DE2809343A1

DE2809343A1 - Impfstoff gegen eierlege-krankheit, seine herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE2809343A1
Application number: DE19782809343
Authority: DE
Inventors: William Baxendale
Original assignee: Akzo NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1977-03-04
Filing date: 1978-03-03
Publication date: 1979-01-18
Also published as: DE2809343C2

Description

DH. ΙΝΠ. 1·\ WtJHSTIIO KK Dlt.H. ν. I¹K(UI MANN WIt. IN(J. I). 15KlIIiKxVS I)UM.. IX(J. Ιί. (JOKTZ SdOO M UXCIl KX OO

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1A-50 613

Patentanmeldung

Anmelder; AKZO H.V₀

Ijssellaan 82 Arnhem/Niederlande

Titel j Impfstoff gegen Eierlege-Krankheitj, seine Herstellung und Verwendung

8 Ü - -83/0588

I)H. ING. KAVUKSTIIOT··!·· I)K-IC. ν. IMCCU MANN I)H. ING. J). ISKIIHKNS I)IIMi. IN«. i{. GOKTZ

ΡΔΤΚΝΤΛΝΛνϋΙΛ'Β

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1ΊΙΟΤΚΟΤΙΆΤΚΝΤ MÜKCUKPT

1Α-50 613 Anmelder: Akzo N.V.

Beschreibung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Impfstoffes zum Immunisieren von
eierlegenden Vögeln, insbesonderevon Hühnern, gegen eine Krankheit die nachfolgend Eierlege-Krankheit bezeichnet
und durch einen neuen Virus hervorgerufen wird, der die
Produktion und Qualität der Eier beeinträchtigt; die Erfindung bezieht sich gleichfalls auf die auf diese Weise hergestellten Impfstoffe.

Es ist bekannt, daß die Eiererzeugung durch verschiedene Faktoren nachteilig beeinflußt werden kann, beispielsweise durch ^"'.wenig Futter oder als Nebenwirkung von Virus-Erkrankungen, die andere Krankheiten hervorrufen, die beispielsweise die Atmunswege betreffen und z.B. durch eine Infektion, die durch den Virus hervorgerufen werden, der für die Newcastle-Krankheit (eine Haushuhn-Krankheit) verantwortlich ist. Die Infektion von Hühnern durch den Eierlege-Krankheit-Virus war bisher unbekannt oder zumindest nicht weit verbreitet, wie sich aus den Ergebnissen einer Untersuchung von Sera ergibt, die zwischen 1973 und 1974 aus 12 Scharen oder Völkern entnommen wurden und zeigten, daß keines dieser Tiere Anti«· körper gegenüber diesem Virus aufwies. In jüngster Zeit jedoch wurde diese besondere Art des Eierlegens bzw. der Eierlege-Krankheit in einer Anzahl von Ländern beobachtet. Eines

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der Merkmale dieser Krankheit ist, daß die für die Schalenproduktion verantwortliche Drüse angegriffen sein kann und die Erzeugung von Eiern dadurch gemindert wird oder ganz ausfällte Antikörper gegenüber diesem Virus wurden in 20 von 24 geprüften Entenscharen nachgewiesen und es scheint_;daß der.^ Virus angeborenermaßen (naturally) in diesen Arten auftritt.

Der diese Krankheit verursachende Organismus ist offensichtlich eine neue Virusart, die allem Anschein nach mit anderen bekannten Vogel-Viren keine Beziehung aufweist mit Ausnahme bestimmter gemgfügiger Proteine und morphologischen Eigenschaften, die er mit Vogel-Drüsen-Viren (Adeno-Viren) gemeinsam haben kann₀ Es wurde der mit EDS bezeichnete Virus gefunden, der für diese Art von Krankheit verantwortlich ist»

Der Virus kann aus den Zellen des Leukocytenfilms in zentrifugiertem Blut auf Hühnerembryo~?ibroblasten (CEF) isoliert werden«, Der Leukocytenfilm ist die Oberflächenschicht des Sedimentes, das nach dem Zentrifugieren des Blutes erhalten wird. Ein Kulturmedium bzw. Nährboden von Hühnerembryo-Fibroblasten wurde mit diesem Leukocytenfilm beimpft und in einer 5 %igen COp-Atmosphäre bei Temperaturen von 37»5 C wachsen gelassen» Ein cytophatischer Effekt wurde nach 2 bis 4 Tagen beobachtet. Der Virus wurde sowohl in Zellen als auch in Gewebe-Kultur-Flüssigkeiten gefunden»

