CN102227444A - 疟原虫疫苗、抗原、组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫学和蛋白质工程改造的交叉领域，且具体来说涉及适用于预防疟原虫属(Plasmodium)寄生虫感染的抗原和疫苗。提供重组蛋白抗原、组合物和在植物中产生所述抗原的方法。在一些实施例中，疟原虫抗原包括Pfs25多肽、Pfs28多肽、Pfs48/45多肽、Pfs230多肽和/或其组合。

Description

疟原虫疫苗、抗原、组合物和方法
交叉申请案
本申请案主张2008年9月28日申请的美国临时申请案61/100,744的权益，所述申请案的整体揭示内容以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
疟疾是一种由疟原虫属(genus Plasmodium)的原生动物寄生虫引起的媒介传播的传染性疾病。其在热带和亚热带地区广泛传播，包括美洲、亚洲和非洲的部分地区。每年约有5.15亿疟疾病例，导致一百万到三百万人死亡，其中大多数是撒哈拉以南非洲(Sub-Saharan Africa)的年幼儿童(斯诺(Snow)等人，2005，自然(Nature)，434：214-7；以引用的方式并入本文中)。疟疾通常与贫穷有关，但也是贫穷的原因和经济发展的主要障碍。
疟原虫属寄生虫通过雌性疟蚊属(Anopheles)蚊虫来传播。症状包括头晕目眩、呼吸急促、心动过速、发热、寒战、恶心、类似流感的疾病、昏迷和死亡中的一种或一种以上。目前没有可用于疟疾的疫苗。现有预防性疗法必须连续使用以降低感染风险，但这些预防性处理对于生活在地方病流行地区的大多数人来说通常太过昂贵。疟疾感染通常通过使用诸如奎宁(quinine)或青蒿素(artemisinin)衍生物等抗疟疾药来治疗，但耐药性越来越常见。
发明内容
本发明提供诱导或增强针对疟原虫有性繁殖阶段(sexual-stage)抗原(例如Pfs25、Pfs28、Pfs48/45、Pfs230、HAP2、GCS1同源物)和配子体表面抗原的免疫反应的组合物和制备组合物的方法。所述组合物适用于减少疟原虫感染的传播。所述组合物可包括包含热稳定性蛋白质和疟原虫多肽的分离的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽可为Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽或其免疫原性部分，且其中所述融合蛋白在投予个体时诱导或增强针对疟原虫多肽的免疫反应。在一些实施例中，所述热稳定性蛋白质可为地衣多糖酶(lichenase)多肽。所述地衣多糖酶多肽可为经修饰的地衣多糖酶B多肽。所述经修饰的地衣多糖酶B多肽可为具有SEQ ID NO：40的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO：40具有至少90％、至少95％、至少98％序列一致性的经修饰的地衣多糖酶B多肽。
在一些实施例中，疟原虫多肽可为Pfs25多肽。所述Pfs25多肽可具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列或可与SEQ ID NO：42具有至少95％、至少98％、至少99％序列一致性。在一些实施例中，疟原虫多肽可为Pfs28多肽。所述Pfs28多肽可具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列或可与SEQ ID NO：55具有至少95％、至少98％、至少99％序列一致性。在一些实施例中，疟原虫多肽可为Pfs48/45多肽。所述Pfs48/45多肽可具有SEQ ID NO：62的氨基酸序列或可与SEQ ID NO：62具有至少95％、至少98％、至少99％序列一致性。在一些实施例中，疟原虫多肽可为Pfs230多肽。所述Pfs230多肽可具有SEQ ID NO：95的氨基酸序列或可与SEQ ID NO：95具有至少95％、至少98％、至少99％序列一致性。
在一些实施例中，融合蛋白可具有选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252和254，或可为与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少99％序列一致性的多肽：SEQ ID NO：152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252和254。
还揭示包含编码所述融合蛋白的序列的核酸。所述核酸可编码选自由以下组成的群组的多肽的氨基酸序列：SEQ ID NO：152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252和254，或与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少99％序列一致性的多肽的氨基酸序列：SEQ ID NO：152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252和254。还揭示包含所述核酸的表达载体。所述表达载体可进一步包含前导序列。表达载体可为农杆菌(Agrobacterial)质粒、植物病毒载体或克隆到农杆菌质粒中的植物病毒载体。还揭示包含所述表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞可为植物细胞且可包含植物。还揭示产生融合蛋白和疟原虫Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽的方法，所述方法包含：提供包含编码所述融合蛋白的核酸的核酸构筑体；将所述核酸构筑体引入植物细胞中；和在允许融合蛋白表达的条件下维持所述细胞。
还揭示在植物中制备诱导或增强针对疟原虫有性繁殖阶段抗原(例如Pfs25、Pfs28、Pfs48/45、Pfs230、HAP2、GCS1同源物)和配子体表面抗原的免疫反应的组合物的方法。这些方法包括制备诱导或增强针对疟原虫Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽的免疫反应的组合物的方法。在一实施例中，所述方法包含在植物中产生如上文所述的融合蛋白；分离融合蛋白；和将分离的融合蛋白与医药学上可接受的载剂组合。在一实施例中，所述方法包含：在植物中产生疟原虫多肽Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230；分离多肽；和将多肽与医药学上可接受的载剂组合。疟原虫多肽可为Pfs25多肽；所述Pfs25多肽可具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列或可为与SEQ ID NO：42具有至少90％序列一致性的多肽。疟原虫多肽可为Pfs28多肽；所述Pfs28多肽可具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列或可为与SEQ ID NO：55具有至少90％序列一致性的多肽。疟原虫多肽可为Pfs48/45多肽；所述Pfs48/45多肽可具有SEQ ID NO：62的氨基酸序列或可为与SEQ ID NO：62具有至少90％序列一致性的多肽。疟原虫多肽可为Pfs230多肽；所述Pfs230多肽可具有SEQ ID NO：95的氨基酸序列或可为与SEQ ID NO：95具有至少90％序列一致性的多肽。植物可短暂表达多肽或融合蛋白；所述短暂表达可来自农杆菌质粒、植物病毒载体或克隆到农杆菌质粒中的植物病毒载体。在一些实施例中，植物可为多肽或融合蛋白转基因植物。植物可来自选自由以下组成的群组的属：芸苔属(Brassica)、烟草属(Nicotiana)、矮牵牛属(Petunia)、西红柿属(Lycopersicon)、茄属(Solanum)、番椒属(Capsium)、胡萝卜属(Daucus)、旱芹属(Apium)、莴苣属(Lactuca)、芥子属(Sinapis)或拟南芥属(Arabidopsis)，例如本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)、埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)、芥菜(Brassica juncea)、欧洲油菜(Brassica napus)、黑芥(Brassica nigra)、甘蓝(Brassica oleraceae)、撒哈拉芥(Brassica tournifortii)、白芥子(Sinapis alba)和萝卜(Raphanus sativus)。可使用的植物包括紫花苜蓿(alfalfa)、萝卜(radish)、芥菜(mustard)、绿豆(mung bean)、西兰花(broccoli)、水田芹(watercress)、大豆(soybean)、小麦(wheat)、向日葵(sunflower)、卷心菜(cabbage)、三叶草(clover)、矮牵牛(petunia)、西红柿(tomato)、马铃薯(potato)、烟草(tobacco)、菠菜(spinach)和小扁豆(lentil)。在一些实施例中，植物可为发芽的籽苗。还提供通过上述方法产生的植物细胞和含有这种植物细胞的植物。
在一些实施例中，植物产疟原虫多肽是从植物材料纯化而来。在一些实施例中，植物产疟原虫多肽不是从植物材料纯化而来。
还揭示包含技术方案1至32中任一技术方案的融合蛋白和医药学上可接受的载剂或赋形剂的医药组合物。所述组合物可进一步包括佐剂。所述佐剂可选自由以下组成的群组：明矾、Quil A、QS21、氢氧化铝、磷酸铝、矿物油、MF59、Malp2、不完全弗氏佐剂(incomplete Freund′s adjuvant)、完全弗氏佐剂(complete Freund′s adjuvant)、铝胶(alhydrogel)、3去-O-酰化单磷酰基脂质A(3D-MPL)、脂质A、百日咳杆菌(Bortadella pertussis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、默克佐剂65(Merck Adjuvant65)、角鲨烯、病毒颗粒(virosome)、SBAS2、SBAS1、AS03和未甲基化CpG序列。
还提供一种在个体中诱导或增强针对疟原虫多肽的免疫反应的方法，所述方法包含投予治疗有效量的根据上述方法制备的疟原虫多肽或其组合物。可经口、鼻内、皮下、静脉内、腹膜内或肌肉内投予所述肽或其组合物。还提供一种在个体中诱导或增强针对疟原虫多肽的免疫反应的方法，所述方法是通过向个体供给通过上文所述产生的植物或其可食用部分或植物细胞来进行。在这些方法中，所述个体可为动物，诸如人类、非人类灵长类动物、鸟类或啮齿动物。
还揭示减少疟原虫感染的传播的方法。在一实施例中，所述方法包含减少疟原虫向处于疟原虫感染风险中的群体中的个体传播，包含向所述群体中的一个或一个以上个体投予有效量的根据上述方法制备的疟原虫多肽或其组合物。在一实施例中，方法包含减少疟原虫从个体传播的方法，所述方法包含向个体投予有效量的根据上述方法制备的疟原虫多肽或其组合物。在这些方法中，所述个体可为动物，诸如人类、非人类灵长类动物、鸟类或啮齿动物。
定义
氨基酸：如本文中所使用，术语“氨基酸”在其最广泛意义上是指任何可并入多肽链中的化合物和/或物质。在一些实施例中，氨基酸具有通用结构H2N-C(H)(R)-COOH。在一些实施例中，氨基酸为天然存在的氨基酸。在一些实施例中，氨基酸为合成氨基酸；在一些实施例中，氨基酸为D-氨基酸；在一些实施例中，氨基酸为L-氨基酸。“标准氨基酸”是指天然存在的肽中常见的二十种标准L-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，这与其是合成制备还是从天然来源获得无关。如本文中所使用，“合成氨基酸”涵盖经化学修饰的氨基酸，包括(但不限于)盐、氨基酸衍生物(诸如酰胺)和/或取代。肽中的氨基酸(包括羧基端和/或氨基端氨基酸)可通过甲基化、酰胺化、乙酰化和/或用其它可改变所述肽的循环半衰期而不会不利地影响其活性的化学基团取代来修饰。氨基酸可能会参与二硫键。术语“氨基酸”可与“氨基酸残基”互换使用并且可以指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。可从使用术语的上下文明了其是指游离氨基酸还是肽的残基。
动物：如本文中所使用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施例中，“动物”是指处于任何发育阶段的人类。在一些实施例中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施例中，所述非人类动物为哺乳动物(例如啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施例中，动物包括(但不限于)哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在一些实施例中，动物可为转基因动物、遗传工程改造动物和/或克隆。
抗体：如本文中所使用，术语“抗体”是指天然或完全或部分合成产生的任何免疫球蛋白。其维持特定结合能力的所有衍生物也都包括在所述术语中。所述术语还涵盖具有与免疫球蛋白结合结构域同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白质。所述蛋白质可以来源于天然来源，或部分或完全合成产生。抗体可为单克隆或多克隆抗体。抗体可为任何免疫球蛋白类别的成员，包括任何人类类别：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。如本文中所使用，术语“抗体片段”或“抗体的特征性部分”可互换使用并且是指小于全长的任何抗体衍生物。一般来说，抗体片段至少保留全长抗体的特定结合能力的相当大部分。抗体片段的实例包括(但不限于)Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、Fv、dsFv双功能抗体和Fd片段。抗体片段可以通过任何方式来产生。举例来说，抗体片段可以通过裂解完整抗体以酶促方式或以化学方式产生和/或其可以由编码部分抗体序列的基因重组产生。或者或另外，抗体片段可以完全或部分合成产生。抗体片段可以任选包含单链抗体片段。或者或另外，抗体片段可以包含例如由二硫键连接在一起的多个链。抗体片段可以任选包含多分子复合物。功能性抗体片段通常包含至少约50个氨基酸且更通常包含至少约200个氨基酸。
约：如本文中所使用，术语“约(approximately/about)”在应用于一个或一个以上所关注的值时是指类似于所述参考值的值。在某些实施例中，除非另有规定或另外从上下文显而易见(除了所述数值将超过可能值的100％的情况以外)，否则术语“约”是指处于所述参考值在任一方向(大于或小于)上的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小以内的值范围。
特征性部分：如本文中所使用，短语蛋白质或多肽的“特征性部分”是含有一段连续氨基酸或共同作为蛋白质或多肽的特点的许多段连续氨基酸的部分。各所述连续段一般将含有至少两个氨基酸。此外，所属领域的技术人员应了解，通常需要至少5个、至少10个、至少15个、至少20个或更多氨基酸表现蛋白质的特点。一般来说，特征性部分是除以上所指定的序列特性外还与相关完整蛋白质共有至少一种功能性特征的部分。
特征性序列：“特征性序列”是存在于多肽或核酸家族的所有成员中的序列，且因此所属领域的技术人员可用来定义家族的成员。
组合疗法：如本文中所使用，术语“组合疗法”是指以重叠方案投予两种或两种以上不同医药剂以使个体同时接触两种药剂的那些情形。
给药方案：如本文中所使用，“给药方案”是指间隔一定时段个别地投予的一组单位剂量(通常是多个)。推荐用于特定医药剂的一组剂量(即，投药量、时序、途径等)构成其给药方案。
表达：如本文中所使用，核酸序列的“表达”是指一个或一个以上如下事件：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如通过转录)；(2)加工RNA转录物(例如通过拼接、编辑和/或3′末端形成)；(3)将RNA翻译为多肽或蛋白质；(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
基因：如本文中所使用，术语“基因”具有如所属领域中所了解的含义。所属领域的技术人员应了解，术语“基因”可以包括基因调控序列(例如启动子、增强子等)和/或内含子序列。应进一步了解，基因的定义包括提及不编码蛋白质而是编码功能性RNA分子(诸如tRNA)的核酸。为了清楚起见，我们应注意，如本申请案中所使用，术语“基因”一般是指编码蛋白质的核酸的一部分；所属领域的技术人员从上下文可显而易见，所述术语可任选涵盖调控序列。这一定义并不打算排除对不编码蛋白质的表达单元应用术语“基因”，而是澄清在大多数情况下，如本文件中所使用的所述术语是指编码蛋白质的核酸。
基因产物：如本文中所使用，术语“基因产物”或“表达产物”一般是指从基因转录的RNA(加工前和/或加工后)或由从所述基因转录的RNA所编码的多肽(修饰前和/或修饰后)。
同源性：如本文中所使用，术语“同源性”是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施例中，如果聚合分子的序列至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％一致，那么认为这些聚合分子彼此“同源”。在一些实施例中，如果聚合分子的序列至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％类似，那么认为这些聚合分子彼此“同源”。
一致性：如本文中所使用，术语“一致性”是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。举例来说，两个核酸序列的一致性百分比的计算可通过出于最佳比较目的对准两个序列来进行(例如，可将间隙引入第一和第二核酸序列中的一个或两个中以便最佳对准且出于比较目的可以忽略非一致序列)。在某些实施例中，出于比较目的所对准的序列长度为参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。接着比较相应核苷酸位置的核苷酸。当第一序列中的位置未被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据时，则所述分子在那个位置上是一致的。两个序列之间的一致性百分比与所述序列共有的一致位置的数目有关，并且考虑最佳对准两个序列需要引入的间隙的数目和各间隙的长度。序列的比较和两个序列之间的一致性百分比的测定可以使用数学算法来完成。举例来说，两个核苷酸序列之间的一致性百分比可以使用迈尔(Meyers)和米勒(Miller)(生物科学中的计算机应用(CABIOS)，1989，4：11-17)的算法来测定，所述算法已并入使用PAM120权数残基表、间隙长度罚分12和间隙罚分4的ALIGN程序(2.0版)中。或者，两个核苷酸序列之间的一致性百分比可以使用GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵来测定。如本文中所使用，术语“总体一致性”是指一长段序列中的一致性。在一些实施例中，总体一致性是指至少50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、400个、500个或更多个氨基酸和/或核苷酸中的一致性。在一些实施例中，总体一致性是指指定序列的完整长度中的一致性。
分离的：如本文中所使用，术语“分离的”是指如下的物质和/或实体：(1)与至少一些在最初产生(在自然界中和/或在实验环境中)时与其结合的组分分离；和/或(2)人工产生、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可以与最初与其结合的其它组分的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％或100％分离。在一些实施例中，分离的药剂的纯度大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、实质上100％或100％。如本文中所使用，如果物质实质上不含其它组分，那么其是“纯的”。如本文中所使用，术语“分离的细胞”是指不包含在多细胞生物体中的细胞。
地衣多糖酶多肽：如本文中所使用，术语“地衣多糖酶多肽”是指与表1中所列的一种或一种以上地衣多糖酶多肽显示至少50％总体序列一致性的多肽。在一些实施例中，地衣多糖酶多肽与所列地衣多糖酶多肽显示至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。在一些实施例中，地衣多糖酶多肽与所列地衣多糖酶多肽进一步共有至少一个特征性序列元件。
核酸：如本文中所使用，术语“核酸”在其最广泛意义上是指并入或可以并入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，核酸是经由磷酸二酯键并入或可以经由磷酸二酯键并入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。在一些实施例中，“核酸”是指个别核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)。在一些实施例中，“核酸”是指包含个别核酸残基的寡核苷酸链。如本文中所使用，术语“寡核苷酸”和“聚核苷酸”可互换使用。在一些实施例中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA和/或cDNA。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似术语包括核酸类似物，即具有非磷酸二酯主链的类似物。举例来说，所属领域中已知且在主链中具有肽键以代替磷酸二酯键的所谓“肽核酸”被认为在本发明的范围内。术语“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括互为简并形式和/或编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和/或RNA的核苷酸序列包括内含子。核酸可以从天然来源纯化，使用重组表达系统产生且任选纯化，化学合成等。适当时，例如在化学合成分子的情况下，核酸可以包含核苷类似物，诸如具有经化学修饰的碱基或糖、主链修饰等的类似物。除非另有指示，否则核酸序列以5′至3′方向呈现。术语“核酸区段”在本文中用于指作为较长核酸序列的一部分的核酸序列。在许多实施例中，核酸区段包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或10个以上残基。在一些实施例中，核酸是以下物质或包含以下物质：天然核苷(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)；核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、(N-吡咯基)-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；经化学修饰的碱基；经生物修饰的碱基(例如甲基化碱基)；插入的碱基；经修饰的糖(例如2′-氟核糖、核糖、2′-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸酯基(例如硫代磷酸酯和5′-N-亚磷酰胺键联)。在一些实施例中，本发明可能具体涉及“未经修饰的核酸”，其意思是尚未经化学修饰以促进或实现传递的核酸(例如聚核苷酸和残基，包括核苷酸和/或核苷)。
可操作地连接：如本文中所使用，术语“可操作地连接”是指两个核酸序列之间的关系，其中一个核酸序列的表达受另一核酸序列控制、调控、调节等。举例来说，核酸序列的转录受可操作地连接的启动子序列指导；核酸的转录后加工受可操作地连接的加工序列指导；核酸序列的翻译受可操作地连接的翻译调控序列指导；核酸或多肽的转运或定位受可操作地连接的转运或定位序列指导；且多肽的翻译后加工受可操作地连接的加工序列指导。可操作地连接于第二核酸序列的核酸序列可以直接或间接共价连接于所述序列，不过任何有效三维结合都是可接受的。
Pfs25多肽：如本文中所使用，术语“Pfs25多肽”是指与图1中所列的一种或一种以上Pfs25多肽显示至少50％总体序列一致性的多肽。在一些实施例中，Pfs25多肽与所列Pfs25多肽显示至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。在一些实施例中，Pfs25多肽与所列Pfs25多肽进一步共有至少一个特征性序列元件。编码代表性Pfs25多肽的氨基酸序列展示于图24中(SEQ ID NO：41；基因库(Genbank)编号AAF63684.1)。与基因库编号AAF63684.1的氨基酸序列相比，Pfs25的其它代表性形式的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、10个或更多个氨基酸变化。Pfs25的已鉴别出的其它氨基酸序列包括例如(但不限于)AAD55785.1；AAD39544.1。
Pfs28多肽：如本文中所使用，术语“Pfs28多肽”是指与图1中所列的一种或一种以上Pfs28多肽显示至少50％总体序列一致性的多肽。在一些实施例中，Pfs28多肽与所列Pfs28多肽显示至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。在一些实施例中，Pfs28多肽与所列Pfs28多肽进一步共有至少一个特征性序列元件。编码代表性Pfs28多肽的氨基酸序列展示于图24中(SEQ ID NO：55；基因库编号AAT00624.1)。与基因库编号AAT00624.1的氨基酸序列相比，Pfs25的其它代表性形式的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、10个或更多个氨基酸变化。
Pfs48/45多肽：如本文中所使用，术语“Pfs48/45多肽”是指与图1中所列的一种或一种以上Pfs48/45多肽显示至少50％总体序列一致性的多肽。在一些实施例中，Pfs48/45多肽与所列Pfs48/45多肽显示至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。在一些实施例中，Pfs48/45多肽与所列Pfs48/45多肽进一步共有至少一个特征性序列元件。编码代表性Pfs48/45多肽的氨基酸序列展示于图24中(SEQ ID NO：62；基因库编号PF13_0247)。与基因库编号PF13_0247的氨基酸序列相比，Pfs48/45的其它代表性形式的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、10个或更多个氨基酸变化。
Pfs230多肽：如本文中所使用，术语“Pfs230多肽”是指与图1中所列的一种或一种以上Pfs230多肽显示至少50％总体序列一致性的多肽。在一些实施例中，Pfs230多肽与所列Pfs230多肽显示至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。在一些实施例中，Pfs230多肽与所列Pfs230多肽进一步共有至少一个特征性序列元件。编码代表性Pfs230多肽的氨基酸序列展示于图24中(SEQ ID NO：95；基因库编号AAA29724)。与基因库编号AAA29724的氨基酸序列相比，Pfs230的其它代表性形式的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、10个或更多个氨基酸变化。
医药剂：如本文中所使用，短语“医药剂”是指当投予个体时具有治疗作用和/或引发所需生物和/或药理学作用的任何药剂。
医药学上可接受的载剂或赋形剂：如本文中所使用，术语“医药学上可接受的载剂或赋形剂”的意思是任何类型的无毒、惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、囊封材料或调配助剂。
