KR100221710B1

KR100221710B1 - 닭 빈혈증 병원체 백신

Info

Publication number: KR100221710B1
Application number: KR1019920017163A
Authority: KR
Inventors: 카를라 크리스티나 슈리에
Original assignee: 이.에이치. 리링크; 악조 노벨 엔.브이.
Priority date: 1991-09-20
Filing date: 1992-09-19
Publication date: 1999-10-01
Also published as: CA2078605A1; HU9202976D0; ES2099200T3; CA2078605C; AU2521792A; MX9205336A; CN1073879A; HU211896A9; JP2007125039A; DE69216732D1; DK0533294T3; KR930006150A; JP3945830B2; HUT65367A; TW340873B; JP4148980B2; HU217214B; NZ244361A; ATE147632T1; EP0533294B1

Abstract

본 발명은 예방 접종된 닭에 면역 반응을 일으킬 수 있는 생(live) 및 불활성화 닭 빈혈증 병원체 백신을 제공하는 것이다. 본 백신의 CAA 비루스는 부화 계란들내에서 연속적인 계대 배양(passages)에 의해서 약독화된다.

Description

닭 빈혈증 병원체 백신

본 발명은 생(live) 또는 불활성화 빈혈증 병원체(CAA : Chichen Anaemia Agent)에 대한 가금류 보호용 백신 및 이러한 백신의 제조방법 그리고 미생물학적으로 순수한 CAA 비루스 조성물 뿐만 아니라 CAA 비루스 산물의 제조방법에 관한 것이다.

닭의 빈혈증 병원체(CAA)는 조류의 감염성 빈혈증의 원인이 되는 인자이며, 1979년에 유아사(Yuasa)등에 의하여 처음으로 기술되었다(조류의 질병 : Avian Diseases 23, 366-385, 1979).

감수성이 있는 어린 닭에 있어서, CAA는 골수의 발육 부전증/저형성증 및 흉선 위축증을 수반한 현저한 빈혈증을 야기한다.

닭들은 CAA에 기인하는 실험적으로 유도된 질병에 대한 연령 저항성(age resistance)을 나타낸다. 이것은 본질적으로 2주의 연령으로 획득하게되나, 더 연령이 높은 조류도 여전히 감연에 대한 감수성이 있다(Yuasa, N. et al., 1979 상기한 서적; Yuasa, N. et al., 조류의 질병(Avian diseases)24, 202-209, 1980). 그러나, 닭들이 CAA와 면역 억제제(IBDV, MDV등)로 이중으로 감염되는 경우에는, 이 질병에 대한 연령 저항성은 지연된다(Yuasa, N. et al., 1979 및 1980 상기한 서적; Bow von V. et al., 수의학 저널(J. Verterinary Medicine)33, 93-116, 1986).

CAA로 접종한 닭들에 있어서의 질병률 및 사망률은 접종에 사용된 CAA의 투여량에 밀접한 관련이 있다. 즉, 투여량을 크게하면 할수록 이 질병도 심해진다(Yuasa, N. et al., 1979. 상기 서적).

CAA는 닭 배(embryo) 섬유아세포(CEF), 닭 배 뇌세포, 닭 배 간 세포 및 신장, 흉선, 파브리시우스낭, 골수 또는 백혈구로 부터 유래되는 닭 세포들과 같은 각종 닭의 조직과 닭의 배 조직으로 부터 유래하는 표준 배양되는 단일층 세포중에서 증식할 수 없으며(Yuasa, N. et al., 1979 상기 서적; Yuasa, N. Natl. Inst. Anim. Health Q., 23, 13-20, 1989), 또한 VERO, CRFX, MDCK 및 A-72와 같은 각종의 통상적으로 사용되는 포유동물의 세포계 중에서도 증식할 수 없다(Rosenberger, J.K. 및 Cloud, s.s., Avian Diseases 33, 707-713, 1989).

CAA는 특히, MDCC-MSB1 세포 배양물중에서의 마렉병(Marek's disease) 및 림프구 백혈병의 림프종들로부터 확립된 몇몇 림프아구 세포계에서 증식한다(Yuasa, N. 1983., 상기 서적). 그러나, 불리하게도, CAA는 MDCC-MSB1 세포중에서는 비교적 낮은 역가(titres)로 증식한다. MDSS-MSB1 세포중에서 단지 10^5.0 10^6.0TCID₅₀/0.1㎖의 역가가 얻어질 수 있다. 첨언하면, CAA는 MDCC-MSB1 세포들 중에서 접종 투여량의 단지 약 10배 정도만 증식하는 것으로 알려져 있다(Yuasa, N., 1983 상기서적; Bow von, V. et al., Zentralblatt Vet. Med. 32, 679-693, 1985).

닭 외에, CAA는닭의 배에서도 또한 증식할 수 있다(Yuasa, N. 및 Yoshida, I., Natl. Inst. Anim. Health Q. 23, 99-100, 1983; Bow von, V. 및 Witt, M., J. Vet Med. 33, 664-669, 1986). 그러나, 이들 배에 대한 어떠한 치사 효과 및 병리학적 효과도 보이지 않았으며, 이것은 CAA가 배에 영향을 주기에 충분히 큰 양으로 부화계란(embryonated eggs)중에서 증식할 수 없음을 나타내는 것이다. 전체의 배들로 부터 얻어질 수 있는 CAA의 가장 큰 역가는, 실험적으로 감염시킨 닭의 간 추출물로부터 얻어진 역가와 동일하였으며, MDCC-MSB1 세포중에서 분석된 것으로서 10^5.0 10^6.0TCID₅₀/㎖ 사이에서 변화하였다.

