LV14204B - Heterologas proteīnu sekvences eksponējošu kartupeļu vīrusam PVY līdzīgo daļiņu iegūšana un izmantošana - Google Patents

Description

Norāde uz tehnikas nozari

Izgudrojums attiecas uz molekulāro bioloģiju, biotehnoloģiju, kā ari uz vakcīnu, gēnu terapijas, diagnostikas līdzekļu komponentu un jaunu nanomateriālu iegūšanu. Tā pamatā ir polipeptīdu subvieriību pašsavākšanās procesu rezultātā izveidotas regulāras, organizētas nanometru izmēru struktūras, kuras satur mākslīgi pievienotas proteīnu sekvences ar imūnstimulējošām īpašībām..

Tehnikas līmeņa analīze

Vīrusiem līdzīgās daļiņas (VLP) ir neinfekciozas multisubvierūbu proteīnu struktūras, kas ir identiskas vai strukturāli analoģiskas attiecīgajiem vīrusiem. Sakarā ar to, ka attiecīgās VLP ir strukturāli identiski vai ari ļoti līdzīgas attiecīgo slimību izraisītājiem vīrusiem, tās ir plaši pazīstamas kā vakcīnu kandidāti [1], Dažas no tām - hepatīta B un cilvēka papilomas VLP jau tiek izmantotas komerciālajā medicīnas praksē kā vakcīnas pret hepatītu B un dzemdes kakla ļaundabīgo audzēju izraisītāju - papilomas vīrusu. VLP efektivitāte imūnatbildes stimulēšanā ir labi zināma no patogēno vīrusu imunoloģiskajiem pētījumiem. Strukturāli stingri sakārtoti un daudzkārtīgi atkārtoti aminoskābju sekvenču motīvi uz vīrusu apvalka proteīnu virsmas, t.s. epitopi, ir noteicošie faktori imunsistēmas B-šūnu aktivēšanai un kalpo kā signāls imūnsistēmai, kad organismā ir nonācis svešas izcelsmes aģents [2]. Bez tam VLP izmēri (pārsvarā zem 50 nm diametrā) ir piemēroti nokļūšanai antigēn-prezentējošās šūnās (piem., B šūnās, dendritiskajās šūnās), kur notiek VLP sašķelšana ar sekojošu imunsistēmas T-šūnu aktivāciju [3], Tādējādi, VLP izsauc efektīvu humorālo un šūnu imūnatbildi, pat bez plaši pielietoto adjuvantu klātbūtnes [4]·

Augu vīrusi neizraisa zīdītāju organismu saslimšanu. Tādēļ tos nav nepieciešams izmantot kā vakcīnas. Tomēr augu vīrusi, bet labāk to VLP var tikt izmantotas kā epitopu nesējas, kuras eksponē patogēniem raksturigus epitopus uz savu strukturālo proteīnu virsmas. Jēdziens „epitops” tiek definēts kā īsākā aminoskābju (AS) sekvence, kura spējīga piesaistīt tam specifisko antivielu molekulas; epitopi var būt kā lineāri, tā ari konformacionāli [lļ.Lineārie epitopi ir īsas aminoskābju sekvences (garumā no 4 līdz 10 aminoskābēm), kuru aktivitāti neietekmē to telpiskā struktūra. KonformaCionālie epitopi veidojas no polipeptīdu ķēdes attālinātiem reģioniem, tiem izveidojot noteiktu telpisko struktūru.

Ideja par patogēniem raksturigo epitopu izmantošanu imunizācijā ir zināma jau vairāk kā 20 gadus. Ir zināms, ka zemmolekulārās vielas, tajā skaitā īsas aminoskābju sekvences (peptīdi), bieži izraisa vājas imūnatbildes. Tāpēc epitopus piesaista pie proteīnu-nesēju molekulām, kas izraisa paaugstinātas imūnatbildes zīdītāju organismos [5]. Attīstoties gēnu inženierijai un augu virusoloģijai, parādījās ideja, ka ari augu vīrusi var tikt izmantoti kā svešu epitopu nesēji. Tā,

