CN114891121B

CN114891121B - 一种抗pedv和prv的二联病毒样颗粒疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN114891121B
Application number: CN202210513835.1A
Authority: CN
Inventors: 贺笋; 闫鹏先; 王清华; 肖升东; 杜久斌; 饶婷婷; 潘毅平
Original assignee: Tiankang Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Tiankang Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2022-05-11
Filing date: 2022-05-11
Publication date: 2024-01-19
Anticipated expiration: 2042-05-11
Also published as: CN114891121A

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种抗PEDV和PRV的二联病毒样颗粒疫苗及其制备方法。本发明的病毒样颗粒含有猪轮状病毒的VP6蛋白和VP2蛋白，且所述VP6蛋白的loop区连接有猪流行性腹泻病毒的RBD。本发明所提供的二联病毒样颗粒及疫苗对猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒均具有很好的免疫原性，能诱导机体产生强效免疫应答，并形成较强的免疫保护。其不仅有利于在相关疾病的防控中节省劳力，提高工作效率，而且还解决了之前弱毒疫苗和灭活疫苗所具有的制备工艺复杂、有效性不佳、容易散毒等问题。

Description

一种抗PEDV和PRV的二联病毒样颗粒疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种抗PEDV和PRV的二联病毒样颗粒疫苗及其制备方法。

背景技术

目前市场上用于预防、控制猪流行性腹泻的疫苗基本都是传统猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）灭活疫苗和弱毒疫苗。但单价或多联灭活疫苗不能刺激动物机体产生足够量的sIgA抗体，保护效果不佳，且制苗成本也比较昂贵。同时，灭活疫苗在猪体内产生免疫力时间长达二周，需要提前接种，以保证预防效果。弱毒疫苗虽然可引起黏膜免疫，但由于存在着成本高、易返祖、有潜在毒力增强风险等缺陷，限制了其在生产中的应用。

发明内容

本发明利用猪轮状病毒( porcinerotavims，PRV)的病毒样颗粒（virus-likeparticle，VLP）作为核心VLP骨架，挑选出骨架表面不影响VLP结构的区域进行改造，并利用基因工程的手段将猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）的受体结合结构域通过蛋白质超级胶水的技术偶联到VLP表面待改造区，研制抗PEDV和PRV的二价VLP疫苗，能诱导机体产生强效的免疫应答，刺激机体产生足够量的抗猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的保护性抗体。

具体而言，本发明首先提供了一种病毒样颗粒，其含有猪轮状病毒的VP6蛋白，且所述VP6蛋白的loop区连接有猪流行性腹泻病毒的RBD。

作为优选，所述VP6蛋白的loop区为loop1、loop3或loop4；

其中，所述loop1为VP6蛋白的第169-176位，所述loop3为VP6蛋白的第240-245位，所述loop4为VP6蛋白的第296-301位。

更优选为loop4时，VP6蛋白嵌合spytag后的表达量和可溶性更佳。

作为优选，所述VP6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

作为本发明的一个实施方式，所述loop1的氨基酸序列为SQPAHDNL，所述loop3的氨基酸序列为SAGGTT，所述loop4的氨基酸序列为RPPNMT。

作为本发明的一个实施方式，所述猪流行性腹泻病毒的RBD的氨基酸序列如SEQID No.3所示。

作为本发明的一个实施方式，所述的病毒样颗粒还含有猪轮状病毒的VP2蛋白。

作为本发明的一个实施方式，所述VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

作为本发明的一个实施方式，所述的病毒样颗粒含有VP6-spytag蛋白、VP2蛋白和spycatcher-RBD蛋白。

其中，所述VP6-spytag蛋白通过在猪轮状病毒的VP6蛋白的loop区嵌合spytag而得到，所述spycatcher-RBD蛋白通过将所述猪流行性腹泻病毒的RBD连接至spycatcher上而得到。

在本发明的一种优选实施方式中，所述spycatcher的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种优选实施方式中，所述spytag的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

作为优选方案，所述VP6-spytag蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

作为优选方案，所述spycatcher-RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本领域人员可对上述方案进行组合，得到有关本发明病毒样颗粒的较优实施例。

作为本发明的一种实施方式，所述病毒样颗粒含有VP6-spytag蛋白、VP2蛋白和spycatcher-RBD蛋白；

其中，所述VP6-spytag蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述spycatcher-RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步的，本发明还提供一种核酸，其编码所述的病毒样颗粒中所含有的蛋白。

