CN111217916B

CN111217916B - 猪三种致腹泻病毒中和抗原表位融合蛋白及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN111217916B
Application number: CN202010039900.2A
Authority: CN
Inventors: 金文杰; 宁晨; 秦爱建; 邵红霞; 钱琨; 黄晓星; 王加圆; 王倩倩; 郑建高; 王建; 王姣; 邓建中; 王秋生; 洪枫
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2020-01-15
Filing date: 2020-01-15
Publication date: 2023-08-01
Anticipated expiration: 2040-01-15
Also published as: CN111217916A

Abstract

本发明涉及猪三种致腹泻病毒中和抗原表位融合蛋白重构体及其制备方法和应用。所述猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV的中和抗原表位融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。编码该中和抗原表位融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示。本发明分别选取PEDV、TGEV、PoRV的主要中和抗原表位基因并进行拼接，而后通过重组杆状病毒真核表达系统对串联基因进行融合蛋白表达。将表达串联基因融合蛋白的重组病毒通过腹腔注射的方式免疫小鼠，可诱导机体产生免疫应答，具有较强的免疫原性。本发明为预防PEDV、TGEV、PoRV感染提供了一种新的方法，也为猪腹泻病毒新型疫苗的开发奠定了基础。

Description

猪三种致腹泻病毒中和抗原表位融合蛋白及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及猪三种致腹泻病毒中和抗原表位融合蛋白及其构建方法和应用。

背景技术

由猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)引起的猪腹泻是严重危害养猪业的急性、高度传染性的肠道疾病。猪腹泻发病特点是严重的肠炎、呕吐和水性腹泻，特别是哺乳仔猪死亡率高，能够造成重大经济损失，成为养猪行业的一个重要问题。尽管近年来针对其研制了相应疫苗，但效果不是十分理想，而且随着病毒的遗传变异，疫苗保护效力愈发不稳，所以很长一段时间内，猪腹泻类病毒感染仍然是中国养猪业的一个不容忽视的问题。

而相关疫苗的发展也是困难重重，例如早期，研究者在体外细胞上获得PEDV是十分困难的，大多数病毒分离自小肠原代细胞感染仔猪的粪便和肠内容物后得到的。直到1988年Hofmann和WyLer才第一次有报道称PEDV能够连续在Vero细胞上进行传代培养。病毒难分离，难以传代培养，传代病毒含量低等因素的存在，使得传统疫苗的研发带来诸多挑战。

而且根据我们相关的流行病学调查得到的数据显示，猪腹泻类病毒感染多成继发感染，所以猪腹泻类病毒防治也应以联合用药为主，但目前而言随着流行毒株不断变异，所以选取保守的中和抗原表位基因片段串联进行融合蛋白的表达从而达到稳定有效的多重防治功效较为可取。然而在中和抗原表位融合蛋白的构建过程中，可能会出现蛋白表达量不高或者蛋白免疫原性不足，或者无法使猪产生较高的免疫效果，从而无法达到保护动物的目的。

就传统疫苗相对基因工程疫苗而言，传统疫苗研发有着长久的历史，大部分科研工作者也具有丰富的相关研发经验，而且研发成本可控，生产工艺成熟，传统的灭活疫苗与弱毒疫苗也在市场上历经考验，起到不可或缺的作用。但是传统疫苗生产研发应用的过程中可能伴随着病毒外源污染，病毒毒力返强等生物安全风险也是不可忽视的。人类所有的生产生活都是随着科技进步而同步提升的，基因工程疫苗必定是未来疫苗的发展趋势，随着人们对病毒感染机制了解的愈加详细和免疫保护机理的日趋明了，我们跟随着科研进展而做出相应的改进，研制新型有效的多重基因工程疫苗是疫苗研发必然的途径，市场选择的不二之选。

发明内容

本发明的目的是提供猪三种致腹泻病毒中和抗原表位融合蛋白及其基因、表达载体构建方法和应用。

本发明公开了猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV的中和抗原表位融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明公开了编码上述猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位融合蛋白的基因，该基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还公开了所述融合蛋白的重组杆状病毒表达载体，含有序列如SEQ IDNO.1所示中和抗原表位融合蛋白的基因抗原表位融合蛋白的基因。