疟原虫多肽：如本文中所使用，术语“疟原虫多肽”或“疟原虫抗原多肽”是指与图1中所列的一种或一种以上Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和/或Pfs230多肽显示至少50％总体序列一致性的多肽。在一些实施例中，疟原虫多肽与所列Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和/或Pfs230多肽显示至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。在一些实施例中、疟原虫多肽与所列Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和/或Pfs230多肽进一步共有至少一个特征性序列元件。在一些实施例中，疟原虫多肽不是Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和/或Pfs230多肽，而是由疟原虫属的一个或一个以上物种天然产生的不同多肽。
部分：如本文中所使用，短语物质的“部分”或“片段”在最广泛意义上是与相关完整物质共有一定程度的序列和/或结构一致性和/或至少一种功能性特征的部分或片段。举例来说，蛋白质或多肽的“部分”是含有一段连续氨基酸或共同作为蛋白质或多肽的特点的许多段连续氨基酸的集合的部分。在一些实施例中，各所述连续段一般将含有至少2个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个氨基酸。一般来说，部分是除以上所说明的序列一致性外还与相关完整蛋白质共有至少一种功能性特征的部分。在一些实施例中，所述部分可以具有生物活性。
蛋白质：如本文中所使用，术语“蛋白质”是指多肽(即，含至少两个由肽键相互连接的氨基酸的链)。蛋白质可以包括除氨基酸以外的部分(例如可为糖蛋白、蛋白聚糖等)和/或可以另外经加工或修饰。所属领域的普通技术人员应了解，“蛋白质”可为由细胞所产生的完整多肽链(有或无信号序列)，或可为其特征性部分。所属领域的普通技术人员应了解，蛋白质有时可以包括多个多肽链，例如由一个或一个以上二硫键连接或通过其它方式结合。多肽可以含有L-氨基酸、D-氨基酸或两者而且可以含有所属领域中已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任一种。适用的修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化等。在一些实施例中，蛋白质可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸和其组合。术语“肽”一般用于指长度小于约100个氨基酸的多肽。
相似性：如本文中所使用，术语“相似性”是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。聚合分子彼此的相似性百分比的计算可以与计算一致性百分比相同的方式进行，除了相似性百分比的计算考虑如所属领域中所了解的保守性取代以外。
个体：如本文中所使用，术语“个体”或“患者”是指例如出于实验、诊断、预防和/或治疗目的可以投予本发明的组合物的任何生物体。典型个体包括动物(例如哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、非人类灵长类动物和人类；昆虫；蠕虫；等)。
实质上：如本文中所使用，术语“实质上”是指展现全部程度或接近全部程度的所关注特征或性质的定性条件。所属领域的普通技术人员应了解，生物学和化学现象很少(如果发生过的话)达到完全和/或进行到完全或达成或避免绝对结果。因此，术语“实质上”在本文中用于记录许多生物学和化学现象中所固有的可能的完全性缺乏。
罹患：“罹患”疾病、病症和/或病状的个体已确诊患有所述疾病、病症和/或病状或呈现所述疾病、病症和/或病状的一种或一种以上症状。
易患：“易患”疾病、病症和/或病状的个体尚未确诊患有所述疾病、病症和/或病状。在一些实施例中，易患疾病、病症和/或病状的个体可能不展现所述疾病、病症和/或病状的症状。在一些实施例中，易患疾病、病症和/或病状的个体将发展所述疾病、病症和/或病状。在一些实施例中，易患疾病、病症和/或病状的个体不会发展所述疾病、病症和/或病状。在一些实施例中，易患疾病、病症和/或病状的个体为发展特定疾病或病症或其症状的风险(通常基于遗传倾向、环境因素、个人病史或其组合)高于一般群体中所观察到的风险的个体。
治疗有效量：术语医药剂或药剂组合的“治疗有效量”欲指在适用于任何医学治疗的合理益处/风险比下对所治疗的个体赋予治疗作用的药剂的量。在一些实施例中，治疗有效量是当投予罹患或易患疾病、病症和/或病状的个体时足以治疗、诊断、预防和/或延缓疾病、病症和/或病状的症状发作的量。所述治疗作用可为客观的(即，可通过一些测试或标记来测量)或主观的(即，个体声明有作用或感到有作用)。治疗有效量通常以可能包含多个单位剂量的给药方案来投予。对于任何特定医药剂，治疗有效量(和/或有效给药方案中的适当单位剂量)可以例如视投药途径、与其它医药剂的组合而变化。用于任何特定个体的特定治疗有效量(和/或单位剂量)也可以视多种因素而定，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所用特定医药剂的活性；所用的特定组合物；个体的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；投药时间、投药途径和/或所用特定医药剂的排泄或代谢速率；治疗持续时间；和如医学技术中熟知的类似因素。
治疗剂：如本文中所使用，短语“治疗剂”是指当投予个体时具有治疗作用和/或引发所需生物和/或药理学作用的任何药剂。
治疗：如本文中所使用，术语“治疗”是指以任何形式投予生物活性剂，从而部分或完全减轻、改善、缓解、抑制特定疾病、病症和/或病状的一种或一种以上症状或特征，延缓其一种或一种以上症状或特征发作，预防其一种或一种以上症状或特征，降低其一种或一种以上症状或特征的严重程度和/或降低其一种或一种以上症状或特征的发生率。所述治疗可以用于不展现相关疾病、病症和/或病状的征兆的个体和/或仅展现疾病、病症和/或病状的早期征兆的个体。或者或另外，所述治疗可以用于展现相关疾病、病症和/或病状的一种或一种以上既定征兆的个体。
单位剂量：如本文中所使用，术语“单位剂量”是指通常在给药方案的情形下医药剂的不连续投予。
载体：如本文中所使用，“载体”是指可以转运与其所连接的另一核酸的核酸分子。在一些实施例中，载体可以在诸如真核和/或原核细胞等宿主细胞中实现与其所连接的核酸的染色体外复制和/或表达。能够指导可操作地连接的基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。
附图说明
图1.来自疟原虫属物种的例示性Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230。粗体氨基酸表示信号肽的位置。下划线氨基酸表示存在地衣多糖酶、6×His标签和KDEL序列。正常字体氨基酸表示Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230序列。粗体又下划线的氨基酸表示天然蛋白质中的跨膜结构域和/或gpi锚。
图2-12.肽与AlMVCP的融合物的表达、表征和纯化
图13是二元投放载体(Binary Launch Vector)的图形表示：pGR-D4。
图14是用于产生构筑体的经修饰的地衣多糖酶基因的图形表示。
图15显示所选疟疾抗原的蛋白质产生的实例。
图16.Pfs25和Pfs28目标的工程改造、表达和溶解性概况。
图17是总结Pfs25构筑体的IFA、SIFA和SMFA分析的结果的表格。
图18是总结Pfs28构筑体的IFA、SIFA和SMFA分析的结果的表格。
图19.Pfs48目标的工程改造、表达和溶解性概况。
图20是总结Pfs48/45构筑体的IFA、SIFA和SMFA分析的结果的表格。
图21.Pfs230目标的工程改造、表达和溶解性概况。
图22是总结Pfs230构筑体的IFA、SIFA和SMFA分析的结果的表格。
图23A描绘在铝胶存在下由Pfs230A引发的IgG反应的同型分析的结果。图23B描绘在Quil A佐剂存在下由Pfs230A引发的IgG反应的同型分析的结果。
图24提供来自疟原虫属物种的例示性Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230融合蛋白序列。
图25提供来自疟原虫属物种的例示性Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230融合蛋白构筑体。
具体实施方式
疟原虫和疟原虫疗法
疟疾，一种常见传染性疾病和巨大公众健康问题，是由疟原虫属的原生动物寄生虫引起。四种疟原虫属物种可感染人类：恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)和三日疟原虫(Plasmodium malariae)。疾病的最严重形式是由恶性疟原虫和间日疟原虫引起。如本文中所使用，术语“疟疾寄生虫”用于指这些疟原虫属物种中的一种、两种、三种或四种。
疟疾寄生虫通过雌性疟蚊属蚊虫来传播。疟疾寄生虫在红血球中繁殖，引起包括贫血症状(例如头晕目眩、呼吸急促、心动过速等)的症状，以及其它全身症状，诸如发热、寒战、恶心、类似流感的疾病和在严重情况下甚至导致昏迷和死亡。疟疾传播可通过用蚊帐和驱虫剂来防止蚊虫叮咬，或通过诸如在室内喷洒杀虫剂和排干积水(蚊虫会在积水中产卵)等蚊虫防治措施来减少。
目前没有可用于疟疾的疫苗。现有预防性疗法必须连续使用以降低感染风险。这些预防性处理对于生活在地方病流行地区的人来说通常太过昂贵。疟疾感染通过使用抗疟疾药来治疗，诸如奎宁或青蒿素衍生物，但耐药性越来越常见。
本文提供用于诱导或增强针对在疟原虫生命周期的有性繁殖阶段表达的抗原的免疫反应的材料与方法。更具体来说，提供多肽和制备所述多肽的方法。针对寄生虫的有性繁殖阶段的免疫性提供减少或阻止疟疾传播的有效方式。特异性靶向蚊虫媒介中的寄生虫的有性发育的传播阻断疫苗(transmission blocking vaccine，TBV)可引出制造可有效地阻断寄生虫从无脊椎动物蚊虫媒介传播到脊椎动物宿主的抗体。疟疾的传播取决于在受感染者的周边血液中存在传染性雄性和雌性配子体和疟蚊属蚊虫成功摄取这些配子体。摄取后不久，在蚊虫的中肠中形成小配子，且新出现的雄配子使雌配子受精，从而形成合子。合子经历受精后转化成为活动型动合子，其穿过中肠上皮并发育成卵囊，从而产生传染性子孢子。最后，子孢子释放到血腔中，侵入唾液腺并且在随后取食血液期间传播到脊椎动物宿主。
传播阻断抗体的目标可包括在循环配子体中表达的受精前抗原(Pfs230和Pfs48/45)和在蚊虫阶段动合子发育期间表达的受精后抗原(Pfs25和Pfs28)。不同于Pfs25和Pfs28，受精前抗原也是天然免疫反应的目标且因此由基于任何这些抗原的疫苗诱导的免疫性将增加免疫性的天然加强的益处。因为传播阻断抗体靶向蚊虫媒介中的寄生虫所表达的抗原，所以预期所述抗体有效减少寄生虫传播到下一宿主。传播阻断抗体适用于减少群体(例如一个、两个、三个、四个、五个或五个以上个体的群组)中的疟原虫传播。所述个体可存在于同一有限地理区域内，例如家庭或社区。
疟原虫抗原
一般来说，疟原虫抗原可以包括引发针对疟原虫属寄生虫的免疫反应的任何免疫原性多肽。根据本发明，所关注的免疫原性多肽可以独立多肽形式、以融合蛋白形式、以经修饰多肽(例如含有其它侧接基团，诸如碳水化合物基团、甲基、烷基[诸如甲基、乙基等]、磷酸酯基、脂质基团、酰胺基、甲酰基、生物素基、血红素基、羟基、碘基、异戊二烯基、十四烷酰基、黄素基、软脂酰基、硫酸酯基、聚乙二醇等)形式提供。在一些实施例中，用于本发明的疟原虫抗原多肽具有是或包括与自然界中所发现的疟原虫多肽序列一致的序列的氨基酸序列；在一些实施例中，疟原虫抗原多肽具有是或包括与自然界中所发现的疟原虫多肽的特征性部分(例如免疫原性部分)一致的序列的氨基酸序列。
在某些实施例中，利用全长蛋白质作为本发明的疫苗组合物中的疟原虫抗原多肽。在一些实施例中，使用疟原虫多肽的一个或一个以上免疫原性部分。在某些实施例中，以一个或一个以上单独多肽形式或以一个或一个以上融合多肽中连接在一起的形式利用两个或三个或三个以上免疫原性部分。
用于本发明的疟原虫抗原多肽可以包括全长疟原虫多肽、其融合物和/或其免疫原性部分。当无论单独还是以融合蛋白形式利用疟原虫蛋白质的部分时，所述部分都保留免疫活性(例如与抗疟原虫抗体的交叉反应性)。本发明涵盖认识到Pfs25多肽、Pfs28多肽、Pfs48/45多肽和/或Pfs230多肽是产生疫苗中所关注的抗原。
因此，本发明提供表达异源蛋白质(例如疟原虫抗原多肽，诸如疟原虫蛋白质或其免疫原性部分，或包含疟原虫蛋白质或其免疫原性部分的融合蛋白)的植物细胞和植物。本发明的异源蛋白质可以包含所关注的任何疟原虫抗原多肽，包括(但不限于)Pfs25多肽、Pfs28多肽、Pfs48/45多肽和Pfs230多肽、其部分、其免疫原性部分、其融合物和/或其组合。
所属领域中已知多种不同疟原虫Pfs25多肽、Pfs28多肽、Pfs48/45多肽和/或Pfs230多肽(例如来自不同物种和/或品系)的氨基酸序列且其可在诸如基因库(GenBank)等公共数据库中获得。图1中提供多种疟原虫属物种和/或品系的Pfs25多肽、Pfs28多肽、Pfs48/45多肽和Pfs230多肽的例示性全长蛋白质序列。
在某些实施例中，本发明的疫苗组合物中利用全长Pfs25。在一些实施例中，可使用Pfs25的一个或一个以上结构域。在某些实施例中，以一个或一个以上单独多肽形式或以在一个或一个以上融合多肽中连接在一起的形式利用两个或三个或三个以上结构域。图1中呈示例示性Pfs25多肽的序列。
在某些实施例中，本发明的疫苗抗原中利用全长Pfs28抗原。在一些实施例中，可使用Pfs28的结构域。在某些实施例中，两个或三个或三个以上结构域可用作本发明的抗原。某些例示性实施例提供包含全长Pfs28但缺乏跨膜锚定肽序列的疟原虫抗原多肽。图1中呈示例示性Pfs28多肽的序列。
在某些实施例中，本发明的疫苗抗原中利用全长Pfs48/45抗原。在一些实施例中，可使用Pfs48/45的结构域。在某些实施例中，两个或三个或三个以上结构域可用作本发明的抗原。某些例示性实施例提供包含全长Pfs48/45但缺乏跨膜锚定肽序列的疟原虫抗原多肽。图1中呈示例示性Pfs48/45多肽的序列。
在某些实施例中，本发明的疫苗抗原中利用全长Pfs230抗原。在一些实施例中，使用Pfs230的结构域。在某些实施例中，在本发明的抗原中提供两个或三个或三个以上结构域。某些例示性实施例提供包含全长Pfs230的疟原虫抗原多肽。图1中呈示例示性Pfs230多肽的序列。
还提供融合蛋白。融合物可包括经修饰的SEQ ID NO：40的地衣多糖酶B序列。融合蛋白的实例展示于图24中；对应于疟原虫多肽或其部分的氨基酸序列加有下划线。融合蛋白可为具有以下任一者的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252和254。在一些实施例中，融合蛋白可为与以下任一者的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列一致性的多肽：SEQ ID NO：152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252和254。
在一些实施例中，融合蛋白构筑体可包括其它序列，例如前导序列和/或His/KDEL标签。包含前导序列(斜体)和His/KDEL标签的融合蛋白构筑体的实例展示于表24中且可包括具有以下氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：44、46、48、50、52、54、57、59、61、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147和149。
另外，范例提供若干种可用于本发明的其它疟原虫多肽序列。
虽然本文提供例示性疟原虫抗原多肽的序列，但应了解可使用具有Pfs25多肽、Pfs28多肽、Pfs48/45多肽和/或Pfs230多肽的免疫原性特征的任何序列。在一些实施例中，用于本发明的疟原虫抗原多肽具有如下氨基酸序列：与选自图1中所示的任何序列的序列约60％一致、约70％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致、约91％一致、约92％一致、约93％一致、约94％一致、约95％一致、约96％一致、约97％一致、约98％一致、约99％一致或100％一致。在一些实施例中，所述疟原虫抗原多肽保留免疫原性活性。
在一些实施例中，用于本发明的疟原虫抗原多肽具有包含选自图1中所示的任何序列的序列的约50个至约700个连续氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，疟原虫抗原多肽具有如下氨基酸序列：与具有选自图1中所示的任何序列的序列的约100个氨基酸的连续段约60％一致、约70％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致、约91％一致、约92％一致、约93％一致、约94％一致、约95％一致、约96％一致、约97％一致、约98％一致、约99％一致或100％一致。
在一些实施例中，用于本发明的疟原虫抗原多肽具有如下氨基酸序列：包含选自图1中所示的任何序列的序列的约150个、约200个、约250个、约300个、约350个、约400个、约450个、约500个、约550个或更多个连续氨基酸。在一些实施例中，疟原虫抗原多肽具有如下氨基酸序列：与具有选自图1中所示的任何序列的序列的约150个、200个、250个、300个、350个或更多个氨基酸的连续段约60％一致、约70％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致、约91％一致、约92％一致、约93％一致、约94％一致、约95％一致、约96％一致、约97％一致、约98％一致、约99％一致或100％一致。
举例来说，与疟原虫抗原多肽具有足够一致性且保留免疫原性特征的序列能够同与本文所提供的一种或一种以上抗原反应的抗体结合。免疫原性特征常常包括相关氨基酸或侧基的三维呈现。所属领域的技术人员可容易地鉴别在序列上具有适度差异的序列(例如在边界和/或某些序列替代物中具有差异，然而仍保留免疫原性特征)。
在一些实施例中，可从疟原虫多肽中删去图1中所示的任何例示性序列的特定部分和/或结构域。举例来说，Pfs25、Pfs28和Pfs48/45多肽通常含有跨膜锚定序列。本发明涵盖删去跨膜锚定序列的Pfs25、Pfs28和Pfs48/45多肽。
我们已利用来自如本文所详述的特定物种的疟原虫属寄生虫的特定序列作为例示性抗原。存在各种物种的疟原虫属寄生虫且当新亚型出现时，其可被持续鉴别出。所属领域的技术人员应了解，本文所提供的方法和组合物可适合于利用其它物种的序列。本文所提供的方法和组合物涵盖和包涵所述变化。
疟原虫多肽与热稳定性蛋白质的融合物
在某些方面，提供包含融合多肽的疟原虫抗原多肽，所述融合多肽包含疟原虫蛋白质(或其部分或变异体)可操作地连接于热稳定性蛋白质。本发明融合多肽可在所属领域中已知的任何可用表达系统中制备。在某些实施例中，本发明融合蛋白是在植物或其部分(例如植物、植物细胞、根、芽等)中制备。
人类或动物细胞中未天然发现的酶或其它蛋白质尤其适合用于本发明的融合多肽中。当融合时赋予融合产物热稳定性的热稳定性蛋白质是适用的。热稳定性允许所产生的蛋白质保持构形，且将所产生的蛋白质保持在室温下。这一特征有利于以容易、节省时间和节省成本的方式回收融合多肽。适用于本发明的热稳定性酶的代表性家族为葡聚糖水解酶家族。这些酶特异性裂解混合连接型多糖中与1，3-β键联相邻的1，4-β糖苷键(汉(Hahn)等人，1994美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，91：10417；以引用的方式并入本文中)。这些酶发现于诸如燕麦和大麦等谷物中，而且也在包括热纤梭菌(C.thermocellum)等许多真菌和细菌物种中发现(金科瓦(Goldenkova)等人，2002，分子生物学(Mol.Biol.)36：698；以引用的方式并入本文中)。因此，用于本发明的融合多肽中的所需热稳定性蛋白质包括糖苷酶。例示性热稳定性糖苷酶蛋白质包括由选自表1中所示的基因库保藏编号的基因库保藏编号表示的蛋白质，各自内容是通过完全并入各参考编号的基因库保藏信息以引用的方式并入本文中。用于本发明的融合蛋白中的例示性热稳定性酶包括热纤梭菌(Clostridium thermocellum)P29716、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)P37073和海洋红嗜热盐菌(Rhodthermus marinus)P45798，其各自以引用其基因库保藏编号的方式并入本文中。代表性融合蛋白利用经修饰的从热纤梭菌分离的热稳定性酶，然而，根据本发明可类似地利用任何热稳定性蛋白质。例示性热稳定性糖苷酶蛋白质列于表1中：
表1：热稳定性糖苷酶蛋白质
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虽然本文提供例示性热稳定性多肽的序列，但应了解可以使用展现热稳定性的任何序列。在一些实施例中，用于本发明的热稳定性多肽具有如下氨基酸序列：与具有选自由SEQ ID NO：1-40组成的群组的序列约60％一致、约70％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致、约91％一致、约92％一致、约93％一致、约94％一致、约95％一致、约96％一致、约97％一致、约98％一致、约99％一致或100％一致。在一些实施例中，所述热稳定性多肽保留热稳定性。
在一些实施例中，热稳定性多肽具有如下氨基酸序列：包含具有选自由SEQ ID NO：1-40组成的群组的序列的约100个连续氨基酸。在一些实施例中，热稳定性多肽具有如下氨基酸序列：与具有选自由SEQ ID NO：1-40组成的群组的序列的约100个氨基酸的连续段约60％一致、约70％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致、约91％一致、约92％一致、约93％一致、约94％一致、约95％一致、约96％一致、约97％一致、约98％一致、约99％一致或100％一致。
在一些实施例中，热稳定性多肽具有如下氨基酸序列：包含具有选自由SEQ ID NO：1-40组成的群组的序列的约150个、约200个、约250个、约300个、约350个、约400个、约450个、约500个、约550个、约600个、约650个、约700个或更多个连续氨基酸。在一些实施例中，热稳定性多肽具有如下氨基酸序列：与具有选自由SEQ ID NO：1-40组成的群组的序列的约150个、200个、250个、300个、350个或更多个氨基酸的连续段约60％一致、约70％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致、约91％一致、约92％一致、约93％一致、约94％一致、约95％一致、约96％一致、约97％一致、约98％一致、约99％一致或100％一致。
当设计本发明的融合蛋白和多肽时，当然需要保留抗原的免疫原性。此外，在本发明的某些方面需要提供使融合蛋白具有热稳定性的构筑体。这一特征有利于以容易、节省时间和节省成本的方式回收目标抗原。在某些方面，可选择提供其它优势的抗原融合搭配物，所述优势包括增强免疫原性、并入多个疫苗决定子的可能性、和免于使疫苗接种个体预先暴露于免疫原。所关注的融合肽的其它有利性质包括使并入一个或一个以上抗原的操作变得容易的蛋白质，以及有可能使疫苗制剂的制备、纯化和/或调配变得容易的蛋白质。所属领域的普通技术人员应了解三维呈现可能会影响这些有利特征中的每一种。因此，免疫性或优选性质的保留可能会影响例如融合搭配物的选择和/或融合位置的选择(例如N端、C端、内部、其组合)。或者或另外，优选可能会影响选择用于融合的区段的长度，无论其为抗原长度，还是为所选融合搭配物的长度。
本发明者已证明多种抗原可与热稳定性蛋白质成功融合。举例来说，本发明者已使用又称为地衣多糖酶的热稳定性载体分子LicB来产生融合蛋白。LicB是来自热纤梭菌的1，3-1，4-β葡聚糖酶(LicB)(基因库保藏编号：X63355[gi：40697])：
MKNRVISLLMASLLLVLSVIVAPFYKAEAATVWTPFVAVFSNFDSSQWEKADWANGSVFNCVWKPSQVTFSNGKMILTLDREYGGSYPYKSGEYRTKSFF GYGYYEVRMKAAKNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEIDIEFLGKDTTKVQFNWYBCNGVGGNEYLHNLGFDASQDFHTYGFEWRPDYIDFYVDGKKVYRGT RNIPVTPGKIMMNLWPGIGVDEWLGRYDGRTPLQAEYEYVKYYPNGVPQDNPTPTPTIAPSTPTNPNLPLKGDVNGDGHVNSSDYSLFKRYLLRVIDRFP
本发明的包含疟原虫抗原多肽的融合蛋白可在包括活体外与活体内系统在内多种表达系统的任一种中制备。所属领域的技术人员将易于理解通常需要优化核酸序列以用于特定表达系统。举例来说，提供用于在植物中表达疟原虫抗原-LicB融合物的例示性优化序列并且以SEQ ID NO：40显示：
Figure BPA00001374782800271
应注意在SEO ID NO：40中，粗体/下划线部分对应于信号序列，斜体/下划线部分对应于6×His标签和内质网滞留序列，而呈小写字母形式的两个部分对应于限制性位点。
因此，编码本发明的疟原虫抗原多肽、融合蛋白和其免疫原性部分的任何相关核酸都打算涵盖在本发明的核酸构筑体中。
对于在植物系统中制备，可利用表达疟原虫抗原(例如疟原虫多肽、其融合物和/或其免疫原性部分)的转基因植物。或者或另外，可使用所属领域中熟知的产生稳定生产作物的方法来制备转基因植物。另外，可使用利用短暂表达系统的植物来制备疟原虫抗原多肽。当利用植物表达系统时，不管是利用在植物中转基因还是短暂表达，都可根据系统对所需抗原的适用性，利用细胞核表达、叶绿体表达、线粒体表达或病毒表达中的任一种。此外，可利用其它表达系统来制备本发明的抗原和融合蛋白。举例来说，可使用哺乳动物表达系统(例如哺乳动物细胞系[例如CHO等])、细菌表达系统(例如大肠杆菌(E.coli))、昆虫表达系统(例如杆状病毒)、酵母表达系统和活体外表达系统(例如网状组织溶解产物)来表达本发明的抗原和融合蛋白。
制备疟原虫抗原
根据本发明，可在任何合意系统中制备疟原虫抗原(包括疟原虫多肽、其融合物和/或其免疫原性部分)；制备不限于植物系统。载体构筑体和表达系统为所属领域中所熟知且可适合于结合使用本文所提供的疟原虫抗原多肽。举例来说，疟原虫抗原多肽可在已知表达系统中制备，所述表达系统包括哺乳动物细胞系统、转基因动物、微生物表达系统、昆虫细胞系统和植物系统(包括转基因和短暂植物系统)。具体来说，如果疟原虫抗原多肽制备为融合蛋白，那么可能需要在非植物系统中制备所述融合蛋白。
在一些实施例中，希望在植物系统中制备疟原虫抗原多肽。植物相对易于遗传操作，且具有若干种优于诸如人类流体、动物细胞系、重组微生物和转基因动物等替代来源的优点。植物对于蛋白质具有类似于哺乳动物的完善的翻译后修饰机构(但应注意到在植物与哺乳动物之间糖基化模式存在某些差异)。这使得能够在植物组织中制备生物活性试剂。同时，植物可经济地产生极大量的生物质，而无需复杂的设施。此外，植物不受动物病原体污染。如同脂质体和微囊一般，预期植物细胞对于抗原通过胃肠道提供保护。
可经由使用各种制备系统，利用植物来制备异源蛋白质。一种所述系统包括使用转基因/遗传改造植物，其中将编码目标产物的基因永久地并入到植物的基因组中。转基因系统可产生作物制备系统。多种外来蛋白质(包括许多哺乳动物来源的蛋白质和许多疫苗候选抗原)已在转基因植物中表达且显示具有功能活性。(塔科特(Tacket)等人，2000，传染病杂志(J.Infect.Dis.)，182：302；和山瓦拉(Thanavala)等人，2005，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，102：3378；两者都以引用的方式并入本文中)。另外，向未经免疫的人类志愿者投予表达乙型肝炎主要表面抗原的未经处理的转基因植物导致发生免疫反应(库塔(Kapusta)等人，1999，美国实验生物学联合会会志(FASEBJ.)，13：1796；以引用的方式并入本文中)。
