CN102178945B - 一种石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗的制备方法，以石斑鱼胚胎细系为病毒的扩增体系，将病毒接种至对数期石斑鱼胚胎细胞上，完全病变后反复冻融离心，所得的病毒液用终浓度为1：500的β-丙内酯4℃灭活16小时，既得灭活病毒疫苗。将其应用于免疫斜带石斑鱼幼鱼，15天后攻毒结果显示相对保护率在90%以上。本发明的方法操作简便，设备要求简单，重复性好，在高效灭活病毒的前提下保持了病毒良好的免疫原性，免疫保护效果好，可应用于石斑鱼的预防免疫，提高养殖石斑鱼的存活率和养殖效率。

Description

一种石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗的制备方法

技术领域

本发明属于兽医生物新医药技术领域，具体地讲涉及一种利用鱼类细胞生产石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗的方法。

背景技术

石斑鱼肉质鲜美蛋白含量高，是一种经济价值极高的食用鱼类，也是我国创汇的优良鱼类品种。但近年来随着养殖规模的扩大和养殖环境的日益恶化，各种病害特别是病毒性疾病频繁爆发，造成了重大的经济损失。虹彩病毒是石斑鱼的重要致病病原，它可以造成鱼类的死亡率从30%(成鱼中)到100%(幼苗阶段)。这种病毒在亚洲，特别是在22℃以上的高水温时，极易感染中国、日本和东南亚等国养殖的海水名贵鱼类，如石斑鱼、尖吻鲈、真鲷、牙鲆和大黄鱼等，致使鱼类大面积的死亡，造成严重的经济损失，因而被称之为“海洋口蹄疫”。石斑鱼虹彩病毒SGIV是从养殖的石斑鱼中分离到的一株新的虹彩病毒，可导致石斑鱼死亡率达90%以上，给石斑鱼的养殖带来巨大的经济损失。因此，如何预防和治疗虹彩病毒病已成为当今世界上石斑鱼养殖业急需解决的重要问题。

众所周知，疫苗作为化学药品和抗生素的替代品，是治疗疾病、特别是病毒病的最好选择。灭活疫苗具有较强的安全性和免疫原性，在哺乳动物和鸟类中，已有利用细胞系大规模繁殖病毒和生产灭活病毒疫苗的成功先例，但到目前为止，在海水鱼中还没有见到利用细胞系制备石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗的报道。病毒的灭活可采用物理的或化学的方法，在各种化学灭活剂中，β-丙内酯直接与病毒核酸作用，灭活效果好，不作用于壳蛋白，不破坏病原体的免疫原性。而且灭活时间短，极易水解，无残留，并且水解产物无毒无害，已广泛应用于多种人和动物疫苗的生产。因此，针对石斑鱼的虹彩病毒病害，建立了一种利用鱼类细胞系制备石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗的方法，并对制备的灭活疫苗进行免疫实验，证明效果良好。

发明内容

本发明的目的是利用石斑鱼胚胎细胞繁殖病毒，利用β-丙内酯进行病毒的灭活，提供一种制备石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗的方法，以便大量生产病毒灭活疫苗。

一种石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：①培养石斑鱼胚胎细胞，待细胞生长至对数期时接种石斑鱼虹彩病毒；②接种后的细胞病变完全后，反复冻融2-3次，去除细胞碎片，收集离心所得的含石斑鱼虹彩病毒的上清液；③调整含石斑鱼虹彩病毒的上清液pH值至7.4-7.6，加入β-丙内酯，病毒液与β-丙内酯混合均匀后4℃灭活处理16小时；其中病毒液与β-丙内酯体积比为1:500。

步骤①所述培养是将石斑鱼胚胎细胞用质量分数0.25%的胰蛋白酶消化1-2分钟后，加入新配置的pH7.4-7.6含8-10%胎牛血清的MEM培养液，于25-28℃进行培养扩增。

步骤①所述接种是用0.01-0.05MOI的石斑鱼虹彩病毒。

步骤②所述的去除细胞碎片是将病变细胞2500g离心10分钟。

步骤③病毒液用氢氧化钠溶液调pH值；病毒液是离心后收集的含石斑鱼虹彩病毒的上清液。

步骤③灭活过程中保持病毒液与β-丙内酯混合液的ph值在7.4-7.6之间。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明首次建立了石斑鱼虹彩病毒的灭活方法，操作简便，设备要求简单，灭活时间短；在高效灭活病毒的前提下保持了病毒良好的免疫原性，免疫保护效果好，可应用于石斑鱼的预防免疫，提高养殖石斑鱼的存活率和养殖效率。

