CN106267195B - 一种猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物及其制备方法 - Google Patents

一种猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物及其制备方法，该抗原抗体复合物包括抗原和抗体，所述抗原为猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒混合得到的三联病毒液，所述抗体是由所述抗原制备的三联卵黄抗体。本发明旨在提供一种使用方便快捷，能安全有效的防治猪病毒性腹泻的抗原抗体复合物及其制备方法。这种抗原抗体复合物能有效降低机体的免疫应激反应，加快保护产生速度，迅速提高机体抗体滴度，在生产和使用过程中会不存在散毒风险。

Description

一种猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物及其制备方法。
背景技术
目前，猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒腹泻是我国猪群中危害最严重的三种病毒性腹泻病，严重影响了养猪业的发展。
猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒引起的，是以猪呕吐、腹泻、脱水为特征的传染病，对新生猪仔具有高度致死率；猪流行性腹泻是猪流行性腹泻病毒引起的一种猪肠道传染病，以水泻、呕吐和脱水为特征，各年龄的猪均易感，尤其哺乳仔猪受害最为严重，主要发生在冬季和早春天气较为寒冷的季节；流行病学调查显示，猪群中轮状病毒的带毒率非常高，中猪和大猪多为亚临床感染和隐性感染，即只携带病毒不发病，发病的只是仔猪。这三种病常常混合感染，在流行病学、临床症状、病理解剖学变化上都非常的相似，很难区分到底是哪一种病毒感染，而且发病迅速，因此，治疗猪的病毒性腹泻疾病已刻不容缓。
现在用于治疗猪病毒性腹泻的主要产品包括疫苗、抗生素、中药及其制剂。疫苗需要一定时间产生免疫应答，紧急发病无法马上产生保护；抗生素对病毒性疾病效果不佳；中药及其制剂药效慢、作用弱、用量大、质量难以稳定以致使用不方便等。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种使用方便快捷，能安全有效的防治猪病毒性腹泻的抗原抗体复合物及其制备方法。这种抗原抗体复合物，既可以快速地使机体产生被动免疫，也可持续的使机体产生自主免疫有效保护机体。它与母源抗体共同作用，通过改变抗原的提呈路径，在短时间内刺激机体产生长期有效的保护力，同时与病毒抗原制成的复合物疫苗相比，能有效降低机体的免疫应激反应，加快保护产生速度，迅速提高机体抗体滴度，在生产和使用过程中会不存在散毒风险。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物，该抗原抗体复合物包括抗原和抗体，所述抗原为猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒混合得到的三联病毒液，所述抗体是由所述抗原制备的三联卵黄抗体。
进一步的，所述猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物中抗原和抗体的体积比为1:1。
进一步的，在所述抗原抗体复合物中，每种病毒的毒价均为1×106.0TCID50以上，每种卵黄抗体的中和效价均达到1:7TCID50以上。
进一步的，所述三联病毒液中猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的体积比为1:1:1。
进一步的，所述猪传染性胃肠炎病毒为猪传染性胃肠炎病毒华毒株，所述猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻病毒CV777株，所述猪轮状病毒为猪轮状病毒NX株。
进一步的，所述抗原抗体复合物按照常规方法制成抗原抗体复合物制剂，所述抗原抗体复合物制剂为普通液体制剂、油乳剂或固体制剂。
普通液体制剂的制备方法：取处方量的三联病毒液及三联卵黄抗体加入PBS液中，经除菌处理制备而成。
