CN114369568B - 一种斜带石斑鱼脊髓组织细胞gsc119及二联灭活疫苗和制备方法 - Google Patents

一种斜带石斑鱼脊髓组织细胞gsc119及二联灭活疫苗和制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119，其保藏编号为GDMCC No：62068，保藏日期为2021年11月16日，其对石斑鱼蛙虹彩病毒高敏感，石斑鱼蛙虹彩病毒可以在GSC119上连续稳定传代，适用于GIV‑R的大规模培养；还公开了石斑鱼蛙虹彩病毒和哈维氏弧菌二联灭活疫苗及其制备方法，二联灭活疫苗包括石斑鱼蛙虹彩病毒和哈维氏弧菌，石斑鱼蛙虹彩病毒采用所述斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119培养获得。该二联疫苗对石斑鱼蛙虹彩病毒的绝对免疫保护效果不低于90％，对石斑鱼哈维氏弧菌的免疫效果不低于80％。该二联灭活疫苗适用于石斑鱼蛙虹彩病毒和哈维氏弧菌引发的石斑鱼病害的预防免疫。

Description

一种斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119及二联灭活疫苗和制备 方法
技术领域
本发明属于兽用生物医药技术领域，具体涉及一种斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119及二联灭活疫苗和制备方法。
背景技术
鱼虹彩病毒又称脊椎动物虹彩病毒，是一种胞浆型大DNA病毒，基因组大小为99～140kb，编码103～162个病毒蛋白。鱼虹彩病毒主要包括3个病毒属，即蛙病毒(Ranavirus)、淋巴囊肿病毒(Lymphocystivirus)和肿大细胞病毒(Megalocytivirus)。蛙病毒的宿主范围最为广泛，包括两栖类、爬行类和硬骨鱼类，相比之下，淋巴囊肿病毒和肿大细胞病毒的敏感宿主仅限硬骨鱼类。
石斑鱼是全球分布的名贵海洋鱼类，其肉质鲜美，营养丰富，被港澳地区推为中国四大名鱼之一。中国是世界上石斑鱼的主要生产国，商品鱼总产量超过 18万吨(2019年中国渔业统计年鉴)，在我国海洋养殖鱼类中排名第二，整个产业链产值200亿元人民币以上，石斑鱼产业在我国海水养殖渔业中占有重要地位。
蛙病毒属(Ranavirus)、肿大细胞病毒属(Megalocytivirus)和淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)等3类鱼虹彩病毒皆能感染不同规格石斑鱼并导致不同程度的发病和死亡。因三者都是广义的鱼虹彩病毒，为区别起见，分别简称为GIV-R(石斑鱼蛙虹彩病毒)、GIV-M(石斑鱼肿大细胞虹彩病毒)和GIV-L(石斑鱼淋巴囊肿虹彩病毒)。
GIV-R是一种独特的蛙病毒属虹彩病毒。GIV-R的独特之处在于，(1)GIV-R 的基因组大小约为139kb，而其它种类的蛙虹彩病毒的基因组大小为99.6～120kb， GIV-R是已知蛙病毒属中基因组最大的一种病毒；(2)GIV-R的敏感宿主仅限石斑鱼，目前为止，尚未发现石斑鱼之外的其它养殖鱼类敏感宿主；(3)在学术界，对蛙虹彩病毒的聚类分析将蛙病毒属成员分为两个亚类，即两栖类样蛙病毒(Amphibian-like ranavirus，ALRV)和石斑鱼样蛙病毒(grouper-like ranavirus， GLRV)，本申请涉及的石斑鱼蛙虹彩病毒特指基因组约139kb，宿主限石斑鱼的这一类GLRV，简称GIV-R。
GIV-R在2000年前后在新加坡和中国台湾地区的养殖石斑鱼发现并流行，此后在中国大陆沿海省份如广东、海南、福建和山东的养殖石斑鱼出现多个病例报道。
中国台湾地区和中国大陆的研究人员分别报道了GIV-R的灭活疫苗，但至今都还没有进入到商业化应用阶段。