一种用于在植物中表达多肽的系统利用经工程改造以表达外来序列(例如短暂表达)的植物病毒载体。这种方法允许使用健康非转基因植物作为快速制备系统。因此，遗传工程改造植物和经重组植物病毒感染的植物可用作“绿色工厂”以迅速产生和制备所关注的特定蛋白质。植物病毒具有某些使得其作为用于制备外来蛋白质的表达载体具有吸引力的优势。已充分表征植物RNA病毒的若干个成员，且感染性cDNA克隆可用来促进遗传操作。感染性病毒遗传物质进入易感宿主细胞后，其复制达到高含量且迅速传遍整个植物。存在若干种使用植物病毒表达载体来制备目标多肽的方法，包括将目标多肽并入病毒基因组中。一种方法包括工程改造感染细菌、动物或植物的病毒的外壳蛋白以充当抗原性肽的载体分子。所述载体蛋白具有装配和形成在表面上呈现所需抗原性抗原决定基的重组病毒样粒子的能力。由于疫苗候选物的微粒性质有利于以容易且节省成本的方式从植物组织中回收，因此这种方法允许以节省时间的方式制备疫苗候选物。其它优势包括目标特异性免疫原性增强，并入多个疫苗决定子的可能性和易于调配成可以经鼻、经口或非经肠传递的疫苗。举例来说，含有带有病毒抗原决定基与外壳蛋白融合的重组植物病毒粒子的菠菜叶在投予后产生免疫反应(莫德斯卡(Modelska)等人，1998，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，95：2481；和友斯博(Yusibov)等人，2002，疫苗(Vaccine)，19/20：3155；两者都以引用的方式并入本文中)。
植物表达系统
本发明的教示适用于多种不同植物。一般来说，任何适于表达如本文所述的所引入构筑体的植物都适用于本发明。在许多实施例中，将需要使用幼苗来提高蛋白质/多肽产生的速度。如本文所指示，在许多实施例中，利用发芽的籽苗。如所属领域中所已知，大多数芽生长快速，从而由贮藏种子长出可食用植物。然而，所属领域的普通技术人员应了解，术语“发芽的籽苗”在本文中在较普遍情形下用于指幼苗，而不管品种是否通常归类为“芽”。生长足够长时间从而具有足够绿色生物质以便允许引入和/或表达如本文所提供的表达构筑体的任何植物(应认识到相关时间可以视表达构筑体的传递和/或表达模式而变化)在本文中可以视为“发芽的籽苗”。
在许多实施例中，利用可食用植物(即欲投予蛋白质或多肽的个体可食用(对所述个体无毒)的植物)。
根据本发明可利用容易并入和/或维持异源核酸且能够产生异源蛋白质的任何植物。一般来说，通常需要利用能够在规定条件下(例如在温室中和/或在水性系统中)生长的植物。可能需要选择通常不由人类或驯养动物食用的植物和/或通常不为人类食物链的部分的植物，以便其可在外界生长而无需考虑可能不当摄取所表达的聚核苷酸。然而，在一些实施例中，可能需要采用可食用植物。在特定实施例中，将需要利用在植物的可食用部分累积所表达的多肽的植物。
通常，某些合意植物特征将由所欲表达的特定聚核苷酸确定。仅举数个实例，当聚核苷酸编码欲以高产量产生的蛋白质时(例如当欲表达抗原蛋白时，情况通常如此)，通常需要选择具有相对高的生物质的植物(例如烟草，其具有其它优势，即其高度容易感染病毒，具有短生长期且不在人类食物链中)。如果聚核苷酸编码完全活性要求特定翻译后修饰(或受特定翻译后修饰抑制)的抗原蛋白，那么某些植物物种完成相关修饰(例如特定糖基化)的能力(或无法完成)可指导选择。举例来说，植物能够完成某些翻译后修饰(例如糖基化)，然而，植物将不会产生哺乳动物翻译后修饰中所见的唾液酸化(sialyation)模式。因此，抗原的植物制备可能导致产生不同于替代系统中所产生的相同蛋白质序列的实体。
在某些实施例中，利用作物植物或作物相关植物。在某些特定实施例中，利用可食用植物。
用于本发明的植物包括被子植物(Angiosperm)、苔藓植物(Bryophyte)(例如苔纲(Hepaticae)、藓纲(Musci)等)、蕨类植物(Pteridophyte)(例如蕨类(ferns)、楔叶类(horsetails)、石松植物(lycopods))、裸子植物(Gymnosperm)(例如针叶树(conifers)、苏铁(cycase)、银杏(Ginko)、买麻藤(Gnetales))和藻类(Algae)(例如绿藻纲(Chlorophyceae)、褐藻纲(Phaeophyceae)、红藻纲(Rhodophyceae)、蓝藻纲(Myxophyceae)、黄藻纲(Xanthophyceae)和裸藻纲(Euglenophyceae))。例示性植物为以下各科的成员：豆科(Leguminosae)(豆科(Fabaceae)；例如豌豆、紫花苜蓿、大豆)；禾本科(Gramineae)(禾本科(Poaceae)；例如玉米、小麦、稻谷)；茄科(Solanaceae)，尤其西红柿属(Lycopersicon)(例如西红柿)、茄属(Solanum)(例如马铃薯、茄子)、番椒属(Capsium)(例如胡椒)或烟草属(Nicotiana)(例如烟草)；伞形科(Umbelliferae)，尤其胡萝卜属(Daucus)(例如胡萝卜)、旱芹属(Apium)(例如芹菜)或芸香科(Rutaceae)(例如橙)；菊科(Compositae)，尤其莴苣属(Lactuca)(例如莴苣)；十字花科(Brassicaceae/Cruciferae)，尤其芸苔属或芥子属。在某些方面，本发明的植物可为芸苔属或拟南芥属(Arabidopsis)物种。一些例示性十字花科成员包括油菜(Brassica campestris)、埃塞俄比亚芥(B.carinata)、芥菜(B.juncea)、欧洲油菜(B.napus)、黑芥(B.nigra)、甘蓝(B.oleraceae)、撒哈拉芥(B.tournifortii)、白芥子(Sinapis alba)和萝卜(Raphanus sativus)。一些适于转化且发芽籽苗可食用的适合植物包括紫花苜蓿、绿豆、萝卜、小麦、芥菜、菠菜、胡萝卜、甜菜、洋葱、大蒜、芹菜、大黄、叶类植物(诸如卷心菜或生菜)、水田芹或水芹、草本植物(诸如欧芹、薄荷或三叶草)、花椰菜、西兰花、大豆、小扁豆、可食用花(诸如向日葵)等。
多种植物物种可适合于实施本发明。多种不同豆类和其它物种可适于由从农杆菌构筑体投放(例如通过农杆菌渗透(agroinfiltration)引入)的病毒载体产生异源蛋白质，所述豆类和其它物种包括例如赤豆(adzuki bean)、紫花苜蓿(alfalfa)、大麦(barley)、西兰花(broccoli)、比尔跳豆(bill jump pea)、荞麦(buckwheat)、卷心菜(cabbage)、花椰菜(cauliflower)、三叶草(clover)、甘蓝(collard greens)、胡芦巴(fenugreek)、亚麻(flax)、鹰嘴豆(garbanzo bean)、青豆(green pea)、日本菠菜(Japanese spinach)、无头甘蓝(kale)、卡姆小麦(kamut)、球茎甘蓝(kohlrabi)、大粒豌豆(marrowfat pea)、绿豆(mung bean)、芥菜叶(mustard greens)、斑豆(pinto bean)、萝卜(radish)、红三叶草(red clover)、大豆(soy bean)、斑点豌豆(speckled pea)、向日葵(sunflower)、烟草(tobacco)、埃塞俄比亚芥(turnip)、黄夹豆(yellow trapper pea)和其它植物。在一些实施例中，比尔跳豆、青豆、大粒豌豆、斑点豌豆和/或黄夹豆特别适用于本发明的这一方面。因此，在某些实施例中，本发明提供在一种或一种以上所述植物中使用投放编码所关注的相关蛋白质或多肽的病毒构筑体(即具有植物病毒特征的RNA)的农杆菌载体制备蛋白质或多肽(例如抗原)。在一些实施例中，RNA具有AlMV的特征(和/或包括AlMV的序列)。在一些实施例中，RNA具有TMV的特征(和/或包括TMV的序列)。
应了解，一方面，本发明提供表达所关注的目标蛋白质或多肽的幼苗(例如发芽的籽苗)。在一些实施例中，幼苗是由转基因种子长出；本发明还提供可产生和/或用于本文所述的方法的种子。可使转有任何所关注基因的转基因种子发芽且任选诱导产生所关注的蛋白质或多肽。举例来说，可使能够表达任何所关注基因的种子发芽且通过以下方式诱导：i)病毒感染；ii)农杆菌渗透；或iii)含有病毒基因组的细菌。可使能够表达任何Pfs多肽的转基因的种子发芽且通过以下方式诱导以产生全长分子：i)病毒感染；ii)农杆菌渗透；或iii)用含有病毒基因组的细菌接种。可使来自健康非转基因植物的种子发芽且通过以下方式用于产生目标序列：i)病毒感染；ii)农杆菌渗透；或iii)用含有病毒基因组的细菌接种。
在一些实施例中，幼苗是由非转基因的种子长出。通常，所述幼苗将包含指导所关注的蛋白质或多肽表达的病毒序列。在一些实施例中，所述植物还可包含农杆菌序列，任选包括“投放”病毒序列的序列。
将载体引入植物中
一般来说，可根据已知技术将载体传递到植物中。举例来说，可将载体本身直接施用到植物(例如经由研磨剂接种、机械化喷雾接种、真空渗透、粒子轰击或电穿孔)。或者或另外，可(例如从已感染植物)制备病毒粒子，且可根据已知技术将其施用到其它植物。
已知多种感染各种植物物种的病毒，且可用于本发明的聚核苷酸表达(参见例如，病毒分类和命名法(The Classification and Nomenclature of Viruses)，“国际病毒分类委员会第6次报告(Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses)”，(摩非(Murphy)等人编)，施普林格(Springer Verlag)：纽约，1995；格日森(Grierson)等人，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)，布莱克(Blackie)，伦敦，第126-146页，1984；格鲁兹曼(Gluzman)等人，分子生物学通讯：病毒载体(Communications in Molecular Biology：Viral Vectors)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约，第172-189页，1988；和马修(Mathew)，植物病毒在线(Plant Viruses Online)；所述文献全部都以引用的方式并入本文中)。在某些实施例中，传递共同允许病毒载体的复制(和任选细胞间移动和/或长距离移动)的多种不同载体，而不是向植物细胞传递单一病毒载体。转基因植物的基因组可编码一些或所有蛋白质。在本文中进一步详述的某些方面，这些系统包括一种或一种以上病毒载体组分。
载体系统包括两种异源植物病毒的组分以获得易于感染多种植物类型但仅造成极低感染传播风险或无感染传播风险的系统。先前已描述例示性系统(参见例如PCT公开案WO 00/25574和美国专利公开案2005/0026291，两者都以引用的方式并入本文中)。如本文所述，在本发明的特定方面，例如通过渗透或机械接种、喷雾等将病毒载体施用到植物(例如植物、植物的一部分、芽等)。如果欲通过将病毒基因组直接施用到植物来实现感染，那么可使用任何可用技术来制备基因组。举例来说，许多适用于本发明的病毒具有ssRNA基因组。可通过在活体内或活体外转录基因组的DNA拷贝或复制RNA拷贝来制备ssRNA。考虑到易于使用的活体外转录系统(例如SP6、T7、网状组织溶解产物等)的易获得性，以及维持RNA载体的DNA拷贝的便利性，预期通常将通过尤其使用T7或SP6聚合酶的活体外转录来制备本发明的ssRNA载体。
在某些实施例中，引入多种不同病毒载体，而不是将单一病毒载体类型引入植物中。所述载体可例如关于诸如复制、细胞间移动和/或长距离移动等功能彼此反式互补。载体可含有编码本发明疟原虫抗原多肽的不同聚核苷酸。可如上文对于单一聚核苷酸或多肽所述，对表达编码一种或一种以上疟原虫抗原多肽的多种多肽的植物或其部分进行选择。
植物组织表达系统
如以上所讨论，根据本发明，疟原虫抗原多肽可在任何合意系统中制备。载体构筑体和表达系统为所属领域中所熟知且可适合于结合使用本文所提供的疟原虫抗原多肽。举例来说，已知转基因植物制备且可根据所属领域中已知的技术改适构筑体的产生和植物制备。在一些实施例中，需要植物中的短暂表达系统。这些系统中的两种包括克隆根和克隆植物系统和其衍生物的制备，以及发芽籽苗系统的制备。
克隆植物
克隆根历经长时间和多次次培养均一地在整个根中维持RNA病毒表达载体和稳定产生目标蛋白质。与植物不同，如果在细胞间移动或长距离移动期间经由重组消除目标基因，那么在根培养物中病毒载体的完整性可以得到保持且目标蛋白质随时间的产生量与在初始筛选期间所观察到的量相似。克隆根允许容易地制备用于抗原和疫苗组合物的口服调配物的异源蛋白质材料。先前已描述用于产生多种从植物获得且适用于制备抗原(例如本发明的抗原蛋白)的克隆实体的方法和试剂且其为所属领域中所已知(参见例如PCT公开案WO 05/81905；其以引用的方式并入本文中)。克隆实体包括能够产生抗原(例如本发明的抗原蛋白)的克隆根系、克隆根细胞系、克隆植物细胞系和克隆植物。本发明进一步提供用于在从各种植物组织(例如根、叶)获得的克隆细胞系和从单一细胞获得的完整植物(克隆植物)中表达抗原聚核苷酸和多肽产物的方法和试剂。所述方法通常是基于使用各种类型的植物病毒载体。
举例来说，一方面，本发明提供获得表达编码本发明的疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的克隆根系的方法，其包含以下步骤：(i)将包含编码本发明的疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的病毒载体引入植物或其部分中；和(ii)从植物产生一种或一种以上克隆根系。可例如通过用引起发根形成的农杆菌(例如发根农杆菌(A.rhizogenes))感染植物或植物部分(例如所收集的叶片)来产生克隆根系。可以各种方法筛选克隆根系以鉴别维持病毒的根系、以高水平表达编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的根系等。本发明进一步提供克隆根系，例如根据本发明的方法所产生的克隆根系，且进一步涵盖使用克隆根系表达编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸和制备编码所述多肽的多肽的方法。
本发明进一步提供产生表达编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的克隆根细胞系的方法，其包含以下步骤：(i)产生克隆根系，其细胞含有基因组包含编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的病毒载体；(ii)从克隆根系释放个别细胞；和(iii)将细胞维持在适于根细胞增殖的条件下。本发明提供克隆根细胞系和使用克隆根细胞系表达聚核苷酸和制备多肽的方法。
一方面，本发明提供产生表达编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的克隆植物细胞系的方法，其包含以下步骤：(i)产生克隆根系，其细胞含有基因组包含编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的病毒载体；(ii)从克隆根系释放个别细胞；和(iii)将培养物中的细胞维持在适于植物细胞增殖的条件下。本发明进一步提供产生表达编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的克隆植物细胞系的方法，其包含以下步骤：(i)将包含编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的病毒载体引入维持在培养物中的植物细胞系的细胞中；和(ii)富集含有病毒载体的细胞。可通过例如以下步骤来进行富集：(i)从培养物中移出一部分细胞；(ii)稀释所移出的细胞以便降低细胞浓度；(iii)使所稀释的细胞增殖；和(iv)筛选含有病毒载体的细胞。可使用克隆植物细胞系制备本发明的疟原虫抗原多肽。
本发明包括多种用于产生克隆植物的方法，所述植物的细胞含有包含编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的病毒载体。举例来说，本发明提供产生表达编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的克隆植物的方法，其包含以下步骤：(i)产生克隆根系，其细胞含有基因组包含编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的病毒载体；(ii)从克隆根系释放个别细胞；和(iii)将所释放细胞维持在适于形成植物的条件下。本发明进一步提供产生表达编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的克隆植物的方法，其包含以下步骤：(i)产生克隆植物细胞系，其细胞含有基因组包含编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的病毒载体；和(ii)将细胞维持在适于形成植物的条件下。一般来说，本发明的克隆植物可表达任何编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸。可使用所述克隆植物制备抗原多肽。
如上文所述，本发明提供用于在克隆根系、克隆根细胞系、克隆植物细胞系(例如从叶、茎等获得的细胞系)和克隆植物中表达编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的系统。使用基因组包括编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸可操作地连接于启动子(即在启动子控制下)的植物病毒载体将编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸引入植物祖细胞中。根据以下进一步描述的若干种技术中的任一种，由含有病毒的细胞建立克隆根系或克隆植物细胞系。可通过感染、用病毒转录物或感染性cDNA克隆接种、电穿孔、T-DNA介导的基因转移等，将植物病毒载体或其部分引入植物细胞中。
以下章节随后描述用于产生表达编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的克隆根系、克隆根细胞系、克隆植物细胞系和克隆植物的方法。“根系”与“根细胞系”的区别之处在于，根系产生实际根样结构或根，而根细胞系由不形成根样结构的根细胞组成。打算使用术语“系”来表明所述系的细胞可增殖且将遗传信息传递给后代细胞。细胞系的细胞通常在培养物中增殖而不会成为诸如那些在完整植物中发现的有组织结构的一部分。打算使用术语“根系”来表明根结构中的细胞可增殖而不会成为完整植物的一部分。应注意术语“植物细胞”涵盖根细胞。然而，为区分本发明的用于产生根系和根细胞系的方法与那些用于从非根组织直接产生植物细胞系的方法(与从克隆根系或从克隆根系获得的克隆植物产生克隆植物细胞系相对比)，如本文所使用的术语“植物细胞”和“植物细胞系”通常是指由非根植物组织组成的细胞和细胞系。植物细胞可为例如叶、茎、芽、花部分等。应注意可从如本文中所获得产生的克隆植物获得种子。所述种子可能与从所述种子获得的植物一样含有病毒载体。用于获得种子储备物的方法为所属领域中所熟知(参见例如美国专利公开案2004/093643；以引用的方式并入本文中)。
克隆根系
本发明提供用于产生克隆根系的系统，在所述克隆根系中使用植物病毒载体来指导编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的表达。根据多种已知方法中的任一种，将一个或一个以上包括编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸可操作地连接于启动子的病毒表达载体引入植物或其部分中。举例来说，可用病毒转录物接种植物叶。可将载体本身直接施用到植物(例如经由研磨剂接种、机械化喷雾接种、真空渗透、粒子轰击或电穿孔)。或者或另外，可(例如从已感染植物)制备病毒粒子且可根据已知技术将病毒粒子施用到其它植物。
如果通过将病毒基因组直接施用到植物来实现感染，那么可使用任何可用技术来制备病毒基因组。举例来说，许多根据本发明适合使用的病毒具有ssRNA基因组。可通过在活体内或活体外转录基因组的DNA拷贝或复制RNA拷贝来制备ssRNA。考虑到易于使用的活体外转录系统(例如SP6、T7、网状组织溶解产物等)的易获得性，以及维持RNA载体的DNA拷贝的便利性，预期通常将通过尤其使用T7或SP6聚合酶的活体外转录来制备本发明的ssRNA载体。可使用感染性cDNA克隆。可根据所属领域中已知的方法，使用例如农杆菌渗透，使用农杆菌介导的基因转移将诸如病毒载体(整个病毒基因组或其部分)等病毒核酸转移到植物细胞。
接着可在适于病毒转录物复制的条件下维持(例如培养或生长)植物或植物部分。在某些实施例中，病毒扩散到初始接种的细胞以外，例如从细胞到细胞局部扩散和/或从初始接种的叶系统地扩散到其它叶。然而，在一些实施例中，病毒不扩散。因此，病毒载体可含有编码功能性MP和/或CP的基因，但可能缺乏这些基因中的一种或两种。一般来说，将病毒载体引入植物或其部分中的多个细胞中(感染所述细胞)。
将病毒载体引入植物中后，收集叶。一般来说，可在引入病毒载体后的任何时间收集叶。然而，将病毒载体引入植物中后，可能需要维持植物一段时间，例如对于病毒复制和任选病毒从初始引入其中的细胞扩散来说足够的一段时间。通过例如以下进一步描述的已知方法来制备克隆根培养物(或多个培养物)。
一般来说，可使用任何可用方法从已引入了病毒载体的植物或植物组织制备克隆根培养物。一种所述方法使用存在于某些细菌质粒中的基因。在感染多种生物体且将DNA转移到这些多种生物体中的各种农杆菌物种中发现这些质粒。作为一个属，农杆菌可将DNA转移到一大组不同的植物类型，包括许多双子叶与单子叶被子植物物种和裸子植物(参见例如，戈尔文(Gelvin)，2003，微生物与分子生物学评论(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)，67：16和其中的参考文献，其全部都以引用的方式并入本文中)。植物细胞的遗传转化的分子基础是从细菌转移且整合到存在于各种农杆菌物种中的大肿瘤诱导(Ti)或生根(Ri)质粒的区域的植物核基因组中。当存在于质粒中时，将这一区域称为T区，且当从质粒切除时称为T-DNA。通常，单链T-DNA分子在天然存在的农杆菌感染中转移到植物细胞中且最终并入(以双链形式)基因组中。基于Ti质粒的系统广泛用于将外来遗传物质引入植物中和制备转基因植物。
用各种农杆菌物种感染植物和转移T-DNA具有许多作用。举例来说，根癌农杆菌(A.tumefaciens)造成冠瘿病，而发根农杆菌造成在感染部位出现发根，即称为“发根病”的病状。各根是从单一遗传转化的细胞形成。因此，根中的根细胞为克隆细胞，且各根代表一个克隆细胞群体。发根农杆菌感染所产生的根的特征为高生长速率和遗传稳定性(格里(Giri)等人，2000，生物技术进展(Biotech.Adv.)，18：1和其中的参考文献，其全部都以引用的方式并入本文中)。另外，这些根能够再生遗传稳定植物(格里(Giri)2000，见上)。
一般来说，本发明涵盖使用能够诱导由植物细胞形成根的任何农杆菌菌株，尤其任何发根农杆菌菌株。如上文所述，Ri质粒的一部分(Ri T-DNA)是引起发根病的原因。尽管将Ri质粒的这一部分转移到植物细胞宜通过用含有Ri质粒的农杆菌感染来实现，但本发明涵盖使用将相关区域引入植物细胞中的替代性方法。这些方法包括将遗传物质引入植物细胞中的任何可用方法，包括(但不限于)基因枪、电穿孔、PEG介导的DNA吸收、Ti基载体等。可通过使用病毒载体将Ri T-DNA的相关部分引入植物细胞中。Ri基因可包括在含有编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的同一载体中，或可与含有编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的载体相同或不同类型的不同病毒载体中。应注意，如所属领域中所已知，产生发根可能不需要整个Ri T-DNA，且本发明涵盖使用部分Ri T-DNA，但是所述部分含有足以诱导根形成的遗传物质。可将其它遗传物质(例如存在于Ri质粒而不是T-DNA中的基因)转移到本发明的植物细胞中，尤其是表达产物促进T-DNA整合到植物细胞DNA中的基因。
为制备某些实施例的克隆根系，使所收集的叶部分在适于感染和转化的条件下与发根农杆菌接触。将叶部分维持在培养物中以让发根发育。各根为克隆根，即根中的细胞是来源于转移有Ri T-DNA的单一祖细胞。根据本发明，一部分所述祖细胞将含有病毒载体。因此，来源于这种祖细胞的根中的细胞可能含有病毒载体，因为病毒载体将在细胞分裂期间复制和传播。因此，高比例(例如至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％)、全部(100％)或实质上全部(至少98％)的细胞将含有病毒载体。应注意，由于克隆根内的子代细胞遗传得到病毒载体，因此在整个根中维持病毒载体并不需要病毒载体在根内移动。可从叶部分移出个别克隆发根并进一步培养。这些根在本文中又称为根系。分离后，分离出的克隆根继续生长。
可大规模培养根系以制备如下文进一步讨论的本发明多肽的抗原。应注意，通常可将克隆根系(和从克隆根系获得的细胞系)维持在不包括通常用于培养根和植物细胞的各种化合物(例如植物生长激素，诸如植物生长素(auxin)、细胞分裂素(cytokinin)等)的培养基中。这一特征大大地降低与组织培养相关的费用，且本发明者预期其将显著促进使用植物制备蛋白质的经济可行性。
可用多种方法中的任一种来选择表达编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的克隆根。可使用西方印迹法、ELISA分析等来检测所编码的多肽。在诸如GFP等可检测标记的情况下，可执行诸如目视筛选等替代性方法。如果使用含有编码可选择性标记的聚核苷酸的病毒载体，那么可进行适当选择(例如，可在适当抗生素或营养条件和经鉴别且分离的存活根存在下，培养由此获得的叶材料和/或根)。某些病毒载体含有两种或两种以上编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸，例如两种或两种以上编码不同多肽的聚核苷酸。如果这些聚核苷酸中的一种为可选择或可检测标记，那么通过选择或检测标记的表达而选择或检测的克隆根将具有也表达第二种聚核苷酸的高概率。也可以使用PCR和其它核酸检测方法来进行含有特定聚核苷酸的根系的筛选。
或者或另外，可通过接种由于病毒感染而会形成局部病变的宿主植物(例如高敏感性宿主植物)来筛选存在病毒的克隆根系。举例来说，可在50μl磷酸盐缓冲液中将5mg根组织均质化且用以接种单一烟草植物叶。如果病毒存在于根培养物中，那么在2至3天内所感染的叶上将会出现特征性病变。这意谓根系含有带有编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的重组病毒。如果无局部病变形成，那么不存在病毒，且根系作为阴性而不被接受。这一方法高度节省时间和成本。初始筛选病毒的存在后，可通过例如西方印迹法或ELISA对含有病毒的根进行第二次筛选以选择高表达者。可应用其它筛选，例如筛选迅速生长、特定培养基中或特定环境条件下的生长等。一般来说，这些筛选方法可应用在本文所述的克隆根系、克隆根细胞系、克隆植物细胞系和/或克隆植物的任一个的发育中。
如对于所属领域的技术人员将显而易见，可对本发明方法的描述进行多种修改以用于产生含有病毒载体的克隆根系。这些修改处于本发明的范围内。举例来说，尽管通常需要在引入Ri T-DNA基因前将病毒载体引入完整植物或其部分中，但在某些实施例中，在引入病毒载体前引入Ri-DNA。另外，可使完整植物与发根农杆菌接触，而不是收集叶部分，然后使其暴露于细菌。
可使用从含有病毒载体的植物或其部分的单一细胞产生克隆根系的其它方法(即，不使用发根农杆菌或来自Ri质粒的遗传物质的方法)。举例来说，已知用某些植物激素或植物激素的组合处理会导致从植物组织产生根。
从克隆根系获得的克隆细胞系