作为本发明的一个实施方式，编码所述VP6-spytag蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。

作为本发明的一个实施方式，编码所述spycatcher-RBD蛋白的核苷酸序列如SEQID NO.5所示。

本发明进一步提供一种生物材料，其为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌，其包含所述的核酸。

本发明进一步提供一种药物组合物，其包含：（a）所述的病毒样颗粒和/或所述的核酸和/或所述的生物材料；以及（b）药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明进一步提供一种疫苗组合物，其包含：（a）所述的病毒样颗粒和/或所述的核酸和/或所述的生物材料；以及（b）药学上可接受的载体或赋形剂。

在具体实施时，所述的疫苗组合物中还包含佐剂。

本发明进一步提供所述的病毒样颗粒的制备方法，其步骤包括：

将所述猪轮状病毒的VP6蛋白的loop区与猪流行性腹泻病毒的RBD连接。

作为优选，所述制备方法的步骤包括：

将所述VP6-spytag蛋白与所述VP2蛋白组装成双层VLP，而后与所述spycatcher-RBD蛋白偶联。

作为一种优选的实施方案，将spycatcher-RBD和所述双层VLP蛋白按照1：（1~3）的摩尔比混匀后于进行孵育偶联；更优选其摩尔比为1：2。

作为本发明的一个实施方式，其步骤还包括：在宿主中分别表达VP6蛋白、VP2蛋白、RBD，并回收表达产物。

在具体实施时，所述的宿主包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、植物或哺乳动物细胞。

优选地，所述的VP2和VP6-spytag蛋白的表达宿主为毕赤酵母。

优选地，所述的spycatcher-RBD蛋白的表达宿主为ExpiCHO-S细胞或CHO-S细胞。

上述宿主在本发明中均能进行高效稳定持续的蛋白表达。

本发明还提供所述的病毒样颗粒和/或所述的核酸和/或所述的生物材料在治疗或预防以下至少一种疾病中的应用：

（1）由猪流行性腹泻病毒感染所引起的疾病；

（2）由猪轮状病毒感染所引起的疾病。

本发明还提供所述的病毒样颗粒和/或所述的核酸和/或所述的生物材料在制备药物中的应用，所述药物被用于以下至少一方面：

（1）治疗或预防由猪流行性腹泻病毒感染所引起的疾病；

（2）治疗或预防由猪轮状病毒感染所引起的疾病。

本发明的有益效果至少在于：

本发明所提供的二联病毒样颗粒及疫苗同时对猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒均具有很好的免疫原性，能诱导机体产生强效免疫应答，并形成较强的免疫保护，免疫生效时间短。不仅在相关疾病的防控中省时省力，提高工作效率，而且还解决了弱毒疫苗制备工艺复杂、生产成本高、有散毒风险的问题，也克服了灭活疫苗免疫生效时间长、免疫原性差等缺陷，具有成本低、生产简单、存储方便，且安全性好、保护效果好等优势。

附图说明

图1为本发明实施例1中嵌合VP6-spytag蛋白与VP2蛋白共转后SDS-PAGE图。

图2为本发明实施例1中spycatcher-RBD融合蛋白SDS-PAGE图。

图3为本发明实施例1中spycatcher-RBD融合蛋白与嵌合了spytag的双层VLP偶联后蛋白SDS-PAGE图。

图4为本发明实施例1中最终的偶联RBD的轮状病毒双层VLP示意图。

图5为本发明实施例3中轮状病毒VP6蛋白表面不同loop区嵌合spytag后表达结果；其中，泳道3~6为本发明实验结果，具体包括：3、RV-L1-ST裂解上清；4、RV-L1-ST裂解沉淀；5、RV-L3-ST裂解上清；6、RV-L3-ST裂解沉淀；各泳道均为10μL样品的结果。

图6为本发明实施例3中轮状病毒VP6蛋白表面不同loop区嵌合spytag后表达结果；其中，泳道7~10为本发明实验结果，具体包括：7、RV-L1-ST上清；8、RV-L1-ST沉淀；9、RV-L4-ST上清；10、RV-L4-ST沉淀；各泳道均为10μL样品的结果。

图7为不同RBD蛋白的表达和纯化结果；其中，1、A分子培养基上清；2、A分子Ni柱穿透；3、A分子Ni柱样品-reduced；4、A分子Ni柱样品-Nonreduced；5、B分子培养基上清；6、B分子Ni柱穿透；7、B分子Ni柱样品-reduced；8、B分子Ni柱样品-Nonreduced。