哈维氏弧菌(Vibrio Harveyi)又称哈氏弧菌，是一种短杆状革兰氏阴性菌海洋弧菌，两端钝圆，具一根极生单鞭毛，菌体大小为(0.6～0.8)μm×(1.4～1.6)μm，鞭毛长约3.6～4.5μm。哈维氏弧菌是近20年来国际上特别是东亚和东南亚濒海国家或地区多种海水养殖鱼类的重要细菌性疾病的病原。常见海水养殖鱼类，如石斑鱼、海鲈、金目鲈、鲷类及鲆鲽类都是哈氏弧菌的易感宿主。在东南亚，哈氏弧菌被认为是金目鲈“脱鳞综合征(SDS)”的主要细菌性病原。
流行病学调查显示，致病性哈维氏弧菌被确认为石斑鱼肌肉坏死/烂身病的主要细菌性病原。
针对海洋鱼类哈维氏弧菌，国内外有多个有关哈维氏弧菌疫苗的研究的报道，其灭活疫苗效果良好。
但迄今为止，国内外均无石斑鱼蛙虹彩病毒(GIV-R)和哈维氏弧菌(VH)联合疫苗的公开报道，也没有石斑鱼脊髓细胞用于石斑鱼蛙虹彩病毒(GIV-R)培养方面的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119，该斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119对石斑鱼蛙虹彩病毒(GIV-R)高敏感，石斑鱼虹彩病毒(GIV-R)可以在GSC119上连续稳定传代，适用于GIV-R的大规模培养。
本发明的目的还在于提供一种石斑鱼蛙虹彩病毒和哈维氏弧菌二联灭活疫苗，该疫苗安全性好、效力高，一针微量注射免疫即可有效预防由GIV-R引发的石斑鱼蛙虹彩病毒病和由哈维氏弧菌(VH)引发的石斑鱼烂身病/肌肉坏死病。
本发明的最后一个目的在于提供上述石斑鱼蛙虹彩病毒和哈维氏弧菌二联灭活疫苗的制备方法。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119，所述斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119的保藏编号为 GDMCC No：62068，保藏日期为2021年11月16日。
所述斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119对石斑鱼蛙虹彩病毒(GIV-R)高敏感。石斑鱼虹彩病毒(GIV-R)可以在GSC119上连续稳定传代，适用于GIV-R 的大规模培养。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种石斑鱼蛙虹彩病毒和哈维氏弧菌二联灭活疫苗，包括石斑鱼蛙虹彩病毒(GIV-R)和哈维氏弧菌(VH)，其中所述石斑鱼蛙虹彩病毒(GIV-R)采用上述的斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119培养获得。
石斑鱼蛙虹彩病毒(GIV-R)是石斑鱼蛙虹彩病毒所致石斑鱼黑身、趴底病的流行毒株；所述哈维氏弧菌(VH)菌株是石斑鱼烂身病的流行菌株。本发明中的石斑鱼蛙虹彩病毒(GIV-R)和哈维氏弧菌(VH)为常规来源的病毒或病菌，可采用实验室早期分离并培养的石斑鱼蛙虹彩病毒(GIV-R)和哈维氏弧菌(VH)。
石斑鱼蛙虹彩病毒(GIV-R)可以在一些细胞中复制，但目前尚无商业化细胞系可用，也无石斑鱼脊髓组织细胞的相关报道，本发明通过试验建立的斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119易于培养并对GIV-R高敏感，适合GIV-R相关疫苗的制备。
优选的，所述灭活疫苗还包括注射疫苗用白油佐剂，所述灭活疫苗是一种油包水型二联灭活疫苗。
有限的，所述石斑鱼蛙虹彩病毒(GIV-R)的病毒含量为(0.85～0.9)×106TCID50/0.1mL，所述哈维氏弧菌(VH)的细菌含量为(1.6～1.8)×107cfu/0.1mL。
更佳的，所述石斑鱼蛙虹彩病毒(GIV-R)的病毒含量为(0.864)×106TCID50/0.1mL，所述哈维氏弧菌(VH)的细菌含量为(1.728)×107cfu/0.1mL。
优选的，所述灭活疫苗的用量为(0.05～0.1mL)/尾石斑鱼，适用于5g及以上的石斑鱼注射免疫。