如上文所述，本发明提供用于产生克隆根系的方法，其中根系中的细胞含有病毒载体。如所属领域中所熟知，可从根产生多种不同细胞系。举例来说，可使用多种已知方法从由根获得的个别根细胞产生根细胞系。可从根中的各种不同根细胞类型获得这些根细胞系。一般来说，收集根材料并解离(例如以物理方式和/或酶促消化)以释放个别根细胞，然后进一步培养。通常不必形成完整原生质体。需要时，可在极稀细胞浓度下涂铺根细胞，以便从单一根细胞获得根细胞系。以此方式获得的根细胞系为含有病毒载体的克隆根细胞系。因此，这些根细胞系展现编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的稳定表达。可通过例如在适当植物激素存在下培养解离的根细胞，以类似方式从克隆根获得克隆植物细胞系。可使用筛选和连续几轮富集来鉴别以高水平表达编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的细胞系。然而，如果获得细胞系的克隆根系已以高水平表达，那么所述其它筛选可能就不需要了。
如在克隆根系的情况下一般，从含有病毒载体的单一祖细胞获得克隆根细胞系的细胞，且其因此也将含有病毒载体，因为病毒载体将在细胞分裂期间复制和传播。因此，高比例(例如至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％)、全部(100％)或实质上全部(至少98％)的细胞将含有病毒载体。应注意，由于克隆根细胞系内的子代细胞遗传得到病毒载体，因此维持病毒载体并不需要病毒载体在细胞间移动。如下文所述，可使用克隆根细胞系来制备编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸。
克隆植物细胞系
本发明提供用于产生克隆植物细胞系的方法，在所述克隆植物细胞系中，使用植物病毒载体指导编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的表达。根据本发明方法，将一个或一个以上包括编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸可操作地连接于启动子的病毒表达载体引入维持在细胞培养物中的植物细胞系的细胞中。所属领域中已知来自各种植物类型的许多植物细胞系，可使用其中任一种。可根据用于实施本发明的已知方法来产生新近获得的细胞系。根据许多方法中的任一种，将病毒载体引入植物细胞系的细胞中。举例来说，可制备原生质体，然后用电穿孔将病毒转录物引入到细胞中。可使用其它将植物病毒载体引入植物细胞系的细胞中的方法。
一种用于产生本发明的克隆植物细胞系和适于引入植物细胞(例如原生质体)中的病毒载体的方法可如下使用：在引入病毒载体后，可将植物细胞系维持在组织培养物中。此时，病毒载体可能会复制，且编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸可得到表达。通过例如连续富集法，从培养物获得克隆植物细胞系。举例来说，可任选在稀释的同时，从培养物中移出样品以便细胞浓度较低，且以个别液滴形式涂铺于皮氏培养皿(Petri dish)中。然后，维持液滴以让细胞分裂。
应了解，视培养物的初始密度和稀释量而定，液滴可含有可变数目的细胞。如果需要在仅一轮富集后获得表达编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的克隆细胞系，那么可稀释细胞以使得大多数液滴含有0或1个细胞。然而，选择使得各液滴中存在多个细胞的浓度并随后筛选液滴以鉴别那些含有表达细胞的液滴可能更为有效。一般来说，可采用任何适当筛选程序。举例来说，可使用诸如GFP等可检测标记的选择或检测。可使用西方印迹法或EL1SA分析。个别液滴(100μl)含有过量细胞以用于进行这些分析。进行多轮富集以连续分离较高表达的细胞系。可使用用于单细胞克隆的标准方法，通过进一步限制稀释来产生单克隆植物细胞系(即，从单一祖细胞获得的群体)。然而，不必分离个别克隆系。可使用含有多个克隆细胞系的群体来表达编码一种或一种以上本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸。
一般来说，上述关于产生克隆根系的某些考虑因素适用于克隆植物细胞系的产生。举例来说，可使用多种含有一个或一个以上编码本发明疟原虫抗原多肽的聚核苷酸的病毒载体，也可使用多个不同载体的组合。可使用类似筛选法。如在克隆根系和克隆根细胞系的情况下一般，从含有病毒载体的单一祖细胞获得克隆植物细胞系的细胞，且其因此也将含有病毒载体，因为病毒载体将在细胞分裂期间复制和传播。因此，高比例(例如至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％)、全部(100％)或实质上全部(至少98％)的细胞将含有病毒载体。应注意，由于克隆植物细胞系内的子代细胞遗传得到病毒载体，因此维持病毒载体并不需要病毒载体在细胞间移动。如下文所述，可使用克隆植物细胞系来制备编码本发明疟原虫抗原多肽的多肽。
克隆植物
可从根据上述各种方法所产生的克隆根、克隆根细胞系和/或克隆植物细胞系产生克隆植物。用于从根、根细胞系和植物细胞系(诸如本文所述的克隆根系、克隆根细胞系和克隆植物细胞系)产生植物的方法为所属领域中所熟知(参见例如皮尔斯(Peres)等人，2001，植物细胞、组织、器官培养(Plant Cell，Tissue，Organ Culture)，65：37；以引用的方式并入本文中；和本文别处所引用的关于植物分子生物学和生物技术的标准参考著作)。因此，本发明提供一种产生克隆植物的方法，其包含以下步骤：(i)根据上述本发明方法中的任一种产生克隆根系、克隆根细胞系或克隆植物细胞系；和(ii)从克隆根系、克隆根细胞系或克隆植物产生完整植物。克隆植物可根据标准方法繁殖和生长。
如在克隆根系、克隆根细胞系和克隆植物细胞系的情况下一般，从含有病毒载体的单一祖细胞获得克隆植物的细胞，且其因此也将含有病毒载体，因为病毒载体将在细胞分裂期间复制和传播。因此，高比例(例如至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％)、全部(100％)或实质上全部(至少98％)的细胞将含有病毒载体。应注意，由于克隆植物内的子代细胞遗传得到病毒载体，因此维持病毒载体并不需要病毒载体的移动。
芽和发芽籽苗植物表达系统
根据本发明，可使用多种不同系统中的任一种来在幼苗(例如发芽的籽苗)中表达蛋白质或多肽。在一些实施例中，产生转基因细胞系或种子，接着发芽和生长一段时间以便在幼苗组织中(例如在发芽的籽苗中)产生转基因序列中所包括的蛋白质或多肽。用于制备转基因植物细胞和/或种子的典型技术包括根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移和微弹轰击(microprojectile bombardment)或电穿孔。
先前已描述用于产生多种适用于制备本发明疟原虫抗原多肽的芽和发芽籽苗的系统和试剂且其为所属领域中所已知(参见例如PCT公开案WO 04/43886；以引用的方式并入本文中)。本发明进一步提供可食用的发芽籽苗作为含有疟原虫抗原多肽的生物质。在某些方面，直接提供生物质以供食用含有抗原的组合物。在某些方面，生物质在食用前通过例如均质化、粉碎、干燥或提取进行加工。在某些方面，从生物质纯化疟原虫抗原多肽且调配成医药组合物。
另外提供用于在可以活体食用或收集的发芽籽苗(例如芸苔属的芽、发芽籽苗)中制备疟原虫抗原多肽的方法。在某些方面，本发明包括使种子在封闭的可调节环境中(例如在室内、在容器中等)生长为可食用的发芽籽苗。种子可为含有编码疟原虫抗原多肽的表达序列盒的遗传工程改造种子，所述疟原虫抗原多肽的表达由外源诱导型启动子驱动。可使用可由例如光、热、植物激素、营养素等诱导的多种外源诱导型启动子。
在相关实施例中，本发明提供在发芽籽苗中制备疟原虫抗原多肽的方法，所述方法首先通过使用农杆菌转化系统用编码疟原虫抗原多肽的表达序列盒转化植物来产生发芽籽苗的种子储备物，其中疟原虫抗原多肽的表达是由诱导型启动子驱动。可从转化植物获得转基因种子，使其在封闭的可调节环境中生长并诱导以表达疟原虫抗原多肽。
在一些实施例中，提供包括用编码疟原虫抗原多肽的病毒表达序列盒感染发芽籽苗的方法，所述疟原虫抗原多肽的表达可由病毒启动子或诱导型启动子中的任一种驱动。使发芽籽苗在封闭的可调节环境中生长2至14天或至少直到已获得对食用或收集来说足量的疟原虫抗原多肽。
本发明进一步提供在发芽籽苗中制备疟原虫抗原多肽的系统，所述系统包括可控制气候的容纳单元和含有编码一个或一个以上疟原虫抗原多肽的表达序列盒的发芽籽苗，其中表达是由组成型或诱导型启动子驱动。系统可提供优于不可控制的室外环境或温室的独特优点。因此，本发明使得生长物能够精确安排疟原虫抗原多肽表达的诱导。这可大大降低制备疟原虫抗原多肽的时间和成本。
在某些方面，短暂转染的芽含有编码本发明疟原虫抗原多肽的病毒载体序列。使籽苗生长一段时间以允许在芽中产生病毒核酸，接着生长一段产生多个病毒拷贝的时间，从而导致产生疟原虫抗原多肽。
在某些方面，使含有编码疟原虫抗原多肽的核酸的遗传工程改造的种子或胚芽在封闭的可调节环境中生长到发芽籽苗阶段。所述封闭的可调节环境可为种子可在室内生长的容纳单元或房间。封闭的可调节环境的所有环境因素都可控制。由于芽的生长不需要光，且光照费用较高，因此可使遗传工程改造的种子或胚芽在不存在光的情况下在室内生长到发芽籽苗阶段。
本发明的封闭的可调节环境中可调节的其它环境因素包括温度、湿度、水分、营养素、气体(例如，O2或CO2含量或空气循环)、化学物质(小分子，诸如糖和糖衍生物；或激素，诸如植物激素赤霉酸(gibberellic acid)或脱落酸(absisic acid)等)等。
根据本发明的某些方法，编码疟原虫抗原多肽的核酸的表达可由外源诱导型启动子控制。使外源诱导型启动子回应于外部而不是内部刺激来增加或降低核酸表达。多种环境因素可充当遗传工程改造芽的表达序列盒所带的核酸的表达的诱导物。启动子可为热诱导型启动子，诸如热休克启动子(heat-shock promoter)。举例来说，使用热休克启动子，可简单地使封闭环境的温度上升来诱导核酸表达。其它启动子包括光诱导型启动子。如果封闭的可调节环境中的光总是开启的，那么可保持光诱导型启动子作为组成型启动子。或者或另外，可在发育期间的特定时间通过简单地开启光来启动核酸的表达。启动子可为用于诱导核酸表达的化学诱导型启动子。根据这些实施例，可简单地将化学物质喷洒或喷雾在种子、胚芽或籽苗上来诱导核酸表达。可精确控制喷雾和喷洒且引导到预定目标种子、胚芽或籽苗上。封闭环境中没有会使化学物质分散偏离预定目标的风或气流，从而化学物质停留在预定目标上。
根据本发明，可选择诱导表达的时间以使得到收集时间时发芽籽苗中疟原虫抗原多肽的表达达到最大。在特定生长阶段的胚芽中诱导表达，例如在萌发后特定天数时的胚芽中诱导表达可使得在收集时间时疟原虫抗原多肽的合成达到最大。举例来说，在萌发后4天的启动子诱导表达可使得蛋白质合成比3天后或5天后的启动子诱导表达多。所属领域的技术人员应了解可由常规实验达成表达的最大化。在某些方法中，在萌发后约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或12天时收集发芽的籽苗。
在表达载体具有组成型启动子而不是诱导型启动子的情况下，可在转化发芽籽苗后的某一时间收集发芽籽苗。举例来说，如果发芽籽苗在发育早期阶段(例如胚芽阶段)用病毒转化，那么可在转化后表达达到其最大值的时间，例如转化后至多约1天、至多约2天、至多约3天、至多约4天、至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、至多约10天、至多约11天、至多约12天、至多约13天、至多约14天、至多约15天、至多约16天、至多约17天、至多约18天、至多约19天、至多约20天、至多约21天、至多约22天、至多约23天、至多约24天、至多约25天、至多约26天、至多约27天、至多约28天、至多约29天、至多约30天收集发芽的籽苗。视种子的萌发而定，芽在转化后可发育1、2、3个月或3个月以上。
一般来说，疟原虫抗原多肽的表达开始后，允许种子、胚芽或发芽籽苗生长直到表达足量的疟原虫抗原多肽。在某些方面，足量是当生食所收集的生物质时将向患者提供治疗益处的量。或者或另外，足量是可从生物质浓缩或纯化疟原虫抗原多肽并将所述疟原虫抗原多肽调配成在投予后向患者提供治疗益处的医药组合物的量。疟原虫抗原多肽通常不是自然界中在发芽籽苗中所表达的蛋白质。无论如何，疟原虫抗原多肽通常以高于自然界中发芽籽苗中会存在的浓度的浓度表达。
诱导疟原虫抗原多肽的表达后，允许继续生长直到发芽籽苗阶段，此时收集发芽的籽苗。可收集活的发芽籽苗。收集活的发芽籽苗具有若干个优点，包括工作量和破坏最小。可以水栽法培养本发明的发芽籽苗，从而使得收集成为从水栽法溶液中取出发芽籽苗的简单事情。虽然本发明的发芽籽苗的生长不需要土壤，但如果所属领域的技术人员认为有必要或需要，那么可以提供土壤。因为芽可以无土生长，所以在收集时不需要清洗发芽籽苗材料。能够在不洗涤或擦洗下直接从水栽法环境中收集发芽籽苗使对所收集的材料造成的破坏最小。植物的破坏和枯萎诱发细胞凋亡。在细胞凋亡期间，某些蛋白水解酶变得具有活性，其会降解发芽籽苗中所表达的医药蛋白质，从而导致蛋白质的治疗活性降低。细胞凋亡诱导的蛋白水解可能会显著降低成熟植物的蛋白质产量。使用本发明的方法，当不进行收集时可避免细胞凋亡直到从植物提取蛋白质时为止。
举例来说，可研磨、粉碎或掺合活的芽以制备发芽籽苗生物质于含有蛋白酶抑制剂的缓冲液中的浆液。可将缓冲液维持在约4℃下。在一些方面，将发芽籽苗生物质风干、喷雾干燥、冷冻或冷冻干燥。如同在成熟植物中一般，这些方法中的一些方法(诸如风干)可能导致医药蛋白质的活性降低。然而，因为发芽籽苗极小且具有大的表面积与体积的比率，所以这很可能不会发生。所属领域的技术人员应了解，可利用许多使所表达蛋白质的蛋白水解最少的生物质收集技术，且可将这些技术应用于本发明。
在一些实施例中，发芽的籽苗可食用。在某些实施例中，收集后(例如收集后立即、在收集后最短时间内)食用表达足量疟原虫抗原多肽的发芽籽苗以使得在食用发芽的籽苗前绝对未进行加工。以此方式，使得在向需要治疗的个体投予疟原虫抗原多肽前疟原虫抗原多肽的任何收集诱导的蛋白水解分解最少。举例来说，可向个体直接传递准备食用的发芽籽苗。或者或另外，向需要治疗的个体交付遗传工程改造的种子或胚芽并由个体培养到发芽籽苗阶段。一方面，向个体或治疗个体的医生提供一批遗传工程改造的发芽籽苗，以便可培养表达某些所需疟原虫抗原多肽的发芽籽苗的连续储备物。这对无法承担或交付昂贵药物的发展中国家的人群来说可能特别有价值。培养本发明的发芽籽苗的容易性使得本发明的发芽籽苗尤其合乎所述发展中国家人群的需要。
封闭环境的可调节性质赋予本发明优于在室外环境中培养植物的优点。一般来说，培养在植物中表达医药蛋白质的遗传工程改造的发芽籽苗相比于培养遗传工程改造的植物提供生长较快(因为植物在幼苗时收集)且工作量、风险和调节考虑因素较少的医药产品。本发明所使用的封闭的可调节环境降低或消除自然界中植物异花受粉的风险。
举例来说，热诱导型启动子可能不能在室外使用，因为室外温度无法控制。室外温度上升到超过某一水平的任何时间，启动子都将开启。类似地，每当室外温度下降时，启动子都将关闭。所述温度转变可能会在一天内发生，例如白天开启表达而在夜晚关闭表达。热诱导型启动子(诸如本文中所述的那些启动子)甚至将不适合用于易受几乎与室外相同程度的气候转变影响的温室中。遗传工程改造植物在温室中的培养成本相当高。相比之下，在本发明系统中，每个变量都可控制，从而每次收集都可获得最大量的表达。
在某些实施例中，可在发芽籽苗发育期间的任何时间浇水、喷雾或喷洒的盘中培养本发明的发芽籽苗。举例来说，盘可配备有一个或一个以上可在发芽籽苗发育期间在特定时间且以精确量传递和/或去除水、营养素、化学物质等的浇水、喷雾、喷洒和排水设备。举例来说，种子需要足够水分来保持潮湿。过量水分穿过盘孔排出且进入房间地面的排水沟中。通常在将排出水排回到环境中之前，将其酌情处理以去除有害化学物质。
盘的另一个优点在于其可容纳在极小的空间内。因为发芽籽苗的生长不需要光，所以含有种子、胚芽或发芽籽苗的盘可一个叠一个地垂直紧密堆叠，从而在为了达到这些目的而特别构造的容纳设施中每单位占地面积提供大量生物质。另外，盘的堆叠可在容纳单元内以水平行排列。籽苗生长到适于收集的阶段(约2至14天)后，将个别籽苗盘人工地或以自动方式(诸如传送带)移到加工设施中。
本发明的系统的独特之处在于其提供作为疟原虫抗原多肽来源的发芽籽苗生物质。无论直接食用还是加工成医药组合物形式，因为发芽籽苗是在封闭的可调节环境中生长，所以发芽籽苗生物质和/或从生物质获得的医药组合物都可以低成本提供给消费者。另外，可控制发芽籽苗的生长条件的事实使得产品品质和纯度一致。本发明的封闭的可调节环境避免可能妨碍科学家在室外培养遗传工程改造的农产品的环境保护局(EPA)的许多安全规程。
转化芽
可使用多种方法转化植物细胞并产生遗传工程改造的发芽籽苗。要求在活体外产生转基因植物细胞系，接着使细胞系再生成完整植物的两种可利用的转化植物的方法包括根癌农杆菌介导的基因转移和微弹轰击或电穿孔。在一些实施例中，利用短暂表达系统。在植物组织中产生蛋白质或多肽的短暂表达的典型技术利用植物病毒。病毒转化提供在获得所需产物之前不会发生实验或生育滞后，更快速且成本较低的转化可收集的胚芽和发芽籽苗的方法。对于这些技术中的任一种，所属领域的技术人员应了解如何调整和优化传统上已经用于植物、种子、胚芽或发芽籽苗的转化方案。
本发明提供具有病毒表达系统(例如快速表达、高产生量)和农杆菌转化(例如控制投药)的优点的表达系统。具体来说，如以下所详细讨论，本发明提供农杆菌构筑体(即，在农杆菌中复制且因此可通过传递农杆菌而传递到植物细胞的构筑体)包括引入植物中后指导带有所关注蛋白质或多肽的基因的病毒序列(例如包括病毒复制序列)表达的植物启动子的系统。这一系统允许蛋白质或多肽在植物中以受控方式高水平短暂表达。
以下更详细地个别讨论表达系统的多个不同实施例，其中一些产生转基因植物而其它提供短暂表达。对于任何这些技术，阅读本说明书的所属领域的技术人员应了解如何调整和优化用于在幼苗组织(例如发芽籽苗)中表达蛋白质或多肽的方案。
农杆菌转化
农杆菌是革兰氏阴性(gram-negative)根瘤菌科(Rhizobiaceae)的代表性属。这一物种造成植物肿瘤，诸如冠瘿病和发根病。在作为肿瘤特征的去分化植物组织中，植物产生称为冠瘿碱(opine)的氨基酸衍生物并由农杆菌分解代谢。负责冠瘿碱表达的细菌基因是嵌合表达序列盒的控制元件的便利来源。根据本发明，可使用农杆菌转化系统产生仅早于成熟植物收集的幼苗(例如发芽籽苗，包括可食用发芽籽苗)。农杆菌转化方法可容易地应用于再生表达疟原虫抗原多肽的发芽籽苗。
一般来说，用农杆菌转化植物包括通过与带有植物/细菌载体的根癌农杆菌共培养来转化在组织培养物中生长的植物细胞。所述载体含有编码疟原虫抗原多肽的基因。农杆菌将载体转移到植物宿主细胞中，然后使用抗生素处理来清除农杆菌。选择表达疟原虫抗原多肽的转化植物细胞，使其分化并最终再生成为完整小植物(海伦斯(Hellens)等人，2000，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)，42：819；皮龙·史密兹(Pilon-Smits)等人，1999，植物生理学(Plant Physiolog.)，119：123；巴菲尔德(Barfield)等人，1991，植物细胞报告(Plant Cell Reports)，10：308；和瑞瓦(Riva)等人，1998，生物技术杂志(J.Biotech)，1(3)；全部都以引用的方式并入本文中)。
用于本发明中的农杆菌表达载体包括设计用于在植物中操作的编码疟原虫抗原多肽的基因(或表达序列盒)以及表达序列盒的上游和下游的伴随序列(companion sequence)。伴随序列通常具有质粒或病毒来源且向载体提供必要的特征以将DNA从细菌转移到所需植物宿主中。
可能希望基本细菌/植物载体构筑体能提供广泛宿主范围的原核生物复制起点、原核生物可选择标记。合适的原核生物可选择标记包括针对诸如氨苄西林(ampicillin)或四环素(tetracycline)等抗生素的抗性。载体中可存在所属领域中熟知的编码其它功能的其它DNA序列。
农杆菌介导的将DNA转移到植物染色体需要农杆菌T-DNA序列。通常在构建农杆菌表达构筑体期间去除T-DNA的肿瘤诱导基因并用编码疟原虫抗原多肽的序列置换。保留T-DNA边界序列，因为其启动T-DNA区域整合到植物基因组中。如果疟原虫抗原多肽的表达不易被检测到，那么细菌/植物载体构筑体可包括适于确定植物细胞是否已转化的可选择标记基因，例如nptII卡那霉素(kanamycin)抗性基因。Ti序列位于同一或不同细菌/植物载体(Ti质粒)上。Ti序列包括编码一组负责T-DNA的切除、转移和整合到植物基因组中的蛋白质的毒性基因(谢尔(Schell)，1987，科学(Science)，237：1176-86；以引用的方式并入本文中)。适于允许异源序列整合到植物基因组中的其它序列可包括用于同源重组的转座子序列(transposon sequence)等。
Ti序列位于同一或不同细菌/植物载体(Ti质粒)上。Ti序列包括编码一组负责T-DNA的切除、转移和整合到植物基因组中的蛋白质的毒性基因(谢尔(Schell)，1987，科学(Science)，237：1176-83；以引用的方式并入本文中)。适于允许异源序列整合到植物基因组中的其它序列也可包括用于同源重组的转座子序列(transposon sequence)等。
某些构筑体将包括编码抗原蛋白的表达序列盒。在指定转化中可使用1个、2个或更多个表达序列盒。除含有疟原虫抗原多肽编码序列外，重组表达序列盒还含有至少以下元件：启动子区域、植物5′非翻译序列、起始密码子(视所表达基因是否自身具有而定)以及转录和翻译终止序列。另外，本发明的表达序列盒或嵌合基因中可包括转录和翻译终止子。表达序列盒中酌情可包括允许蛋白质加工和易位的信号分泌序列。
多种启动子、信号序列以及转录和翻译终止子例如在劳顿(Lawton)等人(1987，植物分子生物学(Plant Mol Biol)，9：315-24；以引用的方式并入本文中)和美国专利5,888,789(以引用的方式并入本文中)中有所描述。另外，通常利用抗生素抗性的结构基因作为选择因子(弗雷利(Fraley)等人，1983，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)，80：4803-7；以引用的方式并入本文中)。表达序列盒的5′和3′末端的独特限制酶位点允许容易地插入预先存在的载体中。
用于农杆菌介导的转化且带有至少一个T-DNA边界序列的其它二元载体(binary vector)系统在PCT公开案WO 2000/020612(以引用的方式并入本文中)中有所描述。对农杆菌介导的转化的进一步讨论见于戈尔文(Gelvin)(2003，微生物与分子生物学评论(Microbiol Mol Biol Rev.)，67：16-37；和其中的参考文献；全部都以引用的方式并入本文中)和劳伦思(Lorence)和费尔波尔特(Verpoorte)(2004，分子生物学方法(Methods Mol Biol)，267：329-50；以引用的方式并入本文中)中。
在某些实施例中，使用除农杆菌以外的细菌将核酸序列引入植物中。参见例如布鲁斯特(Broothaerts)等人(2005，自然(Nature)，433：629-33；以引用的方式并入本文中)。
由已受农杆菌(或其它细菌)感染以便引入编码所关注的蛋白质或多肽的所需异源基因的植物制备种子。收集、干燥、清洁所述种子并检验其存活力和所需基因产物的存在和表达。这一点被确定后，通常就将种子储备物贮存在适当温度、湿度、卫生和安全条件下以供必要时使用。然后可从所培养的原生质体再生出完整植物，例如如伊维恩斯(Evans)等人(植物细胞培养手册(Handbook of Plant Cell Cultures)，第1卷，麦克米兰出版公司(MacMillan Publishing Co.)，纽约(New York，NY)，1983；以引用的方式并入本文中)和瓦斯尔(Vasil)(编，植物细胞培养和体细胞遗传学(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants)，学术出版社(Acad.Press)，佛罗里达州奥兰多(Orlando，FL)，第I卷，1984和第III卷，1986；以引用的方式并入本文中)所述。在某些方面，植物仅再生到发芽籽苗阶段。在一些方面，再生出完整植物以产生种子储备物且从种子储备物的种子产生发芽的籽苗。
在某些实施例中，植物并不再生成成熟植物。举例来说，在一些实施例中，植物仅再生到发芽籽苗阶段。在其它实施例中，再生出完整植物以产生种子储备物且从所述种子储备物的种子产生本发明中所使用的幼苗(例如发芽的籽苗)。
可根据本发明用农杆菌转化可分离出原生质体并进行培养以产生完整再生植物的所有植物，以便回收含有所转移基因的完整植物。已知几乎所有植物都可从培养的细胞或组织再生，包括(但不限于)产生可食用芽的植物的所有主要物种。一些合适的植物包括紫花苜蓿、绿豆、萝卜、小麦、芥菜、菠菜、胡萝卜、甜菜、洋葱、大蒜、芹菜、大黄、叶类植物(诸如卷心菜或生菜)、水田芹或水芹、草本植物(诸如欧芹、薄荷或三叶草)、花椰菜、西兰花、大豆、小扁豆、可食用花(诸如向日葵)等。
从转化细胞再生植物的方式随植物物种的不同而变化。然而，所属领域的技术人员应了解通常首先提供含有异源基因拷贝的经转化原生质体的悬浮液。形成愈伤组织且可从愈伤组织诱导出芽，随后生根。或者或另外，可从原生质体悬浮液诱导胚芽形成。这些胚芽如同天然胚芽一样萌发形成植物。将种子浸泡在水中或用水喷洒种子以使种子的水分含量增加到35-45％之间，从而启始萌发。为使萌发继续进行，通常在控制温度和气流条件下将种子维持在饱含水分的空气中。培养基通常将含有各种氨基酸和激素，诸如植物生长素和细胞分裂素。宜向培养基中添加谷氨酸和脯氨酸，尤其对诸如紫花苜蓿等物种来说。芽和根通常同时发育。有效再生将视培养基、基因型和培养历史而定。如果可控制这三个变量，那么再生完全可再现和可重复。
使从转化植物细胞长成的成熟植物自花授粉并鉴别非隔离纯合转基因植物。近亲繁殖的植物产生含有本发明抗原编码序列的种子。可使所述种子萌发并生长到发芽籽苗阶段以产生本发明的疟原虫抗原多肽。
在相关实施例中，转基因种子(例如带有编码疟原虫抗原多肽的所转移基因，通常整合到基因组中)可形成为种子产品并与关于如何使幼苗生长到适当阶段(例如发芽籽苗阶段)以收集和/或投予或收集到本文所述的调配物中的说明书一起出售。在一些相关实施例中，可从本发明的近亲繁殖植物发展体现所需性状的杂交品种或新颖品种。
直接整合
还可通过微弹轰击或电穿孔将DNA片段直接整合到植物细胞的基因组中来将编码疟原虫抗原多肽的表达构筑体引入到本发明的植物组织中(参见例如，奇科特(Kikkert)等人，1999，植物：组织培养协会杂志(Plant：J.Tiss.Cult.Assoc.)，35：43；和巴特斯(Bates)，1994，分子生物技术(Mol.Biotech.)，2：135；两者都以引用的方式并入本文中)。更具体来说，可利用多种技术将表达本发明的疟原虫抗原多肽的载体引入植物细胞中。如上文所述，载体可包括用于植物细胞中的可选择标记。载体可包括允许在二级宿主中选择和传播的序列，诸如含有复制起点和可选择标记的序列。二级宿主通常包括细菌和酵母。在一些实施例中，二级宿主是细菌(例如大肠杆菌(Escherichia coli)，复制起点为colEl型复制起点)而可选择标记是编码氨苄西林抗性的基因。这些序列为所属领域中所熟知且可购得(例如克隆泰克公司(Clontech)，加利福尼亚州帕洛阿尔托(Palo Alto，CA)；或斯群他根公司(Stratagene)，加利福尼亚州拉霍亚(La Jolla，CA))。
本发明的载体可修饰为含有与根癌农杆菌载体具有同源性的区域、来自根癌农杆菌的T-DNA边界区域和上述嵌合基因或表达序列盒的中间植物转化质粒。其它载体可包括根癌农杆菌的卸甲(disarmed)植物肿瘤诱导质粒。