뷜로우 본 브이(Bow von, V.) 및 위트 엠(Witt, M.)(상기한 바와같음)은 비루스의 어떠한 약독화도 필요로 하지 않는 가금 성체(parent)들에 투여될 수 있는 생백신의 생산을 위한 수단으로서, 부화 계란중에서의 독성 CAA의 증식을 연구하였다. 그러나, 여기서는 비루스의 약독화는 방지되어져야만 한다고 언급하고 있으며, 그 이유는 면역원성의 상실로 귀납될 수 있기 때문이다(Bow von, V. 및 Fuchs, B., J. Vet. Med. 33, 568-573, 1986).

뷜로우(Bow)와 훅스(Fuchs)(J. Vet. Med. 33, 568-573, 1986)는, CAA 계통 Cux-1의 병원성이 MDCC-MSB1 세포들중에서 12회의 연속적인 계대배양(passages)후 감소되었다는 사실을 보고하고는 있으나, 이들 병원성이 약화된 계통들의 면역원성에 관한 어떠한 데이터도 거기에는 발표되어 있지 않다. 사실상, 병원성의 감소에 따른 면역 효능의 감소는 뷜로우와 훅스에 의하여 이미 언급되어 있다.

유아사(Yuasa, 1983, 상기 서적) 및, 고리오등(Goryo et al., Avian Pathology 16, 149-163, 1987), 오타끼등(Otaki et al., Avian Pathology 17, 333-347, 1988)의 어느 누구도, 각각, Gifu-1계통의 19회 계대 배양, TK-5803 계통의 40회 계대 배양, CAA 82-2 계통의 40회 계대 배양후의 MDCC-MSB1 세포들중에서의 약독화(attenuation)에 대한 증거는 전혀 발견하지 못하였다.

비엘리츠 이. 등(Vielitz E. et al., J. Vet. Med. 34, 533-557, 1987)은 Cux-1 계통으로부터 유도된 생(live) CAA 백신에 대한 평가를 보고하고 있다. 그러나, 어떠한 약독화된 CAA계통도 여기서는 사용되고 있지 않다. 독성 CAA로 구성되는 이 백신은 915주의 나이먹은 닭들에게 투여되며, 접종된 조류에 있어서 어떠한 병원성도 나타내지 않았다. 실험적으로 유도된 CAA에 기인하는 질병에 대하여 이미 알려진 연령 저항성(본질적으로 2주의 나이로 획득된다)을 고려할 때, 접종된 조류 그 자체들에 대한 생 백신 비루스의 약독화의 정도는 이 경우에 있어 덜 중요한 것이다. 그러나, 생 CAA 백신에 접촉시킨 후의 어린 병아리에 있어서의 병리학적 징후를 예방하기 위해서는, 생 CAA 백신 비루스는 상당히 약독화시켜야만 한다.

생 CAA 백신에 대한 대안은 불활성화 면역 보강 백신일 것이다. 이러한 불활성화 백신은 닭에 현존하는 면역성을 증대시키기 위하여 또한 사용될 수 있다. 그러나, 어떠한 불활성화 CAA 백신도 현재까지 보고된 바 없으며, 그 이유는 생체외(in vitro)에서 높은 역가로 CAA 비루스를 증식시킨다는 것이 현재까지는 불가하여 이러한 시도는 곤란하였기 때문이다(McNulty, M.S., Avian Pathology 20, 187-203, 1991).

따라서, 본 발명의 첫번째 목적은 생체외에서 높은 역가(titres)로 증식될 수 있는 CAA 비루스를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 면역원성은 유지하면서도 어린 병아리에 있어서 상당히 감소된 병원성을 나타내는 현장 분리주(the field isolates)인 CAA 비루스 계통으로부터 유래되는 CAA 백신을 제공하는 것이다.

더우기, 본 발명의 목적은, 예방 접종후 닭에게 면역 반응을 일으키기에 충분히 많은 양의 CAA 항원으로 구성되는 불활성화 CAA 백신을 제공하는 것이다.

부언하면, 본 발명의 목적은 CAA 비루스 계통을 약독화시키기 위한 보편적인 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 신규의 CAA 비루스, 즉, 닭의 배(embryos)에 병변을 유도할 수 있는 CAA 비루스에 관한 것이다. CAA로 인한 병변으로서는 치사 및 특히 머리의 출혈 및 창백한 배(pale embryos)를 들 수 있다. 이들 타입의 CAA 비루스들은 몇가지 유리한 특성들을 나타낸다. 본 발명에 따른 CAA 비루스들의 유리한 특성중의 하나는, 하기에 개설하는 바와같이 생체외에서 높은 역가로 증식 가능하다는 것이다.

상기한 CAA 비루스들의 또다른 장점은, 이들 비루스들이 닭의 배에 대해서는 독성이 더 큼에도 불구하고, CAA계 비루스들과 비교할 때, 면역학적 특성들은 유지하면서도 부화후 1일 경과 병아리에 대한 감소된 병원성을 갖는다는 다른 것이다.