图8为不同RBD蛋白纯化后的HPLC图；其中，A图为A分子的HPLC图；B图为B分子的HPLC图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1

本实施例提供一种病毒样颗粒，其制备过程如下：

（1）将合成的VP6-spytag融合蛋白基因序列（spytag连接于VP6蛋白的loop3区，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示）与VP2基因序列（氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示）分别构建入载体，然后线性化后共同电转毕赤酵母感受态细胞，对此二蛋白进行表达（图1）；

（2）在细胞裂解后，对VP2及VP6-spytag蛋白进行纯化、颗粒自组装和定量，并利用电镜鉴定组装效果；

（3）将合成的spycatcher-RBD融合蛋白的基因序列（氨基选序列如SEQ ID NO.4所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示）构建入载体，然后转入ExpiCHO细胞进行瞬转表达；

（4）对表达出的spycatcher-RBD蛋白进行纯化和定量（图2）；

（5）将spycatcher-RBD和VP2-VP6-spytag蛋白分别按照1：1、1：2、1：3的摩尔比混匀后于25℃下在缓冲液（300mmNaCl，50mmtris，pH8.0）中孵育偶联8h以上（图3）；

（6）将步骤（5）中偶联好的的病毒样颗粒再次进行纯化，去除掉未结合的蛋白，检测偶联效果和效率，结果表明spycatcher-RBD和VP2-VP6-spytag蛋白摩尔比为1:2时，偶联效率最高，进一步通过电镜鉴定发现原有VLP结构完整，未被破坏（图4）。

实施例2

将实施例1中最优方案制备得到的病毒样颗粒分别按照0.5ug/头份、5ug/头份，10ug/头份和30ug/头份的剂量与佐剂混合后得到PRV-PEDV疫苗，进行疫苗效力检测，具体方法及结果如下：

1、抗体检测

使用实施例1中的疫苗免疫50头仔猪，一次免疫前、二次免后14日、21日和28日采血，分离血清，按PEDV IgG抗体检测试剂盒说明书进行PEDV ELISA抗体检测，使用猪轮状病毒抗体检测试剂盒进行猪轮状病毒ELISA抗体检测，计算抗体S/P几何平均值，检测结果见表1~2。

表1 实验仔猪PEDV抗体检测情况

备注：S/P≥0.5为抗体阳性。

表2 实验仔猪轮状病毒抗体检测情况

在表2中，仔猪二免后14日，5ug/头剂量组所有仔猪抗体水平均转阳(S/P值>0.3)。10ug/头剂量组和30ug/头剂量组所有仔猪，二免后14日抗体水平持续升高，明显优于其他低剂量组。

由上述结果可知，随着疫苗中抗原含量的增加，对应抗体效价相应的升高，说明抗原免疫仔猪后能够产生良好的免疫原性。

2、免后观察

仔猪免疫后体重与对照组仔猪体重增长无明显差异，也无观察到发热、厌食等现象，表明本发明的疫苗安全，具体结果见表3。

表3 疫苗免疫后安全性试验临床观察情况

实施例3

针对VP6蛋白的不同loop区的选择进行大量实验，其中部分结果如下：

按照实施例1中的步骤将RBD序列分别连接于VP6蛋白的loop1（SEQ ID NO.11：SQPAHDNL）、loop3（SEQ ID NO.12：SAGGTT）和loop4（SEQ ID NO.13：RPPNMT）区，以合成RV-L1-ST、RV-L3-ST和RV-L4-ST融合蛋白的基因序列，而后将其分别构建入载体，而后转入毕赤酵母感受态细胞，对其蛋白进行表达。在细胞裂解后，通过SDS-PAGE对细胞裂解后的上清和沉淀进行检测，结果见图5~图6。

由结果可知，从表达量结果来看，RV-L3-ST≈RV-L4-ST>RV-L1-ST，从可溶性结果来看，RV-L4-ST> RV-L1-ST> RV-L3-ST。可见，将spytag-RBD连接于VP6蛋白的loop3、loop4区均能获得较高表达量，其中将spytag-RBD连接于VP6蛋白的loop4区域能够获得可溶性好、更利于后续纯化收集的蛋白。

实施例4

针对PEDV S的RBD序列，发明人经过大量涉及和验证进行确定，以下列举A序列（本发明的RBD序列，具体氨基酸序列如SEQ ID No.3所示）和B序列（氨基酸序列如SEQ IDNo.10所示）进行表达、纯化结果验证，其中，A序列和B序列的具体信息见表4。

