JP2003525619A - ウイルスコートタンパク質融合体としての植物における外来ポリペプチドの産生 - Google Patents

ウイルスコートタンパク質融合体としての植物における外来ポリペプチドの産生

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、植物ウイルス構造タンパク質のアミノ末端に融合した外来ペプチド配列、およびそれらの産生方法に関する。生物学的に含まれるタバモウイルスによって、融合タンパク質は、植物において高レベルで経済的に合成される。この外来ペプチド配列は、タンパク質分解酵素または化学薬品によって融合タンパク質から切断され得る。本発明の外来ペプチド配列は、多数の用途を有する。このような用途としては、所望の結合特性を有する抗体（例えば、防御抗体）の産生を誘導するための抗原としての使用、寄生生物の感染に対する免疫を含む、防御免疫の誘導のためのワクチン抗原としての使用、ホルモン活性に関連するタンパク質としての使用、または免疫調節活性に関連するタンパク質としての使用が挙げられる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 植物中での遺伝的に操作されたポリペプチドの産生の分野における本発明は、
より具体的には、ヒトおよび他の哺乳動物におけるワクチン組成物として有用な
免疫原性タンパク質のような融合タンパク質を発現するための、タバモウイルス
ベクターの使用に関する。
【０００２】 （発明の背景） ポリペプチド（ペプチドと交換可能に使用される）は、その天然の環境で活性
な生体分子の重要なクラスであるか、またはホルモン、サイトカイン、ワクチン
抗原、免疫調節性因子、酵素インヒビター、細胞接着分子、レセプタードメイン
などとして作用する薬理学的因子として利用され得る。化学合成の費用は、治療
薬物またはワクチンとしての合成ペプチドの有用性を制限する。天然に存在する
ポリペプチドのミリグラムおよびより多量の、迅速で安価な合成の必要性が存在
する。動物および細菌性ウイルスは、所望のポリペプチドをコードしそして所望
のポリペプチドを発現するようにされる組換え核酸の「キャリア」として、また
は供給源として、首尾良く利用されてきた。
【０００３】 植物（これは、成長させるのに安全でありかつ安価である）は、このようなペ
プチドの費用的に効率的な産生のための、改善された代替的な宿主を表す。植物
の遺伝子操作のための新しくかつ改善されたベクターの必要性が、当該分野に存
在する。それにもかかわらず、過去１０年間の間、植物中の異種の（外来の）遺
伝子の発現におけるかなりの進歩がなされた。現在では、異種タンパク質は、植
物の改善の目的で、またはタンパク質産生それ自体のために、多くの植物種にお
いて日常的に産生される。動物タンパク質は、植物において首尾よく産生されて
いる（Ｋｒｅｂｂｅｒｓら，１９９２において概説される）。ヒトの医薬におけ
る使用のための１つの利点は、植物中で合成されるタンパク質が、細菌毒素およ
びヒトに対する病原体である他の微生物またはウイルスを比較的含まずに得られ
ることである。
【０００４】 植物の遺伝子操作のためのベクターは、いくつかの天然に存在する植物ウイル
ス（タバコモザイクウイルス、ＴＭＶを含む）由来である。ＴＭＶは、タバモウ
イルス（ＴｂｍＶ）群の型のメンバーである。ＴＭＶは、直径４ｎｍの中空管を
有する約３００×１８ｎｍの直線管状ビリオンとして存在し、単一のＲＮＡ分子
の周りをらせん状に巻きついた約２０００のコピーの単一のキャプシドタンパク
質からなる。ＴＭＶビリオンの組成は、重量で９５％のタンパク質および５％の
ＲＮＡである。このＴＭＶゲノムは、６３９５ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡであ
り、そして５つの大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。各Ｏ
ＲＦ（または遺伝子）の発現は、独立して調節される。このビリオンＲＮＡは、
１２６ｋＤａのレプリカーゼサブユニットおよび重複する１８３ｋＤａのレプリ
カーゼサブユニット（これは、アンバー停止コドンの読み過ごし（ｒｅａｄ−ｔ
ｈｒｏｕｇｈ）（約５％の頻度で生じるプロセス）によって産生される）をコー
ドする５’ＯＲＦのためのｍＲＮＡとして役立つ。「内部」遺伝子の発現は、複
製の間に３’−共通末端（ｃｏｔｅｒｍｉｎａｌ）サブゲノムｍＲＮＡの転写を
駆動するマイナスセンスＲＮＡ鎖上の異なるプロモーターによって制御される（
図１）。ＴｂｍＶの生活環および遺伝子発現の詳細な説明は、Ｄａｗｓｏｎおよ
びＬｅｈｔｏ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３８
：３０７−３４２（１９９１）において見出される。
【０００５】 植物中でのタンパク質産生のために、過渡的に発現される異種遺伝子をコード
するウイルスベクターは、いくつかの利点を有する。植物ウイルス遺伝子の産物
は、ウイルスに感染した植物における最も豊富なタンパク質の１つである。一般
に、ウイルス遺伝子産物は、ウイルス複製の間に植物細胞において産生される主
なタンパク質である。多くのウイルスは、最初の感染部位からこの植物のほとん
ど全ての細胞に迅速に移動する。これらの理由のために、植物ウイルスは、植物
中の異種タンパク質の過渡的な発現のための効率的なベクターへと発展した。多
細胞植物に感染するウイルスは、浸透移行性感染をこの植物全体へ伝播する際に
、細胞間のウイルスの移動を可能にする経路によって課されるサイズ限定におそ
らく起因して、比較的小さい。大部分の植物ウイルスは、１０ｋｂより小さい一
本鎖ＲＮＡゲノムを有する。
【０００６】 遺伝的に変化した植物ウイルスは、「キャリア」配列に連結した目的のペプチ
ドまたはポリペプチドを含む融合ポリペプチド（「ＦＰ」）をコードする遺伝子
を用いて植物を形質導入するための、１つの効率的な手段を提供する。ＴＭＶコ
ートタンパク質融合物の記載については、Ｔｕｒｐｅｎら，米国特許第５，９７
７，４３８（「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｐｌａ
ｎｔｓ ａｓ Ｖｉｒａｌ Ｃｏａｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｓｉｏｎｓ」）を
参照のこと。Ｙｕｓｉｂｏｖ Ｖ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９４：５７８４−５７８８（１９９７）；Ｍｏｄｅｌｓｋａ，Ａら，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：２４８１−２４８５（
１９９８）もまた参照のこと。
【０００７】 （パルボウイルス疾患） パルボウイルスの病原性は、最近、Ｐａｒｉｓｈ，Ｃ．Ｒ．，Ｂａｉｌｌｉｅ
ｒｅｓ Ｃｌｉｎ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．８：５７−７１（１９９５）によって概
説された。ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）およびイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）
は、これらが引き起こす疾患の病態生理学と同様に、密接に関連する。パルボウ
イルスは、扁桃腺において最初に複製し、次いでその最終的な標的細胞（有糸分
裂活性な腸管陰窩上皮細胞および骨髄幹細胞）に伝播する。ウイルス血症は、７
日間未満持続し、その後回復するか死亡するかのいずれかである。ネコにおける
臨床的徴候としては、熱、嘔吐、下痢、汎白血球減少、急性ショックが挙げられ
、そして死を導き得る。この疾患の結果および死亡率は、白血球減少症の重症度
に比例する。
【０００８】 ミンク腸炎ウイルス（ＭＥＶ）は、ＦＰＶと密接に関連する。このＭＥＶ Ｖ
Ｐ２（またはＥ２）エピトープは、黒豆の葉の上で伝播するササゲモザイクウイ
ルス（ＣＰＭＶ）の表面で発現された（Ｄａｌｓｇａａｒｄ，Ｋら，Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２４８−２５２（１９９７））。このエピト
ープを提示する１ｍｇのＣＰＭＶ材料を、ミンクを免疫するために使用し、そし
てこれらを病原性のＭＥＶでの攻撃から保護した。免疫したミンクを臨床的疾患
から保護し、そして感染した場合にほとんどウイルスを分散しなかった（ｓｈｅ
ｄ ｖｅｒｙ ｌｉｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ）。この著者らは、この様式で発現し
たこのエピトープが、そのそれぞれのパルボウイルスによる感染に対してネコお
よびイヌを保護するために使用され得ることを提案した。
【０００９】 ＶＰ２（Ｅ２）についてのコード配列および狂犬病スパイク（ｓｐｉｋｅ）糖
タンパク質は、狂犬病およびネコ汎白血球減少に対する生きた組換えワクチンを
産生するために、アライグマポックスウイルス中へと操作された（Ｈｕ，Ｌ．ら
，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１８：２４８−２５２（１９９６）；Ｈｕ，Ｌ．ら，Ｖ
ａｃｃｉｎｅ １５：１４６６−１４７２（１９９７））。この構築物でワクチ
ン接種されたネコは、病原性パルボウイルスを用いる攻撃に対して保護された。
【００１０】 （発明の要旨） 本発明は、ＦＰをコードするポリヌクレオチド（または核酸）分子に関し、こ
のＦＰは、植物ウイルスコートタンパク質（ＶＣＰ）および目的のポリペプチド
（Ｐ１）を、連結エレメント（Ｌ）を介して植物ＶＣＰのＮ末端に含む。このよ
うな構築物は、タンパク質レベルで以下のように特徴付けられ得る： Ｈ２Ｎ−−Ｐ１−−Ｌ−−ＶＣＰ−−ＣＯＯＨ 目的の第２のポリペプチド（「Ｐ２」）は、この植物ＶＣＰのＣ末端で、 Ｈ２Ｎ−Ｐ１−−Ｌ−−ＶＣＰ−−Ｐ２−ＣＯＯＨ Ｐ１のＣ末端で、 Ｈ２Ｎ−Ｐ１−−Ｌ−−Ｐ２−−−Ｌ−−ＶＣＰ−ＣＯＯＨ またはこの植物ＶＣＰの内部の部位で、 Ｈ２Ｎ−Ｐ１−−Ｌ−−ＶＣＰ（ａ）−Ｐ２−ＶＣＰ（ｂ）−ＣＯＯＨ 上記の融合タンパク質と融合され得、ここで、ＶＣＰ（ａ）およびＶＣＰ（ｂ）
は、内部に位置するＰ２配列に隣接するＶＣＰの２つのフラグメントをいう。
【００１１】 同一であるかまたは異なるかのいずれかであり、連続的に連結し、各反復ペプ
チド単位の間に介在性Ｌ基を含むかまたは含まずに、最終的にはＶＣＰに連結さ
れ、好ましくはそのＮ末端に３と１００との間の目的のペプチドを含むコンカテ
マーであるＦＰもまた含まれる。
【００１２】 本発明の組換え植物ウイルスで植物細胞を感染させることによって、比較的多
量の目的のポリペプチド（Ｐ１またはＰ２）が、ＦＰの形態で産生され得る。
【００１３】 Ｐ１は、化学的または酵素的切断によって、植物ＶＣＰから単離され得る。化
学的な切断因子は、Ｌ内の共有結合を切断する。組換え植物ウイルスによってコ
ードされるＦＰは、いくつかの形態のいずれか１つで存在し得る（？）。 このＦＰは、好ましくは、Ｐ１の１つ以上の性質を保持する。Ｐ２が存在する
場合、ＦＰはまた、Ｐ２の１つ以上の性質を有し得る。単離されたＰ１またはＰ
２あるいはＦＰ自体は、保護的な免疫応答を誘導するために、被験体をワクチン
接種するための免疫原として使用され得、これは抗体、反応性Ｔリンパ球（例え
ば、細胞傷害性Ｔリンパ球、すなわちＣＴＬ）を含み得る。好ましいＰ１は、保
護性パルボウイルスエピトープである。
【００１４】 本発明はまた、このポリヌクレオチドからＦＰを発現し、そしてＰ１またはＰ
２あるいは両方をこのＦＰから切断することによって、Ｐ１またはＰ２を産生す
るための方法を含む。
【００１５】 本発明は、このようなポリヌクレオチドを含む組換えウイルス核酸、組換えウ
イルスゲノム、組換えウイルス粒子、組換え植物ウイルス、植物、植物細胞、植
物プロトプラストなどを提供する。本発明はまた、対象の組換え植物ウイルスの
ゲノムを含むポリヌクレオチドを提供する。
【００１６】 本発明は、対象の組換え植物ウイルスによってコードされる融合ポリペプチド
、およびこのウイルスに感染した植物細胞を提供する。
【００１７】 本発明はまた、対象のポリヌクレオチドを使用して融合ポリペプチドを発現す
ることによって、Ｐ１を合成する方法を提供する。
【００１８】 本発明は、連結エレメントを介して植物ＶＣＰのＮ末端に連結した目的のタン
パク質を含むＦＰをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、対
象のポリヌクレオチドおよびＦＰを使用して、目的のタンパク質を産生するため
の方法を提供する。植物ＶＣＰのＮ末端に融合した目的のタンパク質を有するこ
との利点は、感染性ビリオンが、目的のタンパク質が植物ＶＣＰのＣ末端または
内部の部位に融合される場合よりも、ＦＰを有するＶＣＰサブユニットのより高
い比率に耐性であり得ることである。本発明の他の利点は、以下である： （１）目的のタンパク質は、切断因子の存在下で、この融合タンパク質から切
断可能である。
【００１９】 （２）この融合タンパク質は、測定可能な方法を使用して抽出され得る。
【００２０】 （３）この融合タンパク質からの目的のタンパク質の引き続く切断は、測定可
能である。
【００２１】 （４）内部のメチオニンコドンからの翻訳の開始は、野生型植物ＶＣＰの発現
を生じ、これはより多くのウイルス粒子を生成し、これによってウイルスの単離
および生成が容易になる。
【００２２】 （特定の実施形態の説明） 本明細書において用いられる多数の略語および定義は、以下のようである： ＣＮＢｒ：臭化シアン。 コード配列：ＤＮＡまたはＲＮＡ配列であり、これらは、転写および翻訳される
かまたは直接翻訳されるかのいずれかの場合に、ポリペプチドまたはリボヌクレ
オチド配列の形態を生じ、翻訳される場合、ポリペプチドの形態を生じる。 ＣＰ：コートタンパク質。 ＥＬＩＳＡ：酵素免疫測定法。 ＦＰ：融合ポリペプチド（または、タンパク質）。 ＦＰＶ：ネコ汎白血球減少症ウイルス。 ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィ。 感染：ウイルスがその核酸を宿主に移すかまたはウイルス核酸を宿主に導入する
能力であって、ここでウイルス核酸が複製され、ウイルスタンパク質が合成され
て、そして新たなウイルス粒子が構築される。この状況において、用語「伝播性
」および「感染性」は、本明細書で交換可能に用いられる。この用語はまた、選
択された核酸配列を標的生物のゲノム、染色体、または遺伝子に組みこむ能力を
含むことを意味する。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：マトリックス支援イオン化（ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔ
ｉｏｎ）−飛行時間型質量分析計。 核酸：完全な遺伝子配列に至るかまたはこれを含む１つ以上のヌクレオチドから
なる任意のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。この用語は、天然に存在する（
ネイティブな）ものか、または操作されたものか、または組みかえられた全ての
核酸を含むことを意図する。 ＯＲＦ：オープンリーディングフレーム。 ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミドゲル電気泳動。 ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応。 ＰＥＧ：ポリエチレングリコール。 ＰＥＩ：ポリエチレンイミン。 プロトプラスト：一部もしくは全ての細胞壁を欠損した、単離された植物または
細菌細胞。 組換えウイルス核酸：非ネイティブのヌクレオチド配列を含むよう修飾されたウ
イルス核酸であり、これは、任意の生物体に由来し得るか、または純粋に合成さ
れ得る：しかし、このような核酸は、組み換えウイルス核酸が誘導される生物に
おいて自然に存在する配列を含む。 組換えウイルス：組換えウイルス核酸を含むウイルス。 サブゲノムプロモーター：ウイルス核酸から転写されるサブゲノムｍＲＮＡのプ
ロモーター。 全身性感染：単に直接細胞に接種する以外の拡散する機構を含む、生物のかなり
の部分にわたる感染であるが、むしろこれは、１つの感染した細胞から、近くか
または遠くのいずれかのさらなる細胞に輸送する工程を含む。 ＴｂｍＶ：タバモイルス。 ＴＭＶ：タバコモザイクウイルス。 ＶＣＰ：ウイルスコートタンパク質。 ウイルス粒子：ゲノム核酸を伴うかまたは伴わないウイルス構造タンパク質の高
分子量の凝集塊。 ビリオン：感染性のウイルス粒子。 表現を容易にするため、本明細書中以下の慣用表現が用いられる。 Ｐ１：目的のポリペプチド。 Ｌ：結合エレメントまたはリンカー（例えば、Ｐ１とＶＣＰの間、および／また
はＰ２とＶＣＰの間、および／またはＰ１とＰ２の間。異なるＬ’はＬ１、Ｌ２ などと示す。 Ｐ２：Ｐ１と異なる目的の第２のポリペプチド。 したがって、ＦＰの１つの例は、Ｐ１−−Ｌ−ＶＣＰである。
【００２３】 （本発明） 本発明は、植物ＶＣＰと目的のポリペプチドを合わせた（好ましくはリンカー
を介して植物ＶＣＰのＮ末端に融合される）融合ポリペプチドをコードする新規
な組換え植物ウイルスを提供する。本発明の組換え植物ウイルスは、植物細胞に
感染し次いで全体に感染するよう拡大することによって全体的に融合ポリペプチ
ドを発現する特性を有する。本発明は、切断因子を用いてリンカーを切断するこ
とによって、目的のポリペプチドを融合ポリペプチドから単離する方法を提供す
る。したがって、大量の目的のポリペプチドは、本発明の組換え植物ウイルスを
用いて（植物のＶＣＰに融合させるかまたは融合ポリペプチドから単離されるか
のいずれかで）産生される。
【００２４】 本発明の融合ポリペプチドは、少なくとも３つの構成成分を含む：（１）植物
ＶＣＰ、（２）リンカー、および（３）目的のポリペプチド（Ｐ１）。融合ポリ
ペプチドはまた、目的の第２のポリペプチドを含み得る。植物ＶＣＰの構成成分
は、発現ベクターが主に由来する植物ウイルスのネイティブＣＰに由来し得る。
つまり、このようなＶＣＰは、ネイティブであるかまたは組換えウイルスベクタ
ーゲノムに関するホモログである。あるいは、本発明のＶＣＰ構成成分は、組み
換えウイルスベクターゲノムに対して異種（非ネイティブ）であり得る。植物Ｖ
ＣＰ構成成分は、野生型ＶＣＰまたは天然に存在する植物ＶＣＰである必要は全
くない。しかし、このような植物ＶＣＰ構成成分は、好ましくは、本発明に従う
機能を許容する野生型または天然に存在する植物ＶＣＰの関連する生物学的／化
学的特性を提示する。しかし、本発明はまた、修飾ＶＣＰを意図しており、ここ
でＰ１またはＰ２または他のペプチド融合パートナーは、ＶＣＰの生物学的機能
を阻害するような大きさか、またはこのように配置される。これは、（当該分野
で周知のである）他の手段が所望のペプチドの精製に利用可能であり；さらに、
ビリオン構成体が植物の全体の感染に必要でないためである。
【００２５】 好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、植物ＶＣＰと共に発現され
る融合ポリペプチドをコードする。融合ポリペプチドの翻訳の間かまたは翻訳後
修飾の間に、植物ＶＣＰの発現が、植物ＶＣＰ ＤＮＡ（またはｍＲＮＡ）の内
部の開始コドンにおいて始まり得る。融合ポリペプチドの蛋白分解は、植物ＶＣ
Ｐを生じる転写後修飾である。
【００２６】 本発明の好ましい実施形態において、ＶＣＰは、ＴＭＶ １７．５ｋＤａ Ｃ
Ｐであり、そしてＴＭＶ由来ベクターと共に使用される。
【００２７】 このリンカーは、任意の共有結合または実質的に任意のアミノ酸配列のペプチ
ドであり得、これは、この共有結合または任意のペプチド結合を壊す切断因子に
よって切断される。これは、目的のポリペプチドから植物ＶＣＰを分離する。
【００２８】 この切断因子は、化学化合物かまたは関連する共有結合を壊し得るプロテアー
ゼであり得る。このようなプロテアーゼの例は、トリプシン、キモトリプシン、
ペプシン、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｖ８プロテアーゼ、
および第Ｘａ因子プロテアーゼである。化学化合物の例は、臭化シアン（ＣＮＢ
ｒ）である。
【００２９】 本発明の好ましい実施形態において、リンカーは、本明細書に記載されるよう
な特定の切断因子によって切断されるのに適した、１つ以上のアミノ酸またはペ
プチドである。
【００３０】 切断因子およびこれらの基質リンカーの特性の例は、以下の表に示される。
【００３１】