바람직하게는, 본 발명은 파스퇴르 연구소(the Institute Pasteur)의 CNCM에 1991년 9월 12일자로 기탁된 CAA 비루스 계통 I-1141 (19번째의 계대 배양수준)에 관한 것이다. 이들 비루스는 적어도 10^8.4TCID₅₀/㎖의 역가로 부화 계란중에섭 배양될 수 있으며, 게다가, 부화후 1일 경과 병아리에 대해서 현장의 모계통(parent strain)보다 병원성이 낮으면서도 모 계통과 같은 정도의 면역원성을 갖느다.

이 새로운 종류의 CAA 비루스는, 실시예에서 및 하기한 바와같은 부화 계란중에서 모든 획득 가능한 CAA 비루스를 계대 배양시키는 것에 의하여 얻어질 수 있다.

CAA에 대한 가금 보호용의 신규한 백식은, 닭의 배(embryos)에 병변을 유도할 수 있는 CAA 비루스를 포함하며, 바람직하게는, 부화 계란중에서 계대 배양시키는 것에 의하여 이를 비루스가 얻어지는 것을 특징으로 한다.

닭의 조직, 예컨대, 간으로부터 유용한 CAA 계통의 분리후, 조직 호모제네이트는 다 단계의 약독화 과정에 사용될 수 있다. 우선, 원한다면, 계란들속으로 접속시키기 전에, MDCC-MSB1 세포와 같은 CAA에 적합한 조직 또는 세포 배양물중에서 계대 배양하여 증식시킬 수 있다. 이어서, 이들 비루스 집적물은 부화 계란을 감염시키기 위하여 사용될 수 있으며, 그 다음, 이 기술 분야에 공지되어 있는 방법에 의하여 부화 계란중에서 비루스의 계대배양 및 증식을 위하여 사용될 수 있다.

더욱 상세하게는, 계란은 표준방법에 따라 적어도 계란 당 10^4.5TCID_5.0으로 난황낭 루트를 통하여 CAA로 감염된다. 감염된 배는 접종후 약 13일후에 수거되며, 균질화 되고, 예컨대, 트립토오스 2.5%(1:20 v/v)로 희석된다. 이어서, 신선한 부하 계란은 각각의 계란 계대 배양 단계에서 계란 당호모제네이트 2.0㎖로 접종된다. 마지막의 계란 계대 배양에 있어서, 비루스는 증식되고, 수거되며, CAA 감염에 대하여 면역활성을 갖는 백신으로 가공된다. 마지막 계대 배양후의 비루스는 MDCC-MSB1 세포와 같은 CAA에 감수성이 강한 세포 또는 조직 배양물, 또는 부화 계란속에서 증식될 수 있다. 부화 계란의 경우에는, 배 및/또는 막 및/또는 알란토인액이 수거된다.

유리한 증식 및 약독화된 특성을 갖는 CAA 비루스를 얻기에 필요한 계란-계대 배양(egg-passage)의 수는 무엇보다도, 특정한 CAA 계통 및 약독화 정도 및/또는 생체외에서의 원하는 역가에 좌우된다.

본 발명에 따른 생 백신은 제조하기에 적합한, 병원성이 상당히 감소된 비루스를 만들기 위한 CAA 비루스의 총 계란-계대 배양의 전형적인 수는 18 또는 그 이상이며, 바람직하게는 34 또는 그 이상이다.

특히, 본 발명에 따른 백신은 인터베트(Intervet) CAA 계통 26P4의 비루스로부터 유래된다. 이 계통은 빈혈증에 걸려있는 현장에서의 닭의 간으로부터 최초로 분리되었다. 분리후, 이 계통은 MDCC-MSB1 세포내에서 5회 계대 배양되었으며, 이어서 부화 계란속에서 19회 계대 배양되었다. 이 계통의 시료는 수탁 번호 I-1141로 프랑스, 파스퇴르 연구소의 콜렉션 내셔날 드 걸쳐 드마이크로올개니즘(CNCM : the Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes)에 기탁되어 있다(기탁일 : 1992년 9월 12일).

본 발명에 따른 백신 제조를 위해서는 19회 계대 배양 수준의 CAA 비루스 뿐만 아니라, 이 계통의 더 많은 계대 배양 수준의 비루스도 또한, 더 적합하다는 것은 명백하다.

약독화된 계통은 상당히 감소된 병원성을 나타내는 반면, 계란 이외의 것에 적합한 이 계통의 비루스에 과한 비루스 중화(VN : virus neutralisation) 시험으로 측정한 바, 이 비루스 계통의 면역학적 특성은 영향이 없다.

상기한 과정에 따라 얻어질 수 있는 신규의 생 CAA 비루스는 몇가지의 현저한 특성을 갖고 있으며, 특히,

- 이 CAA 비루스는 이제까지 발표된 모든 CAA 계통과는 대조적으로 배(embryos)에 병리학적 효과 및/또는 치사 효과를 포함하는, CAA에 특이적인 병변을 초래한다(Yuasa, N. et al., 1979 상기서적; Yuasa, N. 및 Yoshida, I., 1983 상기서적; Bulow von, V. 및 Witt, M., 1986 상기 서적).

