KR20190080812A - 백신 제제, 및 어류의 이리도바이러스 감염증 예방 방법 - Google Patents

Abstract

[해결하려고 하는 과제] 돌돔속 어종 등에 대한, 보다 유효한 어류의 이리도바이러스 감염증의 방제 수단을 제공한다.
[해결 수단] 불활화된 이리도바이러스를 항원으로서 함유하고, 1회당 10^7.0 TCID₅₀ 이상 투여하는, 어류의 이리도바이러스 감염증에 대한 백신 제제 등을 제공한다. 불활화된 이리도바이러스를, 항원으로서 1회당 10^7.0 TCID₅₀ 이상 투여함으로써, 종래 백신 효과가 낮다고 여겨졌던 돌돔속 어종 등에 대해서도, 참돔이리도바이러스병 등의 이리도바이러스 감염증을 효율적으로 예방할 수 있다. 이리도바이러스를 배양 세포에서 증식시켰을 때의 배양 상청의 농축액, 또는 배양 상청 및 바이러스 감염 한 배양 세포를 함유시키는 것 등에 의해, 백신 제제 중에 있어서의 이리도바이러스의 농도를, 1회당 10^7.0 TCID₅₀ 이상 투여할 수 있는 정도까지 높일 수 있다.

Description

백신 제제, 및 어류의 이리도바이러스 감염증 예방 방법{VACCINE FORMULATION AND METHOD FOR PREVENTING IRIDOVIRAL DISEASE IN FISH}

본 발명은, 불활화된 이리도바이러스를 항원으로서 함유하고, 1회당 10^7.0 TCID₅₀ 이상 투여하는, 참돔이리도바이러스병 등의 어류 이리도바이러스 감염증에 대한 백신 제제, 어류의 이리도바이러스 감염증 예방 방법 등에 관한 것이다.

수확량을 증대할 수 있고, 비교적 저가로 안정 공급할 수 있는 점 등으로부터, 많은 어류에서 양식이 널리 보급되고 있다. 한편, 양식의 경우, 천연어와 비교하여, 사육 밀도가 높고 환경 조건도 악화되기 쉽기 때문에, 감염증이 발생·전파되기 쉽다.

어류의 이리도바이러스 감염증으로서, 예를 들면 참돔이리도바이러스병이 알려져 있다. 참돔이리도바이러스병은, 참돔이리도바이러스(Red sea bream iridoviral disease)에 의한 바이러스 감염증으로, 현저한 빈혈에 의한 아가미의 퇴색, 비장의 종대 등의 증상을 보이는 치사성이 높은 질환이고, 양식장에서의 사망율은 20∼60%에 달한다. 1990년에 서일본에 있어서 양식 참돔에서 처음으로 그 발생이 확인되고, 그 이후 각종 양식어로도 감염이 확대되고, 지금까지 농어목을 중심으로 30 이상의 어종에서 발생이 확인되고 있다.

그에 대하여, 본 질병에 대한 방제 수단의 하나로서, 포르말린 불활화 백신 제제가 개발되어, 참돔, 방어속 어류, 줄무늬전갱이, 흉기흑점바리, 갈색둥근바리, 자바리, 능성어를 대상으로, 그 백신 제제가 이미 출시되고 있다. 예를 들면, 특허문헌 1에는, 특정한 계대(繼代)에서 얻어진 이리도바이러스 균주를 불활화·조제된 어류용 이리도바이러스 감염증 백신이 기재되어 있다.

한편, 상기 이외의 어종에서는, 상기 출시된 포르말린 불활화 백신 제제의 백신 효과가 낮은 것이 분명하게 되어 있고, 이들 어종에 대하여 유효한 백신 개발이 요구되고 있다. 예를 들면, 비특허문헌 1에는, 「돌돔에서는 다른 어종과 비교하여 수동 면역에 의한 방어 효과가 낮고, 감염에 내과(耐過)한 물고기의 혈청을 이용한 수동 면역 시험에 있어서, … 사망율에 유의차는 인정되지 않았다」는 점, 및 「돌돔에 있어서의 감염 방어에는 액성 면역만으로는 불충분하고, 세포성 면역 등 다른 방어 기구(機構)의 관여가 필요하다고 생각된다」는 점 등이 언급되어 있고, 또한, 비특허문헌 2에는, 「돌돔이나 감성돔이라는 돌돔속 어종에 대한 백신 효과가 낮다」는 점, 및 「돌돔이나 감성돔에 대한 유효한 백신 개발을 시도해 가야 함」이라는 점 등이 언급되고 있다.

