durante 10 minutos) centrifugada 3. Medio RPMI 1640 25 SQ 0.2 mi suplementado con FBS (control medio) 4. 3.0 x 105 células/ml viables 35 SQ 0.2 mi MSB-1, permitidas para sedimento naturalmente durante la noche y el supernadante resultante se filtro entonces a través de 5 µ de filtro Miliporo, y finalmente tratado a 41°C durante 24 horas antes de utilizarse para inoculación de polluelos 5. 3.0 x 10s células/ml viables de MSB-1, permitidas para sedimento naturalmente durante la noche y el supernadante resultante se filtró entonces a través de filtro iliporo 5 µ antes de utilizarse para inoculación de polluelos 6. 3.0 x 105 células/ml viables, congeladas y descongeladas 3 veces a -20°C y luego centrifugadas a 2000 rpm durante 15 minutos, el supernadante resultante se filtró a través del filtro 5 µ Miliporo, y finalmente el filtrado se expuso a 41°C durante 24 horas antes de utilizarse para inoculación de polluelos 7. --- Controles Negativos Subcutáneas Tabla 2 Resultados de prueba de tumorigenicidad de células MDCC-MSB-1 EJEMPLO 9 LOS EFECTOS DE CONGELAMIENTO-DESCONGELAMIENTO E INCUBACION A 37°C EN LA VIABILIDAD DEL VIRUS DE ENFERMEDAD DE MAREK SÍNTESIS La congelación-descongelación a 3 ciclos no pudo completar el virus de enfermedad Marek inactivada (MDV) en medio de cultivo de tejido, pero redujo el número de placas significativamente. Sin embargo, siguiendo 3 congelamientos-descongelamientos y luego incubación de 3 días a 37°C, no hubo virus del serotipo 1 DV detectado por IFA.

INTRODUCCIÓN El virus de la enfermedad de Marek y virus herpes de pavo (HVT) existe en cualesquiera estados libres de células o asociados con células que tienen propiedades de sobrevivencia grandemente diferentes. La inefectividad de la existencia de virus asociada con células se relaciona directamente a la viabilidad de las células que contienen el virus. La inefectividad de la preparación de células libre de virus se reportó ser sensible a diferentes pH y temperaturas. La viabilidad de MDV, cepa de Rispen, bajo congelamiento-descongelamiento y tratamientos de incubación a 37°C se investigó.

MATERIALES Y MÉTODOS 1. Células: Las células CEF (CEF primaria en botella cilindrica, CEF secundaria en 60 mm de placas de cultivo de tejido) se prepararon a partir de embriones de pollos SPF de 9 a 11 días (SPAFAS). 2. Virus: El efecto de congelamiento-descongelamiento en la viabilidad del virus Rispen se investigó conduciendo un estudio de inactivación (eliminación). Las células CEF infectadas de Rispen activas se cultivaron a 43 hpi. Se volvieron a suspender células infectadas en medio esencial mínimo (MEM) suplementado con suero fetal y de ternera y caldo de fosfato de triptosa, y se llenaron en 20 tubos. La concentración de las células fue 36 x 106 células por mi. Las muestras se trataron por congelamiento a -70°C seguido por descongelamiento a temperatura ambiente, de hasta uno hasta tres ciclos, luego se incubaron a 37°C de uno hasta 15 días. Las muestras, con o sin dilución, se inocularon en monocapa de CEF secundaria en 60 mm de placas de cultivo de tejido en duplicado, e incubaron a 37°C durante 4-5 días. Las cantidades se clasificaron por conteo de placas bajo un microscopio con y sin cepa IFA con anticuerpo 2BN90 monoclonal específico de serotipo 1.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se enumeraron y reportaron placas de MDV como la placa promedio que forma la unidad (pfu) por mi. Los resultados indicaron que hasta 3 ciclos de congelamiento-descongelamiento no inactivaron completamente la cepa de Rispen de MDV en medio de cultivo de tejido, pero el número de placas que indicó evidencia de virus viable se redujeron significativamente. Sin embargo, con 3 o más días de incubación a 37°C después de los 3 ciclos de congelamiento-descongelamiento, no hubo placas detectadas por IFA (Tabla 1, y Figuras 3 y 4), sugieren combinar 3 ciclos de congelamiento-descongelamiento con una incubación de 3 días a 37°C pueden destruir completamente la inefectividad de MDV en el medio libre de célula.

