JP2007197454A - 魚類用のイリドウイルス感染症ワクチンと診断剤並びにこれ等の製法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】イリドウイルス感染症の病魚から分離したイリドウイルスを該ウイルス感受性の魚体内で継代し、さらに該ウイルス感受性の魚体内又は細胞培養からなる宿主群から選ばれる1種以上の宿主に継代することにより得られるイリドウイルス株を、不活化剤(例えば、ホルマリン)で不活化することにより調製される不活化抗原を含有する不活化イリドウイルス感染症ワクチン。
【選択図】なし
Description
病原体ウイルスの分離材料:マダイイリドウイルス感染死亡魚の脾臓を摘出し,これを眼科用鋏で細切れにした後,9倍容のBME培地(最終濃度300単位/mlのペニシリンと300μg/mlのストレプトマイシンとを添加混合)を添加し,氷冷下で滅菌ガラスホモジナイザーにより磨砕し,10%(W/W)の脾臓乳剤を調製する。次いで,これを低速遠心(3,000rpm,20分)し,その上清を採取の後,濾孔が450nmのメンブランフィルターで除菌濾過し,その濾液を病原体ウイルスの分離材料として爾後の使用に供する。
魚生体内による病原体ウイルスの分離と継代:実験例1で調製した濾液をマダイ稚魚10尾(平均体長4.0cm,平均体重1.5g)の腹腔内に各魚0.1mlずつ接種した後,水温25±1℃の隔離した飼育水槽(内容積60Lの水槽に海水40Lを入れ,これに新鮮海水を2L/min流入かつ旧水を等量排出し飼育海水を連続交換する)で飼育し,発症の有無を観察する。飼育開始後,早ければ3日目に発症魚が出現し始める。各発症魚は死亡の直前にその都度回収し,実験例1に記載の方法と同様にして脾臓乳剤の上清を調製し,これを新鮮分離株ウイルス浮遊液として爾後の継代に供する。マダイ生体内での新鮮分離株ウイルスの継代は,かかる操作を繰り返し行う。
細胞培養による病原体ウイルスの分離と継代:25cm2のプラスチック瓶5本に培養したGF細胞の各瓶に,実験例1で調製した濾液を0.5mlずつ接種し,25℃で30分間吸着させた後,培地BME(最終濃度15%(V/V)のウシ胎児血清,標準量の非必須アミノ酸,1.2mg/mlの炭酸水素ナトリウム,100単位/mlのペニシリン,及び100μg/mlのストレプトマイシンを添加混合)を各瓶10mlずつ添加し,25℃で静置培養する。新鮮培地との交換は接種日から3日目ごとに行う。細胞培養の状態の判定と,病原体ウイルス感染の指標となる細胞変性効果の有無を検出するための鏡検は毎日行う。培養開始後,14日目までに細胞変性効果,即ち,細胞のラウンディングが細胞モノシートの約70%の領域に広がる。この時点で,各培養瓶ごとに培地を採取し,新鮮分離株ウイルスの浮遊液として爾後の継代に供する。同時に,感染細胞モノシートは,常法のEDTA・トリプシン液(CaとMgの両イオンを除いたDulbeccoのPBSに最終濃度0.08%(W/V)EDTA 3Naと0.125%(W/V)トリプシンとを添加混合)で培養瓶ごとに剥離し,低速遠心してその沈渣を回収の後,これを上記の培地BME2mlに再浮遊し,新鮮分離株ウイルスの感染細胞として爾後の継代に供する。細胞培養による新鮮分離株ウイルスの継代は,ウイルス浮遊液とその感染細胞の両者を用い,次の通り行う:GF細胞モノシートへ両者をそれぞれ接種し培養する;未感染GF細胞浮遊液にウイルス浮遊液を接種し同時培養する;20万細胞/mlの未感染GF細胞浮遊液にその1/10容の感染細胞を接種し混合培養する;及び感染細胞浮遊液を調製しこれを前記の新鮮培地BMEで5倍希釈し培養する持続感染細胞培養により行う。