【表１】 １Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｖ８プロテアーゼは、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ
７．８）、または５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．０）中でグルタミン酸の
カルボキシル基側で切断する；そして５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７
．８）中でアスパラギン酸または。グルタミン酸の両方のカルボキシル基側で切
断する。 上記の例は単なる例示であって、切断因子および連結エレメントの可能な組み合
せを限定するものでない。好ましい実施形態において、１つの壊される共有結合
は、ペプチド結合である。
【００３２】 融合ポリペプチドにおける目的のポリペプチドは、実質的に任意のアミノ酸配
列のペプチドからなり得るが、ただし、以下の例の関連する生物学的／生化学的
活性は維持する：（１）抗体またはＴ細胞レセプターを含むレセプター分子に対
する結合、（２）酵素の活性部位に対する結合、（３）免疫原性または免疫調節
活性、（４）ホルモン活性、および（６）金属キレート活性、を提供する。目的
のポリペプチドは、このポリペプチドが由来するタンパク質のアミノ酸配列の全
てまたは一部を含み得る（例えば、抗原エピトープ）。例えば、Ｂ型肝炎ワクチ
ンにおいての使用のために、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ）と同様の抗原特性
を有する部分的アミノ酸配列は、本発明の融合ポリペプチドに含まれる目的のポ
リペプチドであり得る。任意のタンパク質についての構造および機能の詳細な情
報は、目的のポリペプチドの所望される特性を有する融合ポリペプチドの設計に
使用される。
【００３３】 本明細書で規定されるように、目的のポリペプチドは、１つのアミノ酸残基か
ら数百残基にわたる大きさにおいて変化し得る。好ましくは、目的のポリペプチ
ドは、１００アミノ酸残基未満、より好ましくは、５０残基未満、さらにより好
ましくは、２５残基未満の長さを有する。いくつかの実施形態において目的の部
分のポリペプチドは、所望される特性を維持するため１００残基より大きい必要
があり得ることが当業者に理解される。一般に、所望される生物学的／化学的特
性を維持しながら、本発明の融合物の目的の構成成分のポリペプチドの長さを最
小にすることが好ましい。
【００３４】 特に好ましい実施形態は、免疫原およびワクチン組成物として使用するための
ポリペプチドまたはペプチドである。例えば、融合ポリペプチドまたはこれらの
免疫原性フラグメントは、哺乳動物に注入され（必要に応じて適切なアジュバン
トと共に注入され）；Ｐ１に対する免疫応答を誘導する。Ｐ１は、病原性微生物
の１つ以上のエピトープを含み得、結果として、免疫応答は、免疫された宿主に
おいて予防免疫（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）の状態を引き起こ
す。イムノアッセイ因子として用いられる抗血清またはモノクローナル抗体を産
生するために、同様の免疫応答が利用され得る。
【００３５】 本発明のＦＰはまた、Ｐ１と異なる目的のＰ２の第２のポリペプチドを有し、
そのＮ末端以外の位置でＶＣＰと連結する。ＶＣＰ配列がＰ２配列に結合するＦ
Ｐの部位は、本明細書で「融合接合部」と称する。所定のＦＰは、Ｐ２のＮ末端
に結合するＶＣＰのＣ末端に位置する１つ（または２つ）の融合接合部を有し得
る。他の実施形態において、Ｐ２配列は、ＶＣＰ配列に対し内側にあり、その結
果ＦＰは、Ｐ２のいずれかの末端において２つの融合接合部を有する。これは、
内部ＦＰと呼ばれる。内部ＦＰは、全長または部分的なＶＣＰ配列を含み得、こ
れはＰ２配列によって「中断」される。この構造は、
【００３６】
【化１】 として記載され得る。 ここで、ＶＣＰ（ａ）およびＶＣＰ（ｂ）は、ＶＣＰの２つのセグメントメント
をいい、ここで、ＶＣＰ（ａ）は、介在性のＰ２のＮ末端であり、ＶＣＰ（ｂ） は、Ｐ２のＣ末端である。融合接合部は、ペプチド結合（ＣＯ−ＮＨ）として示
されるが、これらの接合部のいずれかまたは両方において連結エレメント含み得
る。二つの連結エレメントが存在する場合、これらは同じであり得るかまたは異
なり得る。２つの異なる連結エレメントＬ１およびＬ２を有する上記のＦＰを表
す式を以下に示す：
【００３７】
【化２】 内部ＦＰにおいて、融合接合部は、ＶＣＰ内の多くの部位のいずれかに位置し得
る。融合接合部について適切な部位は、位置の慣用的で系統的な変動および所望
される特性についてのその産物の試験通して決定され得る。適切な部位は、ＶＣ
Ｐの３次元構造の事前の分析によって決定され得て、ＶＣＰ機能に顕著な阻害を
伴わずにＰ２の挿入を許容する部位を決定する。植物ＶＣＰの３次元構造の詳細
およびウイルス中でのこれらの配位は、公知であり、公に利用可能である。例え
ば、ウイルスの分解モデルおよびＣｕｃｕｍｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｔｔｌｅ
Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ（これは、他のタバモイルスＣＰと強い構造の類似
性を有する）のＣＰは、ＷａｎｇおよびＳｔｕｂｂｓ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、
２３９：３７１〜３８４（１９９４）において見出される。ＴＭＶおよびＣＰに
おける構造情報の詳細は、Ｎａｍｂａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０８：３０
７〜３２５（１９８９）およびＰａｔｔａｎａｙｅｋおよびＳｔｕｂｂｓ Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２８；５１６〜５２８（１９９２）において見出される。
【００３８】 本発明において有用な他のペプチド（特に、目的の第２のペプチド（すなわち
、Ｐ２）など）は、ＦＰの精製を可能にする親和性タグとして役立つペプチドで
ある。周知の例は、「Ｈｉｓ−Ｔａｇ」であり、ここで配列の５〜７のヒスチジ
ン残基は、Ｐ２を含み、そしてＨｉｓタグタンパク質を精製するために、市販の
ニッケル−アガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたアフィニティークロマト
グラフィーを許容する。本発明のＦＰに含まれ得る他のタグは、マルトース結合
タンパク質、セルロース結合タンパク質、または結合活性を有するこれらのドメ
インもしくはフラグメントである。次いで親和性精製は、マルトースまたはセル
ロースマトリックスもしくはカラムを利用する。ｃ−ｍｙｃは、別の有用なタグ
である。最後に、任意の抗原エピトープ（これに対して抗体（好ましくはモノク
ローナル抗体）が利用可能である）は、固定化抗体を用いた使用のための親和性
タグとして役立ち得る。したがって、抗原性の実質的な任意のペプチドは、Ｐ２
としての能力において貢献し得て、特にＰ２が構成成分であるＰ１含有ＦＰの精
製を補助する。
【００３９】 このような好ましいＨｉｓタグ化ＦＰを示す１つの式は、Ｐ１−Ｌ−Ｈｉｓ６ −ＶＣＰによって示され、ここでリンカーＬは、Ｍｅｔであり、臭化シアンで切
断可能である。
【００４０】 植物ウイルス粒子の３次元構造およびその集合プロセスの知見は、挿入および
部分的置換を含み得る種々のＶＣＰ融合ポリペプチドの設計を可能にする。例え
ば、Ｐ１が親水性である場合、これをＴＭＶ ＶＣＰの表面ループ領域に融合さ
せることは適当であり得る。同様に、サブユニットの接触を維持するαへリック
スセグメントは、ＴＭＶ ＶＣＰαへリックスの適切な領域、またはＲＮＡに対
して配向されたＶＣＰの領域中に発現される核酸結合ドメインについて置換され
得る。
【００４１】 本発明の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、融合接合部
において「漏出性の」終止コドンを含み得る。漏出性の終止コドンは、常に転写
終結を生じるわけでなく、むしろ定期的に転写されるものである。漏出性の終止
コドンは、融合接合部の直後に隣接されても、融合接合部の近く（例えば、９塩
基以内）に位置されてもよい。漏出性の終止コドンの使用は、野生型ＶＣＰに対
するＦＰの所望される割合を維持する。所定の開始コドンまたは終止コドンにお
ける開始または終結の頻度は、「状況依存的」である。最初のＡＴＧコドンに対
してｍＲＮＡの５’末端から、リボソームは「スキャン」する。最適でない配列
の状況において、リボソームは、特定の頻度で、このコドンを通過し、そして次
に利用可能な開始コドンに移動しつづけ、そして下流の位置から翻訳を開始する
。同様に、転写の間に遭遇する最初の終止コドンは、特定の配列状況である場合
に、完全な効率で認識されるわけでない。結果として、多くの天然に存在するタ
ンパク質は、異種のＮ末端および／またはＣ末端伸長部分を有するポリペプチド
の異種集団として存在する。
【００４２】 したがって、ＦＰをコードする組換えウイルスベクターの融合接合部コード領
域においての漏出性の終止コドンは、ＦＰおよび第２の小ポリペプチド（例えば
、ＶＣＰ）の両方を産生するために利用され得る。漏出性の終止コドンは、Ｐ２
がＶＣＰのＣ末端で結合したＦＰの融合接合部において（または近傍で）使用さ
れ得る。次いでこの単一の組み換えウイルスベクターは、ＦＰおよびＶＣＰの両
方を減ずる。さらに、漏出性の終止コドンは、Ｐ１またはＰ２がＶＣＰのＮ末端
に結合する、ａｍＦＰの融合接合部において（または近傍で）使用され得、これ
は、同様の結果を生じる。
【００４３】 ＴＭＶ ＶＣＰの場合において、Ｎ末端およびＣ末端においての伸長は、螺旋
軸から離れ突き出たウイルス粒子の表面で終わる。
【００４４】 ＴＭＶの１２６／１８３ｋＤａリーディングフレームの結合部に生じる漏出性
の終止配列の例は、１９７８年（Ｐｅｌｈａｍ、１９７８）に記載された。Ｓｋ
ｕｚｅｓｋｉら（１９９１）は、ＣＡＲ−ＹＹＡ（Ｃ＝シトシン、Ａ＝アデニン
、Ｒ＝プリン、Ｙ＝ピリミジン）として、この領域の３’状況の必要条件を規定
し、これは、異種タンパク質のマーカー遺伝子（βグルクロニダーゼ）上で漏出
性の終結を与える。
【００４５】 本発明の別の実施形態において、融合接合部は、プロテアーゼに対する基質と
して役立つアミノ酸配列として設計される。このような融合接合部を有するＦＰ
は、ＦＰに由来するＰ１またはＰ２について、インビトロまたはインビボで効果
的である、適切な蛋白分解酵素を用いる簡便な手段を可能にする。
【００４６】 本発明のＦＰの発現は、組換え植物ウイルスの核酸と作動可能である任意の種
々のプロモーターによって駆動され得る。プロモーターは、植物細胞または植物
において機能的であるべきである。プロモーターは、好ましくはＦＰコード配列
に対し５’に位置する。
【００４７】 好ましい実施形態において、ＦＰは、植物細胞（培養中かまたは植物の一部に
おいて増殖）または植物プロトプラストに発現される。
【００４８】 プロモーターは、任意のウイルスプロモーターであり得、好ましくはＲＮＡウ
イルスプロモーター、さらに好ましくは一本鎖（＋）センス鎖ＲＮＡウイルス（
ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｐｌｕｓ−ｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ
）のプロモーターである。さらに好ましい実施形態において、プロモーターは、
タバモイルスプロモーター、さらに好ましくは、ＴＭＶプロモーターである。好
ましいＴＭＶプロモーターの例は、ＴＭＶ ＶＣＰ遺伝子のプロモーターである
。
【００４９】 ＦＰは、好ましくは、例えば、米国特許第５，３１６，９３１号に記載のベク
ターを用いて、植物ウイルスサブゲノムプロモーターから発現される。
【００５０】 発現レベルは、種々の植物またはウイルスの転写因子によって増大または制御
され得る。
【００５１】 １つの実施形態において、ＦＰは、ＦＰのＮ末端近くに、内部のＭｅｔを有す
るかまたは転写を開始し得る別のアミノ酸を有する、これらは、翻訳の開始点と
して貢献する。このような内部のＭｅｔ（または他のアミノ酸）からの転写の開
始は、野生型ＶＣＰまたはこれらのペプチドの発現を生じ、このようなＶＣＰ（
またはペプチド）の内部の開始の欠如した場合より多い数のウイルス粒子を生じ
る。
【００５２】 １つの実施形態において、内部のＭｅｔ（または他のアミノ酸）は、ＦＰの連
結エレメントの一部である。
【００５３】 内部のＭｅｔ（または他のアミノ酸）は、ＦＰのＮ末端残基から好ましくは、
１００残基未満、より好ましくは５０残基未満、より好ましくは２５残基未満、
さらにより好ましくは、２０アミノ酸未満、離れて位置する。内部のＭｅｔがＣ
ＮＢｒによって切断されるのは、好ましい。
【００５４】 組換えＤＮＡ技術は、ウイルスゲノムの操作が容易であるＤＮＡ段階を通して
多くの植物ＲＮＡウイルスのライフサイクルの人為的な伸長を可能にする。これ
らの技術は、本発明の組み換え植物ウイルスを作製するのに有用である。ＴＭＶ
ゲノム全体のｃＤＮＡが、クローニングされ、そしてＥ．ｃｏｌｉプラスミドに
おいて細菌のプロモーターに機能的に連結された（Ｄａｗｓｏｎら、１９８６）
。感染性の組換え植物ウイルスＲＮＡ転写物はまた、他の従来技術（例えば、フ
ァージＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６由来の市販のＲＮＡポリメラーゼ）を用いて産
生され得る。ビリオンＲＮＡの正確な複製は、インビトロでＲＮＡポリメラーゼ
およびジヌクレオチドキャップ（ｍ７ＧｐｐｐＧ）を用いて産生され得る。これ
は、外来遺伝子を発現するためにベクターに入ったウイルスを作製すること含ん
だウイルスゲノムの操作を可能にする。ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡフラグメ
ントを操作することに基づく、植物ＲＮＡウイルスベクターを産生する方法は、
非現実的であることが証明され、そして広く使われていない（Ｐｅｌｃｈｅｒ、
１９８２）。
【００５５】 組換えＲＮＡ植物ウイルスを作製しかつ使用するための詳細は、米国特許第５
、３１６、９３１号（Ｄｏｎｓｏｎら）において見出され、これは、本明細書に
おいて参考として援用される。
【００５６】 本発明は、本発明のＦＰの発現のためのポリヌクレオチドをコードする組換え
ＲＮＡ植物ベクターを提供する。
【００５７】 本発明はまた、対象のベクターの一部を含むポリヌクレオチドを提供する。米
国特許第５，３１６，９３１号（上記参照）に記載のベクターは、特にＦＰの発
現に適している。
【００５８】 本発明のポリヌクレオチド分子を含むウイルス粒子もまた提供される。ウイル
スコートは、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるＦＰの全体を構成
するか、またはＦＰおよび非融合ＶＣＰの混合物の全体を構成し得、ここで、２
つのポリペプチドの割合が変化し得る。タバモイルスコートタンパク質は、ウイ
ルス粒子中で自己構築するので、本発明のウイルス粒子は、インビボまたはイン
ビトロのいずれかで構築され得る。ウイルス粒子は、周知の技術を用いて慣用的
に分解されて、ＦＰまたはこれらのフラグメントの精製を単純化する。
【００５９】 本発明はまた、対象の融合ポリペプチドおよび／または対象の融合ポリペプチ
ドを含むウイルス粒子を含む組換え植物細胞、植物細胞、植物プロトプラストな
どを提供する。これらの細胞は、本発明の感染性ウイルス粒子を用いて細胞を感
染することによって（培養中または植物全体のいずれかにおいて）産生され得る
か、または感染性ウイルス粒子のゲノムであるかもしくはこれをコードするポリ
ヌクレオチドを用いてトランスフェクトすることによって産生され得る。これら
の細胞は、多くの用途（例えば、主にＦＰを発現する供給源または部位として）
を有する。
【００６０】 Ｐ１またＰ２は、多くの異なるアミノ酸残基配列を含み得、したがって多くの
異なる潜在的な生物学的／化学的特性を保持し得る。好ましい実施形態において
、ＦＰのＰ１またはＰ２構成成分は、ワクチン組成物として有用である。ＴＭＶ
粒子および他のタバモイルスの表面は、高い抗原性で連続した、セグメント可動
性を有するエピトープを含み、したがって、ＴＭＶ粒子を作製することは、所望
される免疫応答を生じるのに特に有用である。これらの特性によって、本発明の
ウイルス粒子は、哺乳動物の免疫系への提示のための外来エピトープのキャリア
として特に有用になる。
【００６１】 本発明の組換えＲＮＡウイルスは、ワクチン組成物またはこれらの前駆体のよ
うな、種々のＦＰ用途を産生するのに使用され得、マラリアワクチンは、特に目
的とされる。ヒトマラリアは、原生動物種のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉ
ｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、およびＰ．ｍａｌａｒｉａｅに
よって生じ、ヒトマラリアは、ハマダラカ属の蚊によって広がったスポロゾイト
の形体で伝播される。マラリアの制御は、安全かつ安定なワクチンを必要とする
ようである。寄生虫のライフサイクルの種々の段階の間に発現されるいくつかの
ペプチドエピトープは、地方病の地帯に住む部分的な耐性の個体および照射され
たスポロゾイトで実験的に免疫された個体において防御免疫の誘導に貢献すると
考えられる。
【００６２】 本発明のＦＰ、これらのフラグメント、またはＦＰを含むウイルス粒子が、イ
ンビボで使用される場合、ポリペプチドは、典型的に薬学的キャリアを含む組成
物において投与される。薬学的キャリアは、これらの因子の身体への送達のため
に適した任意の適合性の非毒性物質であり得る。滅菌水、アルコール、脂肪、ワ
ックス、および不活性な固体は、キャリア中に含まれ得る。薬学的に受容可能な
アジュバント（緩衝化因子、分散化因子）はまた、薬学的組成物にとりこまれ得
る。さらに、目的のポリペプチド、ＦＰ、またはこれらのフラグメントを用いて
免疫応答（防御的またはその他）を誘導する場合、処方物は、１つ以上の免疫学
的アジュバントを含み得る。
【００６３】 Ｐ１、Ｐ２、ＦＰ、またはこれらのフラグメントを含む本発明の薬学的組成物
は、種々の経路（経口、または非経口（すなわち、皮下、皮内、筋内、静脈内、
または他の経路での注射または注入を含む）によって、被験体（ヒトまたは動物
）に投与され得る。したがって、非経口投与のための組成物は、Ｐ１、Ｐ２、ま
たはＦＰ、またはこれらのフラグメントもしくは誘導体、またはこれらの１つ以
上の「カクテル」の溶液を含み、受容可能な（好ましくは水性）キャリア（例え
ば、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリセリンなど）に溶解される
か、または分散される。これらの溶液は、好ましくは滅菌され、かつ粒子物質を
含まない。この組成物は、生理的状態に近づけるために必要とされる薬学的に受
容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整ならびに緩衝化因子および塩、毒性軽減因
子等）（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシ
ウム、乳酸ナトリウムなど）を含み得る。これらの処方物中のポリペプチドまた
はタンパク質の濃度は、特定のポリペプチドおよび必要とされる生物学的活性に
依存して広範に変化し得（例えば、約０．５％重量未満（通常少なくとも約１％
重量）から１５または２０％まで）、そして意図する形態および投与経路にした
がって液体容積、粘性等に主に基づいて選択される。
【００６４】 非経口投与され得る組成物の調製および被験体への投与のために必要な調整の
ための実際の方法は、当業者にとって公知であるか明らかであり、そして例えば
、本明細書で参考として援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、最新版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃ
ｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａにより詳細に記載される。
【００６５】 本発明はまた、ＦＰコード核酸分子を発現することによってＰ１またはＰ２ま