本发明还公开了所述的猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位融合蛋白的制备方法，包括步骤如下：

(a)获得PEDV-COE、TGEV-SA、PoRV-VP7中和抗原表位基因融合蛋白重组基因片段，利用PCR方法设计3对引物如下：

PEDV-COE-F：5'-CGGGATCCTTCTAGAAACCTTCTGAGTC-3'，(SEQ ID NO.3)

PEDV-COE-R：5'-CGGAATTCATACTTGGTACACACAT-3'，(SEQ ID NO.4)

TGEV-S-F：

5'-CGGAATTCGGTTCTGGATCAGGAGGTTCTGGATCAGGATACACACATACCATT-3'，(SEQ IDNO.5)

TGEV-S-R：5'-CCGCTCGAGTATAACAGCTGTGGCATCT-3'，(SEQ ID NO.6)

PoRV-VP7-F：

5'-CCGCTCGAGGGTTCTGGATCAGGAGGTTCTGGATCAGGACCAAATGAAGCAGCTACAG-3'，(SEQID NO.7)

PoRV-VP7-R：5'-GGGGTACCGCAGCAGAATCTAAGG-3'；(SEQ ID NO.8)

以病毒液提取的核酸为模板，进行RT-CR反应分别扩增得到PEDV-COE、TGEV-SA、PoRV-VP7的基因片段；反应体系为：Green Taq Mix 12.5μL，cDNA 2μL，Rnase FreedH₂O9.5μL，上下游引物各1μL；反应程序：95℃ 5min，95℃ 1min，61℃ 1min，72℃ 1min，共30个循环；72℃ 10min；

(b)将上述编码PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位融合蛋白的基因片段PEDV-COE、TGEV-SA、PoRV-VP7分别连接至pFastBac-HTA载体上，得到重组表达载体pFastBacHT-COE-SA-VP7；

(c)将重组表达质粒pFastBacHT-COE-SA-VP7转座DH10Bac感受态细胞中，得到阳性转座子经菌液PCR和基因测序鉴定为阳性菌落即为能表达PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位融合蛋白的重组杆状病毒穿梭载体rBac-COE-SA-VP7。

(3)将含有PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位串联基因的rBac-COE-SA-VP7转染Sf9细胞获得重组病毒P1，28℃培养72h-120h直到细胞出现明显的病变。

本发明进一步公开了猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位融合蛋白在制备预防或治疗由猪流行性腹泻病毒引起的仔猪腹泻病药物中的应用。

本发明选取猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV的中和抗原表位基因并进行拼接，中和抗原表位是分别是PEDV的COE基因、TGEV的SA基因、PoRV的VP7基因。而后通过重组杆状病毒真核表达系统对串联基因进行融合蛋白表达。将表达串联基因融合蛋白的重组病毒通过腹腔注射的方式免疫小鼠，可诱导机体产生免疫应答，具有较强的免疫原性。因此，本发明将猪三种致腹泻病毒中和抗原表位串联基因进行融合表达，为预防PEDV、TGEV、PoRV感染提供了一种新的方法，也为猪腹泻病毒新型疫苗的开发奠定了基础。

附图说明

图1为pFastBacHTA空载体质粒图谱

图2为pFastBacHT-VP7的质粒图谱。

图3为pFastBacHT-SA-VP7的质粒图谱。

图4为pFastBacHT-COE-SA-VP7的质粒图谱。

图5为重组质粒pFastBacHT-COE-SA-VP7的质粒酶切图

1：BamHI、EcoRI酶切2：EcoRI、XhoI酶切3：XhoI、KpnI酶切4：BamHI酶切5：1Kb DNAMarker 6：BamHI酶切7：BamHI、XhoI酶切8：EcoRI、KpnI酶切9：BamHI、KpnI酶切

图6为构建pFastBacHT-COE-SA-VP7重组杆状病毒穿梭质粒的M13状PCR鉴定图

M：1Kb DNA Marker 1：pFastBacHT-COE-SA-VP7重组质粒蓝斑的PCR扩增产物2：pFastBacHT-COE-SA-VP7重组质粒白斑的PCR扩增产物3：pFastBacHTA空载体重组质粒白斑的PCR扩增产物