新鮮分離株ウイルスの同定:実験例1で用いた死亡魚,実験例2で得た発症魚の各脾臓切片及び各スタンプ標本をそれぞれ,フォイルゲン反応により核酸染色し,異形肥大細胞の存在と,細胞質部分の赤紫色染色を光学顕微鏡で鏡検し確認した。また,電子顕微鏡により,実験例1で用いた死亡魚及び実験例2で得た発症魚の各脾臓中に存在するウイルスと,新鮮分離株ウイルスとの間のウイルス形態が同一であることを確認した。更に,実験例2に記載の方法により感染実験を行う。即ち,実験例2と3で得た新鮮分離株ウイルス浮遊液を,マダイ稚魚10尾腹腔内に各魚0.1mlずつ接種し,発症魚の症状を観察すると共に,剖検及び病理組織学的検査を行い,新鮮分離株ウイルス接種によるマダイ稚魚の発症がイリドウイルス感染症であることを確認した。
ウイルス感染価の測定:実験例1で用いた培地BMEを用い,1L容のルー瓶で培養したGF細胞モノシートをEDTA・トリプシン液で剥離の後,低速遠心により細胞を採取し,同培地で20万細胞/mlの細胞浮遊液を調製し,これを24穴マイクロプレートの各穴に1.0mlずつ滴下分注する。次いで,同培地で10倍階段希釈したウイルス液0.1mlを各穴に接種する。なお,1列6穴には同一希釈のウイルス液を接種し,25℃の炭酸ガス保温器内で14日間培養の後,CPEを判定の指標として,常法によりウイルス感染価,TICD50/mlを実測し,その結果を対数値,log(TICD50/ml)に換算する。また,感染細胞は,アイスバス中で感染細胞浮遊液20ml当たり2分間,超音波発生装置(KUBOTA 200M)にかけ,細胞を破砕懸濁し,その低速遠心(3,000rpm,20分)上清をウイルス液としてウイルス感染価を測定する。
ワクチン用抗原の製造株の確立:実験例1で得た分離材料から分離したウイルスをイリドウイルスEhime−1株と命名すると共に,実験例2に記載の方法でマダイ稚魚に3代継代した後,更に,実験例3に記載の方法によりGF細胞で継代を重ね馴化させる。かかる継代によりGF細胞に馴化したEhime−1株を抗原製造用株として後述の実施例で使用する。なお,実験例3で行った種々の培養法による継代のうち,これ等の代表例として,マダイ稚魚体内と持続感染細胞培養との組合せ継代による結果を表1に示す。ウイルス分離材料をウイルス感受性の宿主で継代することにより,ウイルス抗原は増幅・量産された。
ワクチン用抗原の量産:実施例1で得たEhime−1株(マダイ稚魚3代・GF細胞10代継代)の感染細胞をシードに用いてワクチンを調製する。先ず,実験例1で用いた培地BMEを用い,1L容のルー瓶1本に培養した上記Ehime−1株の感染GF細胞モノシートをEDTA・トリプシン液で剥離の後,低速遠心(3,000rpm,20分)により感染細胞を回収し,500mlの同培地BMEに再浮遊し,感染細胞浮遊液を調製する。次いで,これを1L容のルー瓶5本に100mlずつに分注の後,25℃で14日間,静置培養する。新鮮培地との交換は,培養開始日から3日目ごとに行う。但し,培養10−14日目の間は培地交換をしない。CPEが細胞モノシートの約80%に達する14日目に培養液を採取し,低速遠心(3,000rpm,20分)の後,その上清を回収しウイルス浮遊液500mlを調製した。一方,感染細胞モノシートはEDTA・トリプシン液で剥離した後,低速遠心(3,000rpm,20分)により採取し,ルー瓶5本からプールした細胞を上記の培地200mlに再浮遊させ,感染細胞浮遊液を得た。
不活化ワクチンの安全性と有効性:実施例2で調製した各不活化ワクチンの安全性と有効性とを確認するため,マダイ稚魚を用いて臨床試験を行う。なお,ウイルスを接種しない細胞培養の培地上清と非感染細胞浮遊液について,ワクチン製造と並行して同一の処理を行い,不活化非感染上清と不活化非感染細胞浮遊液とを調製し,これ等を比較対照検体として使用する。合計150尾の健常なマダイ稚魚(体長4.0−8.0cm,体重1.5−11.5g)を1群30尾からなる5群に分け,1検体に1群を用い,各ワクチン又は各比較対照検体を,稚魚の腹腔内に0.1ml/尾,接種する。なお,残りの1群には何も接種しない。これ等の稚魚は,実験例2に記載の飼育水槽内で,各群30尾につき1飼育水槽を使用し,飼育観察する。接種日から10日目に,各稚魚の腹腔内にEhime−1株の強毒ウイルス浮遊液を0.1mlずつ接種し,直接攻撃を行う。攻撃ウイルス量log(TCID50/ml)は,5.0で実施する。かかる攻撃の後,更に,14日間,上記水槽内の発症魚とその生死の有無を飼育観察する。その結果を示す表2に見られる通り,本発明に係るワクチンは安全かつ有効であった。