일본공개특허 제2007-197454호 공보

마쓰야마 도모마사 외, 「해산 5어종에 있어서의 참돔이리도바이러스병에 대한 수동 면역의 효과」, 어병 연구 Fish Pathology, 51(1), 32-35, 2016, 3 가와토 야스히코 외, 「참돔이리도바이러스병」, 어병 연구 Fish Pathology, 52(2), 57-62, 2017, 6

전술한 바와 같이, 예를 들면, 어류의 이리도바이러스 감염증의 하나인 참돔이리도바이러스병은, 농어목을 중심으로 30 이상의 어종에서 발생이 확인되고 있다. 그러나, 참돔, 방어속 어류, 줄무늬전갱이, 흉기흑점바리, 갈색둥근바리, 자바리, 능성어 이외의 어종에서는, 포르말린 불활화 백신 제제의 백신 효과가 낮아, 현 실정에서는 이들 어종에서의 동(同)질병의 유효한 방제가 어렵다.

이에, 본 발명은 참돔, 방어속 어류, 줄무늬전갱이, 흉기흑점바리, 갈색둥근바리, 자바리, 능성어 이외의 어종에 대하여, 보다 유효한 이리도바이러스 감염증의 방제 수단을 제공하는 것 등을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 참돔, 방어속 어류, 줄무늬전갱이, 흉기흑점바리, 갈색둥근바리, 자바리, 능성어 이외의 어종에 있어서도, 백신 중의 유효 항원량을 높이는 것에 의해, 액성 면역을 주체로 한 면역에서도 이리도바이러스 감염증을 효율적으로 방제할 수 있는 것을 신규로 찾아냈다.

그래서, 본 발명에서는, (1) 불활화된 이리도바이러스를 항원으로서 함유하고, 1회당 10^7.0 TCID₅₀ 이상 투여하는, 어류의 이리도바이러스 감염증에 대한 백신 제제, (2) 항원으로서, 불활화된 이리도바이러스를 10^8.0 TCID₅₀/mL 이상의 농도로 함유한, 어류의 이리도바이러스 감염증에 대한 백신 제제 등을 제공한다.

불활화된 이리도바이러스를, 항원으로서 1회당 10^7.0 TCID₅₀ 이상 투여함으로써, 참돔, 방어속 어류, 줄무늬전갱이, 흉기흑점바리, 갈색둥근바리, 자바리, 능성어 이외의 어종, 예를 들면, 돌돔속, 고등어과, 새치아목 등의 어종에서도, 참돔이리도바이러스병 등의 이리도바이러스 감염증의 발생·감염·전파·만연을 효율적으로 예방할 수 있다. 예를 들면, 불활화된 이리도바이러스를 10^8.0 TCID₅₀/mL 이상의 농도로 함유한 백신 제제를 0.1mL 이상 투여함으로써, 10^7.0 TCID₅₀ 이상 투여할 수 있다.

배양 세포에서 증식시킨 바이러스를 이용한 경우, 즉, 상기 이리도바이러스가 배양 세포에서 증식된 바이러스인 경우, 원칙적으로 단클론성의 바이러스를 항원으로서 이용할 수 있다. 그리고, 바이러스를 배양 세포에서 증식시킴으로써, 비교적 간이하고 또한 대량으로, 균일한 품질의 항원을 조제할 수 있다.

다만, 이리도바이러스를 배양 세포에서 증식시켜도, 그 증식 곡선이 플래토우(plateau)에 달하면 그 이상 바이러스량이 증가하지 않게 되므로, 통상의 일반적 방법에 의해 그 배양액 중의 이리도바이러스의 농도를, 1회당 10^7.0 TCID₅₀ 이상 투여할 수 있는 정도까지 향상시키는 것은 매우 곤란성이 높다.

그에 대하여, 예를 들면 이리도바이러스에 대하여 고감수성의 배양 세포에서 증식시키는 것에 의해, 바이러스의 농도를 높일 수 있다. 또한, 예를 들면 상기 항원으로서, 상기 이리도바이러스를 배양 세포에서 증식시켰을 때의 배양 상청의 농축액, 또는 상기 배양액 및 상기 배양 세포를 함유시키는 것에 의해서도, 백신 제제 중에 있어서의 이리도바이러스의 농도를, 1회당 10^7.0 TCID₅₀ 이상 투여할 수 있는 정도까지 높일 수 있고, 예를 들면 돌돔속, 고등어과, 새치아목 등의 어종에 대해서도, 참돔이리도바이러스병 등의 이리도바이러스 감염증을 효율적으로 예방하는 것이 가능해진다.

본 발명에 의하여, 참돔, 방어속 어류, 줄무늬전갱이, 흉기흑점바리, 갈색둥근바리, 자바리, 능성어 이외의 어종, 예를 들면 돌돔속, 고등어과, 새치아목 등의 어종에서도, 이리도바이러스 감염증을 효율적으로 예방할 수 있다.

[도 1] 실시예 1에서, 세포 혼입 항원으로 면역한 경우에 있어서의 돌돔의 생잔율을 나타내는 그래프이다.
[도 2] 실시예 2에서, 농축 항원 또는 세포 혼입 항원으로 면역한 경우에 있어서의 돌돔의 생잔율을 나타내는 그래프이다.
[도 3] 실시예 3에서, 50배 농축 항원으로 면역한 경우에 있어서의 돌돔의 생잔율을 나타내는 그래프이다.