图7为P3代重组杆状病毒感染的SF9细胞PEDV、TGEV、PoRV猪源阳性血清荧光

A:PEDV阳性血清B:TGEV阳性血清C:PoRV阳性血清

图8为融合蛋白免疫鼠血清间接免疫荧光检测PEDV、TGEV、PoRV抗体效价

A:接种PEDV细胞孔B:接种TGEV细胞孔C:接种PoRV细胞孔。

具体实施方式

实施例1.PEDV-COE、TGEV-SA、PoRV-VP7中和抗原表位基因的获得，利用PCR方法设计3对引物如下：

PEDV-COE-F：5'-CGGGATCCTTCTAGAAACCTTCTGAGTC-3'，(SEQ ID NO.3)

PEDV-COE-R：5'-CGGAATTCATACTTGGTACACACAT-3'，(SEQ ID NO.4)

TGEV-S-F：

5'-CGGAATTCGGTTCTGGATCAGGAGGTTCTGGATCAGGATACACACATACCATT-3'，(SEQ IDNO.5)

TGEV-S-R：5'-CCGCTCGAGTATAACAGCTGTGGCATCT-3'，(SEQ ID NO.6)

PoRV-VP7-F：

5'-CCGCTCGAGGGTTCTGGATCAGGAGGTTCTGGATCAGGACCAAATGAAGCAGCTAC AG-3'，(SEQ ID NO.7)

PoRV-VP7-R：5'-GGGGTACCGCAGCAGAATCTAAGG-3'；(SEQ ID NO.8)

以PEDV-HN13株(赵振鹏.猪流行性腹泻病毒的流行病学调查及快速检测方法的初步建立[D].扬州大学,2016.)、TGEV-TZ株(王仙.猪传染性胃肠炎病毒TZ-10-2016的全基因序列分析及间接ELISA方法的建立[D].扬州大学,2018.)、PoRV-GD株(杨娟,等.一株猪轮状病毒的分离与鉴定[J].畜牧与兽医,2016,48(09):32-37.)病毒液提取的核酸为模板，利用RT-CR反应扩增分别得到PEDV-COE、TGEV-SA、PoRV-VP7的基因片段；所述PCR反应体系为：Green Taq Mix12.5μL，cDNA 2μL，Rnase Free dH₂O 9.5μL，上下游引物各1μL；PCR反应程序：95℃ 5min，95℃ 1min，61℃ 1min，72℃ 1min，共30个循环；72℃ 10min；进行琼脂糖凝胶电泳，将胶回收的产物与pGEM-T Easy载体(购自Promega公司商品目录号A1360)连接，并转化DH5α，筛选阳性质粒送往华大基因测序，测序正确的质粒进行命名并保存，命名如下：pGEM-T-COE、pGEM-T-SA、pGEM-T-VP7。

实施例2.重组pFastBacHT-COE-SA-VP7真核表达载体的构建与鉴定

(1)重组pFastBacHT-COE-SA-VP7真核表达载体的构建

取鉴定正确的pGEM-T-COE、pGEM-T-SA、pGEM-T-VP7与表达载体pFast-Bac-HTA(购自Invitrogen公司)，按1:100接种于3mL的含Amp(100μL/mL)的LB液体培养基中，37℃，225rpm，培养过夜。各取2mL的菌液按小提质粒试剂盒说明书进行，得到相应质粒保存备用，然后将pGEM-T-VP7、pFast-Bac-HTA(见图1)分别进行XhoI、KpnI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，通过T4DNA连接酶连接得到真核表达载体pFastBacHT-VP7；而后将pGEM-T-SA、pFastBacHT-VP7(见图2)分别进行EcoRI、XhoI双酶切，脂糖凝胶电泳回收目的片段，通过T4DNA连接酶连接得到真核表达载体pFastBacHT-SA-VP7(见图3)；最后将pGEM-T-COE、pFastBacHT-SA-VP7进行BamHI、EcoRI双酶切，脂糖凝胶电泳回收目的片段，通过T4DNA连接酶连接得到真核表达载体pFastBacHT-COE-SA-VP7(见图4)，筛选阳性质粒送往华大基因测序，所得序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