优选的，所述灭活疫苗对石斑鱼腹腔注射免疫一次，同时对GIV-R和VH 具有良好免疫保护效果，免疫后21天，对GIV-R的保护效果≥90％，对VH的保护效果≥80％。
本发明的上述最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：上述石斑鱼蛙虹彩病毒和哈维氏弧菌二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)培养斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119；
(2)利用斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119培养石斑鱼蛙虹彩病毒(GIV-R)，获得GIV-R病毒液；
(3)培养石斑鱼哈维氏弧菌(VH)，获得VH菌液；
(4)将GIV-R病毒液和VH菌液分别进行灭活；
(5)将灭活的GIV-R和VH分别加入白油佐剂进行乳化制苗；
(6)将GIV-R和VH单苗按比例混合均匀得到GIV-R和VH联合疫苗。
在上述石斑鱼蛙虹彩病毒和哈维氏弧菌二联灭活疫苗的制备方法中：
优选的，步骤(1)中培养斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119，具体包括：
(1.1)超净工作台无菌操作取出石斑鱼脊髓组织，置添加有含高浓度抗生素PBS的培养皿，洗涤3次(5min/次)；镊子转移脊髓组织至新的培养皿，灭菌剪刀将脊髓组织横切为长度约1mm的组织小块，将组织小块的横切面贴附 T25细胞培养瓶底板，室温静置20min，然后移液管缓缓加入5mL Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM)完全培养液；每2天更换培养液；
(1.2)待脊髓组织块迁出的细胞长至约90％汇合细胞层，吸除培养瓶中的培养液，加入2mL的0.25％胰蛋白酶消化液消化1～2min，当观察到细胞形成流动层，再加入3mLDMEM生长培养液(前10代内含15％胎牛血清，10代后含 10％胎牛血清)，移液管轻吹底板以充分分散细胞，1000rpm离心5分钟收集细胞，加入10mL DMEM生长培养液重悬细胞，分装至两个T25培养瓶，置26℃生化培养箱。3d后，细胞铺满孔底，将长满单层细胞的培养瓶培养液吸除，加入0.25％胰蛋白酶消化液消化1～2min，如上所述进行传代，如此连续传代45次以上，该细胞增殖稳定，状态良好，成为稳定传代细胞系(图1)，命名为斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119，GSC119对GIV-R高敏感(图2-3)，适用于GIV-R 的扩繁。
优选的，步骤(2)中将培养好的GSC119细胞接种GIV-R，进行病毒扩繁，获得GIV-R病毒液，具体包括：取已形成良好单层的GSC119，按比例加入GIV-R 病毒液，感染后的3-4d，感染细胞出现80％以上的病变时收获病变细胞，收获病变细胞得到病毒原液，-30℃保存备用。
优选的，步骤(2)中所述石斑鱼蛙虹彩病毒(GIV-R)的接种量为占所述斜带石斑鱼脊髓传代细胞GSC-119培养液总体积的0.1～0.3％(v/v)；更佳为0.2％(v/v，1∶500)。
优选的，步骤(3)中采用2216E培养液培养石斑鱼哈维氏弧菌(VH)。
进一步的，步骤(3)中采用2216E培养液培养哈维氏弧菌，获得哈维氏弧菌菌液，具体包括：
(3.1)哈维氏弧菌菌株活化：从生长于2216E培养板的哈维氏弧菌挑取单个菌落，接种含10mL 2216E培养液的50mL培养管，100rpm摇床28℃下培养 6h，室温收获菌液备用。
(3.2)哈维氏弧菌的扩大培养：取步骤(3.1)培养的细菌种子液，以1∶ 1000的比例接种新的经高压灭菌处理的2216E培养液，28℃培养10～12h， 6000rpm离心10min收集细菌，用灭菌PBS将菌液重悬为一定浓度，得到哈维弧菌菌液。