根据一些实施例，本发明载体的直接转化可包括通过使用微量吸液管机械转移重组DNA来将载体直接微量注射至植物细胞中(参见例如，克罗斯威(Crossway)，1985，分子普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)，202：179，以引用的方式并入本文中)。可使用聚乙二醇将遗传物质转移到植物细胞中(参见例如，克莱恩斯(Krens)等人，1982，自然(Nature)，296：72；以引用的方式并入本文中)。另一种将核酸引入植物中的方法是通过小珠粒或粒子的基质内或表面上具有核酸的小粒子的高速弹道渗透(参见例如，克莱因(Klein)等人，1987，自然(Nature)，327：70；和克努德森(Knudsen)等人，植物(Planta)，185：330；两者都以引用的方式并入本文中)。另一种引入方法是使原生质体与其它实体(小型细胞、细胞、溶酶体或其它可融合脂质表面体)融合(参见例如，费雷利(Fraley)等人，1982，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)，79：1859；以引用的方式并入本文中)。可通过电穿孔将本发明的载体引入植物细胞中(参见例如，佛姆(Fromm)等人，1985，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)，82：5824；以引用的方式并入本文中)。根据这一技术，在含有基因构筑体的质粒存在下对植物原生质体进行电穿孔。高磁场强度的电脉冲可逆地渗透生物膜，从而允许引入质粒。电穿孔植物原生质体重新形成细胞壁分割且形成植物愈伤组织，愈伤组织可再生形成本发明的发芽籽苗。所属领域的技术人员应了解如何利用这些方法来转化可用于产生可食用发芽籽苗的植物细胞。
病毒转化
类似于常规表达系统，可使用植物病毒载体制备全长蛋白质，包括全长抗原。根据本发明，可使用植物病毒载体感染种子、胚芽、发芽籽苗等并在其中产生抗原。在这点上，感染包括将病毒基因组或其部分引入细胞中的任何方法，包括(但不限于)病毒的天然感染方法、擦伤、接种等。所述术语包括将基因组RNA转录物或其cDNA拷贝引入细胞中。病毒基因组不需要完整基因组，但通常将含有足以允许复制的序列。基因组可以编码病毒复制酶且可以含有复制所必需的任何顺式作用核酸元件。编码短肽以及大的复杂蛋白质的外来基因的高水平表达(例如通过烟草花叶病毒载体)已有描述(参见例如，麦克考米克(McCormick)等人，1999，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)，96：703；库玛盖(Kumagai)等人，2000，基因(Gene)，245：169；和维奇(Verch)等人，1998，免疫方法杂志(J.Immunol Methods)，220：69；其全部都以引用的方式并入本文中)。因此，植物病毒载体具有已证明的表达短肽以及大的复杂蛋白质的能力。
在某些实施例中，利用宿主/病毒系统产生表达疟原虫抗原多肽的幼苗(例如芽)。由病毒感染产生的幼苗提供已经证明安全的转基因蛋白质的来源。举例来说，芽未受动物病原体污染。不同于例如烟草，来自可食用芽的蛋白质至少在理论上可不经纯化而用于经口应用，因此成本显著降低。
另外，病毒/幼苗(例如芽)系统提供简单得多、价格较低廉的扩大规模和制造的途径，因为相关基因(编码所关注的蛋白质或多肽)是被引入到病毒中，而所述病毒可在数日内生长到商业规模。相比之下，转基因植物在可获得足够的种子或植物材料供大规模试验或商业化利用之前可能需要长达5-7年。
根据本发明，植物RNA病毒具有某些优点，这使其成为有吸引力的外来蛋白质表达的载体。多种植物RNA病毒的分子生物学和病理学已经充分表征，且存在相当多的关于病毒生物学、遗传学和调控序列的知识。大多数植物RNA病毒具有小基因组且感染性cDNA克隆可用于促进遗传操纵。感染性病毒物质进入易感宿主细胞后，其复制到高含量且快速传遍整个发芽籽苗(接种后1至10天，例如接种后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或10天以上)。病毒粒子可容易且经济地从受感染的发芽籽苗组织回收。病毒具有广泛的宿主范围，使得能够使用单一构筑体来感染若干种易感物种。这些特征可容易地转移到芽上。
通常可通过用所需序列置换一个病毒基因、通过将外来序列插入病毒基因组中的适当位置或通过使外来肽与病毒的结构蛋白融合，从植物RNA病毒表达外来序列。此外，可组合任何这些方法以通过反向互补病毒的重要功能来表达外来序列。存在许多不同策略作为使用烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)、紫花苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus，AlMV)和其嵌合体在病毒感染的植物中表达外来序列的手段。
AlMV的基因组是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)的代表性病毒且由三个基因组RNA(RNA1-3)和亚基因组RNA(RNA4)组成。基因组RNA1和2分别编码病毒复制酶蛋白P1和P2。基因组RNA3编码细胞间移动蛋白P3和外壳蛋白(coat protein，CP)。CP是从由基因组RNA3合成的亚基因组RNA4翻译，且为起始感染所需。研究已证明CP与多种功能有关，包括基因组活化、复制、RNA稳定性、症状形成和RNA衣壳化(encapsidation)(参见例如波尔(Bol)等人，1971，病毒学(Virology)，46：73；范德沃森(Van Der Vossen)等人，1994，病毒学(Virology)，202：891；俞斯波维(Yusibov)等人，病毒学(Virology)，208：405；俞斯波维(Yusibov)等人，1998，病毒学(Virology)，242：1；波尔(Bol)等人，(综述，100篇参考文献(Review，100refs.))，1999，普通病毒学杂志(J.Gen.Virol)，80：1089；德格拉夫(De Graaff)，1995，病毒学(Virology)，208：583；贾斯帕斯(Jaspars)等人，1974，病毒研究进展(Adv.Virus Res.)，19：37；洛谢费里斯(Loesch-Fries)，1985，病毒学(Virology)，146：177；尼尔曼(Neeleman)等人，1991，病毒学(Virology)，181：687；尼尔曼(Neeleman)等人，1993，病毒学(Virology)，196：883；范德库衣(Van Der Kuyl)等人，1991，病毒学(Virology)，183：731；和范德库衣(Van Der Kuyl)等人，1991，病毒学(Virology)，185：496；其全部都以引用的方式并入本文中)。
使病毒从种子、胚芽或发芽籽苗的接种部分长距离移动到未接种部分和系统性感染通常需要病毒粒子的衣壳化。根据本发明，接种可在植物发育的任何阶段进行。在胚芽和芽中，所接种病毒的扩散将非常快。AlMV病毒粒子由独特的CP(24kD)衣壳化，形成1种以上类型的粒子。粒子的尺寸(长度为30至60nm且直径为18nm)和形状(球形、椭球形或杆状)视衣壳化RNA的尺寸而定。组装后，认为AlMV CP的N端位于病毒粒子的表面上且似乎不干扰病毒组装(波尔(Bol)等人，1971，病毒学(Virology)，6：73；以引用的方式并入本文中)。另外，在N端具有另一38个氨基酸的肽的ALMV CP在活体外形成粒子且保留生物活性(俞斯波维(Yusibov)等人，1995，普通病毒学杂志(J.Gen.Virol)，77：567；以引用的方式并入本文中)。
AlMV具有广泛的宿主范围，包括大量农业上有价值的作物植物，包括植物种子、胚芽和芽。这些特征一起使ALMV CP成为多肽的载体分子的极佳候选物，并使AlMV成为在发育的芽阶段在植物中表达外来多肽序列的有吸引力的候选载体。此外，从诸如TMV等异源载体表达后，AlMV CP衣壳化TMV基因组且不干扰病毒感染性(俞斯波维(Yusibov)等人，1997，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)，94：5784；以引用的方式并入本文中)。这允许使用TMV作为与外来序列融合的AlMV CP的载体病毒。
烟草花叶病毒的原型TMV具有由单一正义RNA组成的基因组经17.0kD CP衣壳化，此产生杆状粒子(长度为300nm)。CP是TMV的唯一结构蛋白且为病毒在受感染宿主中衣壳化和长距离移动所需(塞托(Saito)等人，1990，病毒学(Virology)，176：329；以引用的方式并入本文中)。从基因组RNA翻译出183kD和126kD蛋白质且所述蛋白质为病毒复制所需(石川(Ishikawa)等人，1986，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，14：8291；以引用的方式并入本文中)。30kD蛋白质是病毒的细胞间移动蛋白(美什(Meshi)等人，1987，欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J.)，6：2557)。从亚基因组mRNA翻译出移动蛋白和外壳蛋白(亨特(Hunter)等人，1976，自然(Nature)，260：759；布鲁宁(Bruening)等人，1976，病毒学(Virology)，71：498；和比奇(Beachy)等人，1976，病毒学(Virology)，73：498；其全部都以引用的方式并入本文中)。
可用于将编码疟原虫多肽的基因引入植物细胞中的其它方法包括转化植物的花。拟南芥(Arabidopsis thaliana)的转化可通过将植物花浸泡在根癌农杆菌的溶液中来达成(库提斯(Curtis)等人，2001，转基因研究(Transgenic Res.)，10：363；和青(Qing)等人，2000，分子育种：植物改良中的新策略(Molecular Breeding：New Strategies in Plant Improvement)，1：67；两者都以引用的方式并入本文中)。在“浸泡”植物所产生的种子群体中形成转化植物。在花发育期间的特定时点，子房壁中存在小孔，根癌农杆菌能穿过小孔进入子房内部。进入子房内部后，根癌农杆菌增殖并转化个别胚珠(德斯菲克斯(Desfeux)等人，2000，植物生理学(Plant Physiology)，123：895；以引用的方式并入本文中)。转化胚珠遵循子房内种子形成的典型路径。
农杆菌介导的短暂表达
如本文所说明，在本发明的许多实施例中，需要在植物中快速(例如短暂)表达蛋白质或多肽的系统。本发明提供一种达成所述在植物(尤其在幼苗，例如发芽的籽苗)中快速表达的有效系统，其利用农杆菌构筑体来传递编码疟原虫多肽的病毒表达系统。
具体来说，根据本发明，制备“投放载体”，其含有包括复制序列的农杆菌序列且还含有带有编码所关注的蛋白质或多肽的基因的植物病毒序列(包括自我复制序列)。优选通过允许实质上系统性传递的农杆菌渗透法，将投放载体引入植物组织中。对于短暂转化来说，投放载体的非整合T-DNA拷贝短暂保持存在于细胞核中并且转录，引起载运基因的表达(卡普拉(Kapila)等人，1997，植物科学(Plant Sci.)，122：101-108；以引用的方式并入本文中)。与病毒载体不同，农杆菌介导的短暂表达无法使所关注基因的表达系统性扩散。这一系统的一个优势在于可克隆长于2kb的基因以产生无法利用病毒载体获得的构筑体(韦因尼特(Voinnet)等人，2003，植物杂志(Plant J.)，33：949-56；以引用的方式并入本文中)。此外，使用所述技术，可用一种以上转基因来转化植物，以使得能够表达并组装多聚蛋白质(例如复合蛋白质的抗体亚单位)。此外，可通过个别渗透或使用混合培养物来利用通过与不同农杆菌共渗透而进行多种转基因共表达的可能性。
在某些实施例中，投放载体包括允许在农杆菌中进行选择(或至少检测)以及在渗透组织中进行选择/检测的序列。此外，投放载体通常包括在植物中转录引起病毒RNA产生，随后产生病毒蛋白质的序列。此外，病毒蛋白质和病毒RNA的产生引起快速产生多个拷贝的编码所关注医药活性蛋白质的RNA。所述产生使得在相对短的时间内快速产生所关注的目标蛋白质。因此可产生用于制备蛋白质的高效系统。
利用病毒表达载体的农杆菌渗透技术可用于制备有限量的所关注蛋白质，以便在决定其是否值得产生转基因植物之前检验表达水平。或者或另外，利用病毒表达载体的农杆菌渗透技术适用于快速产生能够作为主要生产平台产生大量蛋白质的植物。因此，这种短暂表达系统可以工业规模使用。
进一步提供可在本发明的这些和其它方面使用的多种不同农杆菌质粒、二元质粒或其衍生物中的任一种，诸如pBIV、pBI1221、pGreen等。大量合适载体为所属领域中所已知且可根据所属领域中已知的方法或本文所述的方法加以引导和/或修饰，以便能够用于本文所提供的所述方法中。
例示性投放载体pBID4含有花椰菜花叶病毒(DNA植物病毒)的35S启动子，其驱动重组病毒基因组在引入植物中后的初始转录；和nos终止子，即农杆菌胭脂碱(nopaline)合成酶的转录终止子。所述载体进一步含有烟草花叶病毒基因组序列，包括用于病毒复制(126/183K)和细胞间移动(MP)的基因。载体进一步含有插入烟草花叶病毒基因组序列内的独特克隆位点中且转录受外壳蛋白亚基因组mRNA启动子控制的编码所关注多肽的基因。由于这一“目标基因”(即编码所关注的蛋白质或多肽的基因)置换TMV外壳蛋白的编码序列，故所得病毒载体为相比于含CP载体不易经历重组且无法在环境中有效扩散和存活的自我复制裸RNA。左和右边界序列(LB和RB)界定在利用带有载体的重组农杆菌渗透植物后转移到植物细胞中的投放载体区域。在将带有这一载体的农杆菌引入植物组织中(通常通过农杆菌渗透法进行，但或者可通过注射或其它方式进行)后，产生多个LB与RB之间的序列的单链DNA(ssDNA)拷贝并于数分钟内释放。随后通过病毒复制来扩增这些所引入的序列。目标基因的翻译导致在短时间内积累大量目标蛋白质或多肽。
在一些实施例中，农杆菌介导的短暂表达在每千克植物组织中产生多达约5g或更多目标蛋白质。举例来说，在一些实施例中，每千克植物组织产生多达约4g、约3g、约2g、约1g或约0.5g目标蛋白质。在一些实施例中，每千克植物组织产生至少约20mg至约500mg或约50mg至约500mg目标蛋白质，或约50mg至约200mg、或约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约170mg、约180mg、约190mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约750mg、约800mg、约850mg、约900mg、约950mg、约1000mg、约1500mg、约1750mg、约2000mg、约2500mg、约3000mg或更多目标蛋白质。
在一些实施例中，这些表达水平在从渗透起约6周、约5周、约4周、约3周或约2周内达到。在一些实施例中，这些表达水平在从引入表达构筑体起约10天、约9天、约8天、约7天、约6天、约5天、约4天、约3天、约2天或甚至约1天内达到。因此，从引入(例如渗透)到收集的时间通常少于约2周、约10天、约1周或更短时间。这允许在从选择氨基酸序列起(甚至包括“预备”表达研究的时间)约8周或更短时间内制备蛋白质。每一批蛋白质通常也可在约8周、约6周、约5周或更短时间内产生。所属领域的普通技术人员应了解，这些数值可视所使用的植物类型而略有变化。大部分芽(包括豌豆)将在指定数值的范围内。然而，本塞姆氏烟草因生长较慢(来自小得多的种子)，而可能生长较长时间(尤其在渗透之前)。所属领域的普通技术人员根据所利用的特定植物的生物学将清楚其它预期的调整。
本发明者已使用投放载体系统在多种不同幼苗中制备多种目标蛋白质和多肽。在一些实施例中，包括例如大粒豌豆、比尔跳豆、黄夹豆、斑点豌豆和青豆在内的某些豌豆品种尤其适用于实施本发明的这一方面。
本发明者还发现，各种烟草属植物尤其适用于实施本发明的这一方面，尤其包括本塞姆氏烟草。所属领域的普通技术人员应了解，烟草属植物通常不被视为“芽”。尽管如此，本发明仍教示，烟草属幼苗(尤其本塞姆氏烟草幼苗)适用于实施本发明。一般来说，在一些实施例中，使本塞姆氏烟草植物在渗透(例如传递含有投放载体的农杆菌)之前生长一段足以允许发展出适量生物质的时间。通常，所述植物在渗透之前生长多于约3周、更通常多于约4周或约5至约6周的时间以积累生物质。
本发明者还意外地发现，尽管TMV与AlMV序列可在所述投放载体构筑体内证实有效，但在一些实施例中，AlMV序列可有效确保制备所传递的蛋白质或多肽。
因此，在本发明的某些特定实施例中，在豌豆幼苗或烟草属幼苗(例如本塞姆氏烟草)中由指导带有所关注基因的AlMV序列产生的投放载体制备所关注的蛋白质或多肽。
表达构筑体
适用于本发明的表达构筑体的许多特征将为如上文所讨论的所用的特定表达系统所特有。然而，可能适用于不同表达系统的某些方面将在此更详细地讨论。
举一例来说，在本发明的许多实施例中，将需要所关注的蛋白质或多肽(或核酸)的表达是可诱导的。在许多这些实施例中，编码所关注的蛋白质或多肽的RNA的产生(和/或反义RNA的产生)是受诱导型(例如外源诱导型)启动子的控制。外源诱导型启动子可回应外部而非内部刺激引起转录物的表达增加或减少。许多环境因素可充当这种外部刺激。在某些实施例中，转录受热诱导型启动子(诸如热休克启动子)控制。
外部诱导型启动子可尤其适用于受控的可调节生长环境的情形。举例来说，使用热休克启动子，可简单地使封闭环境的温度上升来诱导相关转录物的表达。当然，应了解，由于室外温度无法控制，故在室外从不使用热诱导型启动子。室外温度上升到超过某一水平的任何时间，启动子都将开启。类似地，每当室外温度下降时，启动子都将关闭。所述温度转变可在一天内发生，例如白天开启表达而夜晚关闭表达。热诱导型启动子(诸如本文所述的那些启动子)可能甚至将不适合用于易受几乎与室外相同程度的气候转变影响的温室中。遗传工程改造植物在温室中的培养成本相当高。相比之下，在本发明系统中，每个变量都可控制，从而每次收集都可获得最大量的表达。
除本发明所用以外的其它外部诱导型启动子包括光诱导型启动子。如果封闭的可调节环境中的光总是开启的，那么可维持光诱导型启动子作为组成型启动子。或者，可在发育期间的特定时间通过简单地开启光来启动相关转录物的表达。
在其它实施例中，使用化学诱导型启动子来诱导相关转录物的表达。根据这些实施例，可简单地将化学物质喷洒或喷雾在种子、胚芽或幼苗(例如籽苗)上以诱导相关转录物的表达。可视需要精确控制喷雾和喷洒且引导到特定种子、胚芽或幼苗(例如籽苗)上。封闭环境中没有会使化学物质分散偏离预定接受者的风或气流，因此化学物质停留在预定接受者上。
在一些实施例中，本发明的疟原虫多肽可与伴侣蛋白共表达以帮助疟原虫多肽的折叠。分子伴侣蛋白为所属领域中所熟知且可包括疟原虫伴侣蛋白，例如蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)；肽基-脯氨酰基顺-反异构酶(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase，PPI)；DnaJ或Hsp 40同源物(Pfj)；DnaK或Hsp 70同源物(BiP)；和内质网素(endoplasmin)同源物或Grp94(Hsp 90)，或来自其它物种的同源物。
抗原的制备和分离
一般来说，可使用所属领域中已知的标准方法培养或生长本发明的植物、植物细胞和/或植物组织(例如克隆植物、克隆植物细胞、克隆根、克隆根系、芽、发芽的籽苗、植物等)以制备抗原。已采用多种培养基和生物反应器来培养发根细胞、根细胞系和植物细胞(参见例如，格里(Giri)等人，2000，生物技术进展(Biotechnol.Adv.)，18：1；雷奥(Rao)等人，2002，生物技术进展(Biotechnol Adv.)，20：101；和前述两者中的参考文献，其全部都以引用的方式并入本文中)。可以任何合适的方式培养克隆植物。
在某一实施例中，本发明的疟原虫抗原多肽可通过任何已知方法制备。在一些实施例中，在植物或其部分中表达疟原虫抗原多肽。根据所属领域中已知的常规条件和技术来分离和纯化蛋白质。这些技术包括诸如提取、沉淀、色谱、亲和色谱、电泳等方法。本发明涉及使用所属领域中已知和本文所提供的多种植物表达系统(包括本文所述的病毒植物表达系统)中的任一种来纯化疟原虫抗原多肽和以能承担的规模制备疟原虫抗原多肽。
在本发明的许多实施例中，将需要分离疟原虫抗原多肽以用于疫苗产品。当本发明的蛋白质从表达所述蛋白质的植物组织或其部分(例如根、根细胞、植物、植物细胞)制备时，对于从植物材料部分或完全分离中的任一情况来说，可使用本文进一步详述的方法或所属领域中已知的任何适用方法。当需要将表达产物从表达所述表达产物的一些或所有植物细胞或组织中分离时，可采用任何可用的纯化技术。所属领域的技术人员熟悉多种分级分离和分离程序(参见例如，斯考普斯(Scopes)等人，蛋白质纯化：原理与实践(Protein Purification：Principles and Practice)，第3版，杰逊(Janson)等人，1993；蛋白质纯化：原理、高解析度方法和应用(Protein Purification：Principles，High Resolution Methods，and Applications)，威利-VCH(Wiley-VCH)，1998；施普林格(Springer-Verlag)，纽约(NY)，1993；和罗意(Roe)，蛋白质纯化技术(Protein Purification Techniques)，牛津大学出版社(Oxford University Press)，2001；其各自以引用的方式并入本文中)。通常将需要使产物的纯度高于约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％。关于适用于从植物组织或流体纯化物质的某些方法的讨论，参见例如美国专利6,740,740和6,841,659(两者都以引用的方式并入本文中)。
所属领域的技术人员应了解，获得所需疟原虫抗原多肽产物的方法是提取。可提取植物材料(例如根、叶等)以从残余生物质中移出所需产物，由此增加产物的浓度和纯度。可在缓冲溶液中提取植物。举例来说，可将植物材料转移到一定量的已用例如磷酸盐缓冲液缓冲的冰冷水(彼此重量比为1∶1)中。需要时可添加蛋白酶抑制剂。可通过用力掺合或研磨使植物材料碎裂，同时悬浮于缓冲溶液中，且通过过滤或离心移出所提取的生物质。可通过其它步骤来进一步纯化溶液中所带有的产物或通过冷冻干燥或沉淀转化为干粉。提取可通过挤压来进行。植物或根可通过在压榨机中挤压或通过将其穿过间距紧密的滚筒时粉碎来提取。根据所属领域中熟知的方法收集和加工从粉碎植物或根中挤出的流体。通过挤压来提取使得产物以更浓的形式释放。然而，产物的总体产率可能比在溶液中提取产物时低。
在一些实施例中，多肽可进一步通过色谱法(包括(但不限于)阴离子交换色谱法(Q管柱))或超滤法来纯化。含有His标签的多肽可根据标准方法使用镍-交换色谱法来纯化。
在一些实施例中，所制备的蛋白质或多肽不从植物组织分离，而是在活植物(例如发芽的籽苗)的情形中提供。在一些实施例中，当植物可食用时，直接提供含有所表达的蛋白质或多肽的植物组织供食用。因此，本发明提供含有所表达的蛋白质或多肽的可食用幼苗生物质(例如可食用发芽籽苗)。
当可食用植物(例如发芽的籽苗)表达足量的医药蛋白质或多肽且活体食用时，在一些实施例中，在食用发芽的籽苗前绝对不进行收集。以此方式，确保在向需要治疗的个体投予医药蛋白质之前医药蛋白质不存在收集诱导的蛋白水解分解。举例来说，可直接向个体传递准备食用的幼苗(例如发芽的籽苗)。或者，向需要治疗的个体传递遗传工程改造的种子或胚芽并由个体培养到发芽籽苗阶段。在一些实施例中，向个体或治疗个体的医生提供一批遗传工程改造的发芽籽苗，以便可培养表达某些所需医药蛋白质的发芽籽苗的连续储备物。这对无法承担或交付昂贵药物的发展中国家的人群来说可能特别有价值。培养本发明的发芽籽苗的容易性使得本发明的发芽籽苗尤其合乎所述发展中国家人群的需要。
在一些实施例中，植物生物质在食用或调配前通过例如均质化、粉碎、干燥或提取进行加工。在一些实施例中，从生物质分离或纯化所表达的蛋白质或多肽并调配成医药组合物。
举例来说，可研磨、粉碎或掺合活植物(例如芽)以产生生物质于含有蛋白酶抑制剂的缓冲液中的浆液。所述缓冲液优选处于约4℃。在某些实施例中，将生物质风干、喷雾干燥、冷冻或冷冻干燥。如同在成熟植物中一般，一些这些方法(诸如风干)可能导致医药蛋白质或多肽的活性降低。然而，因为植物(例如发芽的籽苗)可能极小且通常具有大的表面积与体积的比率，所以这很可能不会发生。所属领域的技术人员应了解，可利用许多使医药蛋白质或多肽的蛋白水解最低的收集生物质的技术，且可将这些技术应用于本发明。
疫苗
本发明提供包含至少一种疟原虫抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分的疫苗组合物，希望其在投予个体后引发生理作用。疫苗蛋白可具有对抗病症或疾病的恢复治愈或缓和性质且可投予用于改善、缓解、减轻疾病或病症、延迟疾病或病症的发作、逆转或降低疾病或病症的症状或严重程度。包含疟原虫抗原多肽的疫苗可具有预防性质且可用于预防或延迟疾病发作，或降低所述疾病、病症或病理学病状出现时的严重程度或减少或阻断疾病传播到未感染个体。用本发明的抗原治疗个体所引发的生理作用可包括有效免疫反应。蚊虫摄取含有所述抗体的血液可用以阻断蚊虫体内疟原虫的有性繁殖阶段发育并由此阻断疟原虫传播到另一未感染个体，使得生物体感染受阻。在标题为“投药”的章节中更详细地讨论关于向有需要的个体投予疟原虫抗原多肽的考虑因素。
一般来说，有效疫苗接种包括使个体的免疫系统暴露于一种或一种以上视为不需要、非所需和/或外来的且引发内源性免疫反应的药剂。通常，这种免疫反应导致抗原特异性天然淋巴细胞活化，接着产生分泌抗体的B细胞或抗原特异性效应细胞和记忆T细胞或两者。这一方法会产生长久的免疫性，所述免疫性可不时地通过重复暴露于相同抗原性物质而加强。
在一些实施例中，包含至少一种疟原虫抗原多肽的疫苗组合物为亚单位疫苗。一般来说，亚单位疫苗包含经纯化抗原而非完整生物体。亚单位疫苗不具有感染性，因此其可安全地提供给受到免疫抑制的人员，且其很少会诱导不利免疫反应和/或其它不良副作用。亚单位疫苗的一个潜在缺点是，抗原可能不会保留其天然构形，以致针对亚单位所产生的抗体可能不会识别病原体表面上的相同蛋白质；且分离的蛋白质不会刺激免疫系统以及完整生物体疫苗。因此，在一些情形下，可能需要以高于全药剂疫苗(例如活减毒疫苗、灭活病原体疫苗等)的剂量投予亚单位疫苗以达成相同治疗作用。相比之下，全药剂疫苗(诸如利用活减毒病原体或灭活病原体的疫苗)通常产生剧烈免疫反应，但其使用具有限制。举例来说，活疫苗株有时会引起感染性病理学，尤其当投予免疫功能不全的接受者时。
在一些实施例中，包含一种或一种以上植物产疟原虫抗原多肽(例如如本文所述的Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230多肽)的本发明疫苗可投予个体且可刺激免疫反应。在一些实施例中，可使用少于约200μg、少于约150μg、少于约100μg、少于约90μg、少于约80μg、少于约70μg、少于约60μg、少于约50μg、少于约40μg、少于约35μg、少于约30μg、少于约25μg、少于约20μg、少于约15μg、少于约5μg、少于约4μg、少于约3μg、少于约2μg、少于约1μg、少于约0.1μg、少于约0.01μg的植物产疟原虫抗原多肽和/或其免疫原性部分来刺激免疫反应和/或预防疟原虫感染(例如疟疾)、延迟疟原虫感染(例如疟疾)的发作和/或提供针对疟原虫感染(例如疟疾)的防御。
在一些实施例中，本发明提供针对疟原虫属寄生虫的疫苗。在一些实施例中，疫苗包含至少部分从非抗原性组分纯化的抗原。举例来说，疫苗可为疟原虫抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分，其是在活生物体(诸如植物、病毒、细菌、酵母、哺乳动物细胞、卵等)中表达，但至少部分从活生物体的非抗原组分纯化。在一些实施例中，疫苗至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％从表达抗原的生物体的非抗原组分纯化。在一些实施例中，疫苗可为化学合成的疟原虫抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分。
在一些实施例中，疫苗可为疟原虫抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分，其是在活生物体(诸如植物、病毒、细菌、酵母、哺乳动物细胞、卵等)中表达，但并未至少部分从活生物体的非抗原组分纯化。举例来说，疫苗可为疟原虫抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分，其是在直接投予个体以引发免疫反应的活生物体中表达。在一些实施例中，疫苗可为在如本文所述的植物中表达的疟原虫抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分，其中将植物材料直接投予个体以引发免疫反应。