(2)重组pFastBacHT-COE-SA-VP7真核表达载体的鉴定

将得到的真核表达载体pFastBacHT-COE-SA-VP7进行酶切鉴定，取重组质粒分别使用BamHI、EcoRI酶切，EcoRI、XhoI酶切，XhoI、KpnI酶切，BamHI单酶切，BamHI、XhoI酶切，EcoRI、KpnI酶切，BamHI、KpnI酶切，酶切体系为，重组质粒2μl，10×Buffer 2μl，限制性内切酶每种1μl，ddH₂O补足到20μl。酶切鉴定结果见图5。

实施例3.重组杆状病毒rBacmid-COE-SA-VP7穿梭载体的构建及鉴定

(1)重组质粒的转座

取5μL的pFastBacHT-COE-SA-VP7质粒DNA加入到100μL的DH10Bac感受态细胞中，冰浴30min；42℃热击45s，再立即取出冰浴2min；加入800μL的SOC液体培养基，37℃，225rpm培养4h；然后取出培养后的菌液,用SOC液体培养基依次将培养物稀释成三个浓度，(200μL细菌培养物和800μLSOC液体培养基)：10^-1、10^-2、10^-3；稀释后4500rpm，离心5min，弃上清，然后加入200μLSOC液体培养基重悬细菌沉淀，涂布于LA-BAC平板上，于37℃培养箱中倒置培养24-48h至菌落出现。

(2)重组杆状病毒穿梭载体的提取

挑取白色克隆重新划线接种于新鲜的LA-BAC选择性平板上，37℃过夜培养，连续纯化两代，直至全部为白斑；同时选一个蓝斑作阴性对照；将阳性克隆接种到4mL含卡那霉素(50μg/mL)、四环素(10μg/mL)、庆大霉素(7μg/mL)的LB培养基，37℃，225rpm摇床，过夜振荡，同时选一个蓝斑作阴性对照；第二天取2mL菌液于新的2mL离心管中，12000rpm，1min弃上清；加300μLSoLutionⅠ(15mM Tris-HCl，PH8.0，10mM EDTA)重悬细菌；加入300μL新鲜配制的SolutionⅡ，颠倒混匀，室温作用5min；缓慢加入SoLutionⅢ(3M乙酸钾，PH5.5)，边加边轻轻混匀直到形成均一的白色沉淀，冰浴5-10min；4℃,12，000rpm离心10min，同时预先在另一个新的离心管内加入800μL的异丙醇；将上清转移到含异丙醇的离心管内，轻轻颠倒混匀，冰浴5-10min；室温，12,000rpm离心15min，弃上清；加入500μL的70％乙醇，颠倒混匀，12,000rpm离心10min；尽可能弃尽上清；放在超净台里干燥5-10min，直至酒精挥发完全；最后用30μL的灭菌的超纯水溶解；-20℃保存备用；同时设DH10Bac为阴性对照，提取方法同上。

(3)重组杆状病毒穿梭载体的鉴定

使用M13±通用引物对重组杆状病毒穿梭载体rBacmid-COE-SA-VP7进行PCR鉴定，PCR体系为LA Taq酶0.5μl，10×LA Taq Buffer 5μl，dNTP Mix(2.5mM)8μl，M13±引物F/R各2μl，cDNA 1μl，ddH₂O 31.5μl。PCR程序为94℃ 3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 3mim，30cycles，72℃ 10min，4℃∞，鉴定结果见图6。

实施例4.重组杆状病毒rBacmid-COE-SA-VP7的制备

(1)转染Sf9细胞获得原代病毒P1

转染的前一天将处于对数生长期的Sf9细胞轻轻吹下来，向含双抗(50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素)和10％的FBS的2mLGrace’完全培养基中加入1x10⁶个Sf9细胞。轻轻吹打细胞，使细胞均匀分布于6孔板上；28℃培养箱中培养24h。

取两个1.5mL离心管内加250μL Grace’培养基，然后分别在1.5mL的离心管中加入Lipofectamine^TM3000和5μg的pFastBacHT-COE-SA-VP7质粒DNA，轻轻混匀；然后将两个离心管混合均匀，室温静置15min；轻轻吸去Sf9细胞培养上清，用Grace’培养基轻轻洗涤2遍；向脂质体3000-DNA复合物中补加750μLGrace’培养基，轻轻混匀，并1mL/孔均匀滴加到Sf9细胞上，27℃孵育5h；吸去上清，加入2mL/孔的Grace’完全培养基，28℃培养72h-120h直到细胞出现明显的病变，同时设不含rBacmid-COE-SA-VP7基因的BacmidDNA和空白作对照，转染过程同上。