그외, 유리한 특성으로서는;

- 이 CAA 비루스는 약독화될 수 있다. 즉, 부화후 수일 경과 SPF 병아리에 투여시에 현장으로부터 분리된 CAA보다 상당히 완화된 병리학적 증상을 초래한다.

- 이 CAA 비루스는 높은 역가로 부화 계란중에서 증식시키기에 적합하다.

약독화된 생 CAA를 포함하는 본 발명에 따른 백신은, 공지된 방식 그대로 제조될 수 있으며, 현탄액 또는 동결 건조된 제품의 형태로 시판될 수 있다.

생 백신에 대한, 병아리당 투여율은 약독화된 비루스 10^1.0 10^7.0TCID₅₀의 범위이다.

안정제를 첨가하는 것이 유리하며, 건조 조성물이 동결 건조에 의하여 제조되는 경우에는 특히 그러하다. 적절한 안정제로서는, 예컨대, SPGA(Bovarnik 등, J. Bacteriology 59, 509, 950), 탄수화물류(솔비톨, 만니톨, 전분, 수크로오스, 덱스트란 또는 포도당 등과 같은), 단백질류(알부민 또는 카제인과 같은), 또는 그 분해 생성물류 및 완충제류(알카리 금속 포스페이트류와 같은)를 들 수 있다. 원한다면, 보조작용을 갖는 하나 또는 그이상의 화합물도 또한 첨가될 수 있다. 이 목적을 위한 적절한 화합물로서는, 예컨대, 비타민-E 아세테이트 o/w-현탄액, 수산화, 인산, 산화 알루미늄, 광물성 오일(등록상표 Bayol F, 등록상표 Marcol 52와 같은) 및 사포닌을 들 수 있다.

본 발명의 다른 중요한 양태는 이 병원체에 의해서 야기되는 닭의 질병 예방용의 불활성화 CAA 백신의 사용이다. 현재까지는, 접종된 닭에 면역반응을 일으키는 어떠한 불활성화 CAA 백신도 제조될 수 없었다.

본 발명은 예방 접종후 닭에 CAA 비루스를 중화시키는 항체의 생성을 이끌어 낼 수 있는 백신인 효과량의 CAA 비루스로 구성되는 불활성화 CAA 백신을 처음으로 제공하는 것이다.

특히, 이 불활성화 백신은 본 발명에 따른 새로운 종류의 CAA 비루스로부터 유래된다.

본 발명에 따른 바람직한 불활성화 CAA 백신은 상기한 바와같은 연속적인 계대 배양에 의해서 부화 계란중에서 약독화되어진 하나 또는 그 이상의 불활성화 CAA 분리물을 포함한다. 원한다면, 계란에 적합한 CAA는 불활성화 과정에 앞서서, MDCC-MSB1 세포와 같은 감수성이 강한 세포나 조직 배양물중에서 증식될 수도 있다.

바람직하게는, 이 불활성화 백신은, MDCC-MSB1 세포로 분석될 것으로서 약 10^7.5TCID₅₀/1회 투여량 보다 크게, 바람직하게는 약 10^8.0TCID₅₀/1회 투여량 보다 크게, 더욱 바람직하게는, 약 10^9.0TCID₅₀/1회 투여량 보다 더 큰 사전 불활성화(pre-inactivation) 비루스 역가를 갖는 CAA로 구성된다.

불활성화 CAA액은, 아미콘 농축기, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 바와같은 침전기술, 초원심 분리 수단에 의한 농축 또는 보조적 농축 기술과 같은 다양한 수의 유용한 기술에 의하여 또한 농축될 수 있다.

CAA 비루스를 불활성화시키는 목적은 비루스의 증식 능력을 제거하기 위한 것이다. 일반적으로, 이것은 화학적 또는 물리적 수단에 의하여 달성될 수 있다. 화학적 불활성화는, 예컨대, 효소류, 포름알데히드, β-프로피오락톤, 에틸린-이민 또는 그 유도체로 비루스를 처리하는 것에 의하여 달성될 수 있다. 필요하다면, 불활성화시키는 화합물은 뒤에 중화된다; 포름알데히드로 불활성화된 물질은, 예컨대, 티오설페이트로 중화될 수 있다. 물리적 불활성화는, 비루스를 UV광, X-방사선 또는 r-방사선과 같은 고 에너지 방사선 처리하는 것에 의해서 바람직하게 수행될 수 있다. 원한다면, pH는 처리후 약 7의 값으로 환원시킬 수 있다.

통상적으로, 보조제(예를들면 상기한 바와같다) 및, 원한다면, 등록상표 트윈(Tween) 및 등록상표 스판(span)과 같은 하나 또는 그 이상의 유화제도 또한 불활성화된 물질에 첨가될 수 있다.

본 발명에 따른 백신은 비루스 물질을 효과적인 투여량, 즉, 닭에 CAA에 대한 면역반응을 유도할 수 있는 비루스 물질량으로 투여된다.