本发明提供医药疟原虫抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分，其作为治疗性和/或预防性治疗疟原虫感染(例如疟疾)和阻断其传播的疫苗具有活性。在某些实施例中，疟原虫抗原多肽可由本发明的植物或其部分(例如根、细胞、芽、细胞系、植物等)产生。在某些实施例中，所提供的疟原虫抗原多肽是在植物、植物细胞和/或植物组织(例如芽、发芽的籽苗、根、根培养物、克隆细胞、克隆细胞系、克隆植物等)中表达，且可从植物直接使用或部分纯化或纯化为用于投予个体医药的制剂。
本发明提供表达疟原虫抗原多肽的植物、植物细胞和植物组织，所述多肽在投予有需要的个体时保持医药活性。例示性个体包括脊椎动物(例如哺乳动物，诸如人类)。根据本发明，个体包括兽医学个体，诸如非人类灵长类动物、牛、羊、犬、猫、啮齿动物、鸟类等。在某些方面，将治疗有效量的可食用植物或其部分(例如芽、根)经口投予个体。在一些方面，以如本文所述的医药制剂提供一种或一种以上疟原虫抗原多肽。
当需要调配包含植物材料的疟原虫疫苗时，通常将需要利用对相关接受者(例如人类或其它动物)无毒的植物。在适当考虑保持所表达产物的活性下，可根据所属领域中已知的技术简单地收集和加工相关植物组织(例如细胞、根、叶)。在某些实施例中，需要在可食用植物中(且具体来说是在植物的可食用部分中)具有所表达的疟原虫抗原多肽以便可随后食用所述材料。举例来说，如果经口传递后(适当调配时)疫苗抗原具有活性，那么可能需要在可食用植物部分中产生抗原蛋白且调配所表达的疟原虫抗原多肽以供与一些或所有表达蛋白质的植物材料一起经口传递。
本发明的疫苗组合物包含一种或一种以上疟原虫抗原多肽。在某些实施例中，所投予的疫苗组合物中包括正好一种疟原虫抗原多肽。在某些实施例中，所投予的疫苗组合物中包括至少两种疟原虫抗原多肽。在一些方面，组合疫苗可包括一种包含疟原虫抗原多肽的热稳定性融合蛋白；在一些方面，提供两种或两种以上包含疟原虫抗原多肽的热稳定性融合蛋白。
在一些实施例中，疫苗组合物包含正好一种疟原虫多肽(例如正好一种选自由Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230多肽组成的群组的多肽)。在一些实施例中，疫苗组合物包含正好两种疟原虫多肽(例如正好两种选自由Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230多肽组成的群组的多肽)。在一些实施例中，疫苗组合物包含正好三种疟原虫多肽(例如正好三种选自由Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230多肽组成的群组的多肽)。在一些实施例中，疫苗组合物包含四种或四种以上(例如4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种或更多种)疟原虫多肽(例如四种或四种以上选自由Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230多肽组成的群组的多肽)。
在一些实施例中，疫苗组合物包含两种或两种以上疟原虫抗原多肽和/或其免疫原性部分的多胞形(即两个或两个以上氨基酸序列的串联融合物)。举例来说，在一些实施例中，多胞形包含正好一种Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230多肽。在一些实施例中，多胞形包含正好两种Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230多肽。在一些实施例中，多胞形包含正好三种Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230多肽。在一些实施例中，多胞形包含四种或四种以上(例如4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种或更多种)Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230多肽。
当利用组合疫苗时，应了解疟原虫抗原多肽的任何组合都可用于所述组合。组合物可包括多种疟原虫抗原多肽，包括本文所提供的多种抗原。此外，组合物可包括本文所提供的一种或一种以上抗原与一种或一种以上其它抗原。疟原虫抗原多肽的组合包括从一种或一种以上各种亚型或品系获得的疟原虫抗原多肽以使免疫接种赋予针对一种以上感染类型的免疫反应。疟原虫抗原多肽的组合可包括至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或更多种从不同亚型或品系获得的抗原。在一些组合中，将至少两种或至少三种来自不同亚型的抗原组合于一种疫苗组合物中。此外，组合疫苗可利用疟原虫抗原多肽和来自一种或一种以上独特感染剂的抗原。
其它疫苗组分
本发明的疫苗组合物可另外包括任何合适的佐剂以在投予个体时增强疫苗的免疫原性。举例来说，所述佐剂可包括(但不限于)皂角苷，诸如皂树(Quillaja saponaria，QS)提取物，包括食品级QS的纯化子部分，诸如Quil A和QS21；明矾；金属盐粒子(氢氧化铝、磷酸铝等)；矿物油；MF59；Malp2；不完全弗氏佐剂；完全弗氏佐剂；3去-O-酰化单磷酰基脂质A(3D-MPL)；脂质A；百日咳杆菌；结核分枝杆菌；默克佐剂65(Merck Adjuvant 65)(新泽西州罗韦的默克公司(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ))；AS03；角鲨烯；病毒颗粒；水包油乳液(例如SBAS2)；脂质体调配物(例如SBAS1)；等。其它佐剂包括免疫调节寡核苷酸，例如如WO 96/02555中所揭示的未甲基化CpG序列。预期诸如上文提及的佐剂等不同佐剂的组合提供作为TH1细胞反应的优选刺激剂的佐剂。举例来说，QS21可与3D-MPL调配到一起。QS21：3D-MPL的比率通常将为约1∶10至10∶1、1∶5至5∶1，且通常实质上为1∶1。最佳协同作用的所需范围可为2.5∶1至1∶1的3D-MPL∶QS21。适用于人类疫苗调配物的纯化QS提取物的剂量为每千克体重0.01mg至10mg。
应注意某些热稳定性蛋白质(例如地衣多糖酶)本身可显示免疫反应增强活性，使得所述蛋白质无论是在与疟原虫抗原多肽融合使用时还是分开使用时都可考虑使用佐剂。因此，本发明的疫苗组合物可进一步包含一种或一种以上佐剂。某些疫苗组合物可包含两种或两种以上佐剂。此外，视调配物和投药途径而定，特定调配物和/或组合中可能需要某些佐剂。
在某些情况下，可能需要通过减缓皮下或肌肉内注射的疫苗产品(例如蛋白质)的一种或一种以上组分的吸收来延长本发明疫苗的作用。这可通过使用具有弱水溶性的结晶或非晶形材料的液体悬浮液来实现。产品的吸收速率则取决于其溶解速率，而溶解速率又可取决于大小和形式。或者或另外，通过将产品溶解或悬浮于油性媒剂中来实现非经肠投予的产品的延迟吸收。通过在诸如聚丙交酯-聚乙交酯等生物可降解聚合物中形成蛋白质的微囊基质来制备可注射储积形式。视产品与聚合物的比率和所采用的特定聚合物的性质而定，可控制释放速率。生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。可通过将产品裹在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储积式可注射调配物。口服调配物可使用替代聚合传递媒剂。举例来说，可使用诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸等生物可降解、生物相容性聚合物。可将抗原或其免疫原性部分调配成微粒，例如与聚合传递媒剂组合。
经肠投予的疫苗抗原制剂可以固体、半固体、悬浮液或乳液形式引入，且可与任何医药学上可接受的载剂(诸如水、悬浮剂和乳化剂)混合。可借助于泵或持续释放形式投予抗原，尤其当作为预防措施投予时，以便预防个体中疾病的发展或改善或延迟已确立的疾病。可将补充活性化合物，例如针对欲治疗的疾病或临床病状具有独立活性的化合物，或增强本发明化合物的活性的化合物并入组合物中或与组合物一起投予。可使用香料和着色剂。
任选与植物组织一起，本发明的疫苗产品尤其充分适合于以医药组合物形式经口投予。可使用口服液体调配物且其对于儿童群体可具有特别效用。视所需治疗产品的性质和其所需形式而定，可以多种方式(例如风干、冷冻干燥、提取等)中的任一种来加工所收集的植物材料。可经口单独摄取或与食物或饲料或饮料一起摄取如上所述的这些组合物。用于经口投予的组合物包括植物；植物提取物，和以干粉、食品、水性或非水性溶剂、悬浮液或乳液形式提供的从感染植物纯化的蛋白质。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油、鱼油和可注射有机酯。水性载剂包括水、水醇溶液、乳液或悬浮液，其包括生理食盐水和缓冲中间非经肠媒剂，包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖溶液(Ringer′s dextrose solution)、右旋糖加氯化钠溶液、含有乳糖的林格氏溶液或不挥发性油。干粉的实例包括任何已干燥(例如冷冻干燥、风干或喷雾干燥)的植物生物质。举例来说，可通过将植物置于商业风干机中于约120℉下风干植物，直到生物质含有少于5重量％的水分。可贮存所干燥的植物以供进一步加工成大块固体或通过研磨进一步加工成具有所需目数大小的粉末。或者或另外，冷冻干燥可用于易受风干影响的产物。可通过将产物置于真空干燥器中并在真空下干燥冷冻来冷冻干燥产物，直到生物质含有少于约5重量％的水分。可如本文所述进一步加工干燥的材料。
可将从植物获得的材料以一种或一种以上草本制剂形式投予或与一种或一种以上草本制剂一起投予。适用的草本制剂包括液体和固体草本制剂。草本制剂的一些实例包括酊剂、提取物(例如水性提取物、醇提取物)、煎剂、干燥制剂(例如风干、喷雾干燥、冷冻或冷冻干燥)、粉末(例如冻干粉末)和液体。可在任何标准传递媒剂中提供草本制剂，诸如胶囊、片剂、栓剂、液体剂量等。所属领域的技术人员应了解各种可适用于本发明的传递草本制剂的调配物和形式。
本发明的医药调配物可另外包含医药学上可接受的赋形剂，如本文中所使用，所述赋形剂包括适合于所需特定剂型的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒剂、分散助剂或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。雷氏药学科学与实践(Remington′s The Science and Practice of Pharmacy)，第21版，A.R.杰纳罗(A.R.Gennaro)(利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott，Williams & Wilkins)，马里兰州巴尔的摩(Baltimore，MD)，2006)揭示用于调配医药组合物的各种赋形剂和其已知制备技术。除非任何常规赋形剂介质与物质或其衍生物都不相容，诸如产生任何不合需要的生物作用或另外以有害方式与医药组合物的任何其它组分相互作用，否则其使用涵盖在本发明的范围内。
在一些实施例中，医药学上可接受的赋形剂的纯度为至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。在一些实施例中，赋形剂获准用于人类和兽医用途。在一些实施例中，赋形剂经美国食品药物管理局(United States Food and Drug Administration)批准。在一些实施例中，赋形剂为医药级赋形剂。在一些实施例中，赋形剂符合美国药典(United States Pharmacopoeia，USP)、欧洲药典(European Pharmacopoeia，EP)、英国药典(British Pharmacopoeia)和/或国际药典(International Pharmacopoeia)的标准。
用于制造医药组合物的医药学上可接受的赋形剂包括(但不限于)惰性稀释剂、分散剂和/或成粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油类。所述赋形剂可任选包括在调配物中。根据调配者的判断，诸如可可脂和栓剂蜡、着色剂、涂布剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂等赋形剂可存在于组合物中。
例示性稀释剂包括(但不限于)碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉等和/或其组合。
例示性成粒剂和/或分散剂包括(但不限于)马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、羟基乙酸淀粉钠、粘土、海藻酸、瓜尔胶(guar gum)、柑橘渣、琼脂、膨润土、纤维素和木制品、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚(乙烯吡咯烷酮)(交联聚维酮(crospovidone))、羧甲基淀粉钠(羟基乙酸淀粉钠)、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠(交联羧甲纤维素(croscarmellose))、甲基纤维素、预胶凝化淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝(VEEGUM
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)、月桂基硫酸钠、季铵化合物等和/或其组合。
例示性表面活性剂和/或乳化剂包括(但不限于)天然乳化剂(例如阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、海藻酸钠、黄芪胶、角叉菜(chondrux)、胆固醇、三仙胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡和卵磷脂)、胶态粘土(例如膨润土[硅酸铝]和VEEGUM
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[硅酸镁铝])、长链氨基酸衍生物、高分子量醇(例如硬酯醇、鲸蜡醇、油醇、三乙酸甘油酯单硬脂酸酯、乙二醇二硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯和丙二醇单硬脂酸酯、聚乙烯醇)、卡波姆(carbomer)(例如羧基聚亚甲基、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物和羧基乙烯基聚合物)、角叉菜胶(carrageenan)、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素钠、粉状纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素)、脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯[TWEEN
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20]、聚氧乙烯脱水山梨糖醇[TWEEN
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60]、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯[TWEEN80]、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯[SPAN40]、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯[SPAN
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60]、脱水山梨糖醇三硬脂酸酯[SPAN
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65]、甘油单油酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯[SPAN
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80])、聚氧乙烯酯(例如聚氧乙烯单硬脂酸酯[MYRJ
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45]、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙氧基蓖麻油、聚氧亚甲基硬脂酸酯和SOLUTOL
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)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如CREMOPHOR
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)、聚氧乙烯醚、(例如聚氧乙烯月桂基醚[BRIJ
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30])、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、二乙二醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、油酸钠、油酸钾、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、月桂基硫酸钠、PLURONIC
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F68、POLOXAMER
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188、西曲溴铵(cetrimonium bromide)、氯化十六烷基吡锭、氯苄烷铵(benzalkonium chlorid)、多库酯钠(docusate sodium)等和/或其组合。
例示性粘合剂包括(但不限于)淀粉(例如玉米淀粉、淀粉糊等)；明胶；糖(例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露糖醇等)；天然和合成胶(例如阿拉伯胶、海藻酸钠、爱尔兰藓(Irish moss)提取物、潘瓦树胶(panwar gum)、印度树胶(ghatti gum)、艾萨普(isapol)外皮的粘液、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、乙酸纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、硅酸镁铝[VEEGUM]、落叶松阿拉伯半乳聚糖(larch arabogalactan)等)；海藻酸盐；聚环氧乙烷；聚乙二醇；无机钙盐；硅酸；聚甲基丙烯酸酯；蜡；水；醇；等；和其组合。
例示性防腐剂可包括(但不限于)抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和/或其它防腐剂。例示性抗氧化剂包括(但不限于)α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基大茴香醚、丁基化羟基甲苯、单硫代甘油、偏亚硫酸氢钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠和/或亚硫酸钠。例示性螯合剂包括乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)、柠檬酸单水合物、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾、依地酸(edetic acid)、反丁烯二酸、苹果酸、磷酸、乙二胺四乙酸钠、酒石酸和/或乙二胺四乙酸三钠。例示性抗微生物防腐剂包括(但不限于)氯苄烷铵、苄索氯铵(benzethonium chloride)、苯甲醇、溴硝丙二醇(bronopol)、西曲溴铵、氯化十六烷基吡锭、氯己定(chlorhexidine)、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶(hexetidine)、咪唑烷基脲(imidurea)、苯酚、苯氧基乙醇、苯基乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和/或硫柳汞(thimerosal)。例示性抗真菌防腐剂包括(但不限于)对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和/或山梨酸。例示性醇防腐剂包括(但不限于)乙醇、聚乙二醇、苯酚、酚系化合物、双酚、氯丁醇、羟基苯甲酸盐和/或苯基乙醇。例示性酸性防腐剂包括(但不限于)维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、脱氢乙酸、抗坏血酸、山梨酸和/或植酸。其它防腐剂包括(但不限于)生育酚、生育酚乙酸酯、甲磺酸去铁胺(deteroxime mesylate)、西曲溴铵、丁基化羟基大茴香醚(butylated hydroxyanisol，BHA)、丁基化羟基甲苯(butylated hydroxytoluened，BHT)、乙二胺、月桂基硫酸钠(sodium lauryl sulfate，SLS)、月桂基醚硫酸钠(sodium lauryl ether sulfate，SLES)、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钾、偏亚硫酸氢钾、GLYDANT PLUS
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、PHENONIP、对羟基苯甲酸甲酯、GERMALL
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115、GERMABENII、NEOLONETM、KATHONTM和/或EUXYL
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。
例示性缓冲剂包括(但不限于)柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡糖酸钙、D-葡糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、戊酮酸钙、戊酸、磷酸氢二钙、磷酸、磷酸三钙、磷酸氢氧化钙、乙酸钾、氯化钾、葡糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、缓血酸胺、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原质水、等渗生理食盐水、林格氏溶液、乙醇等和/或其组合。
例示性润滑剂包括(但不限于)硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石、麦芽、山嵛酸甘油酯、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、月桂基硫酸镁、月桂基硫酸钠等和其组合。
例示性油类包括(但不限于)扁桃油、杏仁油、鳄梨油、巴巴苏油(babassu)、香柠檬油、黑加仑籽油、琉璃苣油、杜松油、春黄菊油、菜籽油、苋蒿子油、巴西棕榈油、蓖麻油、肉桂油、可可脂油、椰子油、鳕肝油、咖啡油、玉米油、棉籽油、鸸鹋油、桉树油、月见草油、鱼油、亚麻籽油、香叶醇油、苦瓜油、葡萄籽油、榛果油、海索草油、十四烷酸异丙酯、荷荷芭油(jojoba)、夏威夷核果油(kukui nut)、杂薰衣草油(lavandin)、熏衣草油、柠檬油、山苍子油、澳洲坚果油(macadamia nut)、锦葵油、芒果籽油、白芒花籽油、貂油、肉豆蔻油、橄榄油、橙油、深海鱼油(orange roughy)、棕榈油、棕榈仁油、桃仁油、花生油、罂粟籽油、南瓜籽油、油菜籽油、米糠油、迷迭香油、红花油、檀香油、茶梅油、香薄荷油、沙棘油、芝麻油、乳木果油、硅酮油、大豆油、向日葵油、茶树油、蓟油、山茶油、岩兰草油、胡桃油和小麦胚芽油。例示性油类包括(但不限于)硬脂酸丁酯、辛酸三酸甘油酯、癸酸三酸甘油酯、环甲聚硅氧烷、癸二酸二乙酯、二甲聚硅氧烷360、十四烷酸异丙酯、矿物油、辛基十二醇、油醇、硅酮油和/或其组合。
用于经口和非经肠投予的液体剂型包括(但不限于)医药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和/或酏剂。除活性剂外，液体剂型还可包含所属领域中常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂；增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(尤其棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯和其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包括佐剂，诸如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。在非经肠投予的某些实施例中，将组合物与诸如CREMOPHOR
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、醇、油类、改性油类、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或其组合等增溶剂混合。
可注射制剂(例如无菌可注射水性或油性悬浮液)可根据已知技术，使用合适的分散剂、湿润剂和/或悬浮剂来调配。无菌可注射制剂可为非经肠可接受的无毒稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳液，例如1，3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受媒剂和溶剂包括水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。无菌不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。出于这一目的，可使用任何温和的不挥发性油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。诸如油酸等脂肪酸可用于制备可注射剂。
可注射调配物可例如通过经由细菌截留过滤器和/或通过并入灭菌剂来灭菌，呈在使用之前可溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中的无菌固体组合物形式。
用于经直肠或经阴道投予的组合物通常为栓剂，其可通过将组合物与在环境温度下为固体但在体温下为液体且因此在直肠或阴道腔中熔融并释放活性成分的合适无刺激性赋形剂(诸如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡)混合来制备。
用于经口投予的固体剂型包括胶囊、片剂、药丸、散剂和颗粒。在所述固体剂型中，活性成分与以下混合：至少一种医药学上可接受的惰性赋形剂，诸如柠檬酸钠或磷酸二钙；和/或填充剂或增量剂(例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸)；粘合剂(例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶)；保湿剂(例如甘油)；崩解剂(例如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉、木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠)；溶解延迟剂(例如石蜡)；吸收促进剂(例如季铵化合物)；湿润剂(例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯)；吸附剂(例如高岭土和膨润土)；和润滑剂(例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠)；和其混合物。在胶囊、片剂和药丸的情况下，剂型可包含缓冲剂。