(2)收获并扩增重组杆状病毒

待细胞出现明显病变时，收集细胞和培养上清，4℃避光保存(也可放在-70℃长期进行保存)，即得到P1代重组病毒。

用50μLP1代病毒感染对数生长期的sf9细胞，28℃培养箱里培养5-7天，待出现明显病变时，收集细胞及培养上清，于4℃避光保存(也可放在-70℃长期进行保存)，即得到P2代重组病毒。按照上述方法进行扩增P3代病毒。

(3)重组杆状病毒的鉴定

将得到的重组病毒进行间接免疫荧光鉴定，分别以猪源PEDV、TGEV、PoRV阳性血清作为一抗，FITC标记羊抗猪抗体做二抗进行间接免疫荧光鉴定，均为阳性，鉴定结果见图7。

(4)重组蛋白免疫效力分析

将得到的重组病毒稀释至10^5.0TCID₅₀/mL，经由小鼠腹腔注射1mL，于7天、21天加强免疫，第一次免疫后，每7天采集小鼠血清。并通过接种PEDV、TGEV和PoRV的细胞进行间接免疫荧光实验，检测显示小鼠血清具有较高的效价。

本发明的重组载体pFastBacHT-COE-SA-VP7可以表达重组蛋白，小量制备蛋白免疫小鼠28d后可以检测到特异性抗体(见图8)，本发明的成果将为PEDV、TGEV、PoRV三联基因工程疫苗研究奠定基础，提供新的思路。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 猪三种致腹泻病毒中和抗原表位融合蛋白及其构建方法和应用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1557