たはＦＰを産生する方法を含む。この方法は、植物または植物細胞を、対象のコ
ード配列を含む組換え植物ウイルス核酸と接触させる工程；および植物または植
物細胞をＦＰの発現に好ましい条件下で成長させるか、拡大させるか、または培
養する工程を含む。この方法はさらに、インビトロまたはインビボのいずれかに
おいて、活性なＦＰを連結エレメント上で、切断因子に供して、その結果Ｐ１ま
たはＰ２と植物ＶＣＰの間の１つ以上の共有結合を壊す工程を含み得る。壊され
る共有結合は、好ましくはペプチド結合である。
【００６６】 この方法はさらに、植物ＶＣＰからＦＰを単離もしくは精製する工程またはＰ
１またはＰ２を単離および／もしくは精製する工程を含み得る。目的のポリペプ
チドは、機械的方法（例えば、遠心分離、もしくは限外濾過、またはＨＰＬＣに
よって）植物ＶＣＰから分離され得る。この方法はさらに、残りの植物または植
物細胞から、対象のポリヌクレオチドまたは対象の融合ポリペプチドを含む組換
えウイルス粒子を単離する工程を含み得る。
【００６７】 以下の実施例はさらに、本発明を例示する。これらの実施例は、単に本発明の
例示であることを意図し、限定するものとして解釈されるべきものでない。
【００６８】 （実施例） （生物学的寄託） 以下の本発明の実施例は、５’末端にＴ７プロモーター配列を有しかつ３’末
端にＫｐｎＩ部位を有するベクターｐＵＣ１８（ｐＳＮＣ００４、図２）中でク
ローニングされた、野生型ＴＭＶ（Ｕ１株）の全長インサート、または同様のプ
ラスミドｐＴＭＶ３０４に基づく。ＰＣＲ技術およびプライマーＷＤ２９（配列
番号：１）およびＤ１０４９（配列番号：２）を使用して（実施例１〜４に記載
されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関しては表１を参照のこと）、ａ２７
７ ＸｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ増幅産物を、ｐＳＮＣ００４を作製するための一
般的なクローニングベクターｐＵＣ１８のＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩとの間のｐ
ＴＭＶ３０４由来の６１４０ｂｐのＸｍａＩ／ＫｐｎＩフラグメントを用いて挿
入した。このプラスミドｐＴＭＶ３０４は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（
ＡＴＣＣ受託番号４５１３８）より入手可能である。野生型ＴＭＶ株のゲノムを
、ＳＰ６ポリメラーゼを使用してｐＴＭＶ３０４より、またはＴ７プロモーター
を使用してｐＳＮＣ００４より、合成し得る。野生型ＴＭＶ株もまた、Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＶ１３５）より入手し得る。プラ
スミドｐＢＧＣ１５２（Ｋｕｍａｇａｉ，Ｍ．ら、（１９９３））は、ｐＴＭＶ
３０４の誘導体であり、そして以下に記載される実施例においては、これをクロ
ーニング中間体としてのみ使用する。以下の実施例中に記載する各プラスミドベ
クターの構築物を図３に図式化する。
【００６９】 （表１．実施例１〜４に記載のヌクレオチドおよび核酸配列）
【００７０】
【表２】 （実施例１） （ＴＭＶのＵ１株の伝播および精製） 以下の実施例において記載されるＴＭＶ ＶＣＰ融合ベクターは、Ｕ１または
野生型ＴＭＶ株に基づき、従ってこれをコントロールとして親ウイルスと比較す
る。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ Ｘａｎｔｈｉ（本明細書にお
いて、以後タバコと呼ぶ）を、発芽後４〜６週間栽培し、そして２枚の４〜８ｃ
ｍに（展開）された葉を、５０μｇ／ｍｌのＴＭＶ Ｕ１の溶液を用いて１００
μｌをペッティングし、そして手袋をはめた手で表面を軽くくずすことによって
カーボランダムで塵を払われた葉上に接種した。６つのタバコ植物を、接種後２
７日間栽培し、これは、生重量１７７ｇの収穫された葉生物重量（接種された下
方の２つの葉を含まない）を蓄積していた。精製されたＴＭＶ Ｕ１サンプル番
号ＴＭＶ２０４．Ｂ４を、Ｇｏｏｄｉｎｇら（１９６７）の方法に従う２サイク
ルの異なる遠心分離およびＰＥＧを用いる沈殿によって、生重量１ｇあたり４．
２ｍｇビリオンの収量で回収した（７４５ｍｇ）。ＴＭＶ Ｕ１に感染したタバ
コは、葉組織１ｋｇあたり２３０マイクロモルより多いＣＰを蓄積していた。
【００７１】 （実施例２） （ＴＭＶ ＶＣＰの表面ループ領域に融合される哺乳動物Ｂ細胞エピトープの
産生） モノクローナル抗体ＮＶＳ３を、照射されたＰ．ｖｉｖａｘスポロゾイトでマ
ウスを免疫化することによって、作製した。受動的にサルへ移されたＮＶＳ３
ｍＡｖは、このヒト寄生生物でのスポロゾイト感染に対する保護的な免疫性を提
供した。合成ペプチドを用いるエピトープスキャン（ｅｐｉｔｏｐｅ−ｓｃａｎ
ｎｉｎｇ）の技術を使用して、Ｐ．ｖｉｖａｘスポロゾイト表面上に存在しそし
てＮＶＳ３によって認識される正確なアミノ酸配列をＡＧＤＲ（配列番号：３）
と定義した。このエピトープＡＧＤＲは、スポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質
（スポロゾイトを被覆する主な免疫優性タンパク質（ｍａｊｏｒ ｉｍｍｕｎｏ
ｄｏｍｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ））の繰り返しユニット内に含まれる（Ｃｈ
ａｒｏｅｎｖｉｔら、１９９１ａ）。ウイルス粒子の表面に融合されるこのマラ
リアＢ細胞エピトープを運ぶように設計される一般的に改変されるトバモウイル
スの構築を、本明細書中において記載する。
【００７２】 （プラスミドｐＢＧＣ２９１の構築） Ｄａｗｓｏｎ，Ｗ．ら（１９８６）に記載されるｐＴＭＶ２０４由来の２．１
ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントを、ｐＢｓｔＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）へクローニングし、ｐＢＧＣ１１を
形成した。ｐＢＧＣ１１の０．２７ｋｂフラグメントを、５’プライマーＴＢ２
ＣｌａＩ５’（配列番号：４）および３’プライマーＣＰ．ＭＥ２＋（配列番号
：５）を用いてＰＣＲ増幅した（表１を参照のこと）。０．２７ｋｂ増幅産物を
、５’プライマーとして使用し、そしてＣ／ＯＡｖｒＩＩ（配列番号：６）（表
１を参照のこと）を、ＰＣＲ増幅のための３’プライマーとして使用した。この
増幅産物を、ｐＢｓｔＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ）のＳｍａＩ部位へクローニングし、ｐＢＧＣ２４３を形成した。
【００７３】 ＢｓｔＸＩおよびＳａｃＩＩ部位をポリリンカーから除去するために、ｐＢｓ
ｔＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＢｓｔ
ＸＩで消化した後、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いる処理およびセルフライゲ
ーションを行うことによって、ｐＢＧＣ２３４を形成した。ｐＢＧＣ３０４のこ
の１．３ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ−Ｋｐｎｌフラグメントを、ｐＢＧＣ２３４中へク
ローニングし、ｐＢＧＣ２３５を形成した。ｐＢＧＣ３０４をまた、ｐＴＭＶ３
０４とも命名した（ＡＴＣＣ受託番号４５１３８）。
【００７４】 ｐＢＧＣ２４３の０．３ｋｂのＰａｃＩ−ＡｃｃＩフラグメントをｐＢＧＣ２
３５へクローニングし、ｐＢＧＣ２４４を形成した。ｐＢＧＣ２４３（ＳｍａＩ
−ＥｃｏＲＶ）の０．０２ｋｂポリリンカーフラグメントを除去し、ｐＢＧＣ２
８０を形成した。Ｐ．ｖｉｖａｘ ＡＧＤＲ繰り返しをコードする０．０２ｋｂ
合成ＰｓｔＩフラグメントを、ＡＧＤＲ３ｐ（配列番号：７）をＡＧＤＲ３ｍ（
配列番号：８）とアニーリングすることによって形成し（表１を参照のこと）、
そして生じた二本鎖フラグメントをｐＢＧＣ２８０へクローニングし、ｐＢＧＣ
２８２を形成した。ｐＢＧＣ２８２の１．０ｋｂＮｃｏＩ−ＫｐｎＩフラグメン
トをｐＳＮＣ００４へクローニングし、ｐＢＧＣ２９１を形成した。
【００７５】 プラスミドｐＢＧＣ２９１のインビトロでの転写によって産生されたウイルス
ＴＭＶ２９１のＣＰ配列（配列番号：９）を列挙する（アミノ酸配列のみを配列
番号：１０に列挙する）（表１参照のこと）。エピトープ（ＡＧＤＲ）３は、約
６．２％重量のビリオンであると算出される。
【００７６】 （エピトープ発現ベクターの伝播および精製） 感染転写物を、製造業者（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に従っ
て、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびｃａｐ（７ｍＧｐｐｐＧ）を使用して、Ｋ
ｐｎＩ−直鎖状化ｐＢＧＣ２９１から合成した。増加した量の組換えウイルスを
、実施例１に記載されるようにサンプル番号ＴＭＶ２９１．１Ｂ１を継代および
精製することによって、入手した。２０のタバコ植物を接種後２９日間栽培し、
これは生重量１０６０ｇの収穫された葉生物重量（接種された下方の２つの葉を
含まない）を蓄積していた。精製されたサンプル番号ＴＭＶ２９１．１Ｂ２を、
生重量１ｇあたり０．４ｍｇビリオンの収量で回収した（４７４ｍｇ）。従って
抽出した生重量１ｇあたり、２５μｇの１２マーペプチドを得た。ＴＭＶ２９１
に感染したタバコ植物は、葉組織１ｋｇあたり２１マイクロモルより多いペプチ
ドを蓄積していた。
【００７７】 （産物分析）：ウイルスＴＭＶ２９１中に含まれるエピトープＡＧＤＲのコン
フォメーションは、ＥＬＩＳＡアッセイ（図４）において、モノクローナル抗体
ＮＶＳ３によって特異的に認識される。ウエスタンブロット分析によると、ＮＶ
Ｓ３は、ＴＭＶ２９１ ｃｐ融合物とのみ交差反応し（１８．６ｋＤａにて）、
そして野生型またはＴＭＶ２６１中に存在するＣＰ融合物とは交差反応しなかっ
た。領域をコードするエピトープのゲノム配列を、サンプル番号ＴＭＶ２９１．
１Ｂ２から抽出されたウイルスＲＮＡを直接的に配列決定することによって、確
認した。
【００７８】 （実施例３） （ＴＭＶ ＶＣＰのＣ末端に遺伝子的に融合された哺乳動物Ｂ細胞エピトープ
の産生） Ｐ．ｙｏｅｌｉｉまたはＰ．ｂｅｒｇｈｅｉのような人間以外の病原体によっ
て引き起こされるマラリア病のげっ歯類モデルを使用して、効果的なサブユニッ
トワクチンの設計における顕著な進歩がなされてきた。モノクローナル抗体ＮＹ
Ｓ１は、繰り返しエピトープＱＧＰＧＡＰ（配列番号：１１）（Ｐ．ｙｏｅｌｉ
ｉのＣＳタンパク質上に存在する）を認識し、そして受動的にマウスに移された
場合、スポロゾイトの攻撃に対して非常に高いレベルの免疫性を提供する（Ｃｈ
ａｒｏｅｎｖｉｔ， Ｙ．，ら１９９１ｂ）。ウイルス粒子の表面に融合された
この哺乳動物Ｂ細胞エピトープを有するように設計された遺伝子改変型トバモウ
イルスの構築を、本明細書中に示した。
【００７９】 （プラスミドｐＢＧＣ２６１の構築） ｐＢＧＣ １１の０．５ｋｂフラグメントを、５’プライマーＴＢ２ＣｌａＩ
５’（配列番号：４）および３’プライマーＣ／ＯＡｖｒＩＩ（配列番号：６）
を使用して、ＰＣＲ増幅した。この増幅産物をｐＢｓｔＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のＳｍａＩ部位へクローニングして
、ｐＢＧＣ２１８形成した。
【００８０】 ｐＢＧＣ２１９を、ｐＢＧＣ２１８の０．１５ｋｂのＡｃｃＩ−ＮｓｉＩフラ
グメントをｐＢＧＣ２３５へクローニングすることによって、形成した。０．０
５ｋｂ合成ＡｖｒＩＩフラグメントを、ＰＹＣＳ．ｌｐ（配列番号：１２）をＰ
ＹＣＳ．ｌｍ（配列番号：１３）とアニーリングさせることによって、形成する
（表１参照のこと）。そして生じた二本鎖フラグメント（漏出終止（ｌｅａｋｙ
−ｓｔｏｐ）シグナルおよびＰ．ｙｏｅｌｉｉのＢ細胞マラリアエピトープをコ
ードする）をｐＢＧＣ２１９のＡｖｒＩＩ部位へクローニングし、ｐＢＧＣ２２
１を形成した。このｐＢＧＣ２２１の１．０ｋｂのＮｃｏＩ−ＫｐｎＩフラグメ
ントをｐＢＧＣ１５２へクローニングし、ｐＢＧＣ２６１を形成した。
【００８１】 ウイルスＴＭＶ２６１（プラスミドｐＢＧＣ２６１の転写によってインビトロ
で産生された）はＣＰ遺伝子のＣ末端で漏出終止シグナルを有し、従って、野生
型および組換えコートタンパク質を２０：１の比で合成することが予測される。
ＴＭＶ２６１によって合成された組換えＴＭＶ ＶＣＰ融合物を、アミノ酸Ｔｙ
ｒ（アミノ酸残基１６０）に対するコドンに変異させた野生型由来の終止コドン
と共に、（配列番号：１５）に列挙する（表１を参照のこと）。この野生型配列
（同じウイルスによって合成された）を（配列番号：１７）に記載する（表１を
参照のこと）。Ｃ末端のエピトープ（ＱＧＰＧＡＰ）２（配列番号：１１）は０
．３％重量のビリオンで存在すると算出された。
【００８２】 （エピトープ発現ベクターの伝播および精製） 感染転写物を、製造業者（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ）に従って、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼおよびｃａｐ（７ｍＧｐｐｐ
Ｇ）を使用して、ＫｐｎＩ−直鎖状化ｐＢＧＣ２６１から合成した。
【００８３】 増加した量の組換えウイルスを、実施例１に記載されるようにサンプル番号Ｔ
ＭＶ２６１．Ｂ１ｂを継代および精製することによって、入手した。６つのタバ
コ植物を接種後２７日間栽培し、これは、生重量２０５ｇの収穫された葉生物重
量（接種された下方の２つの葉を含まない）を蓄積していた。精製されたサンプ
ル番号ＴＭＶ２６１．１Ｂ２を、生重量１ｇあたり１．２ｍｇビリオンの収量で
回収した（２５２ｍｇ）。従って、抽出した生重量１ｇあたり４μｇの１２マー
のペプチドを得た。ＴＭＶ２６１に感染したタバコ植物は、葉組織１ｋｇあたり
３．９マイクロモル以上のペプチドを蓄積していた。
【００８４】 （産物分析）：ウイルスＴＭＶ２６１中のエピトープＱＧＰＧＡＰの含有量を
、モノクローナル抗体ＮＹＳ１を用いたＥＬＩＳＡ（図５）によって、決定した
。滴定曲線から、５０μｇ／ｍｌのＴＭＶ２６１は、０．２μｇ／ｍｌの（ＱＧ
ＰＧＡＰ）２と同様のＯ．Ｄ．値（１．０）を得た。エピトープとして約０．４
％重量のビリオンの値の測定された値は、０．３％の計算値とよく一致する。ウ
エスタンブロット分析によると、ＮＹＳ１は、ＴＭＶ２６１ ＣＰ融合物とのみ
交差反応し（１９ｋＤａにて）、そして野生型ＣＰまたはＴＭＶ２９１中に存在
するＣＰ融合物とは交差反応しなかった。エピトープコード領域のゲノム配列を
、サンプル番号ＴＭＶ２６１．１Ｂ２から抽出されたウイルスＲＮＡを直接的に
配列決定することによって、確認した。
【００８５】 （実施例４） （ＴＭＶ ＶＣＰのＣ末端に遺伝子的に融合されたマラリアＣＴＬエピトープ
の産生） 照射したＰ．ｙｏｅｌｉｉのスポロゾイトによって誘導されるマウスにおける
マラリアの免疫性はまた、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球に依存している。クローンＢは
、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉおよびＰ．ｂｅｒｇｈｅｉ ＣＳタンパク質の両方に存在す
るエピトープを認識することが示された１つの細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）
細胞クローンである。クローンＢは、以下のアミノ酸配列；ＳＹＶＰＳＡＥＱＩ
ＬＥＦＶＫＱＩＳＳＱ（配列番号：１８）を認識し、そしてマウスに養子免疫的
に伝達される場合、マラリアスポロゾイトの両方の種からの感染に対して保護す
る（Ｗｅｉｓｓら、１９９２）。ウイルス粒子の表面に融合されたこのマラリア
ＣＴＬエピトープを有するように設計された遺伝子改変型トバモウイルスの構築
を本明細書中に記載する。
【００８６】 （プラスミドｐＢＧＣ２８９の構築） ｐＢＧＣ １１の０．５ｋｂフラグメントを、５’プライマーＴＢ２ＣｌａＩ
５’（配列番号：４）および３’プライマーＣＰ／−５ＡｖｒＩＩ（配列番号：
１９）を用いてＰＣＲ増幅した（表１を参照のこと）。この増幅産物をｐＢｓｔ
ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のＳｍａＩ
部位へクローニングし、ｐＢＧＣ２１４を形成した。
【００８７】 ｐＢＧＣ２１５を、ｐＢＧＣ２１４の０．１５ｋｂのＡｃｃＩ−ＮｓｉＩフラ
グメントをｐＢＧＣ２３５へクローニングすることによって、形成した。ｐＢＧ
Ｃ２１５からのこの０．９ｋｂ ＮｃｏＩ−ＫｐｎＩフラグメントをｐＢＧＣ１
５２へクローニングし、ｐＢＧＣ２１６を形成した。
【００８８】 ０．０７ｋｂ合成フラグメントを、ＰＹＣＳ．２ｐ（配列番号：２０）をＰＹ
ＣＳ．２ｍ（配列番号：２１）とアニーリングさせることによって形成し（表１
を参照のこと）、そして生じた二本鎖フラグメント（Ｐ． ｙｏｅｌｉｉ ＣＴ
Ｌマラリアエピトープをコードしている）を、リョクトウ（ｍｕｎｇ ｂｅａｎ
）ヌクレアーゼでの処理および特有のＡａｔＩＩ部位を作製することによって平
滑末端化されたｐＢＧＣ２１５のＡｖｒＩＩ部位へクローニングし、そしてｐＢ
ＧＣ２６２を形成した。０．０３ｋｂの合成ＡａｔＩＩフラグメントを、ＴＬＳ
．１ ＥＸＰ（配列番号：２２）をＴＬＳ．１ ＥＸＭ（配列番号：２３）とア
ニーリングさせることによって、形成した（表１を参照のこと）。そして生じた
二本鎖フラグメント（漏出終止配列およびクローニングを容易にするために使用
されるスタファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）配列をコードする）を、ＡａｔＩＩ消化さ
れたｐＢＧＣ２６２へクローニングして、ｐＢＧＣ２６３を形成した。このｐＢ
ＧＣ２６２を、ＡａｔＩＩで消化し、そしてそれ自身（０．０２ｋｂのスタファ
ーフラグメントを除く）へ連結し、ｐＢＧＣ２６４を形成した。ｐＢＧＣ２６４
のこの１．０ｋｂ ＮｃｏＩ−ＫｐｎＩフラグメントをｐＳＮＣ００４へクロー
ニングし、ｐＢＧＣ２８９を形成した。
【００８９】 プラスミドｐＢＧＣ２８９の転写によってインビトロで産生されたウイルスＴ
ＭＶ２８９は、野生型ＴＭＶ ＣＰ遺伝子のＣ末端からの４つのアミノ酸除去を
もたらす漏出終止シグナルを含み、従って、短縮ＣＰおよびＣ末端で融合された
ＣＴＬエピトープを有するＣＰを２０：１の比で合成することが予測される。 ＴＭＶ２８９（配列番号：２４に列挙されるヌクレオチド配列中にコードされる
）中に存在するこの組換えＴＭＶ ＶＣＰ／ＣＴＬエピトープを、アミノ酸Ｙ（
アミノ酸残基１５６）としてデコードされる終止コドンと共に、配列番号：２５
に列挙する（表１を参照のこと）。Ｃ末端から４つのアミノ酸を除いた野生型配
列を配列番号：２６に列挙する（アミノ酸配列のみを配列番号：２７に列挙する
）（表１を参照のこと）。プラスミドｐＢＧＣ２１６の転写によってインビトロ
で産生されたウイルスＴＭＶ２１６のＣＰのアミノ酸配列をまた、４つのアミノ
酸で短縮した。エピトープＳＹＶＰＳＡＥＱＩＬＥＦＶＫＱＩＳＳＱ（配列番号
：１８）は、実施例３中でＴＭＶ２６１のリードスルー特性の定量的ＥＬＩＳＡ
分析によって確定された同一の仮定を使用して、約０．５％の重量のビリオンで
存在すると算出した。
【００９０】 （エピトープ発現ベクターの伝播および精製） 感染転写物を製造業者（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に従って
、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびｃａｐ（７ｍＧｐｐｐＧ）を使用して、Ｋｐ
ｎＩ−直鎖状化ｐＢＧＣ２８９から合成した。増加した量の組換えウイルスを、
実施例１に記載されるようにサンプル番号ＴＭＶ２８９．１１Ｂ１ａを継代する
ことによって、入手した。１５のタバコ植物を接種後３３日間栽培し、これは生
重量５９５ｇの収穫された葉生物重量（接種された下方の２つの葉を含まない）
を蓄積していた。精製されたサンプル番号ＴＭＶ２８９．１１Ｂ２を、生重量１
ｇあたり０．６ｍｇのビリオンの収量で回収した（３８３ｍｇ）。従って、抽出
された生重量１ｇあたり、３μｇの１９マーペプチドを得た。ＴＭＶ２８９に感
染したタバコ植物は、葉組織１ｋｇあたり１．４マイクロモルより多いペプチド
を蓄積していた。