<본 발명에 관한 백신 제제에 대하여>

본 발명은, (1) 불활화된 이리도바이러스를 항원으로서 함유하고, 1회당 10^7.0 TCID₅₀ 이상 투여하는, 어류의 이리도바이러스 감염증에 대한 백신 제제, (2) 항원으로서, 불활화된 이리도바이러스를 10^8.0 TCID₅₀/mL 이상의 농도로 함유한, 어류의 이리도바이러스 감염증에 대한 백신 제제 등을 모두 포함한다.

상기 백신 제제에서는 항원으로서, 불활화 처리된 이리도바이러스를 이용한다. 이리도바이러스에는 공지의 것을 널리 채용할 수 있고, 특별히 한정되지 않는다. 어류의 이리도바이러스로서, 이리도바이러스과 메갈로사이티바이러스속(Megalocytivirus속)의 이리도바이러스, 예를 들면, 참돔이리도바이러스, 전염성 비장 신장 괴사 바이러스(ISKNV;Infectious spleen and kidney necrosis virus ) 등을 들 수 있다. 예를 들면, 공지의 분리주를 이용해도 되고, 이리도바이러스 감염증을 발증한 어류로부터 분리된 분리주를 이용해도 된다.

이들 분리주를 배양 세포에 감염시킴으로써, 그 이리도바이러스 분리주를 증식시킬 수 있다. 예를 들면, 배양 세포의 배양액 중에 바이러스액을 첨가하여 배양 세포에 바이러스를 감염시키고, 감염된 수일 후, 배양 세포와 배양액을 회수하고, 그 배양 상청을 바이러스액으로서 배양 세포에 더하는 작업을 반복함으로써, 그 바이러스주를 계대·증식시킬 수 있고, 백신용 항원을 조제할 수 있다. 배양 세포에는 공지의 세포주, 예를 들면 GF 세포, BF-2 세포 등을 이용할 수 있다.

예를 들면, 이리도바이러스 균주를 배양 세포에서 증식시킴으로써, 이리도바이러스를 항원으로서 함유하고, 상기 이리도바이러스가 배양 세포에서 증식된 바이러스인 백신 제제의 원액을 조제할 수 있다.

1회당 10^7.0 TCID₅₀ 이상(예를 들면, 10^7.0 TCID₅₀∼10¹⁰ TCID₅₀, 이하 동일) 투여하기 위하여, 고농도의 항원을 조제할 필요가 있다. 이를 위해, 예를 들면 이리도바이러스에 대하여 고감수성의 배양 세포에서 이리도바이러스 균주를 증식시키고, 바이러스를 통상보다 고발현시킴으로써, 고농도 항원을 조제해도 된다. 이리도바이러스에 대하여 고감수성의 배양 세포는 공지의 방법, 예를 들면 참돔이리도바이러스에 대하여 감수성이 높은 어종(예를 들면, 참돔, 돌돔, 감성돔, 바라문디 등의 농어류 등)으로부터 채취한 조직·세포를 파종하여 배양하고, 각 세포를 단클론화하여 계대하고, 또한 그 각 배양 세포에 이리도바이러스 균주를 감염시키고, 바이러스 증식성이 높은 배양 세포주를 선발함으로써, 이리도바이러스에 대하여 고감수성의 배양 세포주를 비교적 정상적으로 수립할 수 있다. 또한, 이리도바이러스에 대하여 고감수성의 배양 세포로서, 참돔이리도바이러스에 대하여 감수성이 높은 어종의 체외 수정란(배세포) 또는 그 유래의 배양 세포 등을 채용해도 된다.

또한, 예를 들면, 이리도바이러스를 배양 세포에서 증식시켰을 때의 배양 상청을 농축함으로써, 고농도 항원을 조제해도 된다. 농축 수단은 원심 한외 여과 등, 공지의 수단을 널리 채용할 수 있다. 예를 들면, 이리도바이러스를 함유한 배양 상청을 농축하여 10^8.0 TCID₅₀/mL 이상(예를 들면, 10^8.0 TCID₅₀∼10¹¹ TCID₅₀, 이하 동일)의 백신 제제(의 원액)를 조제하고, 그 용액을 0.1mL 이상 투여함으로써, 이리도바이러스를 1회당 10^7.0 TCID₅₀ 이상 투여할 수 있다.

또한, 고농도 항원을 조제하기 위하여, 이리도바이러스를 배양 세포에서 증식시켰을 때의 배양액 및 배양 세포를 백신 제제(의 원액)로서 이용해도 된다. 배양액뿐만 아니라 유효량의 배양 세포도 함유시킴으로써, 즉, 유효 항원으로서, 이리도바이러스를 함유한 배양액, 및 감염 중인 이리도바이러스를 함유한 배양 세포의 양자를 함유시킴으로써, 10^8.0 TCID₅₀/mL 이상의 백신 제제(의 원액)를 조제할 수 있고, 그 용액을 0.1mL 이상 투여함으로써, 이리도바이러스를 1회당 10^7.0 TCID₅₀ 이상 투여할 수 있다.