油乳剂的制备方法：取处方量的三联病毒液及三联卵黄抗体加入油佐剂混合乳化，按常规油乳剂疫苗的制备方法制成。
固体制剂的制备方法：取处方量的三联病毒液及三联卵黄抗体加入冻干保护剂中，冻干制成。
进一步的，所述猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物还包括角鲨烯，所述角鲨烯与抗原以及抗体的体积比为1:2:2。
本发明还提供了上述猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物的制备方法，该方法包括如下步骤：
a、抗原的制备
将猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒分别利用细胞扩增培养，然后将培养得到的3种病毒分别进行浓缩，浓缩后混合，其中每种病毒的毒价均为1×107.0TCID50以上，甲醛灭活，最终得到含有3种灭活病毒的三联病毒液，即为所需抗原；
b、抗体的制备
用步骤a中制得的三联病毒液免疫产蛋鸡，将获得的高免鸡蛋经过酸化、辛酸萃取、超滤浓缩经过滤除菌后得到三联卵黄抗体，即为所需抗体；
c、抗原抗体复合物的制备
将步骤a所制得的三联病毒液和步骤b所制得的三联卵黄抗体混合，然后浓缩，得到抗原抗体复合物。
进一步的，在所述步骤a中，猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒分别利用PK-15细胞、Vero细胞和MA104细胞扩增培养。
进一步的，在所述步骤b中，产蛋鸡每隔14天加强免疫一次，三次免疫后10天收集高免蛋，取样检测，每种卵黄抗体中和效价均达到1：10TCID50以上。
进一步的，在所述步骤c中，所述抗原抗体复合物中还包括角鲨烯，所述角鲨烯与抗原以及抗体的体积比为1:2:2。
本发明的有益效果：
相对于现有技术，本发明所述的一种猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物及其制备方法具有以下优势：
(1)本发明所述的一种猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物及其制备方法，所获得的抗原抗体复合物具有性能稳定、安全性好、动物免疫后产生免疫作用快、免疫力强、保护率高的特点，制备的复合物制剂具有制备简单快捷、使用安全方便的特点。用禽蛋黄抗体防治猪的疫病可避免同源或近源带毒和传播疫病的潜在危险，避免了动物高免血清在治疗过程中引起的副作用。
(2)本发明所述的一种猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物中添加角鲨烯，角鲨烯是一种脂质不皂化物，最初是从鲨鱼的肝油中发现的，1914年被命名为Squalene,其化学名为(6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-廿四碳六烯，属开链三萜，又称鱼肝油萜，具有提高体内超氧化物歧化酶(SOD)活性、增强机体免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等多种生理功能，是一种无毒性的具有防病治病作用的海洋生物活性物质
角鲨烯具有：a、保肝作用，促进肝细胞再生并保护肝细胞，从而改善肝脏功能；b、抗疲劳和增强机体的抗病能力，提高人体免疫功能；c、保护肾上腺皮质功能，提高机体的应激能力；d、抗肿瘤，尤其在癌切除外科手术后或采用放化疗时使用，效果显著，其最大的特点是防止癌症向肺部转移；e、升高白细胞的作用，在抗原抗体复合物中加入角鲨烯可以使其效果明显增加，对免疫效果有明显的改善作用。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为试验1免疫试验的血清抗体平均效价绘制图，其中空白组为每头仔猪注射2ml生理盐水，疫苗组为每头仔猪注射2ml常规三联疫苗，抗原抗体复合物I组为每头仔猪注射2ml实施例1制备的抗原抗体复合物I，抗原抗体复合物II组为每头仔猪注射2ml实施例2制备的抗原抗体复合物II；
图2为试验2猪流行性腹泻病毒攻毒保护试验的仔猪发病率、死亡率和保护率的对比图，其中空白组为每头仔猪注射2ml生理盐水，疫苗组为每头仔猪注射2ml常规三联疫苗，抗原抗体复合物I组为每头仔猪注射2ml实施例1制备的抗原抗体复合物I，抗原抗体复合物II组为每头仔猪注射2ml实施例2制备的抗原抗体复合物II；