优选的，步骤(4)中将GIV-R病毒液和VH菌液分别进行灭活时，采用 0.10～0.12％(v/v)终浓度的福尔马林在3～5℃进行灭活7～9d；更佳的，采用0.1％(v/v)终浓度的福尔马林在4℃进行灭活8d。
进一步的，步骤(4)中将GIV-R病毒液和VH菌液进行灭活处理，包括以下步骤：
(4.1)病毒液和细菌液的灭活：以0.1％(v/v)终浓度边搅拌边滴加福尔马林至GIV-R病毒液和VH菌液，充分混匀后置4℃灭活8d；
(4.2)灭活检：取加入灭活剂【终浓度0.1％(v/v)的福尔马林】的病毒液 0.1mL加入长满GSC119单层细胞的T75培养瓶，盲传三代内未观察到细胞病变确定为病毒灭活完全；取加入灭活剂(终浓度0.1％(v/v)的福尔马林)的VH 菌液，以1∶1000比例接种2216E培养液，28℃过夜培养10-12h，无细菌长出，确认为细菌灭活完全。
优选的，步骤(5)中乳化制苗时，将水相与油相以3∶7(v/v)比例乳化，其中水相包括灭活的GIV-R和VH，油相包括注射疫苗用白油佐剂。
进一步的，步骤(5)中对灭活的GIV-R病毒液和VH菌液分别进行乳化处理，具体包括：
(5.1)配苗：对GIV-R病毒抗原和VH细菌抗原分别进行定量，使GIV-R 的灭活前病毒含量为0.6×107及以上TCID50/0.1mL，VH的灭活前细菌含量为 1.2×108及以上cfu/0.1mL；
(5.2)乳化：水相与油相以3∶7(v/v)比例乳化，先将油相导入乳化罐中，开动电机低速搅拌，同时缓慢加入水相，以5000rpm的搅拌速度乳化10min，得到油包水型白油佐剂疫苗。
优选的，步骤(5.2)中水相制备过程为：将灭菌的吐温-80与步骤(5.1)中的抗原分别按4∶96(v/v)配比，充分混匀使吐温-80完全溶解；
优选的，步骤(5.2)中油相制备过程为：油相制备，将预先加入2％硬脂酸铝(w/v)的注射用白油和司本-80以94∶6(v/v)配比，加热搅拌至透明状，然后高压灭菌、待冷却后室温存放备用。
进一步的，步骤(5.2)中油包水型疫苗还包括质检步骤，所述质检步骤包括：取一个清洁吸管，吸取少量油包水型疫苗滴于冷水中，除第一滴外，均应不扩散；取疫苗10mL加入15mL离心管中，3000rpm离心15min，管底析出的水相应不超过0.5mL。
优选的，步骤(6)中将GIV-R和VH单苗按1∶1(v/v)的体积比混合均匀得到GIV-R和VH联合疫苗。
进一步的，步骤(6)中GIV-R单苗和VH单苗的混合：室温条件下取步骤(5)中制备的GIV-R单苗和VH单苗按1∶1(v/v)的比例加入乳化罐，以5000rpm 的搅拌速度搅拌5min，得到GIV-R和VH的二联疫苗。
优选的，步骤(6)中获得的油包水型白油佐剂二联疫苗，其保存条为2～8℃。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明建立了一种对GIV-R高敏感的新的斜带石斑鱼脊髓组织细胞 GSC119，GIV-R在GSC119上可稳定连续传代，适用于GIV-R的大规模培养；
(2)本发明提供的二联灭活疫苗仅需一针微量注射免疫，对由GIV-R和 VH引发的养殖石斑鱼常见虹彩病毒病(黑身、趴底)和细菌性烂身病(肌肉坏死病)皆有高效免疫预防效果；
(3)本发明提供的二联灭活疫苗制作工艺比较简洁，且成本适中，免疫接种比较方便，安全性好，效力高，适用于免疫预防由GIV-R和VH导致的石斑鱼病毒病和弧菌病。
附图说明
图1是实施例1中石斑鱼脊髓传代细胞GSC119形态图(第88代，160×)；
图2是实施例1中感染GIV-R后48h，GSC119的细胞病理变化(160×)；
图3是实施例1中感染GIV-R后60小时GSC119透射电镜图；
图4是实施例3中二联灭活疫苗对石斑鱼蛙虹彩病毒和哈维氏弧菌的保护效果。
具体实施方式
需要说明的是，在本发明的描述中，实施例中未注明具体条件者，均为常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售方式购买获得的常规用品。