【００９１】 （産物分析）：ＴＭＶ２８９の領域をコードするエピトープの配列の部分的コ
ンフォメーションを、サンプル番号ＴＭＶ２８９．１１Ｂ２から単離したウイル
スＲＮＡを用いてＰＣＲ増幅したｃＤＮＡの制限酵素消化分析によって、入手し
た。２０ｋＤａでのＣＰ融合物の予測される移動度を伴うＴＭＶ２８９中のタン
パク質および１７．１ｋＤａでの短縮型ＣＰの存在を、変性ＰＡＧＥによって確
認した。
【００９２】 （実施例５） （ｐＪＬ６０．３の構築） ＴＭＶ Ｕ１ ＣＰ融合物の、感染性ＴＭＶ Ｕ１ ｃＤＮＡ骨格（ｂａｃｋ
ｂｏｎｅ）へのクローニングを容易にするために、ベクターｐＪＬ６０．３を構
築した。プラスミドｐＪＬ６０．３は、小さい複合クローニング部位（ｍｕｌｔ
ｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）ポリリンカーを有するＴＭＶ Ｕ１の全
長感染性クローンを含む。ポリリンカーは、２つのＢｓｔＸＩ部位（ｃｃａｇｔ
ａｇｔａｔｇｇ（配列番号：２９）およびｃｃａｇｔｇｇｔａｔｇｇ（配列番号
：３０）を含むｔａａａｔａｔｔｃｔｔａａｇｃｃａｇｔａｇｔａｔｇｇｇａｔ
ａｔｃｃａｇｔｇｇｔａｔｇｇｇａｔｃｃｔａｃａｇｔａｔｃ（配列番号：２８
）であり、３０Ｋタンパク質遺伝子の終止コドンとＵ１ ＣＰの開始コドンとの
間で、唯一のＥｃｏＲＶ（ＧＡＴＡＴＣ）によって切り離される。
【００９３】 ｐＪＬ６０．３を構築するために、ＴＭＶ Ｕ１ ＣＰおよび３’ＵＴＳを含
む０．７ｋｂのＤＮＡフラグメントを、以下のプライマーを用いて、ｐＢＴＩ
８０１からＰＣＲ増幅した： （キナーゼ化された５’プライマーＪＡＬ ７２） ｔｇｇｇａｔａｔｃｃａｇｔｇｇｔａｔｇｇｇａｔｃｃｔａｃａｇｔａｔａｃａ
ｃｔａｃｔｃｃａｔｃｔｃａｇ（配列番号：３１）および （３’プライマーＪＯＮ ５６） ｃｇｃｇｔａｃｃｔｇｇｇｃｃｃｃｔａｃｃｇｇｇｇｇｔａａｃｇ （配列番号
：３２）（ここで３’プライマーのｇｔａｃｃには下線を付している） ｐＢＴＩ ８０１は、ｐＵＣベースのプラスミド中に、Ｔ７プロモーター配列
の制御下で、全長の感染性クローンＴＭＶ Ｕ１を含む。ＫｐｎＩ制限酵素部位
は、ウイルスｃＤＮＡの３’末端に位置し、直後に、サテライトタバコ輪点ウイ
ルスＲＮＡ由来の自己プロセッシングリボザイム配列が位置する。ＴＭＶ ３’
末端の下流の自己プロセッシングリボザイムの存在は、プラスミドテンプレート
ＤＮＡの事前の直鎖状化（例えば、ＫｐｎＩを用いる）を伴わずに、ＴＭＶ ｃ
ＤＮＡの転写を可能にする。
【００９４】 次いで、ｐＢＴＩ ８０１の０．３ｋｂフラグメントを、以下のプライマーを
使用して、ＰＣＲ増幅した： （５’プライマー ＪＯＮ ５２（ＴＭＶ Ｕｌ ｎｔｓ ５４５６−５４８２
））： ｇｇｃｃｃａｔｇｇａａｃｔｔａｃａｇａａｇａａｇｔｃｇ（配列番号：３３）
キナーゼ化された３’プライマーＪＡＬ ７３ ｃｔｇｇａｔａｔｃｃｃａｔａｃｔａｃｔｇｇｃｔｔａａｇａａｔａｔｔｔａａ
ａａｃｇａａｔｃｃｇａｔｔｃｇｇｃｇａｃａ（配列番号：３４）。
【００９５】 次いで、０．７ｋｂのＰＣＲ産物（Ｕ１ ＣＰ ＯＲＦおよび３’ＵＴＳの上
流にＥｃｏＲＶおよびＢｓｔＸＩ部位（ｃｃａｇｔｇｇｔａｔｇｇ（配列番号：
３０）を含む）を、０．３ｂｐのＰＣＲ産物（これは、ＴＭＶ ３０Ｋタンパク
質遺伝子の３’末端およびＢｓｔＸＩ部位ｃｃａｇｔａｇｔａｔｇｇ（配列番号
：２９）を３０Ｋタンパク質終止コドンの下流に含む）に連結した。次いで、こ
のライゲーション反応の産物を、５’プライマーＪＯＮ ５２（上記に示される
）および３’プライマーＪＯＮ５６ （上記に示される）を用いるＰＣＲに使用
して、１ｋｂ ＰＣＲ産物を生成した。この産物をＰａｃＩおよびＮｃｏＩで消
化し、そして消化されたＤＮＡをアガロースゲル上で電気泳動した。ＮｃｏＩ部
位は、ＪＯＮ ５２のプライマー配列内に含まれ、そしてＰａｃＩ部位は、ＴＭ
Ｖ Ｕ１ ＣＰ遺伝子配列の唯一の制限酵素部位である。次いで、０．４ｋｂの
ＰａｃＩ−ＮｃｏＩフラグメントをアガロースゲルから単離し、そしてこれをＰ
ａｃＩ−ＮｃｏＩ制限酵素処理されたｐＢＴＩ ８０１の８．８ｋｂフラグメン
トへ連結し、ｐＪＬ６０．３を生成した。
【００９６】 また、ｐＢＴＩ ２１４９およびｐＢＴＩ ２１５０の構築に関連するｐＪＬ
６０．３の特徴は、ＴＭＫ３０Ｋ終止コドンとＣＰ開始コドンとの間のＢｓｔＸ
Ｉ部位（ｃｃａｇｔａｇｔａｔｇｇ（配列番号：２９）の存在である。
【００９７】 （実施例６） （プラスミドｐＢＴＩ ２１４９の構築） ０．７ｋｂのＤＮＡフラグメント（ＴＭＶ Ｕｌコートタンパク質（ＣＰ）お
よび３’ＵＴＳを含む）を、以下のプライマーを使用して、ｐＢＴＩ８０１から
ＰＣＲ増幅した： （５’プライマーＪＡＬ １４９） ｃｃｔｇｇｇｃｃａｇｔａｇｔａｔｇｇｇｔｔｃａｇａｔｇｇｔｇｃｔｇｔａｃ
ａａｃｃａｇａｔｇｇａｇｇｔｃａａｃｃａｇｃｔｇｔａｔｃｔｔａｃａｇ ｔａｔｃａｃｔａｃｔｃｃａｔｃｔｃａｇｔｔ（配列番号：３５）（ここでｃｃ
ａｇｔａｇｔａｔｇｇには下線を付している） （３’プライマーＪＯＮ ５６ （上記に示される）） ＪＡＬ １４９は、クローニング目的のためのＢｓｔＸＩ制限酵素部位（下線を
付している）ならびにパルボウイルス（ｐａｒｏｖｉｒｕｓ）エピトープ（ＭＧ
ＳＤＧＡＶＱＰＤＧＧＱＰＡＶ（配列番号：３６）およびＴＭＶ Ｕ１ ｎｔｓ
５７１５−５７４３のコード配列を含む。増幅産物（Ｕ１ ＣＰ遺伝子に融合
されたパルボウイルスエピトープを含む）を、ＫｐｎＩおよびＢｓｔＸＩで消化
し、そしてｐＪＬ ６０．３の８．４ｋｂのＫｐｎｌ−ＢｓｔＸＩフラグメント
へ連結し、ｐＢＴＩ ２１４９を生成した。プラスミドベクターｐＢＴＩ ２１
４９は、コートタンパク質のＮ末端に融合されたＭＧＳＤＧＡＶＱＰＤＧＧＱＰ
ＡＶ（配列番号：３６）の融合タンパク質を有する組換えウイルスをコードする
。プラスミドベクターｐＢＴＩ ２１４９を、ブタペスト条約の下で、２０００
年２月１７日にＡＴＣＣに寄託した（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４０３）。
【００９８】 （実施例７） （プラスミドｐＢＴＩ ２１５０の構築） ０．７ｋｂのＤＮＡフラグメント（ＴＭＶ Ｕｌ ＣＰおよび３’ＵＴＳを含
む）を、以下のプライマーを使用して、ｐ８０１（基本的には、ｐＴＭＶ ２０
４）からＰＣＲ増幅した： ５’プライマーＪＡＬ １５０ ｃｃｔｇｇｇｃｃａｇｔａｇｔａｔｇｇｇｔｔｃａｇａｔｇｇｔｇｃｔｇｔａｃ
ａａｃｃａｇａｔｇｇａｇｇｔｃａａｃｃａｇｃｔｇｔａｔｃｔｔａｃａｇ ｔａｔｃａｃｔａｃｔｃｃａｔｃｔｃａｇｔｔ （配列番号：３７）（ここで、
ｃｃａｇｔａｇｔａｔｇｇｇには下線を付している） ３’プライマーＪＯＮ ５６（上記に示された） （「順方向（ｆｏｒｗａｒｄ）」プライマーＪＡＬ １５０は、クローニング目
的のＢｓｔＸＩ制限酵素部位（上記で下線を引いている）、パルボウイルスエピ
トープのコード配列ＭＧＱＰＤＧＧＱＰＡＶＲＮＥＲＡＴ（配列番号：３８）お
よびＴＭＶ Ｕ１ ｎｔｓ５７１８−５７４３を含む。）Ｕ１ ＣＰ遺伝子に融
合されたパルボウイルスエピトープを含む増幅産物を、ＫｐｎＩおよびＢｓｔＸ
Ｉで消化し、そしてｐＪＬ６０．３の８．４ｋｂのＫｐｎＩ−ＢｓｔＸＩフラグ
メントへ連結し、ｐＢＴＩ ２１５０を生成する。プラスミドベクターｐＢＴＩ
２１５０は、ＣＰのＮ末端へ融合されたＭＧＱＰＤＧＧＱＰＡＶＲＮＥＲＡＴ
（配列番号：３８）の融合タンパク質を有する組換えウイルスをコードする。プ
ラスミドベクターｐＢＴＩ ２１５０を、ブタペスト条約の下で、２０００年２
月１７日にＡＴＣＣに寄託した（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４０４）。
【００９９】 （実施例８） （ウイルスＴＭＶ １４９の産生） ウイルスＴＭＶ １４９を、プラスミドｐＢＴＩ ２１４９の転写によって、
産生した。感染転写物を、製造業者の指示書に従って、ｃａｐアナログ（７ｍＧ
ｐｐｐＧ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下において、Ｔ
７ ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写反応から合成した。転写産物を使用して、
カーボランダム（炭化ケイ素 ４００メッシュ、Ａｌｄｒｉｃｈ）で軽く塵を払
われたＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａおよびＮ．ｔａｂａｃｕｍの葉に接種した。
【０１００】 （実施例９） （ウイルスＴＭＶ １５０の産生） ウイルスＴＭＶ １５０を、プラスミドｐＢＴＩ ２１５０の転写によって産
生した。感染転写物を、製造業者の指示書に従って、ｃａｐアナログ（７ｍＧｐ
ｐｐＧ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下において、Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写反応から合成した。転写産物を使用して、カ
ーボランダム（炭化ケイ素 ４００メッシュ、Ａｌｄｒｉｃｈ）で軽く塵を払わ
れたＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａおよびＮ．ｔａｂａｃｕｍの葉に接種した。
【０１０１】 （実施例１０） （ＴＭＶ ＣＰ融合ビリオンの抽出および精製） ２つのＴＭＶコート融合構築物（ＴＭＶ １４９およびＴＭＶ １５０）を、
以下、および表１に記載されるようなｐＨ−熱（ｐＨ−ｈｅａｔ）方法またはＰ
ＥＩ抽出方法を使用して、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａおよび／またはＮ．ｔａ
ｂａｃｕｍ中で発現させ、そしてこれらから抽出した。ウイルス調製物をＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦを使用して特徴付けた（実施例１；表３を参照のこと）。ＭＡＬＤ
ＩおよびＰＡＧＥ分析によって決定された産物質量に基づいて、タンパク質分解
的な分解プロフィールを、任意の所定の宿主植物に対する各構築物についてか、
またはコート融合タンパク質を産生するために使用された抽出方法について決定
した（表３および表４を参照のこと）。
【０１０２】 （ｐＨ−熱抽出）：生育室で産生されたＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａまたはＮ
．ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ ＭＤ６０９を、コートタンパク質のＮ末端に融合され
たパルボウイルスエピトープを含むＴＭＶ誘導体（ＴＭＶ１４９およびＴＭＶ１
５０融合物）で接種した。植物を、接種後２．５〜５週間、ウイルスが全体的に
広がった後、回収した。葉組織および茎組織（１５０ｇ）を、１ＬのＷａｒｉｎ
ｇ（登録商標）攪拌機の中で、３００ｍｌの氷冷０．０４％ Ｎａ２Ｓ２０５を
用いて、高い設定で２．０分間液浸軟化した。液浸軟化された物質を、４つの層
のチーズクロスを通して漉し、繊維物質を除去した。生じた「グリーンジュース
（ｇｒｅｅｎ ｊｕｉｃｅ）」を、Ｈ３ＰＯ４でｐＨ５．０に調整した。ｐＨを
調整したグリーンジュースを、４７℃まで加温し、そしてこの温度で５分間維持
し、次いで１５℃まで冷却した。熱処理したグリーンジュースを、６，０００×
Ｇで３分間遠心分離し、２つの画分（上清１およびペレット１）を生じた。この
ペレット１の画分を、最初のグリーンジュースの体積の１／２に相当する量の水
を使用して、蒸留水中に再懸濁した。再懸濁したペレット１をＮａＯＨでｐＨ７
．５まで調整し、そして６，０００×Ｇで３分間遠心分離し、２つの画分（上清
２およびペレット２）を生じた。ウイルスを、ＰＥＧ６，０００およびＮａＣｌ
（４体積％）を添加することによって、上清画分１および２の両方から沈降させ
た。４℃でインキュベーション（１時間）した後、沈殿されたウイルスを１０，
０００×Ｇで１０分間遠心分離することによって回収した。このウイルスのペレ
ットを、１０ｍＭ ＮａＫＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．２）に再懸濁し、そして１０
，０００×Ｇで３分間遠心分離することによって、不純物を除去した。不純物を
除したウイルス調製物を、ＰＥＧ６，０００およびＮａＣｌ（４体積％）を添加
することによって、２度目沈降させた。沈殿されたウイルスを、上記のような遠
心分離によって回収した。ウイルスの収量を表２に示す。
【０１０３】 （ＰＥＩ抽出）：増殖室で産生されたＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａまたはＮ．
ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ ＭＤ６０９を、ＣＰ（ＴＭＶ １４９およびＴＭＶ １
５０融合物）のＮ末端に融合されたパルボウイルスエピトープを含むＴＭＶ誘導
体で接種した。植物を、接種後２．５〜５週間、ウイルスが全体的に広がった後
、回収した。葉組織および茎組織（１５０ｇ）を、１ＬのＷａｒｉｎｇ（登録商
標）攪拌機の中で、３００ｍｌの氷冷５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡおよび０．１％ βメルカプトエタノールを用いて、高い設定で２
．０分間液浸軟化した。液浸軟化された物質を、４つの層のチーズクロスを通し
て漉し、繊維物質を除去した。得られた「グリーンジュース」を、１０％ＰＥＩ
Ｗ／Ｖ保存溶液を添加することによって、０．１％のＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）まで調整した。ＰＥＩ処理されたグリーンジュースを３
０分間攪拌し（４℃）、次いで３，０００×Ｇで５分間遠心分離し、２つの画分
（上清１およびペレット１）を生じた。このペレット１の画分を、最初のグリー
ンジュースの体積の１／２に相当する量の水を使用して、蒸留水中に再懸濁した
。再懸濁したペレット１をＮａＯＨでｐＨ７．５まで調整し、そして６，０００
×Ｇで３分間遠心分離し、２つの画分（上清２およびペレット２）を生じた。ウ
イルスを、ＰＥＧ６，０００およびＮａＣｌ（４体積％）を添加することによっ
て、上清画分１および２の両方から沈降させた。４℃でインキュベーション（１
時間）した後、沈降させたウイルスを１０，０００×Ｇで１０分間遠心分離する
ことによって回収した。このウイルスのペレットを、１０ｍＭ ＮａＫＰＯ４緩
衝液（ｐＨ７．２）に再懸濁し、そして１０，０００×Ｇで３分間遠心分離する
ことによって、不純物を除去した。不純物を除去したウイルス調製物を、ＰＥＧ
６，０００およびＮａＣｌ（４体積％）を添加することによって、２度目沈降さ
せた。沈殿させたウイルスを、上記のような遠心分離によって回収した。ウイル
スの収量を表２に示す。
【０１０４】 エピトープ特異的なウイルス粒子の収量は、ウイルス宿主として使用された植
物の種および抽出方法に依存する。ＴＭＶ１４９は、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎ
ａにおいて産生しかつｐＨ−熱方法を使用して抽出した場合に、最高量のウイル
スを産生した。さらに、ＴＭＶ１４９粒子は主に上清１に分配された。ＰＥＩ方
法を使用した場合に、ごくわずかな収量のＴＭＶ１４９を測定した。ＴＭＶ１５
０は、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおいて産生しかつＰＥＩ方法を使用して抽
出した場合に、最大量のウイルスを産生した。ＴＭＶ１５０は、ｐＨ−熱方法に
よって抽出した場合に、上清１および２の両方に分配された（それぞれ、６０％
および４０％）。
【０１０５】 （表２．ウイルス収量）
【０１０６】
【表３】 ＊ウイルス収量を１ｇ生重量あたりのｍｇとして表した、抽出した植物組織を分
光学的に決定した（Ａ２６０での吸光度で）。全ての値は、最初のＰＥＧ沈殿物
由来であった。
【０１０７】 （実施例１１） （ＭＡＬＤＩによるＣＰ融合物の分析） ＰＥＧ沈殿され、再懸濁されたウイルス調製物を、５０％アセトニトリル中に
希釈し、そしてさらにシナピン酸（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ ａｃｉｄ）（Ａｌｄｒ
ｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）で１：１に希釈した。シナピン酸を、０．
１％水性トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｏｕｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）／ア
セトニトリル（容量で７０／３０）中に、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。シ
ナピン酸で処理されたサンプル（１．０μｌ）を、ステンレス鋼のＭＡＬＤＩプ
レート表面に塗布し、そして室温にて風乾させた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペ
クトルを、線形モードで操作されたＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ ＤＥ−ＰＲＯ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を用いて得た。３３７ｒｉｍで操作
するパルスレーザーを、イオン化のために遅延抽出モードで使用した。９０％の
格子電圧および０．１％のガイドワイヤ電圧を伴う２５ｋＶの加速電圧を使用し
た。約１００回の走査が得られ、そして２ｋＤａの低マスゲートを用いて、２〜
１５６ｋＤａの質量範囲にわたって平均化された。イオン源およびミラー圧（ｍ
ｉｒｒｏｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）は、それぞれ、約１．２×１０−７トルおよび
１．６×１０−７トルであった。すべてのスペクトルを、ウマアポミオグロビン
（１６，９５２Ｄａ）を用いる一点フィット（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｏｉｎｔ ｆｉ
ｔ）で質量較正した。
【０１０８】 表３および４に提示される結果は、Ｎ末端ＴＭＶ ＣＰ融合物のタンパク質分
解に対する、宿主種、抽出方法および抽出のタイミングの効果を示す。すべての
場合において、ネイティブなＣＰを用いる場合と同様に、すべての融合物から末
端Ｍｅｔ残基を取り除く。Ｎ末端グリシン残基を、４０〜６０％のＴＭＶ１４９
融合物から取り除く。接種後１７日目のＮ．ｔａｂａｃｕｍにおいて産生された
ＴＭＶ１４９および１５０において実施された抽出（ｐＨ−加熱）は、最も複雑
かつ最も高い程度のタンパク質分解活性を生じた。タンパク質分解性の分解にお
ける差異は、異なる植物種または植物の異なる発達時期に存在するプロテアーゼ
の定性的差異および定量的差異の両方を反映し得る。ＴＭＶ１５０のＰＥＩ抽出
は保護的であることが証明され、ｐＨ−加熱抽出（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ宿主）と
比較して無視できる程度の分解を生じる。
【０１０９】
【表４】 ＊括弧内の数値は、その特定の質量で存在するコート融合物のおおよそのパーセ
ンテージである（ＰＡＧＥによって分離され、そしてクマシーブルーで染色され
た、融合タンパク質の分析に基づく）。＊＊ 質量は、ナトリウムイオン（２３Ｄａ）について補正されている。
【０１１０】
【表５】 ボールドで示されるアミノ酸は、ＴＭＶ ＶＣＰに存在する天然のＮ末端残基で
ある。
【０１１１】 （実施例１２） （動物試験において使用するためのビリオンの精製および形成） ＰＥＧ沈殿されたビリオン調製物（表５を参照のこと）を、注射用蒸留水（Ｗ
ＦＩ）中に、１．０ｍｌのＷＦＩあたり１．０ｍｇウイルスの濃度で再懸濁した
。ウイルス調製物を処理するために使用されたすべての実験器具（ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ ｗａｒｅ）を、２２５℃で１８時間ベーキングした。再懸濁されたウ
イルス調製物を、クロロホルムおよび１−ブタノール（８容量％）を用いて、室
温で１時間断続的に振盪することによって溶媒抽出した。１０，０００×ｇで５
分間遠心分離することによって相分離した。水相を、ドライアイス／メタノール
浴中で凍結させ、そして乾燥するまで一晩凍結乾燥させた。凍結乾燥されたウイ