Der Virus kann auch aus anderen Quellen isoliert werden, beispielsweise aus den Eileitern und Faeces von Hühnern_s sowie auf After-Abstrichen von Enten_o Der Virus erweist sich als ein hitzebeständiger Vogel-Virus„ Im feuchten bzw* nassen Zuäandj, z.B„ in Zellkultur-Flüssigkeiten kann der Virus 10 Tage bei Raumtemperatur überleben₉ wobei der Titer um

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10
weniger als 1 10g. abnimmt. Andere Merkmale, die zeigen daß es sich bei diesem aufgefundenen Virus um eine neue Virusart handelt, die mit bekannten Vogel-Viren nicht verwandt ist, sind folgende:

Die durch diesen Viitis erzeugten Antisera gehen keine Kreuz-Neutralisation mit irgendeinem der bekannten Vogel-Viren ein„

Der Virus multipliziert sich im Zellkern und wächst wenig oder gar nicht in bereits Embryonen enthaltenden Hühnereiern: beide Erscheinungen sind Characteristica dieses Virus. Der Virus erzeugt einen cytopathisehen Effekt unter Fleckenoder Plattenbildung, wenn Agarnahrboden auf Zellkulturen gelegt oder geschichtet wird. Typische intranucleare eosinophile Einschlußkörper werden in Zellkulturen erzeugt." Beruhendauf den Ergebnissen des Virus-Neutralisations-Tests (Plattenreduktionstest) und des Hämagglutinations-Inhibitions-Testes wurde auch gezeigt, daß der neue Virus mit anderen Vogel-Viren nicht verwandt ist. Außerdem beweisen die im Gel-Diffusions-Test erzielten Ergebnisse, daß dieser Virus sane eigenen und charakteristischen und einzelnen bzw. deutlichen Antigene enthält.

Der Hämagglutinintiter kann mindestens 10 HA Einheiten/ml

5 betragen, was bedeutet, daß selbst bei einer Verdünnung von Hühnererythroeyten agglutiniert werden.

Diese Eigenschaft unterscheidet diesen V±us von einer Anzahl von Vogel-Viren, insbesondere von den allgemein als Vogel-Drüsen-Viren (Adenoviren) bekannten. Das in Rede stehende Hämagglutinin kann das gewonnene überstehende Material aus infizierten Kulturen sein und im Versuch bei Raumtemperatur ohne weitere Behandlung eingesetzt werden.

Der Virus wächst auf Hühner- und Entenzellen, beispielsweise

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Näßrenzellen, Embryo-Leberzellen und Embryofibroblasten_o Er wächst auch auf bereits Embryonen enthaltenden Enteneiern.

Die obigen Data reichen aus, um diese neue Virusart zu identifizieren und zeigen, daß der Virus verschieden ist von anderen bei den Vögeln auftretenden Viren wie Vogel-Influenzaviren, Newcastle Krankheit-Virus, Reo-Urus, Adeno-V'irusj Leucosis-^ffirus, Reticuloendotheliosis-Virus, Vogel-Encephalomyelitis-Virus, Herpes-Virus einschließlich infectiöse Laryngotracheitis, Marek's Kraniche it-Virus, Tauben-Herpes-Viren, Truthahn-Herpes-Viren, infectiöse Bronchitis-Viren und Gumboro Krankheit-~Virus.

Der neue Virus wurde im CentralVeterinary Laboratory, New Haw, Weybridge unter der Nummer VLO 10110/AV1 hinterlegt«

Geflügel-Di e Abnahme^-an gelegten Eiern in/Scharen, die mit dieser Virusart infiziertsind, ist kombiniert mit einer Immunantwort. Infolgedessen können empfindliche Tiere gegen diese Krankheit durch Impfen geschützt werden»