不活化ワクチンの試作とその安全性及び有効性の確認:実施例1で得たEhime−1株(マダイ稚魚3代・GF細胞13代継代)の感染細胞をシードとして用い,実施例2の記載と同様にして不活化ワクチンを製造する。即ち,ウイルスをGF細胞で培養の後,培養液を低速遠心してその培養上清を採取し,5Lのウイルス浮遊液(ウイルス感染価は7.5logTCID50/ml)を製造する。次に,該浮遊液に最終濃度0.1%(V/V)になるようホルマリンを添加混合の後,4℃で30日間静置して不活化し,ワクチン原液を得る。この原液について検定に係る各種試験を行い,組織培養不活化ワクチンとしての適格性を確認の後,これを培地BMEで10倍希釈し,200ml容のバイアルに100mlずつ分注し,密栓・密封し小分製品400本を製造した。これより無作為抜取りした小分製品20本について,更に,薬事法(昭和35年法律第145号)に基づく「動物用生物学的製剤基準」に定める「狂犬病組織培養不活化ワクチン」の規程に準拠し,小分製品に係る各種試験,即ち,特性試験,水素イオン濃度試験,無菌試験,染色試験,蛋白窒素定量試験,異常毒性否定試験を行い,組織培養不活化ワクチン小分製品としての適格性を確認した後,残りの小分製品を下記の安全性と有効性の両確認試験に供した。
診断用抗原の調製:実施例2の記載と同様にして,ウイルス浮遊液を調製の後,ホルマリンで不活化し,不活化ウイルス浮遊液を得る。次いで,超遠心管(日立製作(株)製:機種SCP70HのスウィングロータSRP28SA用)6本の各底部に9.0mlずつ40%(W/V)蔗糖溶液を入れ,蔗糖クッション層を形成させ,該蔗糖層の上に静かに不活化ウイルス浮遊液25mlを重層し,4℃にて超遠心(90,000g,90分)する。各遠心管底に沈降したウイルス粒子をそれぞれ,5mlのPBSに浮遊し,これ等をプールして,30mlの精製ウイルス抗原液を得た。
受身凝集反応用試薬の調製:洗浄したヒツジ赤血球0.4mlを10mlのPBSに浮遊させ,これに上記の抗原液1.0mlを加えて軽く撹拌の後,PBSで希釈調整した濃度2.5%(W/V)グルタルジアルデヒド3.0mlを滴下し十分に混和する。これを室温で60分間更に撹拌し,赤血球に抗原を吸着させる。次に,PBSで5回洗浄後,1Mグリシン緩衝液(pH7.2)1.0mlに浮遊させ,8℃で1夜置き,再びPBSで5回洗浄の後,最終濃度1%(V/V)の正常ヒツジ血清を含有のPBSを添加して,1%(V/V)抗原吸着赤血球浮遊液を調製し,これを受身凝集反応用試薬とした。
受身凝集反応によるイリドウイルス抗体の測定:上記の受身凝集反応用試薬を用い,2倍階段希釈のマイクロタイター法により,イリドウイルス感染症魚5尾から採血した各検体血清,及び健常魚2尾の各血清の抗体価を測定する。その結果を表3に示す。この発明の診断用抗原は,極めて特異的な凝集反応を呈し,抗体価の測定による簡便な確定診断を可能にした。
Claims (1)
- イリドウイルス感染症の病魚から分離したイリドウイルス(Ehime−1株を除く)を該ウイルス感受性の魚体内で継代し、さらに該ウイルス感受性の魚体内又は細胞培養からなる宿主群から選ばれる1種以上の宿主に継代することにより得られるイリドウイルス株を、不活化剤で不活化することにより調製される不活化抗原を、抗体産生または感染防御を奏する量、含有する不活化イリドウイルス感染症ワクチン。
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