Tabla 1. Las placas de MDV promedio resultan después de cada tratamiento Tratamiento Resultados Título inicial antes del congelamiento-descongelamiento: 5.4 x 106 pfu/ml Congelamiento-descongelamiento una vez: 3x104 pfu/ml Congelamiento-descongelamiento dos veces: 3x103 pfu/ml (por IFA) Congelamiento-descongelamineto 3 veces: 800 pfu/ml (por IFA) Congelamiento-descongelamiento 3 veces + 37°C 1 día: 70 pfu/ml (por IFA) Congelamiento-descongelamiento 3 veces + 37°C 2 días: 25 pfu/ml (por IFA) Congelamiento-descongelamiento 3 veces + 37°C 3 días: 0 Congelamiento-descongelamiento 3 veces + 37°C 4 días: 0 Congelamiento-descongelamiento 3 veces + 37°C 5 días: 0 Congelamiento-descongelamiento 3 veces + 37°C 7 días: 0 Congelamiento-descongelamiento 3 veces + 37°C 9 días: 0 Congelamiento-descongelamiento 3 veces + 37°C 11 días: 0 Congelamiento-descongelamiento 3 veces + 37°C 3 días: 0 Congelamiento-descongelamiento 3 veces + 37°C 15 días: 0 EJEMPLO 10 COMPARACIÓN DE SECUENCIAS POR CEPAS CIAV Existen numerosas cepas reportadas de CIAV. Algunas de estas han sido secuenciadas y sus secuencias depositadas. Una gráfica que compara la secuencia de aminoácido de varias de las cepas conocidas se proporcionan posteriormente. Se basa en una pila de secuencias obtenidas a partir de la base de datos NCBI.

Cambios del Aminoácido Específico en VPl, VP2 y VP3 de Varios CAV Aislados 15 153 169 4 23 73 103 1 18 DRP5 V D L R V S R C DR V D L R V S R C TX V D L R V s R C Cux-I Cuxhaven-1 A D L R V s K R IV V G P Q A N R c Las secuencias de nucleótido y aminoácido para la cepa Del Ros se proporcionan en la lista de Secuencia y también en NCBI no. de acceso AF313470. Las secuencias de nucleótido y aminoácido para otras cepas adicionales de CIAV pueden encontrarse como sigue: intervet - NCBI no. de acceso DI00068; Cuxhaven-1 - NCBI no. de acceso. NC001427; y CAV-15 - NCBI no. de acceso AF372658. Una comparación de nucleótido por nucleótido o aminoácido por aminoácido de estas y otras secuencias pueden hacerse rutinariamente. A través de esta solicitud, varias publicaciones se referencían. Las descripciones de estas publicaciones en sus totalidades se incorporan en la presente para referencia en esta solicitud para describir más completamente el estado de la técnica a la cual esta invención pertenece. Será aparente por aquellos expertos en la técnica que varias modificaciones y variaciones pueden hacerse en la presente invención sin apartarse del alcance o espíritu de la invención. Otras modalidades de la invención serán aparentes por aquellos expertos en la técnica a partir de la consideración de la especificación y práctica de la invención descrita en la presente. Se pretende que la especificación y ejemplos se consideren como ejemplares únicamente, con un alcance y espíritu verdadero de la invención que se indica por las siguientes reivindicaciones.