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

atggatcctt ctagaaacct tctgagtcat gaacagccaa tttcttttgt tactttgcca 60

tcattcaatg atcattcttt tgttaatatt actgtctctg cggcttttgg tggtcatagt 120

ggtgccaacc tcattgcatc tgacactact atcaatgggt ttagttcttt ctgtgttgac 180

actagacaat ttaccattac actgttttat aacgttacaa acagttatgg ttatgtgtct 240

aagtcacagg atagtaattg ccctttcacc ttgcaatctg ttaatgatta cctgtctttt 300

agcaaatttt gtgtttcaac cagccttttg gctggtgctt gtaccataga tctttttggt 360

taccctgagt tcggtagtgg tgttaagttt acgtcccttt attttcaatt cacaaagggt 420

gagttgatta ctggcacgcc taaaccactt caaggtgtca cggacgtttc ttttatgact 480

ctggatgtgt gtaccaagta tgaattcggt tctggatcag gaggttctgg atcaggatac 540

acacatacca ttgttaacat aactattggt cttggtatga agcgtagtgg ttatggtcaa 600

cccatagcct cgacattaag taacatcaca ctaccaatgc aggatcacaa caccgatgtg 660

tactgtattc gttctgacca attttcagtt tatgttcatt ctacttgcaa aagtgtttta 720

tgggacaata tttttaagcg aaactgcacg gacgttttag atgccacagc tgttatactc 780

gagggttctg gatcaggagg ttctggatca ggaccaaatg aagcagctac agaaattgca 840

gatacaaaat ggacagaaac attgtcgcag ttgtttttaa caaaaggatg gccaacaggg 900

tcagtttatt ttaaaggata tgcagatatt gcgtcatttt ctgtagaacc gcagttatac 960

tgcgactata atattgtact aatgaaatat gatggaaatt tacagttaga catgtctgaa 1020

ttggctgatt taatattgaa tgaatggcta tgtaatccaa tggatataat gctatattat 1080

tatcagcaaa cagatgaagc taataaatgg atatcaatgg gtacatcatg tacgattaaa 1140

gtatgtcctc taaatacgca gactctcggg ataggatgtt cgactacaga cataaattca 1200

tttgaaacag tggccaatgc agagaaatta gctataactg atgttgtcga tggagtcaat 1260

cataaattag acgtaacaac gagtacatgt actataagaa attgtaaaaa acttggacca 1320

agagaaaatg tcgctgtaat tcaggtagga ggtccaaaca tactcgacat aacagctgat 1380

ccaacaactg caccacaaac tgaaagaatg atgcgtataa attggaagag atggtggcaa 1440

gtcttttata caatagttga ttatgtcaat caaattgtac aagtcatgtc caagcgatca 1500

cgctccttag attctgctgc ggtaccaagc ttgtcgagaa gtactagagg atcataa 1557

<210> 2

<211> 518

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

Met Asp Pro Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu Gln Pro Ile Ser Phe

1 5 10 15

Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val Asn Ile Thr Val

20 25 30

Ser Ala Ala Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn Leu Ile Ala Ser Asp

35 40 45

Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val Asp Thr Arg Gln Phe

50 55 60

Thr Ile Thr Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser Tyr Gly Tyr Val Ser

65 70 75 80

Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln Ser Val Asn Asp

85 90 95

Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser Leu Leu Ala Gly

100 105 110

Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Ser Gly Val

115 120 125

Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly Glu Leu Ile Thr

130 135 140

Gly Thr Pro Lys Pro Leu Gln Gly Val Thr Asp Val Ser Phe Met Thr

145 150 155 160

Leu Asp Val Cys Thr Lys Tyr Glu Phe Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser

165 170 175

Gly Ser Gly Tyr Thr His Thr Ile Val Asn Ile Thr Ile Gly Leu Gly

180 185 190

Met Lys Arg Ser Gly Tyr Gly Gln Pro Ile Ala Ser Thr Leu Ser Asn

195 200 205

Ile Thr Leu Pro Met Gln Asp His Asn Thr Asp Val Tyr Cys Ile Arg

210 215 220

Ser Asp Gln Phe Ser Val Tyr Val His Ser Thr Cys Lys Ser Val Leu

225 230 235 240

Trp Asp Asn Ile Phe Lys Arg Asn Cys Thr Asp Val Leu Asp Ala Thr

245 250 255

Ala Val Ile Leu Glu Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro

260 265 270

Asn Glu Ala Ala Thr Glu Ile Ala Asp Thr Lys Trp Thr Glu Thr Leu

275 280 285

Ser Gln Leu Phe Leu Thr Lys Gly Trp Pro Thr Gly Ser Val Tyr Phe

290 295 300

Lys Gly Tyr Ala Asp Ile Ala Ser Phe Ser Val Glu Pro Gln Leu Tyr

305 310 315 320

Cys Asp Tyr Asn Ile Val Leu Met Lys Tyr Asp Gly Asn Leu Gln Leu

325 330 335

Asp Met Ser Glu Leu Ala Asp Leu Ile Leu Asn Glu Trp Leu Cys Asn

340 345 350

Pro Met Asp Ile Met Leu Tyr Tyr Tyr Gln Gln Thr Asp Glu Ala Asn

355 360 365

Lys Trp Ile Ser Met Gly Thr Ser Cys Thr Ile Lys Val Cys Pro Leu

370 375 380

Asn Thr Gln Thr Leu Gly Ile Gly Cys Ser Thr Thr Asp Ile Asn Ser

385 390 395 400

Phe Glu Thr Val Ala Asn Ala Glu Lys Leu Ala Ile Thr Asp Val Val

405 410 415

Asp Gly Val Asn His Lys Leu Asp Val Thr Thr Ser Thr Cys Thr Ile

420 425 430

Arg Asn Cys Lys Lys Leu Gly Pro Arg Glu Asn Val Ala Val Ile Gln

435 440 445

Val Gly Gly Pro Asn Ile Leu Asp Ile Thr Ala Asp Pro Thr Thr Ala

450 455 460

Pro Gln Thr Glu Arg Met Met Arg Ile Asn Trp Lys Arg Trp Trp Gln

465 470 475 480

Val Phe Tyr Thr Ile Val Asp Tyr Val Asn Gln Ile Val Gln Val Met

485 490 495

Ser Lys Arg Ser Arg Ser Leu Asp Ser Ala Ala Val Pro Ser Leu Ser

500 505 510

Arg Ser Thr Arg Gly Ser

515

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 3

cgggatcctt ctagaaacct tctgagtc 28

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 4

cggaattcat acttggtaca cacat 25

<210> 5

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 5

cggaattcgg ttctggatca ggaggttctg gatcaggata cacacatacc att 53

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 6

ccgctcgagt ataacagctg tggcatct 28

<210> 7

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 7

ccgctcgagg gttctggatc aggaggttct ggatcaggac caaatgaagc agctacag 58

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 8

ggggtaccgc agcagaatct aagg 24

Claims

1.猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV的中和抗原表位融合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位融合蛋白的制备方法，包括步骤如下：

1)获得含有PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位融合蛋白重组基因片段：

利用PCR方法设计3对引物如下：

PEDV-COE-F：5'-CGGGATCCTTCTAGAAACCTTCTGAGTC-3'，

PEDV-COE-R：5'-CGGAATTCATACTTGGTACACACAT-3'，

TGEV-S-F：5'-CGGAATTCGGTTCTGGATCAGGAGGTTCTGGATCAGGATACACACATAC

CATT-3'，

TGEV-S-R：5'-CCGCTCGAGTATAACAGCTGTGGCATCT-3'，

PoRV-VP7-F：5'-CCGCTCGAGGGTTCTGGATCAGGAGGTTCTGGATCAGGACCAAATGA

AGCAGCTACAG-3'，

PoRV-VP7-R：5'-GGGGTACCGCAGCAGAATCTAAGG-3'；

并利用RT-PCR反应扩增分别得到PEDV-COE、TGEV-SA、PoRV-VP7的基因片段；反应体系为：Green Taq Mix 12.5μL，cDNA 2μL，Rnase Free dH2O 9.5μL，上下游引物各1μL；PCR反应程序：95℃5min，95℃1min，61℃1min，72℃1min，共30个循环；72℃10min；

2)获得含有PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位融合蛋白基因的重组表达质粒pFastBacHT-COE-SA-VP7：将上述编码PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位融合蛋白的基因片段PEDV-COE、TGEV-SA、PoRV-VP7连接至pFastBac-HTA载体上，得到重组表达载体pFastBacHT-COE-SA-VP7；

3)重组杆状病毒穿梭载体的构建：

将重组表达质粒pFastBacHT-COE-SA-VP7转座DH10Bac感受态细胞中，得到阳性转座子经菌液PCR和基因测序鉴定为阳性菌落即为能表达PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位串联基因融合蛋白的重组杆状病毒穿梭载体；

4)重组杆状病毒rBac-COE-SA-VP7的制备

转染Sf9细胞获得重组病毒P1，转染的前一天将处于对数生长期的Sf9细胞轻轻吹下来，向含50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的双抗及10％的FBS的2mLGrace完全培养基中加入1x10⁶个Sf9细胞;轻轻吹打细胞，使细胞均匀分布于6孔板上；28℃培养箱中培养24h；取两个1.5mL离心管内加250μL Grace培养基，然后分别在1.5mL的离心管中加入LipofectamineTM3000和5μg的pFastBac-COE-SA-VP7质粒DNA，轻轻混匀；然后将两个离心管混合均匀，室温静置15min；轻轻吸去Sf9细胞培养上清，用Grace培养基轻轻洗涤2遍；向脂质体3000-DNA复合物中补加750μLGrace培养基，轻轻混匀，并1mL/孔均匀滴加到Sf9细胞上，27℃孵育5h；吸去上清，加入2mL/孔的Grace完全培养基，28℃培养72h-120h直到细胞出现明显的病变，同时设不含rBac-COE-SA-VP7基因的BacmidDNA和空白作对照，转染过程同上，收获即为重组杆状病毒rBac-COE-SA-VP7。

2.一种编码权利要求1所述的猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位融合蛋白的基因，其特征在于：序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV的中和抗原表位融合蛋白的重组杆状病毒表达载体，其特征在于，含有序列如SEQ ID NO.1所示中和抗原表位融合蛋白的基因抗原表位融合蛋白的基因。

4.权利要求1所述的猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位融合蛋白在制备预防由猪流行性腹泻病毒引起的仔猪腹泻病药物中的应用。