图3为试验3猪传染性胃肠炎攻毒保护试验数的仔猪发病率、死亡率和保护率的对比图，其中空白组为每头仔猪注射2ml生理盐水，疫苗组为每头仔猪注射2ml常规三联疫苗，抗原抗体复合物I组为每头仔猪注射2ml实施例1制备的抗原抗体复合物I，抗原抗体复合物II组为每头仔猪注射2ml实施例2制备的抗原抗体复合物II；
图4为试验4猪轮状病毒攻毒保护试验的仔猪发病率、死亡率和保护率的对比图，其中空白组为每头仔猪注射2ml生理盐水，疫苗组为每头仔猪注射2ml常规三联疫苗，抗原抗体复合物I组为每头仔猪注射2ml实施例1制备的抗原抗体复合物I，抗原抗体复合物II组为每头仔猪注射2ml实施例2制备的抗原抗体复合物II。
具体实施方式
除非另外说明，本文中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义。
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
实施例1：抗原抗体复合物I
一种猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物，该抗原抗体复合物包括抗原和抗体，所述抗原为猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒混合得到的三联病毒液，所述抗体是由所述抗原制备的三联卵黄抗体。
所述抗原抗体复合物中所述抗原和所述抗体的体积比为1:1。
在所述猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物中，每种病毒的毒价均为1×106.0TCID50以上，每种卵黄抗体的中和效价均达到1:7TCID50以上。
所述三联病毒液中猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的体积比为1:1:1。
所述猪传染性胃肠炎病毒为猪传染性胃肠炎病毒华毒株，所述猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻病毒CV777株，所述猪轮状病毒为猪轮状病毒NX株。
该三联抗原抗体复合物具体制备方法包括以下步骤：
a、抗原的制备
将猪传染性胃肠炎病毒华毒株、猪流行性腹泻病毒CV777株和猪轮状病毒NX株分别利用PK-15细胞、Vero细胞和MA104细胞扩增培养，然后将培养得到的3种病毒分别进行浓缩，浓缩后将3种病毒按体积比1:1:1混合，其中每种病毒的毒价均为1×107.0TCID50以上，甲醛灭活，最终得到含有3种灭活病毒的三联病毒液，即为所需抗原；
b、抗体的制备
用步骤a中制得的三联病毒液免疫产蛋鸡，每隔14天加强免疫一次，三次免疫后10天收集高免蛋，取样检测，留蛋使用，高免鸡蛋经过酸化、辛酸萃取、超滤浓缩经过滤除菌后得到三联卵黄抗体，即为所需抗体，在所得到的三联卵黄抗体中，每种卵黄抗体的中和效价均达到1:10TCID50以上；
c、抗原抗体复合物的制备
将步骤a所制备的三联病毒液和步骤b所制备的三联卵黄抗体按体积比1:1混合得到抗原抗体复合物。所得到的抗原抗体复合物浓缩后，每种病毒的毒价均为1×106.0TCID50以上，每种卵黄抗体的中和效价均达到1:7TCID50以上。
所述步骤b中的中和效价的测定方法包括以下步骤：
I、制备细胞悬液
将长至单层的PK-15细胞、Vero细胞、MA104细胞按常规方法消化，计数后用维持液稀释至所需浓度获得细胞悬液；
II、96孔细胞板制备
将该中和效价的测定步骤I中计数完毕的细胞悬液按照200μl/孔加入细胞培养板各细胞孔中，置于37℃的CO2培养箱中进行培养，约24小时可长至单层；
III、TCID50测定
将抗原抗体复合物制备步骤a中制得的三联病毒液用稀释液作10倍系列稀释，从10-1～10-10；将步骤I制备细胞悬液中已长至单层的PK-15细胞、Vero细胞、MA104细胞取出，弃掉原有营养液，各稀释度取50μl三联病毒液按顺序加入该中和效价的测定步骤II中制备的细胞培养板中，记录加样顺序，每个稀释度做8孔，设正常细胞对照2孔，置于37℃的CO2培养箱中孵育1小时。病毒吸附后，按照150μl/孔向细胞板中加入37℃预热的维持液，并置于37℃的CO2培养箱中进行培养；