본 발명에 따른 백신은 어떤 연령의 것에 대해서도 분무, 눈을 통한 점적, 코를 통한 점적, 경구(예컨대, 음용수), 또는 근육내 또는 피하 주사에 의해서 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 생 또는 불활성화 백신은, 이 병원체로 감염되어 고통받는 닭으로부터 얻어질 수 있는 유용한 어떠한 CAA 계통으로 부터도 제조될 수 있다. 수많은 CAA 분리주가 종래의 기술에 있어서 이미 기재되어 있으며, 예컨대, Cux-1 계통(Bow von, V. 등, J. Veterinary Medicine 30, 742-750, 1983), Gifu-1 계통(Yuasa, N. 등, 1979 상기서적), TK-5803계통(Goryo, M. 등, 1987 상기서적) 및 CAA 82-2 계통(Otaki 등, 1988 상기서적)을 들 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 생 또는 불활성화 백신은, 수탁 번호 I-1141로 CNCM에 기탁된 인터베트(Intervet) CAA 계통 26P4 비루스로부터 유래된다.

본 발명에 따른 백신은 바람직하게는 불활성화된 CAA를 포함하는 백신이며, 이것은 CAA 성분과 하나 또는 그 이상의 관련이 없는 조류 비루스들의 조합으로 구성될 수 있으며, 이들 조류 비루스로서는 바람직하게는, 뉴캐슬병 비루스(NDV), 감염성 브론치티스 비루스(IBV), 감염성 버살병 비루스(IBDV), 마렉병 비루스(MDV), 칠면조 헤르페스 비루스(HVT), 감염성 라린고트라케티스 비루스 또는 다른 조류의 헤르페스 비루스류, 레오 비루스, 에그 드롭 신드롬(Egg Drop Syndrome) 비루스, 조류의 뇌척수염 비루스, 세망내피종 비루스, 류코시스 비루스, 계두 비루스, 칠면조 비기관염 비루스(TRTV) 또는 아데노 비루스를 들 수 있다.

본 발명의 또다른 중요한 양태는 CAA 비루스 산물에 대한 새로운 생산시스템이다. 결과로써 얻어지는 비루스 산물은 가금류에 있어서의 CAA 감염에 대항하기 위한 백신 조성물을 조제하기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명전까지는, 생체외 증식으로부터 얻어질 수 있는 최대 역가는 약 10^6.0 10^7.0TCID₅₀/㎖ 사이였다. 본 발명의 생산 시스템에 의한 만족스러운 수준의 CAA 항원 획득은 지금까지의 종래의 기술에 있어서는 극복할 수 없었던 것이다. 더우기, 높은 역가로 CAA 비루스를 증식시키는 것은 지금까지는 불가능하였으므로 고 농도의 항원을 필요로 하는 불활성화 CAA 백신의 제조에 장애가 되어왔다.

본 발명에 따른 CAA 비루스 산물의 제조 방법은, 닭의 배(embryos)에 병변을 유도할 수 있는 CAA 비루스, 특히 부화 계란중에서 약독화되어진 바와같은 CAA 비루스를 감수성이 있는 기질에 접종하고, CAA를 증식시키며, CAA 함유 물질을 수거하는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 이들 CAA 비루스가 증식되는 기질은 SPF 부화 계란이다. 부화 계란은, 예컨대, 적어도 10^4.5TCID₅₀/계란으로 포함되는 0.2㎖의 CAA 함유 현탄액 또는 호모제네이트로 접종될 수 있다. 바람직하게는, 계란은 약 10^6.0TCID₅₀으로 접종되고, 이어서 100℉(약 37.8℃)에서 13일간 부화된다. 13일후, CAA 비루스 산물은 배 및/또는 막 및/또는 알란토인액을 모으고, 이 물질을 적절히 균질화 하는 것에 의해서 수거될 수 있다. 호모제네이트는 그후 10분간 2500g로 원심 분리될 수 있으며, 이어서 필터(100㎛)를 통하여 상청액은 여과된다.

선택적으로는, 상기한 CAA 비루스는 감수성이 있는 세포 배양물, 예컨대 MDCC-MSB1 세포에 접종될 수 있으며, 이어서 세포를 배양하고, 증식된 비루스를 모은다.

MDCC-MSB1 세포중에서 분석된 것으로서 적어도 약 10^8.0TCID₅₀/㎖, 통상적으로는 적어도 약 10^8.4TCID₅₀/㎖의 수거 가능한 비루스 역가가 접종후 1018일 후에 얻어질 수 있으며, 바람직하게는 접종후 13일 후에 얻어진다. 수거된 액은, 괴상(bulk)으로 또는 동결 건조되어 충진 및/또는 동결된 최종제품으로 만들기 위해서 전기한 바아같은 비루스 안정제를 조합시킬 수 있다.

선택적으로는, 수거된 액은 불활성화 될 수 있다. CAA액은, 다음에 한정되는 것은 아니지만 바이너리 에틸렌이민, 아세틸 에틸렌이민, β-프로피오락톤과 같은 다수의 불활성화제로 불활성화 될 수 있으며, 0.10.5%의 농도가 바람직하게 사용된다. 불활성화제는 호모제이트 또는 그 여과액중에 함유된 비루스에 첨가될 수 있따.

β-프로피오락톤은 비루스액에 첨가되며, pH가 산성쪽으로 좋지않게 이동하므로 수산화 나트륨이나 탄산 수소나트륨 용액으로 조절한다. 조합된 불활성화제-비루스 액은 4℃∼37℃의 온도에서 인큐베이션(incubation)된다. 172시간의 인큐베이션 시간이 사용될 수 있다.