Da der Virus bei Vögeln,die sich nxcht i¹' der Legephase befinden, keine ernsthaften pathogenen Wirkungen oder Effekte hervorruft kann er in unabgeschwächter Form zur Erzeugung eines Impfstoffes verwendet werden_o Zur Impfstoff-Urzeugung kann auch der Viurs verwendet werden;, der keine inf ektiven Eigenschaften mehr aufweist, jedoch seine Antigen-Aktivität, d»ho die Fähigkeit, die Erzeugung von Antikörpern zu stimulieren) nicht verloren hat*, Dies kann durch Abschwächung oder durch Inaktivierung erreicht werden; im letzteren"Falle verliert der Virus auch seine Fähigkeit sich zu vermehren_o

Erfindungsgemäß wird m/ι ein Impfstoff hergestellt, der gegen

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die Eierlege-Krankheit schützt unter Verwendung des oben beschriebenen neuen Virus und antigenisch verwandter Viren, die im Hämagglutinations-Inhibitionstest und im Neutralisationstest die Kreuzreaktion eingehen, in entweder abgeschwächter oder nicht abgeschwächter lebender Form oder in einer inaktivierten Form.

Die Erfindung bezieht sich auch auf diese neuen Impfstoffe selbst.

Für die Herstellung eines Impfstoffes mit

lebenden nicht abgeschwächten Virus wird dieser auf Zellgewebe-Nährboden, vorzugsweise einem Vogelgewebe-Nährboden wie Hühnerembryo-Fibroblast, Embryoleber- oder Nierenzellen 2 bis 5 Tage lang oder in bereits Embryonen enthaltenden Eiern gezüchtet. Die Gewebskulturflüssigkeiten und/oder die Zellen werden gewonnen und im Falle der Embryonen enthaltenden Eiern die Embryos und/oder die Membranen und/oder die Allancoal-FlUssig^eiten (allantoic fluids). Darauf wird die Herstellung des Impfstoffes aus der Virussuspension in an sich bekannter Weise vorgenommen. Vorteilhafterweise wird ein Stabilisator zugegeben, vor allem dann,wenn ein trockenes, lyophiliertes Präparat hergestellt wird. Ein Adjuvans oder Hilfsmittel wie Aluminiumhydroxid kann ebenfali zugegeben werden. Das Stabilisierungsmittel kann ein Kohlenhydrat sein wie Sorbit, Mannit, Stärke, Saccharose, Dextran oder Glucose, ein Protein wie Albumin oder Casein, ein Protein enthaltendes Mittel wie Rinderserum und/oder entrahmte Milch und ein Puffer wie ein Alkaliphosphat. Bevorzugt wird als Stabilisator ein Gemisch, das allgemein unter der Bezeichnung "SPGA" beschrieben vonBovarnick. (Journ. Bact. 52,509(195O)) bekannt ist.

Zur Herstellung eines Impfstoffes mit lebendem abgeschwächtem Virus sind verschiedene Methoden möglich, beispielsweise die

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Adaption des isolierten Virus an eine Kultur oder einen Nährbodeiij'die (der) Gewebszellen von Vögeln enthällt und Abschwächen beispielsweise durch 10 bis 200 Passagen durch derartige Kulturen, worauf dann der Virus vermehrt und ein Impfstoff hergestellt wird, wie oben für die Herstellung eines Impfstoffes mit lebendem^nicht abgeschwächtem Virus beschrieben.

Eine andere Methode zur Herstellung von Impfstoffen mit lebendem Erreger besteht darin, daß man geeignete Clone auswählt und züchtet.

Wenn zur Herstellung des Impfstoffes mit lebendem Erreger die infizierten Zellen verwendet werden, wird der Virus vorteilhafterweise au:s den Zellen freigesetzt, beispielsweise mittels Ultraschall-Vibration«, Eine andere Möglichkeit zur Herstellung des Impfstoffes besteht darin, den Virus zu inaktivieren« Die Inaktivierung kann beispielsweise mit Formaldehyd, mit organischen Lösungsmittein, insbesondere mit Halogenkohlenwasserstoffen in Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels wie einem Polyoxyäthylen-Sorbitanmono-Oleat, oder mit ß-Propiolacton vorgenommen iwerden» Der Virus kann auch durch Spalten mit Hilfe einar Reihe von Methoden inaktiviert werden, beispielsweise unter Verwendung eines JSnzyms und/oder eines organischen Lösungsmittels«, Nach der Inaktivierung kann der pH auf 7 eingestellt werdei, das Inaktivierungsmittel kann neutralisiert werden, beispielsweise wird Formaldehyd mit Thiosulfat neutralisiert^ und der inaktivierte Virus wird mit einem Adjuvans gemischt» Das Adjuvans kann beispielsweise Aluminiumhydroxid sein oder ein Gemisch aus einem Mineralöl (beispielsweise der Haiüelsbe-Zeichnung Marcol 52) und einem oder mehreren Emulgatoren wie Tween 80 und Span 80_o