表4

将合成的RBD蛋白的基因序列构建入载体，然后转入ExpiCHO细胞进行瞬转表达，并对表达出的RBD蛋白进行纯化和定量。其间，分别收集A分子和B分子的培养基上清样品、纯化Ni柱穿透样品、Ni柱样品以及Ni柱样品Non-reduced，并进行SDS-PAGE检测，结果见图7。同时，通过HPLC对纯化得到的A分子和B分子进行检测，结果见图8。图中结果表明本发明中的A序列在表达量、纯化过程、纯化结果上都要优于B序列。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 天康制药（苏州）有限公司

<120> 一种抗PEDV和PRV的二联病毒样颗粒疫苗及其制备方法

<130> KHP211124832.4

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Ala Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln

1 5 10 15

Ser Gly Asp Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe

20 25 30

Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu

35 40 45

Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly

50 55 60

Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu

65 70 75 80

Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr

85 90 95

Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly

100 105 110

Asp Ala His Ile

115

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys

1 5 10

<210> 3

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu Gln Pro Ser Ser Phe Val Thr Leu

1 5 10 15

Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val Asn Ile Thr Val Ser Ala Ser

20 25 30

Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn Leu Ile Ala Ser Asp Thr Thr Ile

35 40 45

Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val Asp Thr Arg Gln Phe Thr Ile Ser

50 55 60

Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser Tyr Gly Tyr Val Ser Asn Ser Gln

65 70 75 80

Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln Ser Val Asn Asp Tyr Leu Ser

85 90 95

Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser Leu Leu Ala Ser Ala Cys Thr

100 105 110

Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Ser Gly Val Lys Phe Ala

115 120 125

Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly Glu Leu Ile Thr Gly Thr Pro

130 135 140

Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp Val Ser Phe Met Thr Leu Asp Val

145 150 155 160

Cys Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr Gly Phe Lys Gly Glu Gly Ile Ile Thr

165 170 175

Leu Thr Asn Ser Ser Phe Leu Ala Gly Val Tyr Tyr Thr Ser Asp Ser

180 185 190

Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn Ile Thr Ser Gly Ala Val Tyr Ser

195 200 205

Val Thr Pro Cys Ser Phe

210

<210> 4

<211> 369

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Lys Ser Leu Thr Tyr Phe Trp Leu Phe Leu Pro Val Leu Ser Thr

1 5 10 15

Phe Ser Gly Ala Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln

20 25 30

Gly Gln Ser Gly Asp Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile

35 40 45

Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr

50 55 60

Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser

65 70 75 80

Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe

85 90 95

Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr

100 105 110

Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr

115 120 125

Lys Gly Asp Ala His Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu Gln Pro Ser

145 150 155 160

Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val Asn Ile

165 170 175

Thr Val Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn Leu Ile Ala

180 185 190

Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val Asp Thr Arg

195 200 205

Gln Phe Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser Tyr Gly Tyr

210 215 220

Val Ser Asn Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln Ser Val

225 230 235 240

Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser Leu Leu

245 250 255

Ala Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Ser

260 265 270

Gly Val Lys Phe Ala Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly Glu Leu

275 280 285

Ile Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp Val Ser Phe

290 295 300

Met Thr Leu Asp Val Cys Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr Gly Phe Lys Gly

305 310 315 320

Glu Gly Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Phe Leu Ala Gly Val Tyr

325 330 335

Tyr Thr Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn Ile Thr Ser

340 345 350

Gly Ala Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe His His His His His

355 360 365

His

<210> 5

<211> 1107

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaagagct tgacttactt ttggttgttc ctgcccgtcc tgtccacgtt tagcggcgcg 60