类似类型的固体组合物可用作使用诸如乳糖(lactose/milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。片剂、糖衣药丸、胶囊、药丸和颗粒的固体剂型可使用涂层和外壳(诸如肠溶衣)和医药调配技术中所熟知的其它涂层来制备。其可任选包含遮光剂且可具有任选以延迟方式仅或优先在肠道的某一部分中释放活性成分的组成。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。类似类型的固体组合物可用作使用诸如乳糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。
任选与植物组织一起，疫苗产品尤其充分适合于以医药组合物形式经口投予。可使用口服液体调配物且其对于儿童群体可具有特别效用。视所需治疗产品的性质和其所需形式而定，可以多种方式(例如风干、冷冻干燥、提取等)中的任一种来加工所收集的植物材料。可经口单独摄取或与食物或饲料或饮料一起摄取如上所述的这些组合物。用于经口投予的组合物包括植物；植物提取物；和以干粉、食品、水性或非水性溶剂、悬浮液或乳液形式提供的从感染植物纯化的蛋白质。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油、鱼油和可注射有机酯。水性载剂包括水、水醇溶液、乳液或悬浮液，其包括生理食盐水和缓冲中间非经肠媒剂，包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖溶液、右旋糖加氯化钠溶液、含有乳糖的林格氏溶液或不挥发性油。干粉的实例包括任何已干燥(例如冷冻干燥、风干或喷雾干燥)的植物生物质。举例来说，可通过将植物置于商业风干机中在约120℉下来风干植物，直到生物质含有少于5重量％的水分。可贮存所干燥的植物以供进一步加工成大块固体或通过研磨进一步加工成具有所需目数大小的粉末。或者或另外，冷冻干燥可用于易受风干影响的产物。可通过将产物置于真空干燥器中且在真空下干燥冷冻来冷冻干燥产物，直到生物质含有少于约5重量％的水分。可如本文所述进一步加工干燥的材料。
可将从植物获得的材料以一种或一种以上草本制剂形式投予或与一种或一种以上草本制剂一起投予。适用的草本制剂包括液体和固体草本制剂。草本制剂的一些实例包括酊剂、提取物(例如水性提取物、醇提取物)、煎剂、干燥制剂(例如风干、喷雾干燥、冷冻或冷冻干燥)、粉末(例如冻干粉末)和液体。可在任何标准传递媒剂中提供草本制剂，诸如胶囊、片剂、栓剂、液体剂量等。所属领域的技术人员应了解各种可适用于本发明的传递草本制剂的调配物和形式。
在一些方法中，将表达本发明的疟原虫抗原多肽的植物或其部分或其生物质以医用食物形式经口投予。如果呈固体形式，那么通常通过生食来食用所述可食用组合物，或如果呈液体形式，那么通过饮用来食用。可在无预先加工步骤下或在最小限度的烹饪制备后，直接摄取植物材料。举例来说，可使疫苗抗原在可直接食用的芽中表达。举例来说，疫苗抗原在紫花苜蓿芽、绿豆芽或菠菜或莴苣叶芽等中表达。在一些实施例中，可加工植物生物质且摄取加工步骤后回收的材料。
适用于本发明的加工方法为常用于食品或饲料工业的方法。所述方法的最终产品通常包括实质量的所表达抗原且适宜食用或饮用。可将最终产品与诸如盐、载剂、风味增强剂、抗生素等其它食物或饲料形式混合，且以固体、半固体、悬浮液、乳液或液体形式食用。所述方法可包括保存步骤，例如巴氏消毒法(pasteurization)、蒸煮或添加保存和防腐剂。在本发明中可使用和加工任何植物来产生可食用或可饮用植物物质。可通过所属领域中的标准方法(例如凝胶电泳、ELISA或西方印迹法分析)，使用探针或产物特异性抗体来测试从植物获得的制剂中疟原虫抗原多肽的量。可使用这一测定将所摄取的疫苗抗原蛋白的量标准化。举例来说，可通过例如混合具有不同含量产物的多批产物来确定和调节疫苗抗原的量，以便待饮用或食用以摄取单次剂量的材料量可得到标准化。然而，本发明的封闭的可调节环境应使进行所述标准化程序的需求降至最低。
植物细胞或组织中所产生且由个体食用的疫苗蛋白可优选由消化系统吸收。摄取仅经最低程度地加工的植物组织的一个优势是使蛋白质囊封或隔离在植物细胞中。因此，产物可受到至少一定程度的保护以防在到达胃或肠之前在上消化道中消化，且较高比例的活性产物将可供吸收。
用于局部和/或经皮投予本发明化合物的剂型可包括软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、散剂、溶液、喷雾、吸入剂和/或贴片。通常，在可能需要时，在无菌条件下将活性成分与医药学上可接受的赋形剂和/或任何所需防腐剂和/或缓冲剂混合。另外，本发明涵盖使用经皮贴片，其通常具有使化合物受控传递至身体的额外优点。例如通过将化合物溶解和/或分散于适当介质中来制备这些剂型。或者或另外，可通过提供速率控制膜和/或通过将化合物分散于聚合物基质和/或凝胶中来控制速率。
适合用于传递本文所述的皮内医药组合物的装置包括短针装置，诸如美国专利4,886,499、5,190,521、5,328,483、5,527,288、4,270,537、5,015,235、5,141,496和5,417,662中所述的装置。皮内组合物可通过限制针刺入皮肤内的有效穿透长度的装置来投予，诸如PCT公开案WO 99/34850中所述的装置和其功能等效物。通过液体射流注射器和/或通过刺入角质层且产生到达真皮的射流的针将液体疫苗传递到真皮的射流注射装置是合适的。射流注射装置例如在以下专利中有所描述：美国专利5,480,381；5,599,302；5,334,144；5,993,412；5,649,912；5,569,189；5,704,911；5,383,851；5,893,397；5,466,220；5,339,163；5,312,335；5,503,627；5,064,413；5,520,639；4,596,556；4,790,824；4,941,880；4,940,460；和PCT公开案WO 97/37705和WO 97/13537。使用压缩气体来加速粉末形式的疫苗穿过皮肤外层到达真皮的冲击式粉末/粒子传递装置是合适的。或者或另外，皮内投药的典型曼托方法(mantoux method)中可使用常规注射器。
适合于局部投予的调配物包括(但不限于)液体和/或半液体制剂，诸如擦剂、洗剂、水包油和/或油包水乳液(诸如乳膏、软膏和/或糊剂)和/或溶液和/或悬浮液。可局部投予的调配物可例如包含约1％至约10％(w/w)活性成分，不过活性成分的浓度可高达活性成分在溶剂中的溶解度极限。用于局部投予的调配物可进一步包含一种或一种以上本文所述的其它成分。
本发明的医药组合物可以适合于通过口腔经肺投予的调配物形式制备、包装和/或销售。这种调配物可包含干燥粒子，其包含活性成分且直径在约0.5nm至约7nm或约1nm至约6nm的范围内。所述组合物宜呈干粉形式以供使用包含可引导推进剂流以分散粉末的干粉储集器的装置和/或使用自动推进溶剂/粉末分配容器(诸如在密封容器中包含溶解和/或悬浮于低沸点推进剂中的活性成分的装置)投予。所述粉末包含至少98重量％的粒子具有大于0.5nm的直径且至少95％的粒子(以数目计)具有小于7nm的直径的粒子。或者，至少95重量％的粒子具有大于1nm的直径且至少90％的粒子(以数目计)具有小于6nm的直径。干粉组合物可包括固体细粉稀释剂(诸如糖)且宜以单位剂型提供。
低沸点推进剂一般包括在大气压下沸点低于65℉的液体推进剂。通常，推进剂可构成组合物的50％至99.9％(w/w)，且活性成分可构成组合物的0.1％至20％(w/w)。推进剂可进一步包含其它成分，诸如液体非离子性和/或固体阴离子性表面活性剂和/或固体稀释剂(其可具有与包含活性成分的粒子大致相同的粒度)。
调配用于经肺传递的本发明的医药组合物可提供呈溶液和/或悬浮液液滴形式的活性成分。所述调配物可以任选无菌且包含活性成分的水性和/或稀醇溶液和/或悬浮液形式制备、包装和/或销售，且宜使用任何雾化和/或喷雾装置来投予。所述调配物可进一步包含一种或一种以上其它成分，包括(但不限于)调味剂(诸如糖精钠)、挥发性油、缓冲剂、表面活性剂和/或防腐剂(诸如羟基苯甲酸甲酯)。由这一投药途径提供的液滴可具有在约0.1nm至约200nm范围内的平均直径。
适用于经肺传递的本文所述的调配物适用于鼻内传递医药组合物。另一适合于鼻内投予的调配物为包含活性成分且平均粒子为约0.2μm至500μm的粗粉。以如下方式投予这种调配物：采用用鼻子吸，即通过经由鼻腔从保持在鼻子附近的容器快速吸入粉末。
适合于经鼻投予的调配物可例如包含约少至0.1％(w/w)和多达100％(w/w)的活性成分，且可包含一种或一种以上本文所述的其它成分。本发明的医药组合物可以适合于经颊投予的调配物形式制备、包装和/或销售。所述调配物可例如呈使用常规方法制备的片剂和/或锭剂的形式且可例如0.1％至20％(w/w)为活性成分，其余部分包含经口可溶解和/或可降解的组合物和任选一种或一种以上本文所述的其它成分。或者，适合于经颊投予的调配物可包含含有活性成分的粉末和/或烟雾状和/或雾化溶液和/或悬浮液。所述粉状、烟雾状和/或烟雾状调配物在分散时可具有在约0.1nm至约200nm范围内的平均粒子和/或液滴尺寸，且可进一步包含一种或一种以上本文所述的其它成分。
本发明的医药组合物可以适合于眼部投予的调配物形式制备、包装和/或销售。所述调配物可例如呈滴眼剂的形式，包括例如0.1/1.0％(w/w)活性成分于水性或油性液体赋形剂中的溶液和/或悬浮液。所述滴剂可进一步包含缓冲剂、盐和/或一种或一种以上本文所述的其它成分。其它适用的可眼部投予的调配物包括呈微晶形式和/或呈脂质体制剂形式的包含活性成分的调配物。预期滴耳剂和/或滴眼剂在本发明的范围内。
在某些情况下，可能需要通过减缓皮下或肌肉内注射的疫苗产品(例如蛋白质)的一种或一种以上组分的吸收来延长疫苗的作用。这可通过使用具有弱水溶性的结晶或非晶形材料的液体悬浮液来实现。产品的吸收速率则取决于其溶解速率，而溶解速率又可视大小和形式而定。或者或另外，通过将产品溶解或悬浮于油性媒剂中来实现非经肠投予的产品的延迟吸收。通过在诸如聚丙交酯-聚乙交酯等生物可降解聚合物中形成蛋白质的微囊基质来制备可注射储积形式。视产品与聚合物的比率和所采用的特定聚合物的性质而定，可控制释放速率。生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。可通过将产品裹在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储积式可注射调配物。口服调配物可使用替代聚合传递媒剂。举例来说，可使用诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸等生物可降解、生物相容性聚合物。可将抗原或其免疫原性部分调配成微粒，例如与聚合传递媒剂组合。
关于调配和/或制造医药剂的总体考虑因素可例如见于雷氏：药学科学与实践(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，第21版，利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams & Wilkins)，2005中。
投药
本发明提供疫苗。在一些实施例中，本发明的疫苗可投予个体以刺激免疫反应和/或赋予保护性。在一些实施例中，向有需要的个体投予的疫苗剂量包含约200μg、约150μg、约100μg、约90μg、约80μg、约70μg、约60μg、约50μg、约40μg、约35μg、约30μg、约25μg、约20μg、约15μg、约5μg、约4μg、约3μg、约2μg、约1μg、约0.1μg、约0.01μg植物产疟原虫抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分。在一些实施例中，植物产疟原虫抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分已如本文所述至少部分从非抗原性组分纯化。在一些实施例中，植物产疟原虫抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分未如本文所述至少部分从非抗原性组分纯化。在以上标题为“疫苗”的部分中更详细地描述了适合于投予个体的疫苗组合物。
本发明的疟原虫抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分和/或其医药组合物(例如疫苗)可使用有效用于治疗的任何量和任何投药途径来投予。
所需的确切量视个体的物种、年龄和总体状况、感染的严重程度、特定组合物、其投药模式、其活性模式等而定将在个体之间不同。为了便于剂量的投予和均一性，通常将疟原虫抗原多肽调配成单位剂型。然而，应了解，本发明的组合物的总日用量将由主治医生在正确医学判断范围内决定。用于任何特定个体或生物体的特定治疗有效剂量将视多种因素而定，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所使用的特定疟原虫抗原多肽的活性；所投予的特定医药组合物；投予后组合物的半衰期；个体的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；投药时间、投药途径和所使用的特定化合物的排泄速率；治疗持续时间；与所使用的特定化合物组合或同时使用的药物；和医学技术中熟知的类似因素。
本发明的医药组合物(例如疫苗)可通过任何途径来投予。在一些实施例中，通过多种途径投予本发明的医药组合物，包括经口(PO)、静脉内(IV)、肌肉内(IM)、动脉内、髓内、鞘内、皮下(SQ)、心室内、透皮、经皮、皮内、经直肠(PR)、经阴道、腹膜内(IP)、胃内(IG)、局部(例如采用散剂、软膏、乳膏、凝胶、洗剂和/或滴剂)、经粘膜、鼻内、经颊、肠内、玻璃体、舌下；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；以口服喷雾、鼻用喷雾和/或气溶胶形式；和/或通过门静脉导管。一般来说，最适当投药途径将视多种因素而定，包括所投予药剂的性质(例如其在胃肠道环境中的稳定性)、个体状况(例如个体是否能够耐受特定投药模式)等。
在一些实施例中，通过多种投药途径(例如通过皮下注射和通过鼻内吸入)传递本发明的疫苗。对于包括两个或两个以上剂量的疫苗来说，不同剂量可通过不同途径来投予。
在一些实施例中，通过皮下注射来传递本发明的疫苗。在一些实施例中，通过肌肉内和/或静脉内注射来投予本发明的疫苗。在一些实施例中，通过鼻内吸入来传递本发明的疫苗。
在一些实施例中，通过经口和/或经粘膜途径来传递本发明的疫苗。经口和/或经粘膜传递具有防止粘膜组织感染(许多病原体感染的首要途径)的潜能。经口和/或经粘膜传递会引发全身性免疫反应。在用于经口投予刺激粘膜免疫系统并会引发全身性免疫的抗原的异源表达系统的开发方面已取得相当大的进展。然而，对于传递口服疫苗的先前尝试已证明获得功效需要大量抗原。因此，大量目标抗原的经济制备是产生有效口服疫苗的前提。发展表达抗原(包括热稳定性抗原)的植物是解决所述难题的较实际方法。
在某些实施例中，通过向个体直接投予植物来向个体经口投予在植物或其部分中表达的疟原虫抗原多肽。在一些方面，提取和/或纯化在植物或其部分中表达的疫苗蛋白，并用于制备医药组合物。可能需要调配所述分离的产物以用于其预定用途(例如作为医药剂、疫苗组合物等)。在一些实施例中，可能需要将产物与一些或所有表达所述产物的植物组织调配到一起。
在某些实施例中，通过向个体直接投予植物来向个体经口投予在植物或其部分中表达的疟原虫抗原多肽。在一些方面，提取和/或纯化在植物或其部分中表达的疫苗蛋白，并用于制备医药组合物。可能需要调配所述分离的产物以用于其预定用途(例如作为医药剂、疫苗组合物等)。在一些实施例中，可能需要将产物与一些或所有表达所述产物的植物组织调配到一起。
植物细胞或组织中所产生且由个体食用的疫苗蛋白可优选由消化系统吸收。摄取仅经最低程度地加工的植物组织的一个优势是使蛋白质囊封或隔离在植物细胞中。因此，产物可受到至少一定程度的保护以防在到达胃或肠之前在上消化道中消化，且较高比例的活性产物将可供吸收。
当需要将产物与植物材料调配到一起时，通常将需要利用对相关接受者(例如人类或其它动物)无毒的植物。在适当考虑保持所表达产物的活性下，可根据所属领域中已知的技术简单地收集和加工相关植物组织(例如细胞、根、叶)。在某些实施例中，需要在可食用植物中(且具体来说是在植物的可食用部分中)具有所表达的疟原虫抗原多肽以便可随后食用所述材料。举例来说，如果经口传递后(适当调配时)疫苗抗原具有活性，那么可能需要在可食用植物部分中产生抗原蛋白且调配所表达的疟原虫抗原多肽以供与一些或所有表达蛋白质的植物材料一起经口传递。
在某些实施例中，本发明的疟原虫抗原多肽和/或本发明的其医药组合物(例如疫苗)可以足以传递每日每千克个体体重约0.001mg至约100mg、约0.01mg至约50mg、约0.1mg至约40mg、约0.5mg至约30mg、约0.01mg至约10mg、约0.1mg至约10mg或约1mg至约25mg的剂量来投予以获得所需治疗作用。所需剂量可每日传递超过三次、每日传递三次、每日传递两次、每日传递一次、每隔一日、每三日、每周、每两周、每三周、每四周、每两个月、每六个月或每十二个月传递。在某些实施例中，所需剂量可使用多次投予(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14次或更多次投予)来传递。
以获得所需结果必需的量和时间来投予组合物。在某些实施例中，医药组合物的“治疗有效量”为有效治疗、减弱或预防个体疾病的量。因此，如本文中所使用，“有效治疗、减弱或预防疾病的量”是指治疗、减弱或预防任何个体的疾病的医药组合物的无毒但足够的量。举例来说，“治疗有效量”可为治疗、减弱或预防感染(例如疟原虫感染)等的量。
应了解本发明的疟原虫抗原多肽和/或其医药组合物可用于组合疗法中。组合方案中采用的疗法(例如治疗剂或程序)的特定组合通常将考虑所需治疗剂和/或程序与欲获得的所需治疗作用的相容性。应了解所采用的疗法对于相同目的可达成所需作用(例如，可将适用于治疗、预防疟原虫感染和/或延迟疟原虫感染发作的疟原虫抗原多肽与另一适用于治疗、预防疟原虫感染和/或延迟疟原虫感染发作的药剂同时投予)，或其可达成不同作用(例如控制任何不良作用)。本发明涵盖医药组合物与可提高其生物可用性、降低和/或调节其代谢、抑制其排泄和/或调节其在身体中的分布的药剂组合传递。
本发明的医药组合物可单独投予或者与一种或一种以上其它治疗剂组合投予。“与...组合”打算意味药剂必须同时投予和/或调配用于一起传递，但这些传递方法都在本发明的范围内。组合物可与一种或一种以上其它所需治疗剂或医学程序同时投予、在所述其它治疗剂或程序之前或之后投予。应了解组合中所用的治疗活性剂可同时以单一组合物投予或分别以不同组合物投予。一般来说，各药剂将按照对于所述药剂所确定的剂量和/或时间进度来投予。
一般来说，预期组合利用的药剂的用量不超过其个别利用时的量。在一些实施例中，组合利用的量将低于个别利用的量。
在某些实施例中，与其它疟原虫疫苗组合投予包含至少一种疟原虫抗原多肽的疫苗组合物。在某些实施例中，与其它疟原虫治疗剂组合投予包含至少一种疟原虫抗原多肽的疫苗组合物。在某些实施例中，与以下组合投予包含至少一种疟原虫抗原多肽的疫苗组合物：一种或一种以上生物碱(例如奎宁、盐酸间苯二酚奎宁(quinimax)、奎尼丁(quinidine)、辛可尼(cinchoine)、辛可尼丁(cinchonidine)、甲氟喹(mefloquine)、卤泛群(halofantrine)等)；氯喹(chloroquine)阿莫地喹(amodiaquine)尼瓦奎宁(nivaquine)磺胺药；乙胺嘧啶(pyrimethamine)周效磺胺(sulphadoxine)氯胍(proguanil)阿托伐醌(atovaquone)伯胺喹(primaquine)青蒿素；青蒿素衍生物(例如蒿甲醚(artemether)、青蒿琥酯(artesunate)、蒿乙醚(arteether)、双氢青蒿素(dihydroartemisinin)等)；抗生素(例如多西环素(doxycycline)、克林达霉素(clindamycin)等)；马拉隆(malarone)；胺苯砜(dapsone)；和/或其组合。
试剂盒
一方面，本发明提供包括本发明的疟原虫抗原多肽的医药包装或试剂盒。在某些实施例中，医药包装或试剂盒在一个或一个以上任选填充有本发明的医药组合物的一种或一种以上其它成分的容器中包括产生本发明疟原虫抗原多肽的植物、植物细胞和/或植物组织，或含有疫苗的制剂、提取物或医药组合物。在一些实施例中，医药包装或试剂盒在一个或一个以上任选填充有本发明的医药组合物的一种或一种以上其它成分的容器中包括包含本发明的经纯化疟原虫抗原多肽的医药组合物。在某些实施例中，医药包装或试剂盒包括其它获准用作组合疗法的治疗剂(例如疟原虫抗原多肽、疟原虫疫苗、疟原虫治疗剂)。呈由管理医药产品的制造、使用或销售的政府机关所指定形式的告示可任选与所述容器相关联，所述告示反映政府机关对用于人类投药的制造、使用或销售的批准。
提供包括治疗剂和/或预防剂的试剂盒。仅作为一个非限制性实例，可提供疟原虫疫苗(例如以口服、可注射和/或鼻内调配物形式)并作为疗法投予。可在试剂盒中提供用于投予罹患疟原虫感染或处于疟原虫感染风险中的个体的医药剂量或其说明书。
本文提供疫苗组合物，其包含：植物产疟原虫多肽抗原；和医药学上可接受的赋形剂；其中所述疫苗组合物在投予个体后引发免疫反应。在一些实施例中，所述植物产疟原虫多肽抗原为Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽。在一些实施例中，植物产疟原虫多肽抗原具有如图1中呈示的任一多肽所示的序列。植物产疟原虫多肽抗原可从植物材料纯化而来。植物产疟原虫多肽抗原的纯度可为约70％；纯度为约80％；纯度为约90％；纯度为约95％；纯度为约99％。在一些实施例中，植物产疟原虫多肽抗原不是从植物材料纯化而来并且可以完整植物或植物提取物的形式投予个体。
在一些实施例中，疫苗组合物进一步包含至少一种疫苗佐剂。所述佐剂可选自由以下组成的群组：明矾、Quil A、QS21、氢氧化铝、磷酸铝、矿物油、MF59、Malp2、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂、铝胶、3去-O-酰化单磷酰基脂质A(3D-MPL)、脂质A、百日咳杆菌、结核分枝杆菌、默克佐剂65、角鲨烯、病毒颗粒、SBAS2、SBAS1和未甲基化CpG序列。
在一些实施例中，疟原虫多肽抗原可在转基因植物或短暂表达抗原的植物中产生。所述抗原可在植物中从投放载体表达。
还提供在个体中诱导针对疟原虫感染的保护性免疫反应的方法，其包含向个体投予有效量的疫苗组合物。可经口、鼻内、皮下、静脉内、腹膜内或肌肉内投予所述组合物。可通过供给植物细胞而向个体经口投予组合物。所述个体可为人类；在一些实施例中，个体为鸟、猪或马。
还提供产生疟原虫抗原多肽的方法，其包含：制备编码疟原虫抗原多肽的核酸构筑体；将步骤a的所述核酸引入植物细胞中；和在有利于表达所述疟原虫抗原多肽的条件下培育所述植物细胞；由此产生疟原虫抗原多肽。抗原蛋白的表达可受病毒启动子的控制；所述核酸构筑体可进一步包含载体核酸序列。所述载体可为二元载体且核酸构筑体可进一步包含编码病毒蛋白质的序列。所述植物细胞可选自由以下组成的群组：紫花苜蓿、萝卜、芥菜、绿豆、西兰花、水田芹、大豆、小麦向日葵、卷心菜、三叶草、矮牵牛、西红柿、马铃薯、烟草、菠菜和小扁豆细胞。植物细胞属于选自芸苔属(Brassica genus)、烟草属(Nicotana genus)和矮牵牛属(Petunia genus)的属。可在发芽的籽苗中产生疟原虫抗原多肽。一些实施例进一步包含回收部分纯化或纯化的所产生的疟原虫抗原多肽。
还提供分离的核酸构筑体，其包含编码疟原虫抗原多肽的核酸序列，其中植物产疟原虫多肽抗原具有图1中所呈示的任一多肽所示的序列。所述分离的核酸构筑体可进一步包含载体核酸序列和病毒启动子核酸序列。所述载体可为二元载体且可进一步包含编码病毒蛋白质的核酸序列。
还提供包含核酸构筑体的宿主细胞。所述宿主细胞可为植物细胞。所述植物细胞可选自由以下组成的群组：紫花苜蓿、萝卜、芥菜、绿豆、西兰花、水田芹、大豆、小麦向日葵、卷心菜、三叶草、矮牵牛、西红柿、马铃薯、烟草、菠菜和小扁豆。植物细胞可属于选自芸苔属、烟草属和矮牵牛属的属。
以下代表性实例打算帮助说明本发明，而不打算，也不应解释为限制本发明的范围。实际上，根据本文献的全部内容，包括以下实例和本文中所引用的科学和专利文献的参考，本发明的各种修改和除本文所示和描述的实施例外的许多其它实施例对于所属领域的技术人员也将显而易见。以下实例含有在本发明的各种实施例和其等效物中可适合于实施本发明的信息、例证和指南。
例证
实例1：来自恶性疟原虫的重组Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230抗原
在植物中产生来自恶性疟原虫的重组Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230抗原。将疟原虫抗原克隆到“投放载体”系统中(参见例如，谬斯克(Musiychuk)等人，2007，疟原虫和其它呼吸病毒(Plasmodium and Other Respiratory Viruses)，1：19-25；和PCT公开案WO 07/095304；两者都以引用的方式并入本文中)，具体来说克隆到载体pGR-D4A4中。
接着将投放载体引入农杆菌中并真空渗透到本塞姆氏烟草中。让抗原表达并在植物生物质中积累一段时间(例如3-7天，之后才进行收集)。
基本上如下从植物生物质纯化重组抗原(图7)。在50mM NaPi(pH 8.0)、0.5M NaCl和20mM咪唑中溶解植物细胞。添加曲通(Triton)到0.5％的最终浓度并在4℃下培育20分钟。在4℃下在78,000×g下离心提取物30分钟或在4℃下在48,000×g下离心40分钟。通过神奇滤布(Miracloth)过滤上清液，随后加载到Ni-NTA管柱上。在一些情况下，利用切向流动过滤(tangential flow filtration，TFF)微量过滤步骤(0.1μm-0.2μm孔径)进行任选的额外澄清。将澄清的提取物加载到Ni-NTA管柱(用溶解缓冲液预平衡)上，并用缓冲液A(50mM NaPi(pH 7.5)、0.5M NaCl、20mM咪唑和0.5％曲通)充分洗涤管柱，随后用缓冲液A1(与缓冲液A相同，但无曲通)洗涤。用咪唑洗脱蛋白质。任选进一步使用阴离子交换色谱法(Q管柱)或超滤法纯化洗脱的蛋白质。
图8和9呈示嵌合病毒粒子的例示性表达数据。
图10-12描述嵌合病毒粒子的纯化。
实例2：材料与方法。
重组Pfs构筑体。将Pfs多肽Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230或其部分插入二元投放载体，即如图13中所示和实例1中所述的pGR-D4中。一些Pfs多肽或其部分是表达为与SEQ ID NO：40的经修饰的地衣多糖酶的融合蛋白。将Pfs多肽引入地衣多糖酶基因中以使得融合位于地衣多糖酶氨基酸序列的N端、C端或内部环区域。图14中展示相关克隆位点的图形表示和命名。
产生超过70种不同构筑体，为全长序列、全长序列与地衣多糖酶的融合物或Pfs序列部分与地衣多糖酶的融合物。一些构筑体还在一个或一个以上糖基化位点包括突变。对于每一基因所产生的构筑体的数目包括：Pfs25为14种构筑体；Pfs28为6种构筑体；Pfs48/45为25种构筑体；和Pfs230为22种构筑体。
用Pfs抗原免疫小鼠。在第0天和第28天，以每剂50μg抗原，用Pfs抗原皮下免疫各组8周龄Balb/c小鼠(每组6只小鼠)。对照组动物接受PBS。通过添加10μg Quil A(纽约州韦斯特伯里的精细化学公司(Accurate Chemical，Westbury，NY))来进行所有免疫。在每次免疫之前和在第二次剂量后四周收集血清样品。通过ELISA来测量特异性抗体效价。
干式免疫荧光分析(Immunofluorescence Assay，IFA)和悬浮液免疫荧光分析(Suspension Immunofluorescence Assay，SIFA)。对于IFA，在载玻片上使寄生虫干燥且用从经重组Pfs多肽免疫的小鼠收集的血清探测。对于SIFA，将寄生虫和血清一起培育于溶液中，接着在载玻片上干燥以用于分析。对于两种分析，使用荧光二次抗体进行检测。