더우기, 본 발명은 부화 계란 중에서 약독화된 CAA 계통의 비루스로부터 제조된 백신을 투여하는 것으로 구성되는, 가금류에 있어서의 CAA 감염을 제어하는 방법을 포함한다. 이 방법은 생 또는 불활성화 백신의 투여를 포함한다.

[실시예 1]

[부화 계란중에서의 CAA의 약독화]

본래의 인터베트(Intervet) 계통 26P4를 빈혈증에 걸려 있는 현장에서의 닭의 간으로부터 분리하였다(exp. VIM-CA-89-4-153). 분리후, 이 계통을 계란내로 접종하기 전에 MDCC-MSB1 세포내로 5회 계대 배양하였다.

0.2㎖의 CAA 계통 26P4 또는 Gifu(Yuasa, N. 등, Avian Diseases 23, 366-385, 1979)를 계란의 난황에 접종하였다. 100℉(37.8℃)(상대습도 : 55%)에서 13일간 배양후, 배를 수거하여 균질화하였다. 호모제네이트를 2500g에서 10분간 원심 분리하였다. 상청액을 수집하고, 100㎛ 필터를 통하여 부었다. 이 호모제네이트를 2.5% 트립토오스로 1:20으로 희석하고, 계란당 0.2㎖을 접종하였다. 이와같이 하여, 계통 26P4를 19회 이상 계대 배양하였다. 19번째의 계란 계대 배양을 한 이 계통의 시료(CAA 매스터 씨드 18-09-1990 ; 1㎖/fl)를 프랑스 파리 파스퇴르 연구소의 CNCM의 1991년 9월 12일자로 수탁 번호 I-1141로 기탁하였다.

Gifu 계통은 부화 계란중에서 14회 계대 배양하여 약독화하였다.

[실시예 2]

[2종의 고 계란-계대 배양(high egg-passage) CAA 비루스와 저 계란-계대]

[배양(low egg-passage) CAA 비루스에 대한 부화 계란 중에서의 중식 특성 비교]

계란-계대 배양 정도가 다른 비루스를 3060SPF 계란들의 난황에 접종하였따. 100℉(약 37.8℃)(상대습도 55%)에서 7일간 부화시킨 후, 계란들을 광선별하였으며, 죽은 부화 계란이나 수정되지 않은 계란은 폐기하였다.

접종후 7일째부터 매일 계란들을 광 선별하였으며, 배 치사율을 기록하였다.

CAA로 인한 배 치사 기록은 접종후 10일째, 즉 11일째 되는 날에 시작한다.

접종후 13일 되는 날에 배들을 수거하여 균질화시키고, 2500g에서 10분간 원심 분리하였다.

상청액을 수거하고 MDCC-MSB1 세포내에서 비루스 감염성에 대한 역가를 측정하였다.

표 1과 2는, 배에 대한 병변 및/또는 치사를 유도할 수 있는 고 계란-계대 배양 CAA 비루스가 저 계란-계대 배양 CAA 비루스에 비하여 높은 역가로 생체외에서 증식될 수 있다는 것을 나타내고 있다.

배들은 접종 후 13일째에 수거하였다.

3번째 계란-계대 배양한 26P4 계통으로 접종된 배들은 어떠한 배의 병변도 보이지 않았다.

17번째 계란-계대 배양한 것으로 접종된 배들은 창백하였으며, 몇몇 배들(특히 죽을것들)은 뇌출혈을 나타냈다.

[실시예 3]

[생 CAA 백신을 사용한 실험적 예방 접종]

부화 계란들을 통하여 비루스를 계대 배양시키는 것에 의한 면역원성 유지 및 CAA 비루스의 약독화를 측정하기 위한 실험을 수행하였다.

- 생 CAA 백신의 병원성

실험 1에서는 다음과 같은 계대 배양 수준의 인터베트 계통(Intervet strain)이 사용되었다:

* 1번째의 계란-계대 배양 수준(저 계란-계대 배양 수준)

* 18번째의 계란-계대 배양 수준(고 계란-계대 배양 수준)

* 감염되지 않은 부화된 SPF 계란들(13일간 부화)로 부터 유래하는 배의 호모제네이트.

실험 2에서는 다음과 같은 계대 배양 수준의 인터베트 계통이 사용되었다:

* 4번째의 계란-계대 배양수준(저 계란-계대 배양 수준)

* 19번째의 계란-계대 배양 수준(고 계란-계대 배양 수준)

19번째의 계란 배양 수준의 CAA 비루스를 매스터 씨드로 정했다.

* 감염되지 않은 부화된 SPF 계란들(13일간 부화)로부터 유래된 배의 호모제네이트.

0.2㎖의 희석된 CAA 계통이 약 10TCID으로 함유되도록 하는 방식으로 이 비루스들을 희석하였다.

부화후 1일 경과 병아리들에게 근육내 경로로 백신 0.2㎖을 접종하였다.

실험 3에서는 다음과 같은 계대 배양 수준의 지푸(Gifu)계통을 사용하였다:

* 1번째의 계란-계대 배양

* 14번째의 계란-계대 배양

107마리의 부화후 1일 경과 병아리들을 3536마리의 세 군으로 나누었다(상기 참조). 3번째 군은 예방 접종하지 않았다(대조군).