atggttgaca ctctttctgg tttgtccagc gagcagggac agagcggtga catgactatt 120

gaagaggatt cagctactca catcaagttc tccaagagag acgaagacgg taaggaactg 180

gctggcgcaa ctatggaatt gagggactct tccggtaaaa cgatctctac gtggatctcc 240

gacgggcaag tgaaagattt ctacttgtat ccgggcaagt acacgtttgt tgagacagcg 300

gcgcccgacg ggtatgaggt agccaccgcc attacattca cagtaaatga gcaggggcaa 360

gtgactgtta acgggaaggc aaccaaagga gatgcgcaca ttggaggcgg aggctccgga 420

ggcggcggtt ctggaggagg tggttctagc aggaacctcc tttcacacga gcaaccgtct 480

agttttgtca cgctcccttc ctttaatgat cactctttcg tcaacataac tgtgagtgct 540

tcttttgggg ggcactcagg ggctaatctt attgctagcg atacaacaat aaacggcttt 600

agcagctttt gtgtagatac gagacagttt acgatcagct tgttttacaa cgttactaat 660

agttacggct acgtcagcaa ctctcaagac agcaactgcc ccttcacatt gcaaagtgtc 720

aatgattatc ttagcttctc caaattttgc gtgagcactt cacttctggc gagtgcctgt 780

actatcgacc tctttggata cccggagttc gggtccggtg tgaaattcgc ctccctttac 840

tttcaattta cgaaaggtga actcatcaca gggactccaa agccgttgga gggggtaacg 900

gacgtctctt tcatgacgct cgacgtgtgt acgaagtata ccatctatgg attcaagggt 960

gaggggataa taacgcttac taattccagt tttctcgctg gcgtatacta cacttccgac 1020

tcaggacagt tgctcgcctt taaaaacata acaagcggag ccgtctactc tgttacacct 1080

tgctcattcc accatcatca ccatcac 1107

<210> 6

<211> 397

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Glu Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp

1 5 10 15

Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln

20 25 30

Gln Phe Asn Gln Met Ile Val Thr Met Asn Gly Asn Asp Phe Gln Thr

35 40 45

Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Ile Arg Asn Trp Thr Phe Asp Phe Gly

50 55 60

Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Asn

65 70 75 80

Ala Arg Thr Thr Ile Glu Tyr Phe Ile Asp Phe Ile Asp Asn Val Cys

85 90 95

Met Asp Glu Ile Ala Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln

100 105 110

Ser Glu Ala Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn

115 120 125

Phe Asp Asn Ser Ser Asp Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg

130 135 140

Arg Gln Arg Thr Gly Phe Val Phe His Lys Pro Asn Ile Leu Pro Tyr

145 150 155 160

Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Asp Asn Leu

165 170 175

Met Gly Thr Met Trp Ile Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly

180 185 190

Phe Asp Tyr Ser Cys Ala Phe Asn Ala Pro Ala Asn Ile Gln Gln Phe

195 200 205

Glu His Val Val Pro Leu Arg Arg Ala Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr

210 215 220

Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Gly Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser

225 230 235 240

Ala Gly Gly Thr Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro

245 250 255

Ser Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr

260 265 270

Tyr Gln Ala Arg Phe Gly Thr Ile Ile Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile

275 280 285

Arg Leu Ser Phe Gln Leu Val Arg Pro Pro Asn Met Thr Pro Ala Val

290 295 300

Ala Asn Leu Phe Pro Gln Ala Pro Pro Phe Ile Phe His Ala Thr Val

305 310 315 320

Gly Leu Thr Leu Arg Thr Glu Ser Ala Val Cys Glu Ser Val Leu Ala

325 330 335

Asp Ala Ser Glu Thr Leu Leu Ala Asn Val Thr Ala Val Arg Gln Glu

340 345 350

Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr

355 360 365

Glu Leu Val Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg

370 375 380

Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Ile Lys

385 390 395

<210> 7

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Glu Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp

1 5 10 15

Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln

20 25 30

Gln Phe Asn Gln Met Ile Val Thr Met Asn Gly Asn Asp Phe Gln Thr

35 40 45

Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Ile Arg Asn Trp Thr Phe Asp Phe Gly

50 55 60

Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Asn

65 70 75 80

Ala Arg Thr Thr Ile Glu Tyr Phe Ile Asp Phe Ile Asp Asn Val Cys

85 90 95

Met Asp Glu Ile Ala Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln

100 105 110

Ser Glu Ala Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn

115 120 125

Phe Asp Asn Ser Ser Asp Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg

130 135 140

Arg Gln Arg Thr Gly Phe Val Phe His Lys Pro Asn Ile Leu Pro Tyr

145 150 155 160

Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Asp Asn Leu

165 170 175

Met Gly Thr Met Trp Ile Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly

180 185 190

Phe Asp Tyr Ser Cys Ala Phe Asn Ala Pro Ala Asn Ile Gln Gln Phe

195 200 205

Glu His Val Val Pro Leu Arg Arg Ala Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr

210 215 220

Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Gly Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser

225 230 235 240

Ala Gly Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly

245 250 255

Thr Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Ser Asn Val

260 265 270

Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala

275 280 285

Arg Phe Gly Thr Ile Ile Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser

290 295 300

Phe Gln Leu Val Arg Pro Pro Asn Met Thr Pro Ala Val Ala Asn Leu

305 310 315 320

Phe Pro Gln Ala Pro Pro Phe Ile Phe His Ala Thr Val Gly Leu Thr

325 330 335

Leu Arg Thr Glu Ser Ala Val Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser

340 345 350

Glu Thr Leu Leu Ala Asn Val Thr Ala Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile

355 360 365

Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Glu Leu Val

370 375 380

Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr

385 390 395 400

Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Ile Lys

405 410

<210> 8

<211> 1230

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggaggtat tgtattcctt gtctaaaaca ttgaaggacg cacgtgacaa aatagtggaa 60

ggaacgttgt actctaatgt gtcagacttg atacaacagt tcaatcagat gatcgtaacg 120

atgaacggca acgatttcca gacgggtggt atcggcaatc tacccatacg taattggacg 180

ttcgatttcg gactgctggg tactaccctg ttaaacctag acgcaaacta cgtggagaac 240

gctaggacca ccatcgagta ttttatagac tttatcgaca acgtctgcat ggacgagatc 300

gccagggaat cacagcgtaa cggtattgca ccccagagtg aagcactgag aaagctgagt 360

ggtattaagt tcaaaaggat caatttcgac aactccagtg actatattga aaattggaac 420

ctacaaaata gaaggcaaag gactggattc gtatttcaca aaccaaacat actaccatac 480

agtgcctcat ttaccttaaa cagatcccaa ccagctcacg acaacctgat gggcacaatg 540

tggattaacg caggctctga gattcaagtg gccggattcg attactcctg cgccttcaat 600

gctcctgcaa atattcagca atttgagcac gtagtgccac tgcgtcgtgc tctgaccact 660

gccactatta cgctactgcc tgatgctgag aggttcggtt tccctagagt cattaattcc 720

gccggagctc acatcgtaat ggttgacgca tacaagccaa caaaaggcac aactacgtgg 780

tatttcaatc cagtaattct gagaccatct aacgtagaag tagagtttct acttaacggt 840

caaatcatca atacttatca ggccaggttt ggaaccatta ttgcccgtaa tttcgacaca 900

attagactga gtttccaatt ggttagaccc ccaaacatga cgccagctgt cgctaacttg 960

tttccacaag cacctccctt catattccat gccacggtgg gactaaccct acgtacggag 1020

tcagcagtct gtgaatcagt cttagcagat gcttccgaga cattactagc aaatgtcaca 1080

gcagttcgtc aagagtacgc catcccagta ggacccgtct ttcctcctgg catgaactgg 1140

acagaactag tcacgaacta ctctcctagt agggaggata acctgcaaag agtcttcact 1200

gttgcatcca ttcgttccat gcttattaaa 1230

<210> 9

<211> 890

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Ala Tyr Arg Lys Arg Gly Ala Lys Arg Glu Asn Leu Pro Gln Gln