以下为结合具体的实施例对本发明做进一步详细的说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119的培养方法，具体包括以下步骤：
(1)超净工作台无菌操作取出石斑鱼脊髓组织，置于添加有含高浓度抗生素PBS的培养皿，洗涤3次(5min/次)；镊子转移脊髓组织至新的培养皿，灭菌剪刀将脊髓组织横切为长度约1 mm的组织小块，将组织小块的横切面贴附 T25细胞培养瓶底板，室温静置20min，然后移液管缓缓加入5mL Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM)完全培养液；每2天更换培养液；
(2)待脊髓组织块迁出的细胞长至约90％汇合细胞层，吸除培养瓶中的培养液，加入2mL的0.25％胰蛋白酶消化液消化1～2min，当观察到细胞形成流动层，再加入3mLDMEM生长培养液(前10代内含15％胎牛血清，10代后含10％胎牛血清)，移液管轻吹底板以充分分散细胞，1000rpm离心5分钟收集细胞，加入10mL DMEM生长培养液重悬细胞，分装至两个T25培养瓶，置26℃生化培养箱。3d后，细胞铺满孔底，将长满单层细胞的培养瓶培养液吸除，加入0.25％胰蛋白酶消化液消化1～2min，如上所述进行传代，如此连续传代45次以上，该细胞增殖稳定，状态良好，成为稳定传代细胞系(图1)，命名为斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119，GSC119对GIV-R高敏感(图2-3)，适用于GIV-R的扩繁。
将GSC119送广东省微生物菌种保藏中心进行生物保藏，所述斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119的保藏编号为GDMCC No：62068，保藏日期为2021年11 月16日，分类命名为斜带石斑鱼脊髓组织细胞，拉丁文名称为Spinal cord tissue cell lines of Epinepheluscoioides，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所，广东省微生物菌种保藏中心。
实施例2
石斑鱼蛙虹彩病毒和哈维氏弧菌二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
将实施例1中培养好的GSC119细胞接种GIV-R，进行病毒扩繁，获得GIV-R 病毒液，可以包括：取已形成良好单层的GSC119，按比例加入GIV-R病毒液，感染后的3-4d，感染细胞出现80％以上的病变时收获病变细胞，收获病变细胞得到病毒原液，-30℃保存备用，具体包括以下步骤：
(1)GSC119细胞的传代与培养：取实施例1中的GSC119细胞经胰酶细胞分散液消化传代，用含10％胎牛血清的DMEM培养液将细胞密度调整为1.5×105个/mL的浓度，接种至细胞培养皿或转瓶中，置于26℃培养箱继续扩大培养，当GSC119细胞形成良好单层时，用于接种病毒；
(2)病毒接种和培养：取步骤(1)中已形成良好单层的GSC119，加入0.2％(v/v)的GIV-R病毒液(GIV-R病毒由本实验室分离自海南琼海发病石斑鱼， -80℃冻存备用，可参考文献以下文献分离获得：Ma，H.，Peng，C.，Su，Y.，Feng，J.， Guo，Z..Isolation of aRanavirus-type grouper iridovirus in mainland China and comparison of itspathogenicity with that of a Megalocytivirus-type grouperiridovirus.Aquaculture，2016.463：145～151.)，置于26℃培养箱继续培养4d，当观察到GCS119出现80％以上的病变时，收获病变细胞至-30℃冰柜或冷藏室，冷冻24h 后，转移至室温自然解冻，收集解冻的病毒，混匀。