LISTA DE SECUENCIAS 110> Biomune Leonard, Joan Rosenberger, John Cowen, Barrett VACUNA CONTRA VIRUS DE ANEMIA DE POLLO A PARTIR DE LA LÍNEA CELULAR <130> 02108.0003P1 <150> 60/317,239 <151> 2001-09-05 <160> 2 <170> FastSEQ for Windows Versión 4.0 <210> 1 <211 > 2294 <212> DNA <213> Virus de Anemia del Pollo <400> 1 gcattccgag tggttactat tccatcacca ttctagcctg tacacagaaa gtcaagatgg 60 acgaatcgct cgacttcgct cgcgattcgt cgaaggcggg gggccggagg ccccccggtg 120 gcccccctcc aacgagtgga gcatgtacag gggggtacgt catcagtaca ggggggtacg 180 tcacaaaaag gcgttcccgt acaggggggt acgtcacgcg tacagggggg tacgtcacag 240 ccaatcagaa gctgccacgt tgcgaaagtg acgtttcgaa aatgggcggc gcaagcctct 300 ctatatattg agcgcacata ccggtcggca gtaggtatac gcaaggcggt ccgggtggat 360 gcacgggaac gacggacaac cggccgctgg gggcagtgaa tcggcgctta g ccgagaggg 420 gcagcctggg cccagcggag ccgcgcaggg gcaagtaatt tcaaatgaac g ctctccaag 480 aagatactcc acccggacca tcaacggtgt tcagg ccacc aacaagttca cggccgttgg 540 aaacccctca ctgcagagag atccggattg gtatcg ctgg aattacaatc actctatcgc 600 tgtgtggctg cgcgaatgct cgcgctccca cgctaagatc tgcaactgcg gacaattcag 660 aaagcactgg tttcaag aat gtgccggact tgaggaccga tcaacccaag cctccctcga 720 agaagcgatc ctgcg acccc tccgagtaca gggtaagcga gctaaaagaa agcttgatta 780 ccactactcc cagccgaccc cgaaccgcaa gaaggtgtat aagactgtaa g atggcaaga 840 cgagctcgca gaccg agagg ccg attttac gccttcagaa g agg acggtg gcaccacctc 900 aagcgacttc gacgaagata taaatttcga catcggagga gacagcggta tcgtagacga 960 gcttttagg a aggcctttca caacccccgc cccggtacgt atagtgtgag gctgccgaac 1 020 ccccaatcta ccatgactat ccgcttccaa ggagtcatct ttctcacaga aggactcatt 1 080 ctgcctaaaa acagcacagc ggggggctat g cagaccaca tgtacggggc gagagtcgcc 1 140 aagatctctg tgaacctgaa agagttcctg ctagcgtcaa tgaacctgac atacgtgagc 1 200 aaaatcggag gccccatcgc cggtgagttg attgcggacg ggtctaaatc aca agccgcg 1 260 gag aactggc ctaattgctg gctgccgcta gataataacg tgccctccgc gacaccatcg 1 320 gcatggtgga gatgggcctt aatgatgatg cagcccacgg actcttgccg gttctttaat 1 380 caccctaagc agatgaccct gcaagacatg ggtcgcatgt ttgggggctg gcacctattc 1440 cgacacattg aaacccg ctt tcagctcctt gccactaaga atgagggatc cttcagcccc 1 500 gtggcgagtc ttctctccca gggagagtac ctcacgcgtc gggacgatgt taaatacagc 1 560 agcgatcacc agaaccggtg gcgaaaaggc gaacaaccga tgacgggggg tattgcttat 1 620 g cg accggg a aaatgagacc cgacgagcaa cagtaccctg ctatgccccc agaccccccg 1 680 atcatcacca gtactacagc gcaaggcacg caagtccgct gcatgaatag cacgcaagct 1 740 tggtggtcat gggacacata tatgagcttt gcaacactca cagcactcgg tgcacaatgg 1 800 tcttttcctc cagggcaacg ttcagtttct agacggtcct tcaaccacca caaggcgaga 1 860 ggagccgggg accccaaagg ccagagatgg cacaccctgg tgccgctcgg cacggagacc 1920 atcaccgaca gctacatggg agcacccgca tcagagctgg acacaaattt ctttacgctt 1980 tacgtagcgc aaggtacaaa taagtcgcag cagtacaagt tcggcacagc tacatacgcg 2040 ctaaaggagc cggtaatgaa gagcgattca tgggcagtgg tacgcgtcca gtcggtctgg 2100 caactgggta acaggcagag accataccca tgggacgtca actgggccaa cagcaccatg 2160 tactggggcg ggcagccctg aaaagggggg gggctaaagc ccccccttga acccccccct 2220 QOgggggatt cccccccaga cccccccttt aaatagcact caataaacgc agcaattggc 2280 tttatcgcac aatc 2294 210> 2 211 > 786 212> PRT 213> Virus de Anemia del Poli <400> 2 Met Ala Arg Arg Ala Arg Arg Pro Arg Gly Arg Phe Tyr Ala Phe