ルス調製物を、１．０ｍｌのＷＦＩあたり５〜１０ｍｇウイルスの濃度で再懸濁
した。再懸濁されたウイルス調製物を、クリンピング（ｃｒｉｍｐｉｎｇ）によ
って密封された１０ｍｌ血清バイアル中に充填した。さらなる処理のためのサン
プルの選択は、分解されずに残存する融合物の収量およびパーセンテージの両方
に基づいた（ＭＡＬＤＩ分析に基づく）。
【０１１２】
【表６】 （実施例１３） （ワクチン試験） パルボウイルスワクチンを、タバコ植物で発現されたＴＭＶ１４９融合物およ
びＴＭＶ１５０融合物を利用して、安全性および効力について若年のネコにおい
て試験した。ＴＭＶ粒子において発現されたＴＭＶ１５０融合物は、それ自体は
、安全でありかつ免疫原性であることが証明された。ＴＭＶ１４９融合物ワクチ
ンは、幾分弱い免疫原性であった。ＴＭＶ１５０融合物、ＴＭＶ１４９融合物、
またはＴＭＶ１５０融合物とＴＭＶ１４９融合物との混合物でワクチン接種され
たネコはすべて、３０％致死量のビルレントＦＰＶに対して顕著な防御を示した
。ＴＭＶタンパク質によって提供されるもの（このうちのいくつかは、スーパー
抗原（非特異的な免疫刺激因子）として作用することが公知である）以外に、ア
ジュバントは必要とされなかった。この特定のワクチンの開発および試験に伴い
、本発明者らは、一般的なネコワクチンを作製するための発現系の有用性および
利点を確証した。ＴＭＶ１４９融合物およびＴＭＶ１５０融合物のエピトープは
、ＦＰＶ表面上にある２つの主な血球凝集性抗体および中和性抗体を誘導する抗
原である。この２つのエピトープの配列は重複する。これらのエピトープで免疫
されたネコは、ウイルス中和抗体を発達させ、そしてビルレントウイルスでの攻
撃に対して部分的に防御される。従って、ネコに、ＴＭＶ１４９融合ペプチドも
しくはＴＭＶ１５０融合ペプチドのいずれか、またはその両方で免疫し、次いで
、そのワクチンの安全性、免疫原性および効力についてモニターした。ネコを、
１００〜２００μｇの各ペプチドで免疫し（８〜１２週齢で開始する）、そして
４週間後に二次免疫した。次いで、これらに、多用量のビルレントＦＰＶで経口
的に攻撃した。両方の免疫原は、全く安全であるように見え、発熱も、うつ病（
ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）も、局所的反応も誘導しなかった。ＥＬＩＳＡを使用し
て抗体を測定した。二次免疫後、かなりの力価の抗体が、パルボウイルス全体に
対するＥＬＩＳＡ実行において検出された。ＴＭＶ１４９融合物およびＴＭＶ１
５０融合物を投与したネコは、ＴＭＶ１４９融合物またはＴＭＶ１５０融合物で
免疫されたネコよりもわずかに高い応答を示した。攻撃後、ＴＭＶ１５０融合物
（単独、またはＴＭＶ１４９融合物との組み合わせのいずれか）で免疫されたネ
コは、ＴＭＶ単独で免疫されたコントロールネコ（これは、ＴＭＶ１５０融合物
もＴＭＶ１４９融合物も発現しなかった）と比較して、疾患徴候が最少であるこ
とおよび死亡が発生していないという観察結果によって証明されるように、完全
に防御されているようであった。ＴＭＶ１５０融合ペプチドは、ＴＭＶ粒子で送
達される場合に、安全かつ有効なワクチンであり、さらに、さらなるアジュバン
トを必要としないと結論付けられた。
【０１１３】 まとめると、以下の通りである： １．ＴＭＶ１４９融合物またはＴＭＶ１５０融合物（１００〜２００μｇ）で免
疫されたネコは、ＦＰＶ全体に対するＥＬＩＳＡによって測定された場合に検出
可能な抗体応答をなした。 ２．２００μｇのＴＭＶ１４９融合物またはＴＭＶ１５０融合物に対する抗体応
答は、１００μｇに対する応答よりも高かった。 ３．ＴＭＶ１４９融合物およびＴＭＶ１５０融合物の組み合わせで免疫されたネ
コは、いずれかのタンパク質単独で免疫されたネコよりも良好な抗体応答をなし
た。 ４．ＴＭＶ１５０融合物でワクチン接種されたネコ、またはＴＭＶ１４９融合物
およびＴＭＶ１５０融合物でワクチン接種されたネコは、免疫されなかったコン
トロールネコまたはＴＭＶで免疫されたコントロールネコよりも、ビルレントパ
ルボウイルス攻撃に対してより良好な防御を示した。ＴＭＶ１５０融合物は、Ｔ
ＭＶ１４９融合物よりも防御的であった。 ５．ＴＭＶ１４９融合物およびＴＭＶ１５０融合物の両方は、死亡を回避させた
；ＴＭＶ１５０融合物は、罹患率を減少させるのにより有効であった。ＴＭＶ１
５０融合物で免疫されたネコは、有意に発熱性が低く、疾病の臨床的徴候をほと
んど示さず、そして免疫されていないネコまたはコントロールＴＭＶで免疫され
たネコよりも白血球減少性の程度が著しく低かった。 ６．ＴＭＶ１５０融合物によって付与された免疫は、無菌化（ｓｔｅｒｉｌｉｚ
ｉｎｇ）（これは、死滅パルボウイルスワクチンに典型的である）されなかった
。免疫されたネコは、穏やかな疾患徴候を示したが、明白な免疫学的記憶を有し
た。
【０１１４】 （実施例１４） （生物の寄託） 以下の材料を、ブダペスト条約に従って、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ バー
ジニア州）に２００１年２月５日付けで寄託した： ＴＭＶ Ｕ１株ｃＤＮＡ：ｐＪＬ１５０／１９９，ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−
２９８３、および ＴＭＶ Ｕ１株ｃＤＮＡ ｐＪＬ１５０／１９８，ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−
２９８４。
【０１１５】 （メチオニン結合を介してＴＭＶ Ｕ１コートタンパク質のＮ末端に融合され
た、パルボウイルス由来のペプチドの構築） 表６は、使用されたかまたは作製された、ＴＭＶ Ｕ１に基づくＣＰ融合物の
アミノ酸配列を含む。ＴＭＶ１５０−パルボ（ｐａｒｖｏ）融合物の構築を、実
施例７に記載する。ＴＭＶ１５０融合物ウイルスの産生を、実施例９に記載する
。目的のパルボウイルスエピトープに下線を付す。ＴＭＶ１５０ウイルスを、Ｔ
ＭＶ Ｕ１ ＣＰの高度に保存されたチロシン（Ｙ）残基の直前（ＴＭＶ１５０
／１９８融合物）または直後（ＴＭＶ１５０／１９９融合物）にアミノ酸メチオ
ニンを含むように改変した。メチオニン残基の存在は、このペプチドを、ＣＮＢ
ｒ切断処理による除去に対して感受性にさせる。
【０１１６】 （手順） ＴＭＶ１５０／１９８融合物およびＴＭＶ１５０／１９９融合物を作製するた
めのＴＭＶ１５０融合物ウイルスの改変を、ＰＣＲおよび標準的な分子生物学的
手順を使用して実施した。オリゴヌクレオチドＪＡＬ１９８、ＪＡＬ１９９およ
びＪＡＬ２００を、この実験のために作製した。ＪＡＬ１９８［ａｔｇ ｔａｃ
ａｇｔ ａｔｃ ａｃｔ ａｃｔ ｃｃａ ｔｃｔ ｃａｇ（配列番号（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：）４９）］は、ＴＭＶ Ｕ１ ＣＰ ＯＲＦの５’末端から９
個のコドンにアニールする順方向オリゴヌクレオチドである。ＪＡＬ１９９［ｔ
ａｃ ａｔｇ ａｇｔ ａｔｃ ａｃｔ ａｃｔ ｃｃａ ｔｃｔ ｃａｇ（配
列番号５０）］は、ＹＭＳＩＴＴＰＳＱ（配列番号５１）をコードするように、
ＴＭＶ Ｕ１ ＣＰ ＯＲＦの５’末端を変異させる、順方向ヌクレオチドであ
る。ＪＡＬ２００［ａｇｔ ａｇｃ ｔｃｔ ｔｔｃ ｇｔｔ ｔｃｔ ｔａｃ
ｔｇｃ（配列番号５２）］は、ＡＶＲＮＥＲＡＴ（配列番号５３）についての
パルボウイルスエピトープコドンであるヌクレオチド５７５６〜５７５９で、Ｔ
ＭＶ１５０ ＣＰ融合物にアニールする逆方向オリゴヌクレオチドである。
【０１１７】 （ベクターの調製） Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下で、ＴＭＶ Ｕ１の全長感染
性ｃＤＮＡを含む、プラスミドｐＢＴＩ８０１を、制限酵素ＮｃｏＩおよびＰａ
ｃＩ（これらはそれぞれ、ヌクレオチド５４５９および５７８１で、ＴＭＶ Ｕ
１ ｃＤＮＡを切断する）を用いて消化した。消化されたＤＮＡを、仔ウシアル
カリホスファターゼでホスファターゼ処理し、そしてアガロースゲルを通して電
気泳動した。次いで、約９ｋｂのサイズのベクターフラグメントを、このアガロ
ースから単離した。
【０１１８】 （挿入物の調製） オリゴヌクレオチドＪＡＬ１９８（配列番号４０）およびＪＡＬ１９９（配列
番号４１）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理し、次いで、以下のＰＣＲ
反応に使用した：ｐＪＬ１５０テンプレートＤＮＡを使用して、ＪＡＬ７１［Ｃ
ＧＴ ＣＧＧ ｃｃｇ ｃａｃ ｇｔｇ ｔｇａ ｔｔａ ｃｇｇ ａｃａ ｃ
ａａ ｔｃｃ ｇ（配列番号５４）］およびＪＡＬ１９８、ならびに、ｐＢＴＩ
８０１テンプレートＤＮＡを使用して、ＪＡＬ７１およびＪＡＬ１９９（図６
を参照のこと）。ＪＡＬ７１は、ＴＭＶ Ｕ１ヌクレオチド６２１７〜６２４０
に対してアニールする逆方向オリゴヌクレオチドである。両方のＰＣＲ反応は、
約５３０ｂｐのＤＮＡフラグメントである完全なＴＭＶ ＣＰ ＯＲＦを増幅さ
せる。
【０１１９】 ＪＡＬ２００およびＪＡＬ９５［ｇｔｃ ｇｔｃ ａｃｇ ｇｇｃ ｇａｇ
ｔｇｇ ａａｃ ｔｔｇ ｃｃｔ（配列番号５５）］を、ｐＪＬ１５０テンプレ
ートＤＮＡのＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用した。ＪＡＬ９５は、Ｔ
ＭＶ Ｕ１ヌクレオチド５１１９〜５１４５に対してアニールする順方向オリゴ
ヌクレオチドである。ｐＪＬ１５０は、Ｕ１ ＣＰ遺伝子の５’末端に融合した
パルボウイルスエピトープコドンを含む、ＴＭＶ−Ｕ１に基づくクローンである
（図６を参照のこと）。このＯＲＦの翻訳は、表６に記載されたアミノ酸配列で
始まるＣＰを生成する。ＪＡＬ２００およびＪＡＬ９５のＰＣＲ産物は、約６６
０ｂｐのサイズである。
【０１２０】 次いで、ＪＡＬ７１／１９８のＰＣＲ産物を、ＪＡＬ２００／９５のＰＣＲ産
物に連結した。同様に、ＪＡＬ７１／１９９のＰＣＲ産物およびＪＡＬ２００／
９５のＰＣＲ産物を一緒に連結した。これらの連結されたＤＮＡを、プライマー
ＪＡＬ９５およびＵ１ループを使用するＰＣＲ反応のためのテンプレートとして
使用した。Ｕ１ループ［ｇｔｃ ｔａａ ｔａｃ ｃｇｃ ａｔｔ ｇｔａ ｃ
（配列番号５６）］は、ＴＭＶ Ｕ１ ＣＰループに対してアニールする逆方向
オリゴヌクレオチドである。得られるＰＣＲ産物は、約８００ｂｐのサイズであ
った。
【０１２１】 ＰＣＲ後に、両方のＰＣＲ産物をフェノール：ＣＨＣｌ３で抽出し、そして酢
酸アンモニウムおよびエタノールで沈殿させ、次いで、滅菌蒸留水中に再懸濁し
、そして最終的に、制限酵素ＰａｃＩおよびＮｃｏＩで消化した。消化された各
ＰＣＲ産物について、Ｕ１「３０Ｋ」遺伝子の３’末端およびＵ１ ＣＰ ＯＲ
Ｆの５’末端に融合された変異パルボウイルスエピトープを含む、約３８５ｂｐ
のバンドを、アガロースゲルから単離した。このＤＮＡフラグメントを、実施例
５に記載のようにして調製された、ＮｃｏＩ−ＰａｃＩ消化ｐＢＴＩ８０１ベク
ターフラグメント中に連結した。これらの２つの連結から生じたプラスミドを、
ｐＪＬ１５０／１９８またはｐＪＬ１５０／１９９と命名した。
【０１２２】 連結されたＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ中に形質転換し、そしてＤＮＡを、形質転換
された個々のＤＮＡコロニーから増幅および調製した。ＤＮＡを、ｒＮＴＰおよ
びＧｐｐｐＧキャップアナログの存在下において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼで
転写した。この転写物をプロトプラスト中にトランスフェクトし、そしてこのプ
ロトプラストを、適切な液体培地において培養した。トランスフェクションから
約３日後にプロトプラストの抽出物を生成し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ならび
に一次抗体としてウサギ抗ＴＭＶ Ｕ１血清および二次抗体としてヤギ抗ウサギ
抗体（アルカリホスファターゼ結合体）を使用するウェスタンブロッティングに
よって分析した。この結果は、ＴＭＶ１５０／１９８融合物およびＴＭＶ１５０
／１９９融合物によって生成された、ほぼ予期されたサイズの融合タンパク質を
示した。
【０１２３】
【表７】 （実施例１５） （ＴＭＶ ＶＣＰ融合物ビリオンの抽出および精製、ｐＨ−加熱抽出） 生育室で生産されたＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａに、メチオニン残基を介して
ＣＰのＮ末端に融合されたパルボ（Ｐａｒｖｏ）エピトープを含むＴＭＶ誘導体
（ＴＭＶ１５０／１９８融合物およびＹＭＶ１５０／１９９融合物）を接種した
。ＴＭＶ１５０／１９８融合物およびＴＭＶ１５０／１９９融合物で接種された
植物の初回スクリーニングによって、ＴＭＶ１５０／１９８ウイルスは、ＴＭＶ
１５０／１９９ウイルスよりも高い収量で産生されることが示された。ＴＭＶ１
５０／１９９融合物のさらなる分析は続行しなかった。ＴＭＶ１５０／１９８融
合物で接種された植物を、ウイルスの全身的な伝播後、接種の２〜３週間後に収
穫した。葉および柄の組織（２２１ｇ）を、３００ｍｌの冷却された０．０４％
Ｎａ２Ｓ２Ｏ５と共に、高設定で２．０分間にわたり１ Ｌ Ｗａｒｉｎｇ（登
録商標）ブレンダー中において浸軟（ｍａｃｅｒａｔｅ）した。浸軟された材料
を、４層のチーズクロスを通して濾過して、繊維性の物質を取り除き、「グリー
ンジュース」を生成した。得られた「グリーンジュース」を、Ｈ３ＰＯ４で５．
０のｐＨに調整した。ｐＨ調整したグリーンジュースを、４７℃まで加熱し、そ
してこの温度で５分間維持し、次いで、１５℃まで冷却した。加熱処理されたグ
リーンジュースを、５，０００×ｇで５分間遠心分離して、２つの画分（上清１
およびペレット１）を得た。ペレット１画分を、最初の「グリーンジュース」の
１／２容量と等しい容量の蒸留水を用いて、蒸留水中に再懸濁した。再懸濁され
たペレット１を、ＮａＯＨで７．５のｐＨに調整し、そして５，０００×ｇで５
分間遠心分離して、２つの画分（上清２およびペレット２）を得た。ウイルスを
、ＰＥＧ６，０００およびＮａＣｌ（４容量％）を添加することによって、上清
１および上清２の両方の画分から沈殿させた。４℃での１時間のインキュベーシ
ョン後、沈殿されたウイルスを、１０，０００×ｇで１５分間遠心分離すること
によって回収した。このウイルスペレットを、１０ｍＭ ＮａＫＰＯ４緩衝液（
ｐＨ７．２）中に再懸濁し、そして１０，０００×ｇで１０分間遠心分離するこ
とによって清澄化した。清澄化されたウイルス調製物に、ＰＥＧ６，０００およ
びＮａＣｌ（４容量％）を添加することによって、２回目の沈殿をさせた。沈殿
させたウイルスを、上記のように遠心分離することによって回収した。上清１お
よび上清２に由来する、ＰＥＧ精製されたビリオン調製物を、実施例１１に記載
のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析し、そして質量を決定した（表７）。推定さ
れる全長ＴＭＶ ＶＣＰ融合物、Ｎ末端アルギニン残基を含むタンパク質分解性
分解産物、および内部メチオニンでの翻訳開始またはタンパク質分解性分解から
生じるＮ末端メチオニン残基を含むタンパク質、に対応する３つのタンパク質の
質量が検出された（表８、ならびに図７および図８を参照のこと）。
【０１２４】
【表８】
【０１２５】
【表９】 （実施例１６） （ＴＭＶ ＶＣＰ融合物の臭化シアン切断） ３０ｍｇ（４．４ｍｇウイルス／ｍｌ）の精製されたＴＭＶ１５０／１９８融
合物（実施例１５に記載のように調製された、上清１−ＰＥＧ２）を、２１ｍｌ
のギ酸および２．２ｍｌのｄｉ Ｈ２Ｏと混合して、７０％ギ酸中における１ｍ
ｇ／ｍｌタンパク質を得た。３０ｍｇの固体ＣＮＢｒを反応混合物に添加し、振
盪することによって溶解し、そして暗黒下において室温で６時間インキュベート
した。６時間のインキュベーション後、３５０ｍｌのｄｉ Ｈ２Ｏをこの反応混
合物に添加し、凍結するまでドライアイス−エタノール浴中でインキュベートし
、そして乾燥するまで凍結乾燥させた。この凍結乾燥された粉末を、１０ｍｌの
ｄｉ Ｈ２Ｏ中に再懸濁し、そして６，０００×ｇで５分間遠心分離して、ペレ
ット１および上清１の画分を得た。このペレット１の画分を、１０ｍｌのｄｉ
Ｈ２Ｏ中に再懸濁することによって洗浄し、そして６，０００×ｇで５分間遠心
分離することによって分離することによって、ペレット２および上清２の画分を
得た。この上清１および上清２の画分を合わせ、そして１０Ｋｄ分子量カットオ
フのＡｍｉｃｏｎ ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）を通して濾過した。１０Ｋ
ｄ浸透液を、凍結するまでドライアイス−エタノール浴中でインキュベートし、
そして乾燥するまで凍結乾燥させた。凍結乾燥された材料を、分析のためにｄｉ
Ｈ２Ｏ中に再懸濁した。ＣＮＢｒ切断された産物を、実施例１７に記載のよう
にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析し、そして質量を決定した（表７）。ＣＮＢ
ｒペレット１は、切断されていないＴＭＶ ＶＣＰおよび切断されたＴＭＶ Ｖ
ＣＰにそれぞれ対応する、１９，３３０Ｄａおよび１７，５７０Ｄａの質量を有
する２つの産物を含んだ（図９を参照のこと）。両方のＴＭＶ ＶＣＰ種は、質
量において明らかな増加を有した。これは、酸エステル形成に起因するようであ
る。再懸濁された１０Ｋｄ浸透液の凍結乾燥物は、主として１７３６Ｄａ種を含
み、そして少量の１７２０Ｄａ種、１７５８Ｄａ種および１８２８Ｄａ種を含む
（図１０）。この１７３６フラグメントは、カルボキシ末端ホモセリンを含む放
出されたパルボ（ｐａｒｖｏ）ペプチド配列の推定質量に対応する。切断されて
いないＴＭＶ ＶＣＰまたは切断されたＴＭＶ ＶＣＰが、１０Ｋｄ浸透液の凍
結乾燥物サンプル中において検出されなかった（図１１）。
【０１２６】 （実施例１７） （ＭＡＬＤＩによる、ＣＰ融合物およびＣＮＢｒ切断された融合物の分析） ５ｋＤａを超える質量を有する産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（シナピン酸）分析
。分析のために、種々の濃度の各サンプルを、シナピン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍ
ｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）マトリクスで１：１に希釈し、１μＬをステンレス鋼
のＭＡＬＤＩプレート表面に塗布し、そして風乾させた。シナピン酸を、０．１
％水性ＴＦＡ／アセトニトリル（容量で７０／３０）中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度
で調製した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを、線形モードで操作されたＰ
ｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＰＲＯ（
Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）で得た。３３７ｎｍで操作するパルス窒素レーザーを、
イオン化のために遅延抽出モードで使用した。９０％の格子電圧および０．１％
のガイドワイヤ電圧を伴う２５ｋＶの加速電圧を使用した。約１００回の走査が
得られ、そして２０００の低マスゲートを用いて、２〜１５６ｋＤａの質量範囲
にわたって平均化された。イオン源およびミラー圧は、それぞれ、約５×１０− ８ トルおよび３×１０−８トルであった。すべてのスペクトルを、ウマアポミオ
グロビン（１６，９５２Ｄａ）を用いる一点フィットで質量較正した。
【０１２７】 （５ｋＤａ未満の質量を有する産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（α−シアノ−４−
ヒドロキシ桂皮酸（α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａ
ｃｉｄ））分析） 分析のために、種々の濃度の各サンプルを、再結晶されたα−シアノ−４−ヒ
ドロキシ桂皮酸（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）マトリクスで１
：１に希釈し、１μＬをステンレス鋼のＭＡＬＤＩプレート表面に塗布し、そし
て風乾させた。ＣＨＣＡを、０．１％水性ＴＦＡ／アセトニトリル／エタノール