取2mL病毒液置-80℃冰箱，2h后取出，室温解冻后用于病毒滴度测定，其余病毒液直接加灭活剂【终浓度为0.1％(v/v)福尔马林】灭活或置-30℃冰柜或冷藏室备用。取经-80℃冻融的病毒液，以含2.5％牛血清的DMEM培养液做10 倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8和10-9共6个稀释度的病毒液接种铺满单层GSC119的96孔细胞培养板，每个稀释度的病毒液重复6孔，每孔 0.1mL，5％CO2、26℃培养96小时，观察细胞病变(CPE)，计算TCID50；
采用2216E培养液培养哈维氏弧菌，获得哈维氏弧菌菌液，具体包括：
(3)哈维氏弧菌菌株活化：从生长于2216E培养板的哈维氏弧菌(VH菌株由本实验室按常规方法分离自广东阳江烂身病石斑鱼，-80℃冻存备用)挑取单个菌落，接种含10mL2216E培养液的50mL培养管，100rpm摇床28℃下培养6h，室温收获菌液备用。
(4)哈维氏弧菌的扩大培养：取步骤(3)培养的细菌种子液，以1∶1000 的比例接种新的经高压灭菌处理的2216E培养液，28℃培养10～12h；平板计数法计算收获细菌的浓度，即取少量菌液，以无菌PBS做10倍系列稀释，取10-8和10-9和10-10共3个稀释度铺板覆盖有2216E培养基的直径为8-cm的培养皿，每个稀释度菌液重复铺板3个平皿，每个平皿0.1mL，37℃生化培养箱培养12 小时，统计不同稀释度菌液长出的聚落情况，计算原始菌液的细菌浓度； 6000r/min 10min离心收集细菌，用灭菌PBS将菌液重悬为特定浓度，得到哈维弧菌菌液。
(5)病毒抗原和细菌抗原灭活与灭活检：
用移液管吸取福尔马林溶液，滴向步骤(2)和步骤(4)获得的GIV-R病毒液和VH菌液至终浓度为0.1％(v/v)，边滴加边摇动混匀，然后置于4℃冷柜灭活8d。
取添加灭活剂的病毒液0.1mL加入长满GSC119单层细胞的T75培养瓶，盲传三代内未观察到细胞病变确定为病毒灭活完全，取加入灭活剂的VH菌液，以1∶1000比例(v/v)接种于2216E培养液，28℃过夜培养10-12h，无细菌长出，确认为细菌灭活完全。
(6)配苗：以灭菌生理盐水分别对GIV-R病毒液和VH菌液进行抗原定量，使GIV-R病毒液中的灭活前病毒含量为0.6×107TCID50/0.1mL，VH细菌液的灭活前细菌含量为1.2×108cfu/0.1mL。
(7)水相制备、油相制备与疫苗乳化：
水相制备过程为：将灭菌的吐温-80与步骤(6)中的GIV-R抗原和VH抗原分别按4∶96(v/v)配比，充分混匀使吐温-80完全溶解。
油相制备：将预先加入2％硬脂酸铝(w/v)的注射用白油和司本-80以94∶ 6(v/v)配比，加热搅拌至透明状，然后高压灭菌、待冷却后室温存放备用。
疫苗乳化：水相与油相以3∶7(v/v)比例乳化，先将油相导入乳化罐中，开动电机低速搅拌，同时缓慢加入水相，以5000rpm的搅拌速度乳化10min，得到GIV-R和VH的油包水型白油佐剂单苗。
油包水型疫苗的质检，取一个清洁吸管，吸取少量油包水型疫苗滴于冷水中，除第一滴外，均应不扩散；取疫苗10mL加入15mL离心管中，3000rpm离心 15min，管底析出的水相应不超过0.5mL。获得的油包水型疫苗，2～8℃冰柜存放备用。
(8)混合GIV-R和VH为二联疫苗：按1∶1(v/v)的比例取步骤(7)中的制备的GIV-R和VH单苗，分别导入到乳化罐中，5000rpm的搅拌速度乳化5 min，得到GIV-R和VH的油包水型白油佐剂联合疫苗，分装后4℃冰柜保存备用，其中石斑鱼蛙虹彩病毒(GIV-R)的病毒含量约为0.864×106TCID50/0.1mL，哈维氏弧菌(VH)的细菌含量约为1.728×107cfu/0.1mL。
实施例3石斑鱼蛙虹彩病毒和哈维氏弧菌二联灭活疫苗用于预防GIV-R和 VH的感染