附图说明

图1为注射灭活疫苗石斑鱼和对照组15天后攻毒各组的累积死亡率

具体实施方式：

实施例1

1、石斑鱼虹彩病毒扩增用石斑鱼胚胎细胞的培养。取长满单层的石斑鱼胚胎细胞，去除原有培养液，磷酸缓冲盐溶液漂洗后加入0.25%的胰蛋白酶消化2分钟，加入新配置的含10%胎牛血清的MEM培养液（pH7.4），吹匀后分至3个细胞培养瓶中于25℃进行培养扩增，待细胞生长至对数期时接种石斑鱼虹彩病毒扩增。

2、石斑鱼虹彩病毒的扩增与收获。接种0.05MOI（multiplicity of infection，感染复数）的病毒于对数期细胞中，置25℃培养箱中培养，以扩增病毒。连续培养4天后，细胞病变完全，反复冻融3次后分装入50毫升离心管中，2500g离心10分钟，去除细胞碎片，收集离心所得上清液，用于以下的病毒灭活。

3、石斑鱼虹彩病毒灭活条件的确定及安全性试验。病毒液（即离心后收集的含石斑鱼虹彩病毒的上清液）用氢氧化钠溶液调pH值至7.4，加入β-丙内酯，病毒液与β-丙内酯体积比分别为1:250、1:500、1:1000、1:2000，病毒液与β-丙内酯混匀后在4℃灭活处理不同时间（6h、12h和24h）后取样，灭活期间不时调整pH值使其维持在7.4。所有样品37℃水浴水解2小时，以充分水解残留的β-丙内酯。接种石斑鱼胚胎细胞，观察细胞病变效应（cytopathic effect, CPE），连续传3代以检测灭活效果。检测结果见表1。

表1不同浓度的β-丙内酯处理病毒不同时间后的细胞盲传结果                                                

（+表示观察到CPE，-表示无CPE）

从表 1可知，病毒液与β-丙内酯体积比为1:500时， 4℃灭活处理12小时的安全性检测结果显示，灭活病毒液不会引起细胞病变，证明病毒已被有效灭活。后续试验中，为安全起见，适度延长了灭活时间，采用病毒液与β-丙内酯体积比为1:500，4℃灭活处理16小时。

4、免疫保护效果检测。根据上述确定的病毒灭活条件，病毒液与β-丙内酯体积比为1:500，4℃灭活处理16小时制备疫苗。取使用剂量即10⁶TCID50/0.1毫升腹腔免疫石斑鱼幼鱼，对照组注射同样剂量的磷酸缓冲盐溶液，实验设立一个重复（分别命名为A1组和A2组）。15天后攻毒，每日统计死亡鱼数，根据统计出来的各组的死亡率，依下列公式计算相对保护率(Relative percentage survival，RPS)：相对保护率(RPS)= [1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100%。结果显示对照组的死亡率在90%以上，疫苗免疫组的相对保护率为92.3%-100%，产生了坚强的免疫保护力。具体结果见图1和表2。

表2 根据统计出来的各组的死亡率，依公式计算相对保护率

处理组	存活率（%）	相对保护率（%）
			A1-PBS(磷酸缓冲盐溶液对照组)	13.33	-
A1-BPL(灭活疫苗组)	93.33	92.31
			A2-PBS(磷酸缓冲盐溶液对照组)	13.33	-
A2-BPL(灭活疫苗组)	100	100

本发明制备的疫苗免疫保护效果好，可应用于石斑鱼的预防免疫，提高养殖石斑鱼的存活率和养殖效率。

Claims (5)

1.一种石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：①培养石斑鱼胚胎细胞，待细胞生长至对数期时接种石斑鱼虹彩病毒；②接种后的细胞病变完全后，反复冻融2-3次，去除细胞碎片，收集离心所得的含石斑鱼虹彩病毒的上清液；③调整含石斑鱼虹彩病毒的上清液pH值至7.4-7.6，加入β-丙内酯，病毒液与β-丙内酯混合均匀后4℃灭活处理16小时；其中病毒液与β-丙内酯体积比为1:500；步骤③灭活过程中保持病毒液与β-丙内酯混合液的pH值在7.4-7.6之间。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤①所述培养是将石斑鱼胚胎细胞用质量分数0.25%的胰蛋白酶消化1-2分钟后，加入新配置的pH7.4-7.6含8-10%胎牛血清的MEM培养液，于25-28℃进行培养扩增。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤①所述接种是用0.01-0.05MOI的石斑鱼虹彩病毒。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤②所述的去除细胞碎片是将病变细胞2500g离心10分钟。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤③石斑鱼虹彩病毒液用氢氧化钠溶液调pH值；所述病毒液是离心后收集的含石斑鱼虹彩病毒的上清液。

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