이와 같이, 상기 항원으로서, (1) 상기 이리도바이러스를 배양 세포에서 증식시켰을 때의 배양 상청의 농축액, 또는 (2) 상기 이리도바이러스를 배양 세포에서 증식시켰을 때의 상기 배양액 및 상기 배양 세포를 함유한 백신 제제로 하는 것에 의해, 고농도 항원으로서, 이리도바이러스를 1회당 10^7.0 TCID₅₀ 이상 투여하는 것이 가능해진다.

본 발명에 관한 항원은 불활화 항원이어도 된다. 이리도바이러스의 불활화는, 예를 들면 본 발명에 관한 고농도 항원 함유액에 대하여, 물리적 처리[자외선 조사(照射), X선 조사, 열처리, 초음파 처리 등], 화학적 처리(포르말린 등에 의한 처리, 클로로포름·알코올 등에 의한 유기 용매 처리, 아세트산 등의 약산에 의한 산 처리, 염소·수은 등에 의한 처리) 등의 처리를 실시하는 것에 의해, 행할 수 있다.

예를 들면, 고농도 항원 함유액에 포르말린을 0.01∼2.0%, 보다 바람직하게는 0.05∼1.0%의 용량 농도로 첨가하고, 배양 균액을 4∼30℃에서, 1∼10일간 감작하는 것에 의해, 포르말린에 의한 불활화를 행할 수 있다. 또한, 예를 들면 불활화 처리 후에, 완충액 등으로 세정하여 포르말린 등의 불활화제를 제거하거나, 중화제를 첨가하여 중화하거나 해도 된다.

상기한 바와 같이, 예를 들면 백신 제제를 1회당 0.1mL 투여하는 경우, 그 백신 제제 중의 이리도바이러스의 농도를, 10^8.0 TCID₅₀/mL 이상으로 조제함으로써, 이리도바이러스를 1회당 10^7.0 TCID₅₀ 이상 투여할 수 있다. 본 발명에 관한 백신 제제 중의 이리도바이러스의 농도에는, 예를 들면 불활화 전의 바이러스 감염치를 지표로서 사용해도 되고, 백신 제제 중의 불활화 이리도바이러스량을 직접적으로 측정하여 얻은 값에 상당하는 감염치를 지표로서 사용해도 된다. 그리고, 불활화 이리도바이러스량은, 예를 들면 ELISA법이나 단백질 정량법 등을 직접적으로 측정하는 것에 의해 추량할 수 있다.

본 발명에 관한 백신 제제는, 바이러스 항원 이외의 총 단백량이 0.1% 이하 (1.0mg/mL 이하)인 것이어도 된다. 이리도바이러스를 배양 세포에서 증식할 때, 그 배양액에 혈청 등을 첨가하는 경우가 있다. 그 경우, 백신 제제(의 원액)에도, 이들의 협잡 단백질이 잔류하므로, 예를 들면, 한외 여과 등 공지의 수단에 의해, 이들의 협잡 단백질을 제외한 것을 백신 제제(의 원액)로서 사용해도 된다. 혈청 유래 등의 협잡 단백질을 제외하여, 제제 중의 총 단백량을, 예를 들면 0.1mg/mL 이하로 억제하는 것에 의해, 항원 농도를 높이고, 백신 효과를 보다 높게 할 수 있는 가능성이 있는 등, 이들의 협잡 단백질을 원인으로 한 부작용 등의 발생 리스크를 경감할 수 있다.

본 발명에 관한 백신 제제는, 아쥬반트를 함유하고 있어도 된다.

아쥬반트에는 공지의 것을 널리 이용할 수 있다. 예를 들면, 동물유(스쿠알렌 등) 또는 이들의 경화유, 식물유(팜유, 피마자유 등) 또는 이들의 경화유, 무수 만니톨·올레산 에스테르, 유동 파라핀, 폴리부텐, 카프릴산, 올레산, 고급 지방산 에스테르 등을 포함하는 유성 아쥬반트, PCPP, 사포닌, 글루콘산망간, 글루콘산칼슘, 글리세로인산망간, 가용성 아세트산알루미늄, 살리실산알루미늄, 아크릴산 코폴리머, 메타크릴산 코폴리머, 무수말레산 코폴리머, 알케닐 유도체 폴리머, 수중 오일형 에멀션, 제4급 암모늄염을 함유하는 양이온 지질 등의 수용성 아쥬반트, 수산화알루미늄(명반), 수산화나트륨 등의 침강성 아쥬반트, 콜레라 독소, 대장균 이열성(易熱性) 독소 등의 미생물 유래 독소 성분, 그 외 벤토나이트, 무라밀디펩티드 유도체, 인터류킨 등을 들 수 있다. 또한, 이들을 혼합한 것이어도 된다.

또한, 본 발명에 관한 백신 제제는 목적·용도 등에 따라서, 완충제, 등장화제, 무통화제, 방부제, 항균제, 항산화제, pH 조절제, 분산제, 방향제, 착색제, 소포제 등이 적절히 첨가되어 있어도 된다.