用实施例2制备的GIV-R和VH联合疫苗进行预防感染试验。
试验鱼及其饲养条件，平均规格为7.1g/尾石斑鱼购自广东阳江某石斑鱼培苗场，暂养于本实验室的室内养殖鱼池中，水温维持在27±0.5℃，空气动力泵自动补充氧气，循环水系统可即时将鱼池中的粪便等废物排出，日常投喂石斑鱼专用饵料，早晚各投喂一次，免疫前在上述养殖池暂养7d，养殖鱼体表完好、游动活跃、抢食正常；随机取5尾鱼，镜检未检到寄生虫，PCR检测未检出石斑鱼蛙虹彩病毒和肿大细胞虹彩病毒。
分组与免疫：实验鱼分为3组，组1为正常剂量组，组2为二倍剂量接种组，组3为未免疫对照组。组1，腹腔注射二联疫苗75尾，0.05mL/尾疫苗；组2腹腔注射75尾，0.1mL/尾；组3，腹腔注射75尾DMEM培养液，0.05mL/尾。上述处理前24h内停止投喂；
攻毒：免疫后12h，开始正常投喂。每日观察并记录免疫鱼的状态，如有死亡，应及时捞出。免疫后21天，自组1取70尾鱼分为组1-1和组1-2两个组， 35尾/组；自组2取70尾鱼分为组2-1和组2-2两个组，35尾/组；自组3取70 尾鱼苗分为组3-1和组3-2，35尾/组。组1-1，组2-1和组3-1腹腔注射 2.5×106.0TCID50/0.1mL的GIV-R病毒液，0.1mL/尾；组1-2，组2-2和组3-2腹腔注射1.2×107.0TCID5o/0.1mL的哈维氏弧菌菌液，0.1mL/尾。连续观察20天，统计各组的死亡情况。
疫苗安全性：免疫后21天，各处理组养殖情况正常，疫苗免疫组在48h内发现有轻微摄食减少现象，48h后，各组养殖情况表现未见显著差异。免疫观察期的21天内，组1、组2和组3分别有1尾、2尾和2尾的死亡(表1)，除组1死亡鱼疑似为注射操作致死外，组2和组3均为养殖过程发生互相吞食导致双双死亡。提示无论是0.05mL/尾接种组还是0.1mL/尾接种组，联合疫苗安全性好，未见显著副作用。
表1 21d免疫观察期内，各处理组石斑鱼的死亡情况
疫苗效力：
GIV-R攻毒组，免疫攻毒后连续观察20天内，组1-1、组2-1和组3分别死亡1尾、2尾和23尾(表2)；计算联苗对GIV-R的绝对有效率组1-1和组2-1 分别为97.1％(34/35)和94.3％(33/35)；以RPS＝【1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)】×100％计算组1-1和组2-1对GIV-R攻毒的相对免疫保护率(RPS)分别为95.7％和91.3％。
VH攻毒组，免疫攻毒后连续观察20天内，组1-2、组2-2和组3-2分别死亡5尾、3尾和29尾；计算联苗对VH的绝对有效率，组1-2和组2-2分别为 85.7％(30/35)和91.4％(32/35)(图4，表3)；以RPS＝【1-(免疫组死亡率/ 对照组死亡率)】×100％计算组1-2和组2-2对VH攻毒的相对免疫保护率(RPS)分别为82.8％和89.7％。
表2攻毒GIV-R后20天内，各组攻毒鱼的死亡情况(N＝35)。
表3攻毒VH后20天内，各组攻毒鱼的死亡情况(N＝35)。
二联灭活疫苗对石斑鱼蛙虹彩病毒和哈维氏弧菌的保护效果如图4所示。以0.05mL/尾和0.1mL/尾的免疫剂量腹腔注射免疫石斑鱼鱼苗，21天后分别进行免疫攻毒。
如图4所示，结果显示：
GIV-R攻毒组，未免疫对照组死亡率超过60％(65.7％)情况下，0.05mL/ 尾和0.1mL/尾免疫剂量组的存活率分别为97.1％(34/35)和94.3％(33/35)，计算相对保护效果(RPS)分别为95.7％和91.3％。
VH攻毒组，未免疫对照组死亡率超过80％(82.9％)情况下，0.05mL/尾和 0.1mL/尾免疫剂量组的存活率分别为85.7％(30/35)和91.4％(32/35)，计算相对保护效果(RPS)分别为82.8％和89.7％。
联合疫苗的田间试验：