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Die so hergestellen Impfstoffe mit entweder lebendem oder inaktiviertem Erreger werden den Vögin üblicherweise im Alter von 10 bis 20 Wochen vor Eintritt der Legephase verabreicht. Für Impfstoff mit lebendem Er-

3 8 reger kann die Dosierung im Bereich von 10 - 10 pfu (Einheiten je Vogel liegen; vorzugsweise sollte der Impfstoff aber in einer Dosis von 10 - 10 pfu je Vogel gegeben werden. Die Verabreichung kann durch Zerstäuben (Sprühen), im Trinkwasser oder mittels Injektion erfolgen. Der Impfstoff mit inaktiviertem Erreger muß injiziert werden.

2
Die Mindeste! osisjsoll 10 HA Einheiten je Vogel betragen

und vorzugsweise mehr als 4 χ 10 HA Einheiten je Vogel.

Experimentelle Ergebnisse

I. Sicherheitstest

15 x spezifisch pathogenfreie (SPF) 1 Tage alte Hühner-Küken, die intranasal mit 10⁷ pfu je Küken infiziert worden waren, zeigten keinerlei klinische Krankheitsmerkmale während einer zweiwöchigen Beobachtungsperiode nach der Infektion.

II. Antikörperumwandlungs- und Sicherheitstest

10 χ 9 Wochen alte SPF Kücken, die mit 10⁷ pfu behandelt worden waren, entwickelten 4 Wochen nach der Impfung spezifischen, die Hämagglutination hemmenden Antikörper und Gelausfällungs-Antikörper, Wiederum wurden während einer zweimonaitgen Beobachtungsperiode keinerlei klinische Krankheitszeichen beobachtet.

III. Pathogenitäts-Test in Legehühnern

18 χ SPF Legehennen, die mit 10 pfu/Huhn intranasal be-

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handelt worden waren, zeigten 3 bis 4 Tage nach der Infektion deutliche Eierlegetätigkeit_s während eine unbehandelte Kontrollgruppe keine Legetätigkeit ent-, faltete.

IVo Schutztest mit Impfstoff mit inaktiviertem Erreger Impfstoff;

Auf Entenei gezüchteter BC14 Virus, der mit O₉4 % Formalin inaktiviert und mit folgenden Adjuvantien gemischt worden wars

Wasserphase Ölbhase

inaktivierter · BC14 Virus Marcol

(800 HA Einheiten/Dosis)

Allantoinflüssigkeit (Allantoic fluid) Tween Merthiolat (auf 1: 10 000) Span

Destilliertes Wasser

Versuchsanordnung

50 Zuchthennen für Brat- und Grillhühnchen und 6 Hähne, die seit dem Ausschlüpfen isoliert gehalten worden waren, wurden im Alter von 19 Wochen in zwei gleiche Gruppen geteilt» Die eine Gruppe wurde subcutan mit dem EDS Impfstoff geimpft; die andere Gruppe blieb ungeeimpft. Die Hennen kamen mit 23 Wochen ins Legealter. Im Alter von 29 Wochen wurden beide Gruppen durch intraoculare Instillation (Eintröpfeln) infiziert und zwar mit einem der erfindungsgemäßen Feldisolate (Stamm M13) in einer

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Dosis von 10 pfu/Vogel.

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Ergebnisse

Bei der nicht geimpften Gruppe fiel die Eiererzeugung (Tabelle 1) nach 6 Tagen erheblich ab und dieses Absinken der Eierlegetätigkeit dauerte 24 Tage an. Die Hennen schienen auch träge und fraßen wenig während 5 bis 7 Tagen. Die geimpften Vögel hingegen waren gut geschützt gegen die Wirkungen wie sie durch die Infektion in der Kontrollgruppe hervorgerufen wurden.