（容量で１：１：１）中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯ
Ｆ質量スペクトルを、反射（ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎ）モードで操作されたＰｅｒ
Ｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＰＲＯ（Ｈｏ
ｕｓｔｏｎ，ＴＸ）で得た。３３７ｎｍで操作するパルス窒素レーザーを、イオ
ン化のために遅延抽出モードで使用した。７４％の格子電圧および０．０５％の
ガイドワイヤ電圧を伴う２０ｋＶの加速電圧を使用した。約１００回の走査が得
られ、そして３５０の低マスゲートを用いて、３８５〜８５００Ｄａの質量範囲
にわたって平均化された。イオン源およびミラー圧は、それぞれ、約５．９×１
０−８トルおよび２．８×１０−８トルであった。すべてのスペクトルを、アン
ギオテンシンＩ（１，２９７．５１Ｄａ）を用いる一点フィットで質量較正した
。
【０１２８】 （実施例１８） （ＣＮＢｒ切断され、そして精製されたペプチドのＮ末端アミノ酸配列分析） ＣＮＢｒ放出されたペプチドを含む、再懸濁された１０Ｋｄ浸透液の凍結乾燥
物のＮ末端アミノ酸配列決定を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａ
ｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃａｒｂｏｈｙ
ｄｒａｔｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙにより実施した。凍結乾燥
された１０Ｋｄ浸透液を、２．６ｍｇタンパク質／ｍｌのタンパク質濃度でｄｉ
Ｈ２Ｏ中に再懸濁し、そして自動化ＡＢＩ Ｍｏｄｅｌ ４７７配列決定装置
を使用して配列決定した。この手順は、標準的なエドマン分解を使用して連続的
に、ペプチドのアミノ酸末端（Ｎ末端）で始まるアミノ酸を切断し、そして同定
する。この装置は、２０個すべての一般的なアミノ酸およびいくつかの改変形態
を検出し得る。これは、液体パルスモードで操作された。配列決定を１５サイク
ル実施して、このペプチドの最初の１５アミノ酸を同定した。配列決定に基づく
最初の１３個のアミノ酸は、推定アミノ酸配列と一致した。１３サイクル後、反
復収量は、確証をもって残基１４および１５を読み出すのが可能な程度を下回っ
た。しかし、最初の１３個のアミノ酸は、このペプチドの推定配列に一致するの
で、この同一性は確証される。
【０１２９】 （実施例１９） （ＨＰＬＣによる、ＣＮＢｒ切断ペプチドの分離および精製） 実施例１６に記載のような、ＣＮＢｒ切断されたＴＭＶ１５０／１９８融合物
のペレット１および上清１の画分を、ＨＰＬＣによって分離し、そしてピーク画
分を、実施例１７に記載のようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析した。ＨＰＬ
Ｃ分離を、フォトダイオードアレイ検出能を備えるＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａ
ｒｄ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）Ｍｏｄｅｌ １１００ Ｈ
ＰＬＣにおいて実施した。この条件は、以下の通りであった：
【０１３０】
【表１０】 ペレット１および上清１の画分の分離のためのＨＰＬＣクロマトグラムを、それ
ぞれ、図１２および１３に示す。各サンプルについて検出された主要なピーク（
１７．４分−上清１および３２．５分−ペレット１）を収集し、そしてＭＡＬＤ
Ｉによって分析した（表７を参照のこと）。ＨＰＬＣは、１７．４分で溶出する
切断されたペプチドを、３２．５分で溶出した切断されていないＴＭＶ ＶＣＰ
と切断されたＴＭＶ ＶＣＰとから、効率的に分離した。
【０１３１】 本発明を、本明細書において好ましい実施形態を参照して記載したが、種々の
改変が、本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきで
ある。
【０１３２】 本明細書中に引用されたすべての刊行物、特許、特許出願およびウェブサイト
は、個々の刊行物、特許、特許出願またはウェブサイトがそれぞれ、詳細かつ個
々に参照として援用されているかのごとく、それらの全体が参照として援用され
る。
【０１３３】
【表１１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、タバモウイルス遺伝子の発現を示す。タバモウイルスの遺伝子発現が
図示される。
【図２】 図２は、ＴＭＶ転写ベクターｐＳＮＣ００４のプラスミドマップである。ＴＭ
ＶのＵ１菌株の感染性ＲＮＡゲノムは、ＫｐｎＩで直線化されたｐＳＮＣ００４
からインビトロでＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって合成される。
【図３Ａ】 図３Ａは、プラスミド構築物の図を示す。実施例において議論される種々のウ
イルスエピトープ融合ベクターをコードするプラスミドＤＮＡの構築における各
工程が図示される。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、プラスミド構築物の図を示す。実施例において議論される種々のウ
イルスエピトープ融合ベクターをコードするプラスミドＤＮＡの構築における各
工程が図示される。
【図３Ｃ】 図３Ｃは、プラスミド構築物の図を示す。実施例において議論される種々のウ
イルスエピトープ融合ベクターをコードするプラスミドＤＮＡの構築における各
工程が図示される。
【図４】 図４は、モノクローナル抗体（ＮＶＳ３）のＴＭＶ２９１への結合を示す。Ｔ
ＭＶ２９１中に存在するマラリアエピトープに対するＮＶＳ３の反応性は、標準
的なＥＬＩＳＡにおいて測定される。
【図５】 図５は、モノクローナル抗体（ＮＹＳ１）のＴＭＶ２６１への結合を示す。Ｔ
ＭＶ２６１中に存在するマラリアエピトープに対するＮＹＳ１の反応性は、標準
的なＥＬＩＳＡにおいて測定される。
【図６】 図６は、ｐＪＬ１５０／１９８およびｐＪＬ１５０／１９９の構築物において
使用されるオリゴおよび制限部位の位置を示す。
【図７】 図７は、実施例１５の上清１由来のＰＥＧ精製ビリオン調製物の、マトリック
ス支援レーザー脱離飛行時間型質量（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）分析を示す（表６を
参照のこと）。３つのポリペプチドの質量を示すピークが検出され、そしてこれ
は以下に対応する：（１）予想される全長ＴＭＶコート融合ペプチド（１９，１
６３．８０６４によって示される）、Ｎ末端アルギニン残基を含むタンパク分解
性の分解産物（１８，１０４．８７９１によって示される）、および内部Ｍｅｔ
コドンの翻訳の開始またはタンパク分解性の分解から生じるＮ末端Ｍｅｔ残基を
含むタンパク質（１７，５３７．１１９０）。
【図８】 図８は、実施例１５の上清２由来のＰＥＧ精製ビリオン調製物のＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦ分析を示す（表６を参照のこと）。３つのタンパク質の質量のピークを検
出し、これは以下に対応する：予測される全長ＴＭＶコートペプチド融合物（１
９，１８８．２０１６によって示される）、（２）Ｎ末端Ａｒｇ残基を含むタン
パク分解性の分解産物（１８，１２１．６１６６によって示される）、および（
３）最初のメチオニンコドンで開始された翻訳またはタンパク分解性の分解のい
ずれかから生じるＮ末端Ｍｅｔ残基を含むポリペプチド（１７，５５０．６２１
２）。
【図９】 図９は、実施例１６における臭化シアン（ＣＮＢｒ）切断産物のＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦ分析を示す（表６を参照のこと）。このＣＮＢｒペレットは、それぞれ非
切断および切断ＴＭＶコートタンパク質に対応する１９，３３０および１７，５
７０Ｄａの質量の２つの産物を含んだ。質量の明らかな増加は、おそらく酸エス
テルの形成に起因する。
【図１０】 図１０は、実施例１６の再懸濁した浸透凍結乾燥物（ｐｅｒｍｅａｔｅ ｌｙ
ｏｐｈｉｌｉｓａｔｅ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す（表６を参照のこと）
。この再懸濁した１０ｋＤａの浸透凍結乾燥物サンプルは、主に１７３６Ｄａの
種および少量の１７２０、１７５８および１８２８Ｄａの種を含んだ。この１７
３６フラグメントは、Ｃ末端ホモセリンを含む放出されたパルボウイルスペプチ
ド配列の予想される質量に対応する。
【図１１】 図１１は、実施例１６の再懸濁した浸透凍結乾燥物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析
を示す（表６を参照のこと）。この再懸濁した１０ｋＤａの浸透凍結乾燥物サン
プルは、検出可能な量の非切断または切断ＴＭＶコートを含まなかった。
【図１２】 図１２は、実施例１９のペレット１のＨＰＬＣクロマトグラムを示す（表６を
参照のこと）。
【図１３】 図１３は、実施例１９の上清１のＨＰＬＣクロマトグラムを示す（表６を参照
のこと）。
【図１４】 図１４は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ中で増殖し、そして
ｐＨおよび熱処理で精製した構築物１４９の質量分析データを示す。
【図１５】 図１５は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ中で増殖し、そしてｐＨおよ
び熱処理で精製した構築物１４９の質量分析データを示す。
【図１６】 図１６は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ中で増殖し、そして
ＰＥＩ処理方法で精製した構築物１５０の質量分析データを示す。
【図１７】 図１７は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ中で増殖し、そして
ｐＨおよび熱処理で精製した構築物１５０の質量分析データを示す。
【図１８】 図１８は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ中で増殖し、そしてｐＨおよ
び熱処理で精製した構築物１４９の質量分析データを示す。
【図１９】 図１９は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ中で増殖し、そしてｐＨおよ
び熱処理で精製した構築物１５０の質量分析データを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 リンドボ， ジョン エイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 95688， バカビル， サンダンス ドライブ 143 (72)発明者 マクラック， マイケル ジェイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 95687， バカビル， ラク ロモンド ドライブ 296 (72)発明者 ローレンス， ジョナサン イー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 95687， バカビル， グリーン ツリー ドライ ブ 166 (72)発明者 グロス， シンシア エス． アメリカ合衆国 カリフォルニア 95688， バカビル， コート マラガ 801 (72)発明者 ガーガー， スティーブン ジェイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 95687， バカビル， コットンウッド ストリー ト 593 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 CB02 4B024 AA01 BA31 BA32 CA04 CA07 DA01 DA06 EA01 EA04 GA11 HA08 4B064 AG32 CA02 CA11 CA12 CA19 CC24 CE02 DA01 4B065 AA26X AA88X AA95X AA95Y AB01 BA02 CA24 CA45

Claims (100)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 植物または植物細胞において発現され得る融合タンパク質を
    コードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、以下： （ａ）目的のポリペプチドまたはペプチド、Ｐ１、を含み、該Ｐ１は、 （ｂ）植物ウイルスコートタンパク質、ＶＣＰ、のＮ末端に連結され、該連結は
    、 （ｃ）切断可能なリンカーＬを介し、 その結果、該融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと読み取る以下の式： Ｐ１−−Ｌ−−ＶＣＰ を有する、ポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 植物または植物細胞において発現され得る融合タンパク質を
    コードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、植物細胞または
    植物中で産生される少なくとも２つの目的のポリペプチドまたはペプチド、Ｐ１
    およびＰ２、を含み、ここで、 （ａ）Ｐ１は、切断可能なリンカーＬを介して植物ＶＣＰのＮ末端に連結され、 （ｂ）Ｐ２は、以下： （ｉ）該ＶＣＰのＣ末端でか、または （ｉｉ）該ＶＣＰの配列内の内部にか、または （ｉｉｉ）該ＶＣＰのＮ末端であるが、Ｐ１に対してはＣ末端で、 該ＶＣＰに連結され、 Ｐ２は、該ＶＣＰに連結され、そして必要に応じて、切断可能なリンカーＬに
    よって該Ｐ１に連結され、その結果、該融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ
    と読み取る以下の式： Ｐ１−−Ｌ−−ＶＣＰ−−Ｌ−−Ｐ２、 Ｐ１−−Ｌ−−Ｐ２−−Ｌ−−ＶＣＰ、および、 Ｐ１−−Ｌ−−ＶＣＰ（ａ）−Ｌ−Ｐ２−Ｌ−ＶＣＰ（ｂ）、 からなる群より選択される式を有し、 ここで、ＶＣＰ（ａ）およびＶＣＰ（ｂ）は、該内部に位置するＰ２に隣接する
    該ＶＣＰの２つのフラグメントであり、そしてここで、１つより多いＬが存在す
    る場合、各Ｌは、同じリンカーまたは異なるリンカーであり得る、ポリヌクレオ
    チド。
  3. 【請求項３】 植物または植物細胞において発現され得る融合タンパク質を
    コードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、少なくとも２つ
    の同一かまたは異なる目的のポリペプチドユニットまたはペプチドユニット、Ｐ ｍ 、を含み、ここで、 （ａ）第１Ｐｍ、Ｐｍ１は、切断可能なリンカーＬを介して植物ＶＣＰのＮ末端
    に連結され、 （ｂ）第２Ｐｍ、Ｐｍ２は、Ｐｍ１のＮ末端に、必要に応じて切断可能なリンカ
    ーＬを介して連結され、 （ｃ）必要に応じて、Ｐｍ３、Ｐｍ４、．．．．Ｐｍｎと示される１つ以上のさ
    らなるＰｍユニットは、該Ｐｍユニットに順番にそのＮ末端で、必要に応じて切
    断可能なリンカーを介して連結され、 （ｉ）該Ｐｍ１、Ｐｍ２、．．．．Ｐｍｎのそれぞれは、同じペプチドまたは
    異なるペプチドであり； （ｉｉ）ｎは、３と１００との間であり； （ｉｉｉ）１つより多いＬが存在する場合、各Ｌは、同じリンカーまたは、異
    なるリンカーであり得、 その結果、該融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと読み取る以下の式： Ｐｍ２−Ｌ０−Ｐｍ１−Ｌ−ＶＣＰ、 Ｐｍ３−Ｌ０−Ｐｍ２−Ｌ０−Ｐｍ１−Ｌ−ＶＣＰ、 Ｐｍ４−Ｌ０−Ｐｍ３−Ｌ０−Ｐｍ２−Ｌ０−Ｐｍ１−Ｌ−ＶＣＰ、 および Ｐｍｎ−Ｌ０−．．．−Ｐｍ４−Ｌ０−Ｐｍ３−Ｌ０−Ｐｍ２−Ｌ０−Ｐｍ １ −Ｌ−ＶＣＰ、 からなる群より選択される式を有し、 ここで、Ｌ０は、該リンカーが任意であることを示す、ポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドであ
    って、ここで、Ｌは、メチオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、ア
    ルギニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、およびテ
    トラペプチドイソロイシン−グルタミン酸−グリシン−アルギニンからなる群よ
    り選択される１つ以上のアミノ酸の配列である、ポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 請求項４に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、前記
    Ｌがメチオニンである、ポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドであ
    って、ここで、前記切断可能なリンカーが非酵素的化学薬品によって切断される
    、ポリヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 請求項６に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、前記
    化学薬品が臭化シアンである、ポリヌクレオチド。
  8. 【請求項８】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドであ
    って、ここで、前記切断可能なリンカーが酵素によって切断される、ポリヌクレ
    オチド。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、前記
    酵素が、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
    ｓ ａｕｒｅｕｓ Ｖ８プロテアーゼ、および第Ｘａ因子プロテアーゼからなる
    群より選択される、ポリヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドで
    あって、該ポリヌクレオチドを、植物細胞または植物中で発現可能とするエレメ
    ントを含む、ポリヌクレオチド。
  11. 【請求項１１】 請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド
    であって、ここで、前記ＶＣＰが一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルスのコー
    トタンパク質である、ポリヌクレオチド。
  12. 【請求項１２】 請求項１１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ウイ
    ルスが、タバコモザイクウイルスである、ポリヌクレオチド。
  13. 【請求項１３】 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド
    であって、ここで、前記Ｐ１が、ワクチン組成物において有用な１つ以上のエピ
    トープを含む、ポリヌクレオチド。
  14. 【請求項１４】 請求項１３に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、
    前記エピトープが、以下： ａ．ＭＧＳＤＧＡＶＱＰＤＧＧＱＰＡＶまたはそのフラグメント；および ｂ．ＭＧＱＰＤＧＧＱＰＡＶＲＮＥＲＡＴまたはそのフラグメント、 からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド
    であって、ここで、前記Ｐ１が、１５アミノ酸より長い、ポリヌクレオチド。
  16. 【請求項１６】 請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド
    を含む、組換えウイルス核酸。
  17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の組換えウイルス核酸を含む、組換えウ
    イルス粒子。