완충제의 호적한 예로서, 예를 들면 인산염, 아세트산염, 탄산염, 구연산염, 주석산염, 트리스히드록시메틸아미노메탄, HEPES 등의 완충액 등을 사용할 수 있다.

등장화제의 호적한 예로서, 예를 들면 염화나트륨, 글리세린, D-만니톨 등을 사용할 수 있다.

무통화제의 호적한 예로서, 예를 들면 벤질알코올 등을 사용할 수 있다.

방부를 목적으로 한 약제의 호적한 예로서, 예를 들면 티메로살(thimerosal), 파라옥시벤조산 에스테르류, 페녹시에탄올, 클로로부탄올, 벤질알코올, 페네틸알코올, 데히드로아세트산, 소르브산, 그 외 각종 방부제, 항생 물질, 합성 항균제 등을 사용할 수 있다.

항산화제의 호적한 예로서, 예를 들면 아황산염, 아스코르브산 등을 사용할 수 있다.

pH 조절제의 호적한 예로서, 예를 들면 염산, 탄산, 아세트산, 구연산, 인산, 붕산, 황산 등의 산, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화마그네슘 등의 알칼리 금속 수산화물, 탄산나트륨 등의 알칼리 금속 탄산염 또는 탄산수소염, 아세트산나트륨 등의 알칼리 금속 아세트산염, 구연산나트륨 등의 알칼리 금속 구연산염, 트로메타몰 등의 염기, 모노에탄올아민, 디이소프로판올아민 등을 사용할 수 있다.

분산제의 호적한 예로서, 예를 들면 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리소르베이트 80(TWEEN 80) 등을 사용할 수 있다.

방향제의 호적한 예로서, 예를 들면 레몬, 오렌지, 그레이프후르츠 등의 감귤계 향료, 페퍼민트, 스피어민트, 멘톨, 파인, 체리, 과일, 요구르트, 커피 등을 사용할 수 있다.

착색제의 호적한 예로서, 예를 들면 캐러멜 색소, 치자 색소, 안토시아닌 색소, 안나토 색소, 파프리카 색소, 홍화 색소, 홍국 색소, 카로틴 색소, 카로티노이드 색소, 플라보노이드 색소, 코치닐 색소, 아마란스(적색 2호), 에리트로신(적색 3호), 알루라 레드 AC(적색 40호), 뉴콕신(적색 102호), 플록신(적색 104호), 로즈 벵갈(적색 105호), 애시드 레드(적색 106호), 타트라진(황색 4호), 선셋 옐로우 FCF(황색 5호), 패스트그린 FCF(녹색 3호), 브릴리언트 블루 CF(청색 1호), 인디고 카르민(청색 2호), 구리 클로로필, 구리클로로필린나트륨 등을 사용할 수 있다.

소포제의 호적한 예로서, 예를 들면 디메티콘, 시메치콘, 실리콘에멀션, 소르비탄세스퀴올레이트, 비이온계 물질 등을 사용할 수 있다.

상기 외에, 본 제제에는 보조 성분, 예를 들면 보존·효능의 조제가 되는 광흡수 색소(리보플라빈, 아데닌, 아데노신 등), 안정화를 위한 킬레이트제·환원제(비타민 C, 구연산 등), 탄수화물(소르비톨, 락토오스, 만니톨, 전분, 수크로오스, 글루코오스, 덱스트란 등), 카제인 소화물, 각종 비타민 등이 함유시켜도 된다.

백신 제제의 제형 등에 대해서는 공지의 것을 채용할 수 있고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 액체 제제로서 사용해도 된다.

그 외, 상기 백신 제제는, 다른 질환에 대한 하나 또는 복수 개의 백신과의 혼합 백신 제제여도 된다.

<본 발명에 관한 어류의 이리도바이러스 감염증 예방 방법에 대하여>

본 발명은, 불활화된 이리도바이러스를, 항원으로서 1회당 10^7.0 TCID₅₀ 이상 투여하는 어류의 이리도바이러스 감염증 예방 방법을 널리 포함한다.

전술한 고농도 항원을 어류에 투여하는 것에 의해, 광범위한 어종에 있어서, 참돔이리도바이러스병 등의 이리도바이러스 감염증의 발생·감염·전파·만연을 효율적으로 예방할 수 있다.

본 발명은 참돔, 방어속 어류, 줄무늬전갱이, 흉기흑점바리, 갈색둥근바리, 자바리, 능성어 이외의 이리도바이러스에 감염될 수 있는 어종에 널리 적용 가능하다. 적용 대상으로 되는 어류로서, 예를 들면 돌돔속 어류(예를 들면, 돌돔, 감성돔 등), 고등어과 어류(예를 들면, 다랑어·황다랑어·날개다랑어·눈다랑어 등의 다랑어속 어류, 점다랑어 등의 점다랑어속 어류, 고등어 등의 고등어속 어류, 가다랑어 등의 가다랑어속 어류 등), 새치아목 어류(황새치 등의 황새치과 어류, 농어 등의 농어과 어류) 등을 들 수 있다.