Die serologischen Antworten 30 Tage nach der Impfung sind in Tabelle 2 gezeigt.

Schlußfolgerung :

Der Impfstoff gibt einen ausgezeichneten Schutz gegen die Wirkungen eines virulenten Stammes des EDS Virus.

Tabelle 1

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- 10 -

Tabelle 1

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	Anzahl der	gelegten Eier
Tag
	Kontrolle	geimpfte Gruppe
1	16	16
2	14	16
3	14	17
4	14	15
Tag der Infektion
■ . 5	13	15
- 6	14	14
7	14	14
8	14	14
9	13	15
IO	5	15
11	5	13
12	2	13
13	2	13
14	3	13
15 ' - ■	3	14
16	2	14
17	• 2	15
18	2	15
19	2	15
20	3	15

11

ÜS37Ü

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Fortsetzung Tabelle 1

	Anzahl der gelegten Eier	geimpfte Gruppe
21	Kontrolle	15
22	3	18 !
23	3	18
24	3	17 1
25	5	17
26	5	17
27	5	16
28	5	16
6

- Tabelle 2 -

- 12 -

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Tabelle 2

Antwort von 19 Wochen alten Versuchstieren auf BC14 inaktivierten Impfstoff (30 Tage nach Inokulation)

geimpfte	Hl	ppe	Antikörper-Titer	Ge 1— Di :f f u s i on
Gruppe	64	Alle<8	Neutralisatbns-Test	+
1	128	2048	+
2	64	2048	+
3	<8	2048	-
4	128	32	+
5	64	2048	+
6	128	2048	+
7	64	2048	+
8	2048
Kontroll gru;		MTB -
IO	Alle<16

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Die folgerrlaiBeispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1
Isolieren des Virus

20 Blutproben wurden von willkürlich ausgewählten Vögeln einer Schar entnommen. Die weißen Blutkörperchen wurden nach dem Zentrifugieren abgetrennt und 0,2 ml gepackte Zellen auf je eine von zwei CEF Zellkulturplatten (6 cm) gegeben (geimpft).

Nach 24 stündigem Bebrüten in 5 %iger COp-Atmosphäre bei 37°C wurden die weißen Blutkörperchen in die überstehende Flüssigkeit abgeschwemmt; die Kulturen wurden mit Phosphat gepufferter Salzlösung 1 (PBS) gewaschen und das Medium bzw. der Nährboden wurde wieder aufgefüllt. Nach weiteren 72 stündigem Bebrüten wurde ein cytopathischer Effekt in den Z_ellkultüren beobachtet, die mit zwei der Blutproben beimpft worden waren.

Zusätzlich wurden in den überstehenden Flüssigkeiten der vier positiven Platten Hamagglutinine gefunden.

Beispiel 2

Herstellung eines inaktivierten Impfstoffes.

Antigenherstellung

Küken-Embryo-Leberzell-Kultüren wurden aus 17 Tage incubierten SPF Embryonen enthaltenden Eiern hergestellt, indem die Leber aus den Embryonen herausgenommen, in PBS gewaschen und dann mit Trypsin behandelt wurde unter Verwendung einer 0,25 !&Lgen Trypsinlösung in PBS bei 37⁰C. Die Zellen wurden abzentrifugiert, die überstehende FlüssigleLt verworfen und die Zellen erneut in Wachstumsmedium (Nährlösung) supendiert.

Die Nährlösung setäB sich wie folgt zusammen;

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- 14 -

/17.

Eagles Minimum Essential Medium 80 Teile Tryptose-Phosphat-Nährlösung (30 g/l) 10 " 2,5 i&ige wässrige Natriumbicarbonatlösung 4 "

Kälberserum 15 "

Penicillin (100 E/ml)
Streptomycin (0,1 mg/ml)
Mycostatin (25 E/ml)

Darauf wurden Platten mit jeweils 3x10 Zellen in 5 ml für 6 cm Platten oder mit 40 χ 10 Zellen in 20 ml für 15 cm Platten besetzt oder beimpft.

Nach 24stündigem Bebrüten bei 37°C in 5 9^iger CO₂"Atmosphäre wurden die Zellkulturen mit dem EDS-Virus beimpft in einer Menge von etwa 10 pfu/6 cm bzw« von 10 pfu/15 cm Platte. Die Kulturen wurden dann weitere 72 h beimpft.