예방 접종후 10 및 14일째에 군 당 10마리를 헤마토크릿트 측정 및 검사를 위해서 격리장으로부터 꺼냈다.

예방 접종후 3주째에 이 닭들로부터 채혈하고, 혈청들을 간접적인 면역 형광 테스트(IIFT)하여 CAA-항체들을 조사하였다.

예방 접종은 실험 1과 2에 기술한 바와같이 하여 수행하였다.

실험 1과 2에서는, 150마리의 부화후 1일 경과 병아리들을 각각 50마리의 3군으로 나누고, 각 군을 감압 격리장에 위치시켰다.

군 당 40마리를 상기한 비루스중의 하나로 예방 접종하였고, 군 당 10마리는 예방 접종하지 않았으며, 접촉 대조군으로 삼았다.

예방 접종후 10, 14 및 21째에 군 당 4 또는 8마리를 헤마토크릿트 측정 및 검시를 위해서 격리장으로부터 꺼냈다.

예방 접종후 5주째에 이 닭들로부터 채혈하였으며, 혈청들을 VN-테스트에 의하여 CAA 항체들을 조사하였다.

[비루스 역가 측정]

96웰 마이크로플레이트(조직 배양 등급)를 사용하여 MDCC-MSB1 세포들 중에서 이 비루스들의 역가를 측정하였다.

10%의 송치 혈청 및 항생제들이 보충된 RPMI 1640 배지로 이 비루스의 연속적인 10배 희석액을 만들었다. 96웰 마이크로플레이트중의 10개의 웰에 모든 단계의 비루스 희석액을 휄당 100μℓ씩 채웠다. 이어서 100μℓ MDCC-MSB1 세포들(최종농도 : 6×10⁵세포/㎖)을 가하였다. 이 세포들을 매 2-3일 마다 예비 배양하였으며, 10번의 예비 배양후 종말점을 판독하였다. 감염 역가는 리드 및 멘츠에 의한 것에 따라 계산되었다(Reed, L.J. 및 Muench, H., Am. J. Hyg. 27 493-497, 1938).

[혈청학적 테스트]

CAA에 대한 항체들을 MDCC-MSB1 세포들 및 종래의 일정한 비루스를 사용한 96웰 마이크로플레이트를 적용한 VN 데스트로 측정하였다; 변경된 혈청법(Kunitoshi, I., 및 Yuasa, N., Jpn. J. Vet. Sci. 52, 873-875, 1990).

IIFT는 표준 절차에 따라 수행하였다(Yuasa, N. 등 Avian Pathology 14, 521-530, 1985).

[헤마토크릿트 값]

날개 정맥으로부터 채혈한 혈액을 헤파린 처리된 마이크로헤마토크릿트 모세 튜브에 넣었다. 5분간 12,000rpm으로 원심 분리한 후, 헤마토크릿트 값(%)을 읽었다. 헤마토크릿트 값이 27.0% 미만을 나타내는 경우, 이러한 닭들은 빈혈로 간주되었다(Yuasa, N. 등, 1979 상기서적).

실험 1-3으로 부터의 SPF닭들에 초래되었던 주요한 병리학적 병변들을, 각각 표3-5에 요약한다.

1) 예방 접종후 14-21일째에 발생하는, CAA 감염으로 인한 치사율

2) 흉선 위축증을 나타낸 닭의 총수/조사된 닭의 총수×100%

3) 핏기없고 지방이 많은 골수를 가진 닭의 총수/조사된 닭의 총수×100%

4) 27% 미만의 Ht값을 갖는 닭의 총수/조사된 닭은 총수×100%

2) 흉선 위축증을 나타낸 닭의 총수/조사된 닭의 총수×100%

4) 27% 미만의 Ht값을 갖는 닭의 총수/조사된 닭은 총수×100%

1)-4) 표 3에서 기재한 바와같다.

5) 표준편차를 갖는 로그 베이스 2를 나타냄.

질병에 걸린 닭의 총 수에 있어서 뿐만 아니라, 평균 Ht 값의 차이로 나타내진 바와같이 병리학적 변화의 극심함에 있어서, 저 계란-계대 배양 비루스와 고 계란-계대 배양 비루스의 양족 CAA 분리물 사이에는 병리학적 변화들에 있어서 현격한 차이가 있다.

또한, 고 계란-계대 배양 비루스에 의해서 유도된 골수와 흉선의 전체 병변의 저 계란-계대 배양 비루스에 의해서 유도된 병변보다 덜 심했다.

- 생 CAA 백신들의 면역원성

표 5는 지푸 계통의 면역원성이 CAA 비루스의 약독화 결과로서 불리한 영향이 없다는 것을 증명하고 있다.

표 6에서는 실시예 1과 2의 혈청학적 결과들을 나타내고 있다. 고 계란-계대 배양 비루스의 병원 특성의 감소에도 불구하고, 이 비루스의 면역원성에는 어떠한 감소도 주목되지 않았다.

1) 표준편차를 갖는 로그 베이스 2로 나타냄.

[실시예 4]

[조합 생 백신(live combination vaccine)을 사용한 예방 접종]

레오 비루스 백신 : 상업적으로 구입 가능한(인터베트 인터내셔날 비.브이., 네덜란드) 생 레오 백신, 등록 상표면 Nobilis(뱃치 016901). 이 백신은 제조업자의 사용 설명서에 따른 희석제로 희석하였다.