본 발명에 관한 불활화 백신 제제의 투여 방법으로서, 예를 들면 주사법을 채용할 수 있다.

1회당 10^7.0 TCID₅₀ 이상 투여하기 위하여, 예를 들면 불활화 처리 전의 이리도바이러스의 농도를 10^8.0 TCID₅₀/mL 이상으로 조제한 불활화 백신 제제를 0.1mL 이상, 근육내 또는 복강내에 투여해도 된다. 또한, 어종별 또는 개체별 사이즈 등에 따라서, 예를 들면 1회당 10^7.0 TCID₅₀ 이상 투여할 수 있도록 바이러스 농도를 적절히 조정한 후에, 또는 불활화 처리 전의 이리도바이러스의 농도를 10^8.0 TCID₅₀/mL 이상으로 조제한 후에, 그 불활화 백신 제제를 0.05mL∼5.0mL, 보다 바람직하게는 0.05∼3.0mL, 가장 바람직하게는 0.05∼1.5mL의 범위로 투여해도 된다. 불활화 처리 전의 이리도바이러스의 농도를 10^8.0 TCID₅₀/mL 이상으로 조제하는 방법은, 전술한 바와 같다.

불활화 백신 제제의 투여 회수는, 그 작용이 지속하는 한 1회로 되지만, 대상 어류의 크기, 백신 효과의 정도 등에 따라서, 1∼60일 간격으로 복수 회 투여해도 된다. 예를 들면, 1회당 10^7.0 TCID₅₀ 이상을 1회 또는 1∼60일 간격으로 2회 투여하는 것이 호적하다.

<본 발명에 관한 어류의 이리도바이러스 감염증에 대한 백신 제제 제조를 위한 사용에 대하여>

본 발명은, 불활화된 이리도바이러스를 항원으로서 함유하고, 1회당 10^7.0 TCID₅₀ 이상 투여하는, 어류의 이리도바이러스 감염증에 대한 백신 제제의 제조를 위한, 상기 이리도바이러스의 사용을 널리 포함한다.

예를 들면, 10^8.0 TCID₅₀/mL 이상의 농도의 불활화된 이리도바이러스를 사용함으로써, 1회당 10^7.0 TCID₅₀ 이상 투여하는, 어류의 이리도바이러스 감염증에 대한 백신 제제를 제조할 수 있다. 사용하는 이리도바이러스 및 그 농도, 제조되는 백신 제제의 목적·용법·용량·항원 이외의 함유 성분 등은 상기와 동일하다.

[실시예 1]

실시예 1에서는, 참돔이리도바이러스를 배양 세포에서 증식시켰을 때의 배양액과 그 배양 세포의 양자를 함유한 불활화 항원을 돌돔에게 접종하여 면역한 경우에 있어서의, 참돔이리도바이러스병에 대한 예방 효과를 검증하였다.

항원으로서, 세포 혼입 항원을 조제하였다. 부착 세포인 GF 세포에 참돔이리도바이러스 RIE-124 균주를 감염시킨 후, 그 세포와 배양액을 각각 분취하고, 혼합하였다. 상기 세포에는 감염 중의 참돔이리도바이러스가 함유되어 있고, 배양액에는 참돔이리도바이러스가 함유되어 있다. 분취한 세포 혼입 배양액에 포르말린을 0.1%의 농도로 첨가하여 불활화하고, 「세포 혼입 항원」의 시료로 하였다. 상기 시료의 이리도바이러스 농도는 10^8.04 TCID₅₀/mL이었다. 그리고, 사용한 RIE-124 균주는, 2012년 8월, 에히메현(愛媛縣)의 참돔 양식장에서 감염 물고기의 비장을 채취하고, 거기에서 배양 세포로 분리·계대하여 얻은 단클론성의 참돔이리도바이러스 균주이다.

양성 대조로서, 통상의 배양 상청 항원을 조제하였다. 상기와 마찬가지로, 참돔이리도바이러스 RIE-124 균주를 GF 세포에 감염시킨 후, 그 배양 상청을 얻었다. 이 배양 상청에는 참돔이리도바이러스가 함유되어 있다. 그 배양 상청에 포르말린을 0.1%의 농도로 첨가하여 불활화하고, 「배양 상청 항원」의 시료로 하였다. 이 시료의 이리도바이러스 농도는 10^7.25 TCID₅₀/mL였다.

평균 체중 22.1g의 돌돔 치어 90마리를 준비하고, 30마리씩 3군으로 나누고, 각각 군마다 시험 수조에 넣어서 사육하였다.

3군 중, 제1군의 돌돔에 세포 혼입 항원을, 제2군에는 통상의 배양 상청 항원을, 각각 0.1mL씩 비마취 하에서 복강내에 주사하여 면역하고, 14일간, 사육 수온 25℃ 하에서 사육 관찰하였다. 그리고, 제3군에서는, 대조로서 항원을 투여하지 않고, 동일한 조건 하에서 사육 관찰하였다.