Die überstehenden Flüssigkeiten wurden gewonnen und die infizierten Zellen mit einem Gummi von den Platten abgerieben. Die Zellen wurden dann mit der überstehenden Flüssigkeit zusammengegeben und das Ganze auf -70 C eingefroren. Dieser-Vorrat wurde nach Lagern aufgetaut und mit destilliertem Wasser 10-fach verdünnte

Inak t ivi e rung«,

Eine kalte Lösung aus ß-Propiolacton wurde zu dem aufgetauten Material gegeben bis zu einer Endkonzentration von 0,2 %_e Nach 2stündigem Bebrüten bei 37⁰C wurde der pH-Wert der Lösung auf pH 7,0 eingestellt und zwar mit 1n Natronlauge ο Wenn dieses Präparat auf Zellkulturen geimpft

» 15 _

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-yS-

/Ig-

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rief es keinen cytopathisehen Effekt hervor.
Adjuvans -Zugabe

Zusammensetzung: Marcol 52 90 %

Tween 80 3,5 %
Span 80 6,5 %

Das Antigen wurde mit Hilfe des Hämagglutinationstestes titriert unter Verwendung von Kükenerythrocyten und das Volumen wurde mit Wasser für die Injektion eingestellt, sodaß beim Vermischen mit einem gleichen Volumen Adjuvans die abschließend erhaltene Emulsion 400 HA Einheiten je Vogeldosis enthielt - als Vogeldosis können 0,5 ml verwendet werden. Dieses Gemisch wurde dann durch einen
Emulgierapparat gegeben,

Beispiel 3

Impfstoff mit lebendem Erreger (abgeschwächt oder nicht abgeschwächt).

Das Antigen wurde wie im Beispiel 2 beschrieben hergestellt und zwar bis zu dem Stadium des Einfrierens auf
-70⁰C unter Verwendung eines vorbezeichneten Stammes von Impfstoffvirus (abgeschwächt oder nicht abgeschwächt).

Nach dem Auftauen wurde das Material mit gleichem Volumen SPGA Stabilisator verdünnt, in 2 ml Mengen/Fläschen abgefüllt und lyophilisiert.

Anschließend wurden die Proben titriert und ergaben einen hohen Titer an darin enthaltenden lebenden Viren«

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Claims

Patentansprüche

1. Impfstoff gegen Eierlege-Krankheit enthaltend den beim Central Veterinary Laboratory, New Haw, Weybridge unter der Nummer VLO 10110/AVl hinterlegten Virus in nicht abgeschwächter, abgeschwächter oder inaktivierter Form.

2. Verfahren zur Herstellung des Impfstoffes nach Anspruch 1 zum Schutz von eierlegenden Vögeln gegen Eierlege-Krankheit dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise den beim Central Veterinary Laboratory, New Haw, Weybridge unter Nummer VLO 10110/AVl hinterlegten Virus kultiviert und das Kulturmedium zum Impfstoff aufarbeitet.

3. Verfahren nach Anspruch 2 zur Herstellung eines Impfstoffes mit lebendem, nicht abgeschwächtem Erreger, dadurch gekennzeichnet, daß man den Virus auf Zellgewebekultur züchtet und das infizierte Kulturmaterial gewinnt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 zur Herstellung eines Impfstoffes mit lebendem, abgeschwächtem Erreger, dadurch gekennzeichnet, daß man mehrere Passagen des Virus in Vogelgewebe-Kulturen vornimmt_o

5ο Verfahren nach Anspruch 2 zur Herstellung eines Impfstoffes mit inaktiviertem Erreger, dadurch g e k e η η ■=

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2 e i ch η e t, daß man den Virus unter Verwendung eines Enzyms und/oder eines organischen Lösungsmittels inaktiviert.

6. Verwendung des Impfstoffes mit lebendem Erreger nach Anspruch 3 oder 4 in einer Dosis von 10 bis 10⁸ pfu Einheiten je Vogel.

7. Verwendung des Impfstoffes mit inaktiviertem Erreger nach Anspruch 5 in einer Dosierung von mindestens 10² HA-Einhsiten je Vogel.

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' ORIGINAL INSPECTED