Arg 1 5 10 15 Arg Gly Arg Trp His His Leu Lys Arg Leu Arg Arg Arg Tyr Lys Phe 20 25 30 Arg His Arg Arg Arg Gln Arg Tyr Arg Arg Arg Ala Phe Arg Lys Ala 35 40 45 Phe His Asn Pro Arg Pro Gly Thr Tyr Ser Val Arg Leu Pro Asn Pro 50 55 60 Gln Ser Thr Met Thr lie Arg Phe Gln Gly Val lie Phe Leu Thr Glu 65 70 75 80 Gly Leu lie Leu Pro Lys Asn Ser Thr Ala Gly Gly Tyr Ala Asp His 85 90 95 Met Tyr Gly Ala Arg Val Ala Lys lie Ser Val Asn Leu Lys Glu Phe 100 105 110 Leu Leu Ala Ser Met Asn Leu Thr Tyr Val Ser Lys Me Gly Gly Pro 115 120 125 lie Ala Gly Glu Leu lie Ala Asp Gly Ser Lys Ser Gln Ala Ala Glu 130 135 140 Asn Trp Pro Asn Cys Trp Leu Pro Leu Asp Asn Asn Val Pro Ser Ala 145 150 155 160 Thr Pro Ser Ala Trp Trp Arg Trp Ala Leu Met Met Met Gln Pro Thr 165 170 75 Asp Ser Cys Arg Phe Phe Asn His Pro Lys Gln Met Thr Leu Gln Asp 180 185 190 Met Gly Arg Met Phe Gly Gly Trp His Leu Phe Arg His lie Glu Thr 195 200 205 Arg Phe Gln Leu Leu Ala Thr Lys Asn Glu Gly Ser Phe Ser Pro Val 210 215 220 Ala Ser Leu Leu Ser Gln Gly Glu Tyr Leu Thr Arg Arg Asp Asp Val 225 230 235 240 Lys Tyr Ser Ser Asp His Gln Asn Arg Trp Arg Lys Gly Glu Gln Pro 245 250 255 Met Thr Gly Gly lie Ala Tyr Ala Thr Gly Lys Met Arg Pro Asp Glu 260 265 270 GIn GIn Tyr Pro Ala Met Pro Pro Asp Pro Pro lie Me Thr Ser Thr 275 280 285 Thr Ala GIn Gly Thr GIn Val Arg Cys Met Asn Ser Thr GIn Ala Trp 290 295 300 Trp Ser Trp Asp Thr Tyr Met Ser Phe Ala Thr Leu Thr Ala Leu Gly 305 310 315 320 Ala GIn Trp Ser Phe Pro Pro Gly GIn Arg Ser Val Ser Arg Arg Ser 325 330 335 Phe Asn His His Lys Ala Arg Gly Ala Gly Asp Pro Lys Gly GIn Arg 340 345 350 Trp His Thr Leu Val Pro Leu Gly Thr Glu Thr lie Thr Asp Ser Tyr 355 360 365 Met Gly Ala Pro Ala Ser Glu Leu Asp Thr Asn Phe Phe Thr Leu Tyr 370 375 380 Val Ala GIn Gly Thr Asn Lys Ser GIn GIn Tyr Lys Phe Gly Thr Ala 385 390 395 400 Thr Tyr Ala Leu Lys Glu Pro Val Met Lys Ser Asp Ser Trp Ala Val 405 410 415 Val Arg Val GIn Ser Val Trp GIn Leu Gly Asn Arg GIn Arg Pro Tyr 420 425 430 Pro Trp Asp Val Asn Trp Ala Asn Ser Thr Met Tyr Trp Gly Gly GIn 435 440 445 Pro Met His Gly Asn Asp Gly GIn Pro Ala Ala Gly Gly Ser Glu Ser 450 455 460 Ala Leu Ser Arg Glu Gly Gln Pro Gly Pro Ser Gly Ala Ala Gln Gly 465 470 475 480 Gln Val lle Ser Asn Glu Arg Ser Pro Arg Arg Tyr Ser Thr Arg Thr 485 490 495 lle Asn Gly Val Gln Ala Thr Asn Lys Phe Thr Ala Val Gly Asn Pro 500 505 510 Ser Leu Gln Arg Asp Pro Asp Trp Tyr Arg Trp Asn Tyr Asn His Ser 515 520 525 lle Ala Val Trp Leu Arg Glu Cys Ser Arg Ser His Ala Lys lle Cys 530 535 540 Asn Cys Gly Gln Phe Arg Lys His Trp Phe Gln Glu Cys Ala Gly Leu 545 550 555 560 Glu Asp Arg Ser Thr Gln Ala Ser Leu Glu Glu Ala lle Leu Arg Pro 565 570 575 Leu Arg Val Gln Gly Lys Arg Ala Lys Arg Lys Leu Asp Tyr His Tyr 580 585 590 Ser Gln Pro Thr Pro Asn Arg Lys Lys Val Tyr Lys Thr Val Arg Trp 595 600 605 Gln Asp Glu Leu Ala Asp Arg Glu Ala Asp Phe Thr Pro Ser Glu Glu 610 615 620 Asp Gly Gly Thr Thr Ser Ser Asp Phe Asp Glu Asp lle Asn Phe Asp 625 630 635 640 lle Gly Gly Asp Ser Gly lle Val Asp Glu Leu Leu Gly Arg Pro Phe 645 650 655 Thr Thr Pro Ala Pro Val Arg lie Val et Asn Ala Leu Gln Glu Asp 660 665 670 Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg 675 680 685 Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu lie Arg lie Gly Me Ala Gly 690 695 700 lie Thr lie Thr Leu Ser Leu Cys Gly Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro 705 710 715 720 Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp Asn Ser Glu Ser Thr Gly Phe Lys 725 730 735 Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp Gln Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys 740 745 750 Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr Arg Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser 755 760 765 Leu lie Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro Arg Thr Ala Arg Arg Cys lie 770 775 780 Arg Leu 785

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una vacuna contra virus de anemia infecciosa de pollo (CIAV), que comprende el paso de CIAV activo en células MDCC-MSB-1 (MSB-1), caracterizada porque la vacuna no provoca Enfermedad de Marek.
2. La vacuna contra CIAV de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la vacuna no produce lesiones totales en embriones de pollo.
3. La vacuna contra CIAV de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la vacuna no produce anemia en embriones de pollo.
4. Un método para realizar una vacuna contra CIAV, caracterizado porque comprende cultivar CIAV en células MSB-1, y remover o eliminar cualquier virus de la enfermedad de Marek presente en el cultivo de célula MSB-1 que contiene CIAV.
5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque comprende someter al cultivo de célula MSB-1 que contiene CIAV a al menos 3 ciclos de congelamiento y descongelamiento, seguido por una etapa para mantener las células durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 37°C.
6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque comprende la etapa de filtrar el cultivo de célula MSB-1 a través de un filtro de 5 mieras.
7. El método de conformidad con las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado porque el método realiza una vacuna que no provoca enfermedad de Marek en pollos inmunizados con la vacuna.
8. Un método para inmunizar un pollo contra infección CIAV, caracterizado porque comprende administrar al pollo una cantidad de la vacuna contra VIAC de conformidad con la reivindicación 1, suficiente para inducir una respuesta inmune a CIAV.
9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la respuesta inmune es protector contra infección por CIAV.
10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la respuesta inmune es protectora contra la enfermedad clínica provocada por la infección de CIAV.
11. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la respuesta inmune produce anticuerpos que son protectores contra infección de CIAV en la progenie de pollos inmunizados.
12. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la vacuna se administra a pollos a partir de aproximadamente 4 a 12 semanas de edad.
13. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la vacuna se administra en agua para beber.
14. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la vacuna se administra parenteralmente.
15. El método de conformidad con la reivindicación 14,