  18. 【請求項１８】 請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド
    によってコードされるウイルスコートタンパク質を含む、組換え植物ウイルス。
  19. 【請求項１９】 請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド
    を含む、植物細胞。
  20. 【請求項２０】 請求項１６に記載の組換えウイルス核酸を含む、植物細胞
    。
  21. 【請求項２１】 請求項１７に記載の組換えウイルス粒子を含む、植物細胞
    。
  22. 【請求項２２】 請求項１８に記載の組換え植物ウイルスを含む、植物細胞
    。
  23. 【請求項２３】 前記融合ポリペプチドを発現する、請求項１９〜２２のい
    ずれか１項に記載の植物細胞。
  24. 【請求項２４】 前記Ｐ１ポリペプチドを発現する、請求項１９〜２３のい
    ずれか１項に記載の植物細胞。
  25. 【請求項２５】 請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の植物細胞を含む
    、植物。
  26. 【請求項２６】 目的のポリペプチド、Ｐ１、を産生するための方法であっ
    て、該方法は、以下の工程： （ａ）植物または植物細胞を組換え植物ウイルス核酸と接触させる工程であって
    、該植物ウイルス核酸は、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含
    み、該融合ポリペプチドは、切断可能なリンカーＬを介して植物ウイルスコート
    タンパク質ＶＣＰのＮ末端に連結される目的のポリペプチドＰ１を含む、工程、 （ｂ）該植物または該植物細胞を、該融合ポリペプチドが発現される条件下で、
    増殖させる工程、および （ｃ）該融合タンパク質が該植物もしくは該植物細胞から少なくとも部分的に精
    製もしくは単離された後に、該融合タンパク質を、 （ｉ）該植物もしくは該植物細胞中か、または （ｉｉ）該植物もしくは該植物細胞の外側で、 Ｐ１と該ＶＣＰとを結合する共有結合を切断する切断試薬を用いて、切断し、
    その結果、Ｐ１が該ＶＣＰから分離される、工程； を包含し、これによって、該Ｐ１を産生する、方法。
  27. 【請求項２７】 １つかまたは２つの目的のポリペプチド、Ｐ１およびＰ２
    、を産生するための方法であって、該方法は、以下の工程： （ａ）植物または植物細胞を組換え植物ウイルス核酸と接触させる工程であって
    、該植物ウイルス核酸は、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含
    み、該融合ポリペプチドは、Ｐ１およびＰ２を含み、ここで、 （ｉ）Ｐ１は、切断可能なリンカーＬを介して植物ＶＣＰのＮ末端に連結され
    、 （ｉｉ）Ｐ２は、 （１）該ＶＣＰのＣ末端でか、または （２）該ＶＣＰの配列内の内部で、または、 （３）該ＶＣＰのＮ末端であるが、Ｐ１に対してＣ末端で、該ＶＣＰに連結
    され、 Ｐ２は、ＶＣＰおよび、必要に応じて、該Ｐ１に切断可能なリンカーＬによっ
    て連結され、工程、 （ｂ）該植物または該植物細胞を、該融合ポリペプチドが発現される条件下で増
    殖させる工程、ならびに （ｃ）該融合タンパク質が少なくとも部分的に該植物または該植物細胞から精製
    または単離された後に、該融合タンパク質を、 （ｉ）該植物もしくは該植物細胞中でか、または （ｉｉ）該植物もしくは該植物細胞の外側で、Ｐ１と該ＶＣＰ、Ｐ１とＰ２ま
    たはＰ２と該ＶＣＰとを結合する共有結合を切断する切断試薬を用いて、切断し
    、その結果、Ｐ１および／またはＰ２が該ＶＣＰから単離される、工程； を包含し、これによって該Ｐ１、Ｐ２、またはその両方を産生する、方法。
  28. 【請求項２８】 請求項２６または請求項２７に記載の方法であって、以下
    の工程： （ｄ）前記ＶＣＰから前記Ｐ１、Ｐ２、またはその両方を単離または精製する工
    程、 をさらに包含する、方法。
  29. 【請求項２９】 請求項２６、請求項２７、または請求項２８に記載の方法
    であって、ここで、前記融合ポリペプチドが、前記切断工程の前に、前記植物ま
    たは細胞から精製される、方法。
  30. 【請求項３０】 植物または植物細胞中で発現され得る融合タンパク質をコ
    ードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、以下： （ａ）コード領域であって、該コード領域は、該融合タンパク質をコードし、そ
    して以下： ｉ．一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルス由来の植物ウイルスコートタン
    パク質（ＶＣＰ）、およびそれに融合したもの、 ｉｉ．アミノ酸ＭＧＳＤＧＡＶＱＰＤＧＧＱＰＡＶ（配列番号１）を含むペ
    プチドまたはそのフラグメント、 を含む、コード領域；および （ｂ）該コード領域に対して５’側にある、植物において機能的なプロモーター
    、 を含む、ポリヌクレオチド。
  31. 【請求項３１】 請求項３０に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、
    前記ペプチドが前記植物ウイルスコートタンパク質のＮ末端に融合される、ポリ
    ヌクレオチド。
  32. 【請求項３２】 請求項３０に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、
    前記ペプチドが前記植物ウイルスコートタンパク質のＣ末端に融合される、ポリ
    ヌクレオチド。
  33. 【請求項３３】 請求項３０に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、
    前記融合タンパク質が前記コートタンパク質に関する内部融合タンパク質である
    、ポリヌクレオチド。
  34. 【請求項３４】 請求項３０〜３３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
    ドであって、該ポリヌクレオチドは、以下： （ｃ）一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルス由来の漏出終止コドンを有する融
    合接合部、 をさらに含む、ポリヌクレオチド。
  35. 【請求項３５】 請求項３０に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、
    前記ペプチドＭＧＳＤＧＡＶＱＰＤＧＧＱＰＡＶまたはそのフラグメントが抗原
    性エピトープである、ポリヌクレオチド。
  36. 【請求項３６】 請求項３０〜３５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
    ドであって、ここで、前記コートタンパク質が、タバコモザイクウイルスコート
    タンパク質である、ポリヌクレオチド。
  37. 【請求項３７】 請求項３０〜３５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
    ドであって、ここで、前記コートタンパク質が、タバモウイルスコートタンパク
    質である、ポリヌクレオチド。
  38. 【請求項３８】 請求項３０〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
    ドを含む、組換え植物ウイルスゲノム。
  39. 【請求項３９】 請求項３８に記載のゲノムを含む、組換え植物ウイルス粒
    子。
  40. 【請求項４０】 請求項３０〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
    ドによってコードされるコートタンパク質を有する、組換え植物ウイルス。
  41. 【請求項４１】 請求項３０〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
    ドを含む、植物細胞。
  42. 【請求項４２】 請求項３８に記載の組換え植物ウイルスゲノムを含む、植
    物細胞。
  43. 【請求項４３】 請求項３９に記載の組換え植物ウイルス粒子を含む、植物
    細胞。
  44. 【請求項４４】 請求項４０に記載の組換え植物ウイルスを含む、植物細胞
    。
  45. 【請求項４５】 請求項３０〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
    ドを含む、植物。
  46. 【請求項４６】 請求項３８に記載の組換え植物ウイルスゲノムを含む、植
    物。
  47. 【請求項４７】 請求項３９に記載の組換え植物ウイルス粒子を含む、植物
    。
  48. 【請求項４８】 請求項４０に記載の組換え植物ウイルスを含む、植物。
  49. 【請求項４９】 植物または植物細胞中で発現され得る融合タンパク質をコ
    ードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、以下： （ａ）コード領域であって、該コード領域は、該融合タンパク質をコードし、そ
    して、以下： ｉ．一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルス由来の植物ＶＣＰ、およびそれ
    に融合したもの、 ｉｉ．アミノ酸ＭＧＱＰＤＧＧＱＰＡＶＲＮＥＲＡＴ（配列番号２）を含む
    ペプチドまたはそのフラグメント、 を含む、コード領域；ならびに （ｂ）該コード領域に対して５’側にある、植物において機能的なプロモーター
    、 を含む、ポリヌクレオチド。
  50. 【請求項５０】 請求項４９に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、
    前記ペプチドが、前記植物ウイルスコートタンパク質のＮ末端に融合される、ポ
    リヌクレオチド。
  51. 【請求項５１】 請求項４９に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、
    前記ペプチドが、前記植物ウイルスコートタンパク質のＣ末端に融合される、ポ
    リヌクレオチド。
  52. 【請求項５２】 請求項４９に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、
    前記融合タンパク質が、前記コートタンパク質に関する内部融合タンパク質であ
    る、ポリヌクレオチド。
  53. 【請求項５３】 請求項４９〜５２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
    ドであって、該ポリヌクレオチドが、以下： （ｃ）一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルス由来の漏出終止コドンを有する融
    合接合部、 をさらに含む、ポリヌクレオチド。
  54. 【請求項５４】 請求項４９〜５３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
    ドであって、ここで、前記ペプチドＭＧＱＰＤＧＧＱＰＡＶＲＮＥＲＡＴまたは
    そのフラグメントが、抗原性エピトープである、ポリヌクレオチド。
  55. 【請求項５５】 請求項４９〜５４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
    ドであって、ここで、前記コートタンパク質が、タバコモザイクウイルスコート
    タンパク質である、ポリヌクレオチド。
  56. 【請求項５６】 請求項４９〜５４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
    ドであって、ここで、前記コートタンパク質が、タバモウイルスコートタンパク
    質である、ポリヌクレオチド。
  57. 【請求項５７】 請求項４９〜５６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
    ドを含む組換え植物ウイルスゲノム。
  58. 【請求項５８】 請求項５７に記載のゲノムを含む、組換え植物ウイルス粒
    子。
  59. 【請求項５９】 組換え植物ウイルスであって、ここで、コートタンパク質
    が、請求項４９〜５６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによってコード
    される、組換え植物ウイルス。
  60. 【請求項６０】 請求項４９〜５６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
    ドを含む、植物細胞。
  61. 【請求項６１】 請求項５７に記載の組換え植物ウイルスゲノムを含む、植
    物細胞。
  62. 【請求項６２】 請求項５８に記載の組換え植物ウイルス粒子を含む、植物
    細胞。
  63. 【請求項６３】 請求項５９に記載の組換え植物ウイルスを含む、植物細胞
    。
  64. 【請求項６４】 請求項４９〜５６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
    ドを含む、植物。
  65. 【請求項６５】 請求項５７に記載の組換え植物ウイルスゲノムを含む、植
    物。
  66. 【請求項６６】 請求項５８に記載の組換え植物ウイルス粒子を含む、植物
    。
  67. 【請求項６７】 請求項５９に記載の組換え植物ウイルスを含む、植物。
  68. 【請求項６８】 植物または植物細胞中で産生され得る融合タンパク質を含
    む免疫化学的試薬であって、ここで、該融合タンパク質が、以下： （ｉ）一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルス由来の植物ＶＣＰ；および （ｉｉ）コートタンパク質のＮ末端に融合される、アミノ酸ＭＧＱＰＤＧＧＱＰ
    ＡＶＲＮＥＲＡＴを含むペプチドまたはそのフラグメント、 を含む、免疫化学的試薬。
  69. 【請求項６９】 請求項６８に記載の免疫化学的試薬を含む、パルボウイル
    スに対する、哺乳動物の予防のためのワクチン。
  70. 【請求項７０】 薬学的または獣医学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤
    と共にある、請求項６９に記載のワクチン。
  71. 【請求項７１】 組換え植物ウイルスを含む免疫化学的試薬であって、ここ
    で、少なくとも１つのコートタンパク質のカプシドが、植物または植物細胞中で
    産生され得る融合タンパク質であり、ここで、該融合タンパク質が、以下： （ｉ）一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルス由来の植物ＶＣＰ；および （ｉｉ）該コートタンパク質のＮ末端に融合される、アミノ酸ＭＧＳＤＧＡＶＱ
    ＰＤＧＧＱＰＡＶを含むペプチドまたはそのフラグメント、 を含む、免疫化学的試薬。
  72. 【請求項７２】 請求項７１に記載の免疫化学的試薬を含む、パルボウイル
    スに対する、哺乳動物の予防のためのワクチン。
  73. 【請求項７３】 薬学的または獣医学的に受容可能なキャリアと共にある、
    請求項７２に記載のワクチン。
  74. 【請求項７４】 請求項６９に記載のワクチンであって、ここで、前記融合
    タンパク質が、組換え植物ウイルス中にある、ワクチン。
  75. 【請求項７５】 前記ウイルスが、生きているウイルスである、請求項７４
    に記載のワクチン。
  76. 【請求項７６】 前記組換え植物ウイルスが、生きているウイルスである、
    請求項７２に記載のワクチン。
  77. 【請求項７７】 請求項７５に記載の生きている組換え植物ウイルスおよび
    薬学的または獣医学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む、ワクチン組成
    物。
  78. 【請求項７８】 請求項７６に記載の生きている組換え植物ウイルスおよび
    薬学的または獣医学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む、ワクチン組成
    物。
  79. 【請求項７９】 請求項３０〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
    ドを作製する方法であって、該方法は、配列ＭＧＳＤＧＡＶＱＰＤＧＧＱＰＡＶ
    を有するペプチドをコードするオリゴヌクレオチドまたはそのフラグメントをＶ
    ＣＰ遺伝子に連結する工程を包含する、方法。
  80. 【請求項８０】 組換え植物ウイルスゲノムを作製する方法であって、該方
    法は、以下の工程： （ａ）配列ＭＧＳＤＧＡＶＱＰＤＧＧＱＰＡＶを有するペプチドをコードするオ
    リゴヌクレオチドまたはそのフラグメントを、一本鎖（プラス）センスＲＮＡウ
    イルスのゲノム中に挿入し、その結果、該オリゴヌクレオチドが、植物において
    機能的なプロモーターの制御下で、植物ＶＣＰ遺伝子とインフレームで融合され
    る、工程；または （ｂ）請求項３０〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを該一本鎖（
    プラス）センスＲＮＡウイルスのゲノム中に連結する工程、 を包含し、これによって該組換え植物ウイルスゲノムを作製する、方法。
  81. 【請求項８１】 融合タンパク質をコードする組換え植物ウイルスを作製す
    る方法であって、該融合タンパク質は、一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルス
    由来の植物ＶＣＰおよびアミノ酸ＭＧＳＤＧＡＶＱＰＤＧＧＱＰＡＶを含むペプ
    チドまたはそのフラグメントを含み、該方法は、以下の工程： （ａ）植物または植物細胞中で発現され得る融合タンパク質をコードするＤＮＡ
    を、一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルスのゲノムのＤＮＡコピーに連結する
    工程； （ｂ）該連結されたＤＮＡをＲＮＡに転写する工程；および （ｃ）該転写されたＲＮＡを用いて宿主植物または宿主植物細胞に感染させる工
    程、 を包含し、その結果、該植物または植物細胞が、該組換え植物ウイルスを作製す
    る、方法。
  82. 【請求項８２】 融合タンパク質をコードする組換え植物ウイルスを作製す
    る方法であって、該融合タンパク質は、一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルス
    由来の植物ＶＣＰおよびアミノ酸ＭＧＳＤＧＡＶＱＰＤＧＧＱＰＡＶを含むペプ
    チドまたはそのフラグメントを含み、該方法は、以下の工程： （ａ）植物または植物細胞において発現され得る融合タンパク質をコードするＤ
    ＮＡを、植物において機能的なプロモーターの制御下で、一本鎖（プラス）セン
    スＲＮＡウイルスのゲノムのＤＮＡコピーに連結する工程；および （ｂ）該連結されたＤＮＡを用いて宿主植物または宿主植物細胞を形質転換する
    かまたはトランスフェクトし、その結果、該ＤＮＡが、該植物または植物細胞に
    おいて発現される工程、 を包含し、これによって、該植物または植物細胞が、該組換え植物ウイルスを作
    製する、方法。
  83. 【請求項８３】 融合タンパク質を産生する植物細胞を作製する方法であっ
    て、該融合タンパク質は、一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルス由来の植物Ｖ
    ＣＰおよびアミノ酸ＭＧＳＤＧＡＶＱＰＤＧＧＱＰＡＶを含むペプチドまたはそ
    のフラグメントを含み、該方法が、請求項８０に記載の植物ウイルスゲノムを用
    いて宿主植物細胞を形質転換またはトランスフェクトする工程を包含する、方法
    。
  84. 【請求項８４】 融合タンパク質を産生する植物細胞を作製する方法であっ
    て、該融合タンパク質は、一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルス由来の植物Ｖ
    ＣＰおよびアミノ酸ＭＧＳＤＧＡＶＱＰＤＧＧＱＰＡＶを含むペプチドまたはそ