계속해서, 공격용 균주로서 참돔이리도바이러스 RIE12-1 균주를 준비하고, 면역 14일 후, 각 돌돔에 마취 하에서 10^0.5 TCID₅₀/마리, 복강내 주사하였다. 그리고, 공격 후 28일간, 동일한 조건 하에서 사육 관찰을 계속하였다. 그리고, 공격 시의 돌돔의 평균 체중은 31.0g이었다.

결과를 도 1에 나타낸다. 도 1은, 세포 혼입 항원으로 면역한 경우에 있어서의 돌돔의 생잔율을 나타내는 그래프이다. 도면 중, 가로축은 공격한 날부터의 일수를, 세로축은 생잔율(%)을, 각각 나타낸다. 도면 중, 「세포 혼입 항원」은 상기 세포 혼입 항원으로 면역한 경우의 결과를, 「배양 상청 항원」은 상기 통상의 배양 상청 항원으로 면역 한 경우의 결과를, 「무투여(대조)」는 항원으로 면역하지 않았을 경우의 결과를, 각각 나타낸다.

도 1에 나타내는 바와 같이, 무투여의 경우에 있어서의 바이러스 공격 후의 생잔율은 0%이고, 통상의 배양 상청 항원으로 면역한 경우라도 생잔율 6.7%이었던 것에 대하여, 세포 혼입 항원으로 면역한 경우에는 생잔율이 53.3%이며, 현저하게 높았다. 상기 결과로부터, 세포 혼입 항원이 통상의 배양 상청 항원과 비교하여, 돌돔속 어류의 이리도바이러스병의 예방에 현저하게 유효한 것이 나타내어졌다.

[실시예 2]

실시예 2에서는, 불활화된 참돔이리도바이러스의 고농도 항원을 돌돔에 접종하여 면역한 경우에 있어서의, 참돔이리도바이러스병에 대한 예방 효과를 검증하였다.

이하의 3종류의 항원을 이하와 같이 조제하였다.

(1) 통상 항원(1배) : 실시예 1과 동일하게, 참돔이리도바이러스 RIE-124 균주를 GF 세포에 감염시킨 후, 원심분리하여 그 배양 상청을 얻어, 그 배양 상청에 포르말린을 0.1%의 농도로 첨가하여 불활화하고, 「통상 항원(1배)」의 시료로 하였다. 이 시료의 이리도바이러스 농도는 10^7.34 TCID₅₀/mL였다.

(2) 농축 항원(5배) : (1)과 동일한 배양 상청을 100kDa 원심 한외 여과에 의해 5배 농축한 농축액에 포르말린을 0.1%의 농도로 첨가하여 불활화하고, 「농축 항원(5배)」의 시료로 하였다. 이 시료의 이리도바이러스 농도는 10^8.04 TCID₅₀/mL였다.

(3) 세포 혼입 항원 : 실시예 1과 동일하게, GF 세포에 참돔이리도바이러스 RIE-124 균주를 감염시킨 후, 그 세포와 배양액을 각각 분배·혼합하고, 그 세포 혼입 배양액에 포르말린을 0.1%의 농도로 첨가하여 불활화하고, 「세포 혼입 항원」의 시료로 하였다. 이 시료의 이리도바이러스 농도는 10^8.24 TCID₅₀/mL였다.

평균 체중 9.4g의 돌돔 치어 60마리를 준비하고, 15마리씩 4군으로 나누고, 각각 군마다 시험 수조에 넣어서 사육하였다.

4군 중, 제1군의 돌돔에는 (1)의 통상 항원을, 제2군에는 (2)의 농축 항원을, 제3군에는 (3)의 세포 혼입 항원을, 각각 0.1mL씩 복강내에 주사하여 면역하고, 14일간, 사육 수온 25℃ 하에서 사육 관찰하였다. 그리고, 제4군에서는, 대조로서, 항원을 투여하지 않고, 동일한 조건 하에서 사육 관찰하였다.

계속해서, 공격용 균주로서 참돔이리도바이러스 RIE12-1 균주를 준비하고, 면역 14일 후, 각 돌돔에게 마취 하에서 10^0.5 TCID₅₀/마리, 복강내 주사하였다. 그리고, 공격 후 20일간, 동일한 조건 하에서 사육 관찰을 계속하였다. 그리고, 공격 시의 돌돔의 평균 체중은 15.6이었다.

결과를 도 2에 나타낸다. 도 2는, 각 항원으로 면역한 경우에 있어서의 돌돔의 생잔율을 나타내는 그래프이다. 도면 중, 가로축은 공격한 날부터의 일수를, 세로축은 생잔율(%)을 각각 나타낸다. 도면 중, 「농축 항원(5배)」은 상기 농축 항원으로 면역한 경우의 결과를, 「세포 혼입 항원」은 상기 세포 혼입 항원으로 면역한 경우의 결과를, 「통상 항원(1배)」은 상기 통상 항원으로 면역한 경우의 결과를, 「무투여(대조)」는 항원으로 면역하지 않았을 경우의 결과를, 각각 나타낸다.