IV、抗体中和试验
将抗原抗体复合物制备步骤b中制得的三联卵黄抗体倍比稀释，稀释好的抗体与该中和效价的测定步骤III标定好的三联病毒液按体积比1:1依次混合，放入37℃的CO2培养箱中孵育1小时。将孵育后稀释液各稀释度取50μl液按顺序加入细胞培养板，然后按照150μl/孔向细胞板中加入37℃预热的维持液，并置于37℃的CO2培养箱中进行培养；
V、毒液TCID50检测
细胞板接毒后观察至第二天，低稀释度的病毒出现病变；第三天时病变数继续增加，进行结果判定并记录；由Reed-Muench法计算出本次三联病毒液TCID50；
VI、根据中和试验结果计算每种卵黄抗体的中和效价。
所述抗原抗体复合物按照常规方法制成抗原抗体复合物制剂，所述抗原抗体复合物制剂为普通液体制剂、油乳剂或固体制剂；
所述普通液体制剂的制备方法：取处方量的三联病毒液及三联卵黄抗体加入PBS液中，经除菌处理制备而成；
所述油乳剂的制备方法：取处方量的三联病毒液及三联卵黄抗体加入油佐剂混合乳化，按常规油乳剂疫苗的制备方法制成；
所述固体制剂的制备方法：取处方量的三联病毒液及三联卵黄抗体加入冻干保护剂中，冻干制成。
实施例2：抗原抗体复合物II
在实施例1的基础上，所述抗原抗体复合物还包括角鲨烯，所述角鲨烯与抗原以及抗体的体积比为1:2:2。该抗原抗体复合物的制备方法与实施例1相同，在此不再赘述。
将实施例1中得到的猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物I和实施例2中得到的猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物II分别进行如下试验：
试验1、免疫试验
取非免疫3日龄仔猪40头，随机分成四组，每组10头，具体操作如下：
空白对照组：每头仔猪注射2ml生理盐水。
疫苗对照组：每头仔猪注射2ml常规三联疫苗组(2ml为常规疫苗一头份注射量)。
抗原抗体复合物I组：每头仔猪注射2ml实施例1制备的抗原抗体复合物I。
抗原抗体复合物II组：每头仔猪注射2ml实施例2制备的抗原抗体复合物II。
上述各组在肌注后，每隔一天随机取4头上述仔猪进行采血，并测其血清的抗体水平；15天后每隔5天，取4头上述仔猪进行采血，并测其血清的抗体水平。取测得的各组血清抗体平均效价绘制图，如图1。
结果表明：注射抗原抗体复合物I和抗原抗体复合物II的仔猪开始产生免疫应答的时间都要早于常规疫苗组；其中注射抗原抗体复合物II的仔猪体内产生免疫应答的效应时间最短，抗体效价上升最快，持续时间最长；说明抗原抗体复合物II明显优于抗原抗体复合物I。
试验2、猪流行性腹泻病毒攻毒保护试验
取非免疫3日龄仔猪80头，随机分成四组，每组20头，具体操作如下：：
空白对照组：每头仔猪注射2ml生理盐水。
疫苗对照组：每头仔猪注射2ml常规三联疫苗组(2ml为常规疫苗一头份注射量)。
抗原抗体复合物I组：每头仔猪注射2ml实施例1制备的抗原抗体复合物I。
抗原抗体复合物II组：每头仔猪注射2ml实施例2制备的抗原抗体复合物II。
上述各组仔猪在肌注后5天，每头猪用2ml的猪流行性腹泻病毒CV777株强毒肌肉注射(含100LD50)，统计各组仔猪发病率和死亡率，并计算保护率，如图2。
结果表明：注射抗原抗体复合物的小组保护效果最好，其中注射实施例2制备的抗原抗体复合物II的小组的死亡率最低，保护率95％，而空白对照组的死亡率高达100％。
试验3、猪传染性胃肠炎病毒攻毒保护试验
取非免疫3日龄仔猪80头，随机分成四组，每组20头，具体操作如下：：
空白对照组：每头仔猪注射2ml生理盐水。
疫苗对照组：每头仔猪注射2ml常规三联疫苗组(2ml为常规疫苗一头份注射量)。
抗原抗体复合物I组：每头仔猪注射2ml实施例1制备的抗原抗体复合物I。
抗原抗体复合物II组：每头仔猪注射2ml实施例2制备的抗原抗体复合物II。
上述各组仔猪在肌注后5天，每头猪用2ml的猪传染性胃肠炎病毒华毒株强毒肌肉注射(含100LD50)，统计各组仔猪发病率和死亡率，并计算保护率，如图3。
结果表明：注射抗原抗体复合物的小组保护效果最好，其中注射实施例2制备的抗原抗体复合物II的小组的死亡率最低，保护率高达100％，而空白对照组的死亡率高达100％。