    のフラグメントを含み、該方法が、請求項８１に記載の植物ウイルスを用いて宿
    主植物細胞を感染させる工程を包含する、方法。
  85. 【請求項８５】 融合タンパク質を産生する植物細胞を作製する方法であっ
    て、該融合タンパク質は、一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルス由来の植物Ｖ
    ＣＰおよびアミノ酸ＭＧＳＤＧＡＶＱＰＤＧＧＱＰＡＶを含むペプチドまたはそ
    のフラグメントを含み、該方法が、請求項８２に記載の植物ウイルスを用いて宿
    主植物細胞を感染させる工程を包含する、方法。
  86. 【請求項８６】 融合タンパク質を産生する植物を作製する方法であって、
    該融合タンパク質は、一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルス由来の植物ＶＣＰ
    およびアミノ酸ＭＧＳＤＧＡＶＱＰＤＧＧＱＰＡＶを含むペプチドまたはそのフ
    ラグメントを含み、該方法が、請求項８０に記載の植物ウイルスゲノムを用いて
    宿主植物を形質転換またはトランスフェクトする工程を包含する、方法。
  87. 【請求項８７】 融合タンパク質を産生する植物を作製する方法であって、
    該融合タンパク質は、一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルス由来の植物ＶＣＰ
    およびアミノ酸ＭＧＳＤＧＡＶＱＰＤＧＧＱＰＡＶを含むペプチドまたはそのフ
    ラグメントを含み、該方法が、請求項８１に記載の植物ウイルスを用いて宿主植
    物を感染させる工程を包含する、方法。
  88. 【請求項８８】 融合タンパク質を産生する植物を作製する方法であって、
    該融合タンパク質は、一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルス由来の植物ＶＣＰ
    およびアミノ酸ＭＧＳＤＧＡＶＱＰＤＧＧＱＰＡＶを含むペプチドまたはそのフ
    ラグメントを含み、該方法が、請求項８２に記載の植物ウイルスを用いて宿主植
    物を感染させる工程を包含する、方法。
  89. 【請求項８９】 請求項４９〜５６のポリヌクレオチドを作製する方法であ
    って、該方法は、配列ＭＧＱＰＤＧＧＱＰＡＶＲＮＥＲＡＴを有するペプチドを
    コードするオリゴヌクレオチドまたはそのフラグメントを、ＶＣＰ遺伝子に連結
    する工程を包含する、方法。
  90. 【請求項９０】 組換え植物ウイルスゲノムを作製する方法であって、該方
    法は、 （ａ）配列ＭＧＱＰＤＧＧＱＰＡＶＲＮＥＲＡＴを有するペプチドをコードする
    オリゴヌクレオチドまたはそのフラグメントを、一本鎖（プラス）センスＲＮＡ
    ウイルスのゲノム中に挿入し、その結果、該オリゴヌクレオチドが、植物におい
    て機能的なプロモーターの制御下で、植物ＶＣＰ遺伝子とインフレームで融合さ
    れる、工程；または （ｂ）一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルスのゲノムに請求項１に記載のポリ
    ヌクレオチドを連結する工程、 を包含し、これによって、該組換え植物ウイルスゲノムを作製する、方法。
  91. 【請求項９１】 組換え植物ウイルスを作製する方法であって、該組換え植
    物ウイルスは、一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルス由来の植物ＶＣＰおよび
    アミノ酸ＭＧＱＰＤＧＧＱＰＡＶＲＮＥＲＡＴを含むペプチドまたはそのフラグ
    メントを含む融合タンパク質をコードし、該方法は、以下の工程： （ａ）植物または植物細胞において発現され得る融合タンパク質をコードするＤ
    ＮＡを、一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルスのゲノムのＤＮＡコピーに連結
    する工程； （ｂ）該連結されたＤＮＡをＲＮＡに転写する工程；および （ｃ）該転写されたＲＮＡを用いて宿主植物または植物細胞に感染させる工程、
    を包含し、その結果、該植物または該植物細胞が該組換え植物ウイルスを作製す
    る、方法。
  92. 【請求項９２】 融合タンパク質をコードする組換え植物ウイルスを作製す
    る方法であって、該融合タンパク質は、一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルス
    由来の植物ＶＣＰおよびアミノ酸ＭＧＱＰＤＧＧＱＰＡＶＲＮＥＲＡＴを含むペ
    プチドまたはそのフラグメントを含み、該方法は、以下の工程： （ａ）植物または植物細胞中で発現され得る融合タンパク質をコードするＤＮＡ
    を、植物において機能的なプロモーターの制御下で、一本鎖（プラス）センスＲ
    ＮＡウイルスのゲノムのＤＮＡコピーに連結する工程；および （ｂ）該連結されたＤＮＡを用いて宿主植物または宿主植物細胞を形質転換また
    はトランスフェクトし、その結果、該ＤＮＡが該植物または該植物細胞において
    発現される、工程、 を包含し、 これによって、該植物または該植物細胞が該組換え植物ウイルスを作製する、方
    法。
  93. 【請求項９３】 融合タンパク質を産生する植物細胞を作製する方法であっ
    て、該融合タンパク質は、一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルス由来の植物Ｖ
    ＣＰおよびアミノ酸ＭＧＱＰＤＧＧＱＰＡＶＲＮＥＲＡＴを含むペプチドまたは
    そのフラグメントを含み、該方法は、請求項９０に記載の植物ウイルスゲノムを
    用いて宿主植物細胞を形質転換またはトランスフェクトする工程、を包含する、
    方法。
  94. 【請求項９４】 融合タンパク質を産生する植物細胞を作製する方法であっ
    て、該融合タンパク質は、一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルス由来の植物Ｖ
    ＣＰおよびアミノ酸ＭＧＱＰＤＧＧＱＰＡＶＲＮＥＲＡＴを含むペプチドまたは
    そのフラグメントを含み、該方法は、請求項９１に記載の植物ウイルスを用いて
    宿主植物細胞を感染させる工程を包含する、方法。
  95. 【請求項９５】 融合タンパク質を産生する植物細胞を作製する方法であっ
    て、該融合タンパク質は、一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルス由来の植物Ｖ
    ＣＰおよびアミノ酸ＭＧＱＰＤＧＧＱＰＡＶＲＮＥＲＡＴを含むペプチドまたは
    そのフラグメントを含み、該方法は、請求項９２に記載の植物ウイルスを用いて
    宿主植物細胞を感染させる工程を包含する、方法。
  96. 【請求項９６】 融合タンパク質を産生する植物を作製する方法であって、
    該融合タンパク質は、一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルス由来の植物ＶＣＰ
    およびアミノ酸ＭＧＱＰＤＧＧＱＰＡＶＲＮＥＲＡＴを含むペプチドまたはその
    フラグメントを含み、該方法は、請求項９０に記載の植物ウイルスゲノムを用い
    て宿主植物を形質転換またはトランスフェクトする工程を包含する、方法。
  97. 【請求項９７】 融合タンパク質を産生する植物を作製する方法であって、
    該融合タンパク質は、一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルス由来の植物ＶＣＰ
    およびアミノ酸ＭＧＱＰＤＧＧＱＰＡＶＲＮＥＲＡＴを含むペプチドまたはその
    フラグメントを含み、該方法は、請求項９１に記載の植物ウイルスを用いて宿主
    植物を感染させる工程を包含する、方法。
  98. 【請求項９８】 融合タンパク質を産生する植物を作製する方法であって、
    該融合タンパク質は、一本鎖（プラス）センスＲＮＡウイルス由来の植物ＶＣＰ
    およびアミノ酸ＭＧＱＰＤＧＧＱＰＡＶＲＮＥＲＡＴを含むペプチドまたはその
    フラグメントを含み、該方法は、請求項９２に記載の植物ウイルスを用いて宿主
    植物を感染させる工程を包含する、方法。
  99. 【請求項９９】 ウイルスを単離する方法であって、以下： （ａ）Ｎａ２Ｓ２Ｏ５中でウイルス含有植物組織をホモジナイズする工程； （ｂ）該ホモジネートを濾してグリーンジュースを得る工程； （ｃ）酸を用いて、該グリーンジュースのｐＨを５．０まで調整する工程； （ｄ）約５分間、約４７℃まで該グリーンジュースを加熱し、次いで約５℃まで
    冷却する工程； （ｅ）約３分間、約６０００×ｇで該グリーンジュースを遠心分離して、上清お
    よびペレットを得る工程； （ｆ）ポリエチレングリコールおよびＮａＣｌ中で該上清を沈澱させて、沈澱物
    を得る工程； （ｇ）１ｍｌあたり約１ｍｇの濃度で該沈澱物を水中に再懸濁する工程； （ｈ）クロロホルムおよびブタノール中で該沈澱物を抽出し、該抽出物を遠心分
    離する工程； （ｉ）該遠心分離された材料の水相を回収して凍結乾燥する工程； （ｊ）水１ｍｌあたり約５〜約１０ｍｇの濃度で、該凍結乾燥した材料を再懸濁
    する工程、 を包含する、方法。
  100. 【請求項１００】 ウイルスを単離する方法であって、該方法は、以下の工
    程： （ａ）緩衝液中でウイルス含有植物材料を粉砕してホモジネートを得る工程； （ｂ）該ホモジネートを濾してグリーンジュースを得、そしてそれにポリエチレ
    ンイミンを約０．１％（ｖ／ｖ）の濃度まで添加する工程； （ｃ）約３０分間、約４℃で撹拌し、次いで、約５分間、約３０００×ｇで遠心
    分離して、上清を得る工程； （ｄ）ポリエチレングリコールおよびＮａＣｌ中で該上清を沈澱させて、沈澱物
    を得る工程； （ｅ）１ｍｌあたり約１ｍｇの濃度で、該沈澱物を水に再懸濁する工程； （ｆ）クロロホルムおよびブタノール中で、該再懸濁した材料を抽出し、そして
    該抽出した材料を遠心分離する工程； （ｇ）水相を回収して凍結乾燥する工程；および （ｈ）水１ｍｌあたり約５〜約１０ｍｇの濃度で、該凍結乾燥した材料を再懸濁
    する工程、 を包含する、方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6037456A (en) * 1998-03-10 2000-03-14 Biosource Technologies, Inc. Process for isolating and purifying viruses, soluble proteins and peptides from plant sources
ITRM20010332A1 (it) * 2001-06-11 2002-12-11 Ist Superiore Sanita Vaccini a subunita' e procedimenti per la loro produzione.
US20040170606A1 (en) * 2002-06-07 2004-09-02 Palmer Kenneth E. Production of peptides in plants as viral coat protein fusions
US20040033585A1 (en) 2002-06-07 2004-02-19 Mccormick Alison A. Flexible vaccine assembly and vaccine delivery platform
US8101189B2 (en) 2002-07-05 2012-01-24 Folia Biotech Inc. Vaccines and immunopotentiating compositions and methods for making and using them
DK1523329T3 (da) 2002-07-05 2013-10-14 Folia Biotech Inc Viruspartikeladjuvant
CA2497798A1 (en) * 2002-09-03 2004-04-22 Large Scale Biology Corporation Production of peptides in plants as viral coat protein fusions
EP1699820A2 (en) * 2003-12-31 2006-09-13 Schering-Plough Ltd. Neutralizing epitope-based growth enhancing vaccine
CN1926238A (zh) * 2004-02-27 2007-03-07 陶氏化学公司 植物细胞中的高效肽生产
EP1732615A4 (en) * 2004-03-25 2009-09-16 Kentucky Bioproc Llc PRODUCTION OF PEPTIDES IN PLANTS IN THE FORM OF FUSION OF VIRAL ENVELOPE PROTEINS
TW200634156A (en) * 2004-12-30 2006-10-01 Schering Plough Ltd Neutralizing epitope-based growth enhancing vaccine
WO2007038145A2 (en) * 2005-09-08 2007-04-05 Large Scale Biology Corporation Modified tobacco mosaic virus particles as scaffolds for display of protein antigens for vaccine applications
US8052971B2 (en) * 2005-11-21 2011-11-08 MG Biologics Oral use of specific antibodies for intestinal health
WO2007149534A2 (en) * 2006-06-21 2007-12-27 University Of Dayton Methods of polarization engineering and their applications
EP2078086A4 (en) 2006-11-15 2010-06-30 Folia Biotech Inc PAPAYAMOSAIC VIRUS-BASED IMMUNOGENE AFFINITY-CONJUGATED ANTIGENSYSTEMS AND THEIR USES
WO2008094512A2 (en) * 2007-01-29 2008-08-07 The Ohio Sate University Research Foundation System for expression of genes in plants from a virus-based expression vector
CN102634511B (zh) * 2012-04-13 2013-03-13 淮阴师范学院 成熟油菜次生休眠种子rna的提取方法
US11285204B2 (en) 2017-09-22 2022-03-29 The Government Of The United States, As Represen Tobamovirus-based virus-like particles and vaccines

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09296000A (ja) * 1996-03-04 1997-11-18 Suntory Ltd プロセッシング酵素を用いたキメラタンパク質の切断方法
WO1997049425A1 (en) * 1996-06-25 1997-12-31 Stichting Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid Vaccine comprising antigens bound to carriers through labile bonds
WO1999058662A1 (fr) * 1998-05-14 1999-11-18 Merck Patent Gmbh Proteine fusionnee
JPH11341991A (ja) * 1998-03-31 1999-12-14 Itoham Foods Inc 新規な融合蛋白質をコ―ドするｄｎａおよびその発現を介する有用ポリペプチドの製造方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4921802A (en) 1983-05-05 1990-05-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant virus cDNA
US5977438A (en) 1988-02-26 1999-11-02 Biosource Technologies, Inc. Production of peptides in plants as viral coat protein fusions
FR2633518B1 (fr) * 1988-06-30 1991-03-22 Merieux Inst Procede de stabilisation des vaccins et associations de vaccins a virus attenues conserves sous forme lyophilisee, et compositions obtenues
DK0647655T3 (da) * 1993-01-23 1999-08-23 Inmunologia & Genetica Aplic Syntetiske peptider og vacciner mod parvovirus
US5622822A (en) 1994-09-13 1997-04-22 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Methods for capture and selective release of nucleic acids using polyethyleneimine and an anionic phosphate ester surfactant and amplification of same
GB9607899D0 (en) 1996-04-17 1996-06-19 Scottish Crop Research Inst Virus-like particle
US6042832A (en) * 1996-08-28 2000-03-28 Thomas Jefferson University Polypeptides fused with alfalfa mosaic virus or ilarvirus capsid proteins
US6037456A (en) * 1998-03-10 2000-03-14 Biosource Technologies, Inc. Process for isolating and purifying viruses, soluble proteins and peptides from plant sources

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09296000A (ja) * 1996-03-04 1997-11-18 Suntory Ltd プロセッシング酵素を用いたキメラタンパク質の切断方法
WO1997049425A1 (en) * 1996-06-25 1997-12-31 Stichting Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid Vaccine comprising antigens bound to carriers through labile bonds
JPH11341991A (ja) * 1998-03-31 1999-12-14 Itoham Foods Inc 新規な融合蛋白質をコ―ドするｄｎａおよびその発現を介する有用ポリペプチドの製造方法
WO1999058662A1 (fr) * 1998-05-14 1999-11-18 Merck Patent Gmbh Proteine fusionnee

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