在广东某工厂化石斑鱼养殖场实施，按照实施例2的方法制备二联灭活疫苗，石斑鱼苗规格约5～8g/尾，平均规格为6.7g/尾，鱼苗来自山东某石斑鱼苗种场；免疫剂量0.05mL/尾，约7500尾，免疫观察期间养殖水温为24～29℃，免疫后的 3个月，随机取免疫鱼30尾分别进行GIV-R和VH强毒攻毒，测免疫保护率，随机取未免疫鱼30尾作为对照。
结果显示，免疫后3个月，二联疫苗免疫鱼对GIV-R攻毒的绝对保护率为 93.3％(28/30)，计算对GIV-R的相对保护率RPS为87.5％，对VH攻毒的绝对保护率为73.3％(22/30)，计算对VH的相对保护率RPS为70.4％(表4)。该批免疫鱼经过12个月的养殖，成为规格为1.2kg以上商品鱼，养殖期间未发生黑身、趴底、昏睡等典型GIV-R病毒病，也未发现烂身病等典型哈维氏弧菌病，该批免疫鱼的总体成活率高达96.1％。
表4免疫后3个月，联合疫苗对GIV-R和VH的保护效果(N＝30)。
综上述，本发明提供的联合疫苗免疫效果好，操作比较简单，一次微量注射免疫即可有效预防由石斑鱼蛙虹彩病毒哈维氏弧菌导致的虹彩病毒病和由哈维氏弧菌导致的烂身病，可显著提升石斑鱼的养殖成功率。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (4)

1.一种斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119，其特征是：所述斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119的保藏编号为GDMCC No：62068，保藏日期为2021年11月16日。
2.根据权利要求1所述的斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119，其特征是：所述斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119对石斑鱼蛙虹彩病毒GIV-R高敏感。
3.一种石斑鱼蛙虹彩病毒和哈维氏弧菌二联灭活疫苗，其特征是包括石斑鱼蛙虹彩病毒GIV-R和哈维氏弧菌VH，其中所述石斑鱼蛙虹彩病毒GIV-R采用权利要求1中的斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119培养获得；
所述灭活疫苗还包括注射疫苗用白油佐剂，所述灭活疫苗是一种油包水型二联灭活疫苗；
所述石斑鱼蛙虹彩病毒的病毒含量为0.85×106~0.9×106 TCID50/0.1 mL，所述哈维氏弧菌的细菌含量为1.6×107~1.8×107 cfu / 0.1mL；
所述灭活疫苗的用量为0.05 mL ~0.1mL/尾石斑鱼，适用于5g及以上的石斑鱼注射免疫；
所述石斑鱼蛙虹彩病毒和哈维氏弧菌二联灭活疫苗通过以下方法制备获得：
（1）培养所述斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119；
（2）利用所述斜带石斑鱼脊髓组织细胞GSC119培养石斑鱼蛙虹彩病毒，获得GIV-R病毒液；
（3）培养石斑鱼哈维氏弧菌，获得VH菌液；
（4）将GIV-R病毒液和VH菌液分别进行灭活；
（5）将灭活的GIV-R和VH分别加入白油佐剂进行乳化制苗；
（6）将GIV-R和VH单苗按比例混合均匀得到GIV-R和VH联合疫苗；
步骤（5）中乳化制苗时，将水相与油相以3︰7，v/v比例乳化，其中水相包括灭活的GIV-R和VH，油相包括注射疫苗用白油佐剂；
步骤（6）中将GIV-R和VH单苗按1:1的体积比混合均匀得到GIV-R和VH联合疫苗。
4.根据权利要求3所述石斑鱼蛙虹彩病毒和哈维氏弧菌二联灭活疫苗，其特征是：所述灭活疫苗对石斑鱼腹腔注射免疫一次，同时对GIV-R和VH具有良好免疫保护效果，免疫后21天，对GIV-R的保护效果≥90%，对VH的保护效果≥80%。
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