试验4、猪轮状病毒攻毒保护试验
取非免疫3日龄仔猪80头，随机分成四组，每组20头，具体操作如下：：
空白对照组：每头仔猪注射2ml生理盐水。
疫苗对照组：每头仔猪注射2ml常规三联疫苗组(2ml为常规疫苗一头份注射量)。
抗原抗体复合物I组：每头仔猪注射2ml实施例1制备的抗原抗体复合物I。
抗原抗体复合物II组：每头仔猪注射2ml实施例2制备的抗原抗体复合物II。
上述各组仔猪在肌注后5天，每头猪用2ml的猪轮状病毒NX株强毒肌肉注射(含100LD50)，统计各组仔猪发病率和死亡率，并计算保护率，如图4。
结果表明：注射抗原抗体复合物的小组保护效果最好，其中注射实施例2制备的抗原抗体复合物II的小组的死亡率最低，保护率高达90％，而空白对照组的死亡率高达100％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物，其特征在于：该抗原抗体复合物包括抗原和抗体，所述抗原为猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒混合得到的三联病毒液，所述抗体是由所述抗原制备的三联卵黄抗体；所述猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物还包括角鲨烯，所述角鲨烯与抗原以及抗体的体积比为1:2:2。
2.根据权利要求1所述的一种猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物，其特征在于：在所述抗原抗体复合物中，每种病毒的毒价均为1×106.0TCID50以上，每种卵黄抗体的中和效价均达到1:7TCID50以上。
3.根据权利要求1或2所述的一种猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物，其特征在于：所述三联病毒液中猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的体积比为1:1:1。
4.根据权利要求3所述的一种猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物，其特征在于：所述猪传染性胃肠炎病毒为猪传染性胃肠炎病毒华毒株，所述猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻病毒CV777株，所述猪轮状病毒为猪轮状病毒NX株。
5.根据权利要求1所述的一种猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物，其特征在于：所述抗原抗体复合物按照常规方法制成抗原抗体复合物制剂，所述抗原抗体复合物制剂为普通液体制剂、油乳剂或固体制剂。
6.权利要求1至5中任一项所述的猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
a、抗原的制备
将猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒分别利用细胞扩增培养，然后将培养得到的3种病毒分别进行浓缩，浓缩后混合，其中每种病毒的毒价均为1×107.0TCID50以上，甲醛灭活，最终得到含有3种灭活病毒的三联病毒液，即为所需抗原；
b、抗体的制备
用步骤a中制得的三联病毒液免疫产蛋鸡，将获得的高免鸡蛋经过酸化、辛酸萃取、超滤浓缩经过滤除菌后得到三联卵黄抗体，即为所需抗体；
c、抗原抗体复合物的制备
将步骤a所制得的三联病毒液和步骤b所制得的三联卵黄抗体混合，然后浓缩，得到抗原抗体复合物；
在所述步骤c中，所述抗原抗体复合物中还包括角鲨烯，所述角鲨烯与抗原以及抗体的体积比为1:2:2。
7.根据权利要求6所述的一种猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物的制备方法，其特征在于：在所述步骤b中，产蛋鸡每隔14天加强免疫一次，三次免疫后10天收集高免蛋，取样检测，每种卵黄抗体中和效价均达到1：10TCID50以上。
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