CAA 백신 : 인터베트 계통의 19번째 계란-계대 배양 수준의 생 CAA 비루스를, 1마리 투여량(0.2㎖)이 10TCID으로 포함되도록 하는 방식으로하여 희석제로 희석하였다.

생 레오백신 1마리 투여량 또는 생 CAA 백신 1마리 투여량, 또는 조합된 생레오 및 CAA 및 백신 1마리 투여량을 부화후 4주 경과한 SPF 닭에 근육내로 예방 접종하였다.

예방 접종후 4 및 6주된 닭의 혈액 시료를 채혈하였으며, CAA 및 레오 비루스에 대한 항체의 존재를 알기위한 비루스 중화 테스트로 그 혈청들을 시험하였다.

1) 표준편차를 갖는 로그 베이스 2로 나타냄.

비록, 조합 백신이 살아있는 형태의 양 타입의 비루스를 모두 포함하고는 있으나, 그 면역원성에 대한 어떠한 불리한 상호 간섭 작용도 관찰되지 않는다는 것은 상기의 표로부터 명백하다.

[실시예 5]

[불활성화 CAA 백신을 사용한 실험적 예방 접종]

부화후 4주 경과된 SPF 닭을 유-중-물(water-in-oli : W/O) 상태의 불활성화 CAA 백신으로 근육내로 예방 접종하였다. 이 백신은 19번째의 계란-계대 배양 수준의 인터베트 계통의 배 호모제네이트로부터 제조되었다. 이 비루스들은 37℃에서 3시간동안 0.5% β-프로피오락톤으로 불활성화시켰다. W/O 현탄액은 50%의 불활성화 CAA-계란 물질 및 50%의 광물유 현탄액을 포함하도록 조제되었다.

감염성 역가에 근거한 10TCID비루스 항원을 포함하는 W/O 현탄액 0.5㎖을 닭마다 근육내로 주사하였다. 예방 접종후 8주째에, 동일한 불활성화 백신을 근육내로 하여 2번째의 예방 접종을 닭에게 하였다. 첫번째와 두번째의 예방 접종후 다른 시간대에서 혈액 시료를 채혈하고, CAA 항체들의 존재를 알아보기 위한 VN 테스트로 그 혈청들을 시험하였다(표 8). 감염성 역가에 근거한 10TCID비루스 항원을 포함하는 불활성화 백신을 접종된 동물에 면역 반응을 유도할 수 있다는 것이 증명되었다.

다른 예방 접종 실험에서는, 백신 투여량을 1㎖의 수-중-유(oli-in-water) 현탄액중 10및 10TCID으로 한 것을 제외하고는 상기한 바와같이 하였다(표 9).

1) 로그 베이스 2로 나타냄.

N.D.=측정하지 않음.

1) 로그 베이스 2로 나타냄.

Claims

닭의 배(embryos)에 병변을 유도할 수 있는 닭의 빈혈증 병원체(Chicken Anemia Agent ; CAA) 비루스.
제1항에 있어서, 비루스가 파스퇴르 연구소(Institut Pasteur)의 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)에 기탁된 계통 I-1141(기탁일 : 1991년 9월 12일, 기탁번호 I-1141)인 것을 특징으로 하는 비루스.
기질 세포를 포함하는, 제1항 또는 제2항에 따른 CAA 비루스들의 미생물학적으로 순수한 배양 조성물.
제3항에 있어서, 조성물이 10^8.0TCID₅₀/㎖ 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 배양 조성물.
제1항 또는 제2항에 따른 CAA 비루스들을 포함하는 것을 특징으로 하는 약독화된(attenuated) 생 CAA 비루스를 포함하는 CAA에 대한 가금 보호용 백신.
제5항에 있어서, CAA 비루스들이 부화 계란들(embryonated eggs) 중에서 약독화되는 것을 특징으로 하는 백신.
효과적인 양의 불활성화 CAA 비루스들을 포함하는 것을 특징으로 하며, 예방 접종후 닭에게 CAA 비루스 중화 항체들의 생산을 유도해 낼 수 있는, CAA에 대한 가금 보호용 백신.
제7항에 있어서, CAA 비루스들의 사전 불활성화(pre-inactivation)량이 약 10^7.5TCID₅₀/투여량 이상인 것을 특징으로 하는 백신.
제8항에 있어서,사전 불활성 량이 약 10^8.0TCID₅₀/투여량 이상, 바람직하게는 약 10^9.0TCID₅₀/투여량 이상인 것을 특징으로 하는 백신.
제7항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 제1항 또는 제2항에 따른 CAA 비루스들을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제7항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 보조제(adjuvant)를 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제5항에 있어서, 백신이 하나 또는 그 이상의 관련없는 조류 병원균의 항원을 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
a) 감염되기 쉬운 기질에 제1항 또는 제2항에 따른 CAA 비루스를 접종하고, b) CAA 비루스를 증식시키며, c) CAA 비루스 함유 물질을 수거하는 단계들로 구성되는 CAA 비루스 산물의 제조방법.
제13항에 있어서, 기질이 부화 계란인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제5항 또는 제6항에 있어서, 보조제(adjuvant)를 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제7항에 있어서, 백신이 하나 또는 그 이상의 관련없는 조류 병원균의 항원을 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.