도 2에 나타내는 바와 같이, 무투여의 경우라도 생잔율이 33.3%이고, 또한, 통상 항원으로 면역한 경우라도 생잔율이 53.3%로, 무투여 군과 비교하여, 약간의 생잔율의 향상이 관찰되었지만, 농축 항원 및 세포 혼입 항원으로 면역한 군의 생잔율은, 양쪽 모두 73.3%이며, 통상 항원으로 면역한 군과 비교하여, 현저하게 생잔율이 높았다. 상기 결과로부터, 농축 항원 및 세포 혼입 항원이, 통상의 배양 상청 항원과 비교하여, 돌돔속 어류의 참돔이리도바이러스병 예방에 현저하게 유효한 것이 나타내어지고, 또한, 1회당 유효 항원량을 10^7.0 TCID₅₀ 이상으로 함으로써, 돌돔속 어류 등의 참돔이리도바이러스병을 효율적으로 예방할 수 있는 것이 시사되었다.

[실시예 3]

실시예 3에서는, 50배 농축한 참돔이리도바이러스의 고농도 항원을 돌돔에 접종하여 면역한 경우에 있어서의, 참돔이리도바이러스병에 대한 예방 효과를 검증하였다.

실시예 2에서 얻은 배양 상청을 500kDa 원심 한외 여과에 의해 50배 농축하고, PBS로 버퍼 교환하여 협잡 단백질을 제거한 후, 포르말린을 0.1%의 농도로 첨가하여 불활화하고, 「농축 항원(50배)」의 시료로 하였다. 이 시료의 이리도바이러스 농도는 10^9.04 TCID₅₀/mL였다.

또한, 실시예 2에서 얻은 배양 상청에 포르말린을 0.1%의 농도로 첨가하여 불활화하고, 「통상 항원(1배)」의 시료로 하였다.

평균 체중 8.4g의 돌돔 치어 60마리를 준비하고, 20마리씩 3군으로 나누고, 각각 군마다 시험 수조에 넣어서 사육하였다.

3군 중, 제1군의 돌돔에 농축 항원(50배)을, 제2군에는 통상 항원(1배)을, 각각 0.1mL씩 비마취 하에서 복강내에 주사하여 면역하고, 14일간, 사육 수온 25℃ 하에서 사육 관찰하였다. 그리고, 제3군에서는, 대조로서 항원 대신에 PBS를 투여하고, 동일한 조건 하에서 사육 관찰하였다.

계속해서, 공격용 균주로서 참돔이리도바이러스 RIE12-1 균주를 준비하고, 면역 14일 후, 각 돌돔에 10^0.5 TCID₅₀/마리, 복강내 주사하였다. 그리고, 공격 후 27일간, 동일한 조건 하에서 사육 관찰을 계속하였다.

결과를 도 3에 나타낸다. 도 3은, 50배 농축 항원으로 면역한 경우에 있어서의 돌돔의 생잔율을 나타내는 그래프이다. 도면 중, 가로축은 공격한 날부터의 일수를, 세로축은 생잔율(%)을 각각 나타낸다. 도면 중, 「농축 항원(50배)」은 50배 농축 항원으로 면역한 경우의 결과를, 「통상 항원(1배)」은 통상 항원(1배)으로 면역 한 경우의 결과를, 「PBS(대조)」는 항원 대신에 PBS를 투여한 경우의 결과를 각각 나타낸다.

도 3에 나타내는 바와 같이, 통상의 농도 항원으로 면역한 경우의 생잔율은 10%이고, 음성 대조인 PBS 투여의 경우(15%)와 동등한 값이었던 것에 대하여, 50배 농축한 고농도 항원으로 면역한 경우의 생잔율은 85%이며, 현저하게 높았다. 상기 결과로부터, 고농도 항원이 통상의 농도 항원과 비교하여, 돌돔속 어류의 이리도바이러스 병의 예방에 현저하게 유효한 것이 나타내어졌다.

Claims (6)

1. 불활화된 이리도바이러스를 항원으로서 함유하고, 1회당 10^7.0 TCID₅₀ 이상 투여하는, 어류의 이리도바이러스 감염증에 대한, 백신 제제.
2. 제1항에 있어서,
   상기 이리도바이러스가 배양 세포에서 증식된 바이러스인, 백신 제제.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 항원으로서, 상기 이리도바이러스를 배양 세포에서 증식시켰을 때의 배양 상청의 농축액, 또는 배양액 및 상기 배양 세포를 함유한, 백신 제제.
4. 제1항에 있어서,
   대상이 돌돔속 어종인, 백신 제제.
5. 항원으로서, 불활화된 이리도바이러스를 10^8.0 TCID₅₀/mL 이상의 농도로 함유한, 어류의 이리도바이러스 감염증에 대한, 백신 제제.
6. 불활화된 이리도바이러스를, 항원으로서 1회당 10^7.0 TCID₅₀ 이상 투여하는, 어류의 이리도바이러스 감염증 예방 방법.

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