为分析Pfs25、Pfs48/45和Pfs230，活化后3小时用寄生虫进行IFA和SIFA。在活体外用胎牛血清活化成熟配子体(第14天培养物)3小时。将一部分经活化的培养物的放到IFA载玻片上，干燥并贮存于-80℃下直到使用。将另一部分经活化的培养物分配到试管中(每个试管约105个寄生虫)且直接与来自经免疫小鼠的血清一起培育(SIFA)。30分钟后，洗涤寄生虫并与ALEXA抗小鼠结合物一起培育。在活化后约2-3小时可在圆形大配子/合子的表面上检测到Pfs25。对于Pfs28反应性，如下将成熟配子体喂给蚊虫且次日从中肠移出寄生虫并直接与来自经免疫小鼠的血清一起培育(SIFA)。培育30分钟后，洗涤寄生虫并与ALEXA抗小鼠结合物一起培育。
在蚊虫的中肠中活化后24小时，来自经Pfs28(以及Pfs25)免疫的小鼠的所有血清都呈寄生虫阳性。
标准膜供给分析。在标准膜供给分析(SMFA)中，基本上如以下文献中所述，测试来自经免疫动物的抗体的传播阻断功效：″使用实验数据评估标准膜供给分析(SMFA)以测定减少疟疾传播的活性(Evaluation of the standard membrane feeding assay(SMFA)for the determination of malaria transmission-reducing activity using empirical data)″，M·范德科尔卡(van der Kolk M)，SJ·德拉斯(De Vlas SJ)，A·所罗(Saul A)，M·范德维格特-伯尔姆(van de Vegte-Bolmer M)，WM·伊林(Eling WM)，RW·肖尔温因(Sauerwein RW.)等人，寄生虫学(Parasitology).2005年1月；130(Pt 1)：13-22(艾拉特姆(Erratum)，寄生虫学(Parasitology)2005年10月；131(Pt 4)：578.[W·肖尔温因(Sauerwein，W)纠正为RW·肖尔温因(Sauerwein，RW)])和″通过膜供给来测量由地方病血清诱导的恶性疟原虫传播的减少(Measurement by membrane feeding of reduction in Plasmodium falciparum transmission induced by endemic sera)″，A·乐恩森(Lensen A)，J·范杜鲁特恩(van Druten J)，M·伯尔姆(Bolmer M)，G·范格姆特(van Gemert G)，W·伊林(Eling W)，R·肖尔温因(Sauerwein R.)，皇家热带医学与卫生学会会刊(Trans R Soc Trop Med Hyg).1996年1-2月；90(1)：20-2，所述文献以引用的方式并入本文中。简单来说，使实验室饲养的史帝芬塞疟蚊(Anopheles stephensi)从覆盖有膜的装置取食血粉，所述装置含有来自以上经免疫小鼠的血清与感染有恶性疟原虫配子体的补体和红血球悬浮液的组合。一周后，测定受感染的蚊虫数目以及每只蚊虫所产卵囊的数目。通过比较喂食测试血清相对于对照血清的蚊虫的卵囊数目来计算传播减少活性(TRA)。使用第0天(免疫前)和第40天(第三次剂量后12天)所收集的样品进行SMFA。
实例3：疟疾抗原的蛋白质产生
在植物中产生重组Pfs抗原且根据实例1所述进行纯化并通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。图15中展示25MF1E、25MF2E、28F2E、48F1E、230D2M-2E、230D4M-2E、230D4M-2E的经考马斯蓝(Coomassie blue)染色的凝胶。
实例4：Pfs25构筑体的分析
图16中展示16种不同植物产Pfs25和Pfs28抗原的表达水平和溶解性概况。所有样品都可溶。表达水平的范围为每千克植物生物质290mg至每千克植物生物质约2666mg 。
如实例2中所述，使用从图16选择的抗原免疫小鼠。收集血清并在IFA、SIFA和SMFA分析中进行测试。这些分析的结果展示于图17的表格中。在IFA和SIFA中所测试的所有血清都显示特异性寄生虫结合。在SMFA中，与来自注射PBS的对照动物的血清相比，来自经Pfs25构筑体(25F2E、25MF1E、25MF2E、25MF3E、25-2-25-3和25-2-25M-3)免疫的小鼠的血清显著减少最终卵囊计数。
实例5：Pfs28构筑体的分析
如实例2中所述，使用从图16选择的抗原免疫小鼠。收集血清并在IFA、SIFA和SMFA分析中进行测试。这些分析的结果展示于图18的表格中。在IFA和SIFA中来自经Pfs28构筑体28-2-25-3和28-2-25M-3免疫的小鼠的血清显示特异性寄生虫结合。
实例6：Pfs48/45构筑体的分析
图19展示11种不同植物产Pfs48/45抗原的表达水平和溶解性概况。所有样品都可溶或部分可溶。表达水平的范围为每千克植物生物质265mg至每千克植物生物质约1212mg。
如实例2中所述，使用所选Pfs48/45抗原免疫小鼠。收集血清并在IFA、SIFA和SMFA分析中进行测试。这些分析的结果展示于图20的表格中。在IFA中来自经Pfs48/45构筑体(除了48F3E、48D2-2E、48D2M-2E和48D1-2E173)免疫的小鼠的所有血清都显示弱的但特异性的寄生虫结合；在IFA中来自经Pfs48/45构筑体48F1E、48MF3E、48D1M-2E、48D1-2E173、48D1-1E173免疫的小鼠的血清显示特异性寄生虫结合和在SIFA中显示寄生虫结合；在SMFA中，与来自注射PBS的对照动物的血清相比，来自经Pfs48/45构筑体48F2E、48D1-2E、48D2-2E免疫的小鼠的血清减少最终卵囊计数。
实例7：Pfs230构筑体的分析
图21展示4种不同植物产Pfs230抗原的表达水平和溶解性概况。所有样品都可溶。表达水平的范围为每千克植物生物质163mg至每千克植物生物质约848mg。
如实例2中所述，使用Pfs230抗原免疫小鼠。收集血清并在IFA、SIFA和SMFA分析中进行测试。这些分析的结果展示于图22的表格中。在IFA和SIFA中来自经Pfs230构筑体230A免疫的小鼠的血清显示特异性寄生虫结合。在SMFA中，与来自注射PBS的对照动物的血清相比，来自经230D4M-3E免疫的小鼠的血清减少最终卵囊计数；来自经230A免疫的小鼠的血清显示部分减少。
实例8：铝胶对Pfs230的免疫原性的影响
基本上根据实例2中所述的方法，测定铝胶对Pfs230A的免疫原性的影响。在每次注射之前收集血清样品且分析其中的Pfs23A特异性IgG同型。这项实验的结果展示于图23A和23B中。如所指示，在铝胶(图23A)和Quil A(图23B)存在下，优势IgG同型为IgG1。相较于铝胶，Quil A诱导出更多IgG2a和IgG2b抗体，但不足以诱导补体固定和寄生虫减少。
等效物和范围
所属领域的技术人员将认识到或能够仅使用常规实验即可确定本文所述的本发明的特定实施例的许多等效物。本发明的范围不欲限于以上实施方式，而实际上如随附权利要求书中所述。
所属领域的技术人员将认识到或能够仅使用常规实验即可确定本文所述的本发明的特定实施例的许多等效物。本发明的范围不欲限于以上实施方式，而实际上如随附权利要求书中所述。
在权利要求书中，除非相反地指出或另外从本文显而易见，否则诸如“一”和“所述”等冠词可能意谓一个或一个以上。除非相反地指出或另外从本文显而易见，否则如果群组成员中的一个、一个以上或全部存在于、用于指定产物或方法中或以其它方式与指定产物或方法有关，那么认为群组中的一个或一个以上成员之间包括“或”的权利要求或实施方式得到满足。本发明包括正好群组中的一个成员存在于、用于指定产物或方法中或以其它方式与指定产物或方法有关的实施例。本发明包括群组成员中的一个以上或全部存在于、用于指定产物或方法中或以其它方式与指定产物或方法有关的实施例。此外，应了解本发明涵盖所有变化、组合和变更，其中将来自一个或一个以上所列权利要求的一个或一个以上限制、要素、条款、描述性术语等引入另一权利要求中。举例来说，附属于另一权利要求的任何权利要求可修改成包括附属于同一基础权利要求的任何其它权利要求中所见的一个或一个以上限制。此外，当权利要求描述组合物时，应了解除非另有指示或除非所属领域的普通技术人员将明显知道会出现矛盾或不一致，否则包括出于本文所揭示的任一目的使用所述组合物的方法，且包括根据本文所揭示的任何制备方法或所属领域中已知的其它方法制备组合物的方法。
当要素以列表呈现，例如呈马库什(Markush)群组格式时，应了解也揭示所述要素的各亚组，且可从群组中去除任何要素。应了解，一般来说，当本发明或本发明的方面被称为包含特定要素、特征等时，本发明的某些实施例或本发明的方面由所述要素、特征等组成或基本上由所述要素、特征等组成。出于简单的目的，那些实施例在本文中未特定地以那些词进行描述。应注意术语“包含”打算为开放式的且允许包括其它要素或步骤。
当提供范围时，包括端点。此外，应了解除非另有指示或另外从本文和所属领域的普通技术人员的理解显而易见，否则在本发明的不同实施例中以范围形式表述的值可采取所述范围中的任何特定值或子范围，除非上下文另外明确规定，否则精确到所述范围的下限单位的十分之一。
除非本文另外清楚指示，否则如说明书和随附权利要求书中所使用，单数形式“一”和“所述”包括多个指示物。
另外，应了解属于现有技术的本发明的任何特定实施例可明确地从权利要求书的任一个或一个以上权利要求中排除。因为认为所述实施例为所属领域的普通技术人员所已知，所以可将其排除在外，即使本文未明确阐明所述排除。出于任何原因，不管是否与现有技术的存在有关，本发明的组合物的任何特定实施例(例如任何疟原虫属物种、品系等；任何疟原虫多肽抗原；任何表达系统；任何植物制备系统；任何投药方法；等)都可从任一个或一个以上权利要求中排除。
本文所引用的所有参考文献都以引用的方式并入本文中。已描述本发明的许多实施例。然而，应了解可在不脱离本发明的精神和范围下进行各种修改。因此，其它实施例在以下权利要求书的范围内。

Claims (84)

1.一种分离的融合蛋白，其包含热稳定性蛋白质和疟原虫(Plasmodium)多肽，其中所述疟原虫多肽为Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽或其免疫原性部分，且其中所述融合蛋白在投予个体时诱导或增强针对所述疟原虫多肽的免疫反应。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述热稳定性蛋白质为地衣多糖酶(lichenase)多肽。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述地衣多糖酶多肽为与SEQ ID NO：40具有至少90％序列一致性的经修饰的地衣多糖酶B多肽。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述地衣多糖酶B多肽与SEQ ID NO：40具有至少95％的序列一致性。
5.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述地衣多糖酶B多肽与SEQ ID NO：40具有至少98％的序列一致性。
6.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述地衣多糖酶B多肽与SEQ ID NO：40具有至少99％的序列一致性。
7.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述地衣多糖酶多肽具有SEQ ID NO：40的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽为Pfs25多肽，其中所述Pfs25多肽与SEQ ID NO：42具有至少90％的序列一致性。
9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQ ID NO：42具有至少95％的序列一致性。
10.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQ ID NO：42具有至少98％的序列一致性。
11.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQ ID NO：42具有至少99％的序列一致性。
12.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述Pfs25多肽具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列。
13.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽为与SEQ ID NO：55具有至少90％序列一致性的Pfs28多肽。
14.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQ ID NO：55具有至少95％的序列一致性。
15.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQ ID NO：55具有至少98％的序列一致性。
16.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQ ID NO：55具有至少99％的序列一致性。
17.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中所述Pfs28多肽具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列。
18.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽为Pfs48/45多肽，其中所述Pfs48/65多肽为与SEQ ID NO：62具有至少90％序列一致性的多肽。
19.根据权利要求18所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQ ID NO：62具有至少95％的序列一致性。
20.根据权利要求18所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQ ID NO：62具有至少98％的序列一致性。
21.根据权利要求18所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQ ID NO：62具有至少99％的序列一致性。
22.根据权利要求18所述的融合蛋白，其中所述Pfs48/45多肽具有SEQ ID NO：62的氨基酸序列。
23.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽为Pfs230多肽，其中所述Pfs230多肽与SEQ ID NO：95具有至少90％的序列一致性。
24.根据权利要求23所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQ ID NO：95具有至少95％的序列一致性。
25.根据权利要求23所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQ ID NO：95具有至少98％的序列一致性。
26.根据权利要求23所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQ ID NO：95具有至少99％的序列一致性。
27.根据权利要求23所述的融合蛋白，其中所述Pfs230多肽具有SEQ ID NO：95的氨基酸序列。
28.一种融合蛋白，其包含与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有至少90％的序列一致性的多肽：SEQ ID NO：152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252和254。
29.根据权利要求28所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有至少95％的序列一致性：SEQ ID NO：152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252和254。
30.根据权利要求28所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有至少98％的序列一致性：SEQ ID NO：152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252和254。
31.根据权利要求28所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有至少99％的序列一致性：SEQ ID NO：152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252和254。
32.根据权利要求28所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252和254。
33.一种核酸，其包含编码根据权利要求1至32中任一权利要求所述的融合蛋白的序列。
34.一种表达载体，其包含根据权利要求33所述的核酸。
35.根据权利要求34所述的表达载体，其进一步包含前导序列。
36.根据权利要求34或35所述的表达载体，其中所述表达载体为农杆菌质粒(Agrobacterial plasmid)、植物病毒载体或克隆到农杆菌质粒中的植物病毒载体。
37.一种宿主细胞，其包含根据权利要求34至36中任一权利要求所述的表达载体。
38.根据权利要求37所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为植物细胞。
39.一种植物，其包含根据权利要求38所述的植物细胞。
40.一种医药组合物，其包含根据权利要求1至32中任一权利要求所述的融合蛋白和医药学上可接受的载剂或赋形剂。
41.一种在个体中诱导或增强针对疟原虫多肽的免疫反应的方法，其中所述疟原虫多肽为Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽，所述方法包含向所述个体投予有效量的根据权利要求40所述的医药组合物。
42.一种产生根据权利要求1至32中任一权利要求所述的融合蛋白的方法，所述方法包含：
(a)提供包含编码所述融合蛋白的核酸的核酸构筑体；
(b)将所述核酸构筑体引入植物细胞中；和
(c)在允许表达所述融合蛋白的条件下维持所述细胞。
43.一种制备诱导或增强针对疟原虫多肽的免疫反应的组合物的方法，其中所述疟原虫多肽为Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽，所述方法包含：
a)在植物中产生根据权利要求1至32中任一权利要求所述的融合蛋白；
b)分离所述融合蛋白；和
c)将步骤(b)的所述融合蛋白与医药学上可接受的载剂组合。
44.一种制备诱导或增强针对疟原虫多肽的免疫反应的组合物的方法，其中所述疟原虫多肽为Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽或其免疫原性部分，所述方法包含：
a)在植物中产生所述疟原虫多肽；
b)分离所述多肽；和
c)将所述多肽与医药学上可接受的载剂组合。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述疟原虫多肽为Pfs25多肽，其中所述Pfs25多肽为与SEQ ID NO：42具有至少90％序列一致性的多肽。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述Pfs25多肽具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列。
47.根据权利要求44所述的方法，其中所述疟原虫多肽为Pfs28多肽，其中所述Pfs28多肽为与SEQ ID NO：55具有至少90％序列一致性的多肽。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述Pfs28多肽具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列。
49.根据权利要求44所述的方法，其中所述疟原虫多肽为Pfs48/45多肽，其中所述Pfs48/45多肽为与SEQ ID NO：62具有至少90％序列一致性的多肽。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述Pfs48/45多肽具有SEQ ID NO：62的氨基酸序列。
51.根据权利要求44所述的方法，其中所述疟原虫多肽为Pfs230多肽，其中所述Pfs230多肽为与SEQ ID NO：95具有至少90％序列一致性的多肽。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述Pfs230多肽具有SEQ ID NO：95的氨基酸序列。
53.根据权利要求42至52中任一权利要求所述的方法，其中所述植物短暂表达所述多肽或融合蛋白。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述短暂表达是来自农杆菌质粒、植物病毒载体或克隆到农杆菌质粒中的植物病毒载体。
55.根据权利要求42至52中任一权利要求所述的方法，其中所述植物是所述多肽的转基因植物。
56.根据权利要求43至55中任一权利要求所述的方法，其进一步包含将所述组合物与至少一种佐剂组合。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述佐剂是选自由以下组成的群组：明矾、Quil A、QS21、氢氧化铝、磷酸铝、矿物油、MF59、Malp2、不完全弗氏佐剂(incomplete Freund′s adjuvant)、完全弗氏佐剂(complete Freund′s adjuvant)、铝胶(alhydrogel)、3去-O-酰化单磷酰基脂质A(3D-MPL)、脂质A、百日咳杆菌(Bortadella pertussis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、默克佐剂65(Merck Adjuvant 65)、角鲨烯、病毒颗粒(virosome)、SBAS2、SBAS1、AS03和未甲基化CpG序列。
58.一种产生疟原虫多肽的方法，其中所述疟原虫多肽为Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽或其免疫原性部分，所述方法包含：
(a)提供包含编码所述疟原虫多肽的核酸的核酸构筑体；
(b)将所述核酸构筑体引入植物细胞中；和
(c)在允许表达所述融合蛋白的条件下维持所述细胞。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述疟原虫多肽为Pfs25多肽，其中所述Pfs25多肽为与SEQ ID NO：42具有至少90％序列一致性的多肽。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述Pfs25多肽具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列。
61.根据权利要求58所述的方法，其中所述疟原虫多肽为Pfs28多肽，其中所述Pfs28多肽为与SEQ ID NO：55具有至少90％序列一致性的多肽。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述Pfs28多肽具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列。
63.根据权利要求58所述的方法，其中所述疟原虫多肽为Pfs48/45多肽，其中所述Pfs48/45多肽为与SEQ ID NO：62具有至少90％序列一致性的多肽。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述Pfs48/45多肽具有SEQ ID NO：62的氨基酸序列。
65.根据权利要求58所述的方法，其中所述疟原虫多肽为Pfs230多肽，其中所述Pfs230多肽为与SEQ ID NO：95具有至少90％序列一致性的多肽。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述Pfs230多肽具有SEQ ID NO：95的氨基酸序列。
67.根据权利要求38、39或42至66中任一权利要求所述的方法，其中所述植物是来自选自由以下组成的群组的属：芸苔属(Brassica)、烟草属(Nicotiana)、矮牵牛属(Petunia)、西红柿属(Lycopersicon)、茄属(Solanum)、番椒属(Capsium)、胡萝卜属(Daucus)、旱芹属(Apium)、莴苣属(Lactuca)、芥子属(Sinapis)或拟南芥属(Arabidopsis)。
68.根据权利要求38、39或42至66中任一权利要求所述的方法，其中所述植物是来自选自由以下组成的群组的物种：本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)、埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)、芥菜(Brassica juncea)、欧洲油菜(Brassica napus)、黑芥(Brassica nigra)、甘蓝(Brassica oleraceae)、撒哈拉芥(Brassica tournifortii)、白芥子(Sinapis alba)和萝卜(Raphanus sativus)。
69.根据权利要求38、39或42至66中任一权利要求所述的方法，其中所述植物是选自由以下组成的群组：紫花苜蓿(alfalfa)、萝卜(radish)、芥菜(mustard)、绿豆(mung bean)、西兰花(broccoli)、水田芹(watercress)、大豆(soybean)、小麦(wheat)、向日葵(sunflower)、卷心菜(cabbage)、三叶草(clover)、矮牵牛(petunia)、西红柿(tomato)、马铃薯(potato)、烟草(tobacco)、菠菜(spinach)和小扁豆(lentil)。
70.根据权利要求38、39或42至66中任一权利要求所述的方法，其中所述植物为发芽的籽苗。
71.根据权利要求43至70中任一权利要求所述的方法，其中通过根据权利要求58所述的方法来进行步骤(a)。
72.一种植物细胞，其是通过根据权利要求58至71中任一权利要求所述的方法产生的。
73.一种植物，其包含根据权利要求72所述的植物细胞。
74.一种在个体中诱导或增强针对疟原虫多肽的免疫反应的方法，所述方法包含向个体投予通过根据权利要求42、58至73中任一权利要求所述的方法产生的植物或植物细胞。
75.一种在个体中诱导或增强针对疟原虫多肽的免疫反应的方法，所述方法包含向所述个体投予治疗有效量的通过根据权利要求43至55中任一权利要求所述的方法产生的组合物。
76.根据权利要求41或75所述的方法，其中经口、鼻内、皮下、静脉内、腹膜内或肌肉内投予所述组合物。
77.根据权利要求41、74至76中任一权利要求所述的方法，其中所述个体为人类。
78.根据权利要求41、74至76中任一权利要求所述的方法，其中所述个体为非人类灵长类动物、鸟类或啮齿动物。
79.一种保护个体群体免受疟原虫感染的方法，所述方法包含向个体投予有效量的根据权利要求40所述的组合物。
80.一种减少疟原虫在个体群体中传播的方法，所述方法包含向一个或一个以上个体投予有效量的根据权利要求40所述的组合物。
81.一种减少疟原虫传播到处于疟原虫感染风险中的群体中的个体的方法，所述方法包含向所述群体中的一个或一个以上个体投予有效量的根据权利要求40所述的组合物。
82.一种减少疟原虫从个体传播的方法，所述方法包含向所述个体投予有效量的根据权利要求40所述的组合物。
83.根据权利要求79至82中任一权利要求所述的方法，其中所述个体为人类。
84.根据权利要求79至82中任一权利要求所述的方法，其中所述个体为非人类灵长类动物、鸟类或啮齿动物。
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