1 5 10 15

Asn Glu Arg Leu Gln Glu Lys Glu Val Glu Lys Asn Ile Asp Ala Asn

20 25 30

Met Glu Ser Lys Ala Asn Asn Lys Lys Gln Gln Leu Ser Asp Lys Val

35 40 45

Leu Ser Gln Lys Glu Glu Ile Thr Thr Asp Ala Gln Asp Asp Val Lys

50 55 60

Met Thr Asp Glu Val Lys Lys Ser Ser Lys Glu Glu Ser Lys Gln Leu

65 70 75 80

Leu Glu Ile Leu Lys Thr Lys Glu Asp His Gln Lys Glu Ile Gln Tyr

85 90 95

Glu Ile Leu Gln Lys Thr Ile Pro Thr Phe Glu Pro Lys Glu Ser Ile

100 105 110

Leu Lys Lys Leu Glu Asp Ile Lys Pro Glu Gln Ala Lys Lys Gln Thr

115 120 125

Lys Leu Phe Arg Ile Phe Glu Pro Lys Gln Leu Pro Ile Tyr Arg Ala

130 135 140

Asn Gly Glu Arg Glu Leu Arg Asn Arg Trp Tyr Trp Lys Leu Lys Arg

145 150 155 160

Asp Thr Leu Pro Asp Gly Asp Tyr Asp Val Arg Glu Tyr Phe Leu Asn

165 170 175

Leu Tyr Asp Gln Ile Leu Ile Glu Met Pro Asp Tyr Leu Leu Leu Lys

180 185 190

Asp Met Ala Val Glu Asn Lys Asn Ser Arg Asp Ala Gly Lys Val Val

195 200 205

Asp Ser Glu Thr Ala Ser Ile Cys Asp Ala Ile Phe Gln Asp Glu Glu

210 215 220

Thr Glu Gly Val Ile Arg Arg Phe Ile Ala Asp Met Arg Gln Gln Val

225 230 235 240

Gln Ala Asp Arg Asn Val Val Asn Tyr Pro Ser Ile Leu His Pro Ile

245 250 255

Asp His Ala Phe Asn Glu Cys Phe Leu Asn His Gln Leu Val Glu Pro

260 265 270

Leu Asn Asn Glu Ile Ile Phe Asn Tyr Ile Pro Glu Arg Ile Arg Asn

275 280 285

Asp Val Asn Tyr Ile Leu Asn Met Asp Met Asn Leu Pro Ser Thr Ala

290 295 300

Arg Tyr Ile Arg Pro Asn Leu Leu Gln Asp Arg Leu Ser Leu His Asp

305 310 315 320

Asn Phe Glu Ser Leu Trp Asp Thr Ile Thr Thr Ser Asn Tyr Ile Leu

325 330 335

Ala Arg Ser Val Val Pro Asp Leu Lys Glu Lys Glu Leu Val Ser Thr

340 345 350

Glu Ala Gln Ile Gln Lys Met Ser Gln Asp Leu Gln Leu Glu Ala Leu

355 360 365

Thr Ile Gln Ser Glu Thr Gln Phe Leu Ala Gly Ile Asn Ser Gln Ala

370 375 380

Ala Asn Asp Cys Phe Lys Thr Leu Ile Ala Ala Met Leu Ser Gln Arg

385 390 395 400

Thr Met Ser Met Glu Phe Val Thr Thr Asn Tyr Met Ser Leu Ile Ser

405 410 415

Gly Met Trp Leu Leu Thr Val Ile Pro Asn Asp Met Phe Leu Arg Glu

420 425 430

Ser Leu Val Ala Cys Glu Leu Ala Ile Ile Asn Thr Ile Val Tyr Pro

435 440 445

Ala Phe Gly Met Gln Arg Met His Tyr Arg Asn Gly Asp Pro Gln Thr

450 455 460

Pro Phe Gln Ile Ala Glu Gln Gln Ile Gln Asn Phe Gln Val Ala Asn

465 470 475 480

Trp Leu His Phe Ile Asn Asn Asn Arg Phe Arg Gln Val Val Ile Asp

485 490 495

Gly Val Leu Asn Gln Thr Leu Asn Asp Asn Ile Arg Asn Gly Gln Val

500 505 510

Ile Asn Gln Leu Met Glu Ala Leu Met Gln Leu Ser Arg Gln Gln Phe

515 520 525

Pro Thr Met Pro Val Asp Tyr Lys Arg Ser Ile Gln Arg Gly Ile Leu

530 535 540

Leu Leu Ser Asn Arg Leu Gly Gln Leu Val Asp Leu Thr Arg Leu Leu

545 550 555 560

Ser Tyr Asn Tyr Glu Thr Leu Met Ala Cys Ile Thr Met Asn Met Gln

565 570 575

His Val Gln Thr Leu Thr Thr Glu Lys Leu Gln Leu Thr Ser Val Thr

580 585 590

Ser Leu Cys Met Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Ile Pro Ser Pro Gln

595 600 605

Thr Leu Phe His Tyr Tyr Asn Val Asn Val Asn Phe His Ser Asn Tyr

610 615 620

Asn Glu Arg Ile Asn Asp Ala Val Ala Ile Ile Thr Ala Ala Asn Arg

625 630 635 640

Leu Asn Leu Tyr Gln Lys Lys Met Lys Ser Ile Val Glu Glu Phe Leu

645 650 655

Lys Arg Leu Gln Ile Phe Asp Val Pro Arg Val Pro Asp Asp Gln Met

660 665 670

Tyr Arg Leu Arg Asp Arg Leu Arg Leu Leu Pro Val Glu Arg Arg Arg

675 680 685

Leu Asp Ile Phe Asn Leu Ile Leu Met Asn Met Glu Gln Ile Glu Arg

690 695 700

Ala Ser Asp Lys Ile Ala Gln Gly Val Ile Ile Ala Tyr Arg Asp Met

705 710 715 720

Gln Leu Glu Arg Asp Glu Met Tyr Gly Tyr Val Asn Ile Ala Arg Asn

725 730 735

Leu Asp Gly Tyr Gln Gln Ile Asn Leu Glu Glu Leu Met Arg Thr Gly

740 745 750

Asp Tyr Gly Gln Ile Thr Asn Met Leu Leu Asn Asn Gln Pro Val Ala

755 760 765

Leu Val Gly Ala Leu Pro Phe Val Thr Asp Ser Ser Val Ile Ser Leu

770 775 780

Ile Ala Lys Leu Asp Ala Thr Val Phe Ala Gln Ile Val Lys Leu Arg

785 790 795 800

Lys Val Asp Thr Leu Lys Pro Ile Leu Tyr Lys Ile Asn Ser Asp Ser

805 810 815

Asn Asp Phe Tyr Leu Val Ala Asn Tyr Asp Trp Ile Pro Thr Ser Thr

820 825 830

Thr Lys Val Tyr Lys Gln Val Pro Gln Pro Phe Asp Phe Arg Ala Ser

835 840 845

Met His Met Leu Thr Ser Asn Leu Thr Phe Thr Val Tyr Ser Asp Leu

850 855 860

Leu Ala Phe Val Ser Ala Asp Thr Val Glu Pro Ile Asn Ala Val Ala

865 870 875 880

Phe Asp Asn Met Arg Ile Met Asn Glu Leu

885 890

<210> 10

<211> 311

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val Asn Ile Thr

1 5 10 15

Val Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn Leu Ile Ala Ser

20 25 30

Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val Asp Thr Arg Gln

35 40 45

Phe Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser Tyr Gly Tyr Val

50 55 60

Ser Asn Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln Ser Val Asn

65 70 75 80

Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser Leu Leu Ala

85 90 95

Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Ser Gly

100 105 110

Val Lys Phe Ala Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly Glu Leu Ile

115 120 125

Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp Val Ser Phe Met

130 135 140

Thr Leu Asp Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val

165 170 175

Asn Ile Thr Val Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn Leu

180 185 190

Ile Ala Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val Asp

195 200 205

Thr Arg Gln Phe Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser Tyr

210 215 220

Gly Tyr Val Ser Asn Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln

225 230 235 240

Ser Val Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser

245 250 255

Leu Leu Ala Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu Phe

260 265 270

Gly Ser Gly Val Lys Phe Ala Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly

275 280 285

Glu Leu Ile Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp Val

290 295 300

Ser Phe Met Thr Leu Asp Val

305 310

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Ser Gln Pro Ala His Asp Asn Leu

1 5

<210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Ser Ala Gly Gly Thr Thr

1 5

<210> 13

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Arg Pro Pro Asn Met Thr

1 5

Claims

1.一种病毒样颗粒，其特征在于，其含有VP6-spytag蛋白、VP2蛋白和spycatcher-RBD蛋白；

将VP6-spytag蛋白与VP2蛋白组装成双层VLP，再与spycatcher-RBD蛋白偶联；

所述VP6-spytag蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；

所述spycatcher-RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种核酸，其特征在于，其编码权利要求1所述的病毒样颗粒中所含有的蛋白。

3.根据权利要求2所述核酸，其特征在于，编码所述VP6-spytag蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

4.根据权利要求2所述核酸，其特征在于，编码所述spycatcher-RBD蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

5.一种生物材料，其为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌，其特征在于，其包含权利要求2-4任一项所述的核酸。

6.一种药物或疫苗组合物，其特征在于，其包含：

（a）权利要求1所述的病毒样颗粒和/或权利要求2-4中任一项所述的核酸和/或权利要求5所述的生物材料；以及

（b）药学上可接受的载体或赋形剂。

7.权利要求1所述的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，其步骤包括：

将猪轮状病毒的VP6蛋白的loop区与猪流行性腹泻病毒的spytag连接，形成VP6-spytag蛋白。

8.根据权利要求7中所述的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，其步骤还包括：在宿主中分别表达VP6-spytag、VP2、spycatcher-RBD蛋白并回收表达产物。

9.权利要求1所述的病毒样颗粒和/或权利要求2~4中任一项所述的核酸和/或权利要求5所述的生物材料在制备药物中的应用，所述药物被用于以下至少一方面：

（1）预防由猪流行性腹泻病毒感染所引起的疾病；

（2）预防由猪轮状病毒感染所引起的疾病。