-2 klonējot poliovīrusam raksturīgo peptīdu kodējošās DNS sekvences tabakas mozaīkas vīrusa (TMV) virsmas proteīna gēna cDNS kopijā, un ekspresējot šos rekombinantos gēnus Escherichia coli, tika iegūts vakcīnas kandidāts. Uz TMV virsmas lokalizētie poliovīrusa epitopi izraisīja poliovīrusu neitralizējošas antivielas pēc injekcijas laboratorijas žurkās [6], Līdzīga stratēģija tikusi demonstrēta ari vairāku citu augu vīrusu gadījumos, piem., Cowpea mosaic vīrus, Tomato bushy stunt virus, Cucumber mosaic virus, Potato vīrus X, Johnsongrass mosaic vīrus, Papaya mosaic virus [7]. Attiecīgo vakcīnu kandidātu iegūšanai ir tikuši izmantoti dažādi saimniekorganismi, piem., ar rekombinantiem vīrusiem inficēti augi, ar modificētiem bakulovīrusiem inficētas insektu šūnas, dažādi raugi un baktērijas, pirmām kārtām, Ecoli. Kartupeļu vīruss PVY pieder pie Potyvirus vīrusu grupas, kas ir viena no lielākajām augu vīrusu grupām; tajā ietilpst apmēram 30% no visiem zināmajiem augu vīrusiem [8] Genbank nukleotīdu sekvenču datubāzē atrodamas vairāk nekā 4000 dažādu Potyvirus pārstāvju sekvences [9] Morfoloģiski PVY virioni ir elastīgas, 730 nm garas pavedienveida struktūras ar 11 nm diametru (filamenti). To vienpavediena RNS sastāv no apmēram 9700 nukleotīdiem, kas kodē vairāk nekā 3000 aminoskābju garu poliproteīnu. Tas tiek sašķelts funkcionālos proteīnos ar tris vīrusa kodētu proteāžu palīdzību. Ari vienīgais strukturālais proteīns - vīrusa virsmas proteīns (CP - „coat protein”) tiek izšķelts no poliproteīna, tāpēc tā N-galā nav metionīna [10].

Līdzīgi kā daudziem pavedienveida vīrusiem, Potyvirus, tajā skaitā PVY, kristālu struktūra nav zināma. Tas apgrūtina to izmantošanu kā svešu epitopu un citu aminoskābju sekvenču nesējus, jo nav iespējams noteikt uz vīrusu virsmas lokalizētos reģionus un paredzēt, vai ievietotās sekvences atradīsies uz VLP virsmas un kā Šo sekvenču ievietošana vīrusa virsmas proteīna struktūrā ietekmēs VLP veidošanos. Tomēr filamentiem vīrusiem ir iespējams izveidot struktūras modeļus, kas ir balstīti uz imunoloģisku un bioķīmisku eksperimentu rezultātiem [11]. Jāatzīmē, ka filamentiem vīrusiem virsmas proteīnu N- un/vai C-gali nereti ir lokalizēti uz daļiņu virsmas, kas ļauj epitopus ievietot virsmas proteīnu N- vai C-galos. Tādos gadījumos gan ir nepieciešams empīriski pārbaudīt VLP veidošanos.

Ir zināmi vairāki piemēri, kad filamento augu VLP no E.coli ekspresijas sistēmām ir izmantotas kā medicīniski nozīmīgu epitopu nesēji ar augstu imunoloģisko aktivitāti. Papaya mosaic virus (PapMV - Potexvirus grupa) VLP ar virsmas proteīna C-galā ievietotiem hepatīta C E2 epitopiem, kuras tika iegūtas no E.coli ekspresijas sistēmas, pēc izmantošanas imunizācijā inducēja ilgstošu humorālo anti-E2 imūnatbildi eksperimentālo dzīvnieku organismos. Interesanti, ka imūnatbilde tika novērota tikai tādā gadījumā, kad imunizācijā tika izmantotas E2CP filamentās daļiņas. E2-CP monomērs izrādījās vājš imunogēns [12], Tādējādi, šie eksperimenti parāda epitopu multimerizācijas nozīmi efektīvas imūnatbildes izraisīšanā. Jāatzīmē, ka filamentās augu vīrusu daļiņas var tikt izmantotas arī kā antivielu veidošanos

-3 stimulējoši aģenti - adjuvanti [13] Arī Potyvirus grupas pārstāvja JGMV (Johnsongrass mosaic vīrus) VLP ar encefalīta vīrusa epitopu, kas pievienots CP C-galā, spēja izraisīt vīrusu neitralizējošu efektu imunizētajās pelēs [14], Arī citu filamento augu vīrusu virsmas proteīnu Cgala sekvence ir izmantota svešu epitopu prezentācijai uz VLP virsmas, piem; Tobamovirus grupas vīrusi TMV [15] un CGMMV [16], kā aiī pie Potyvirus piederošais PVA [17], Jāatzīmē, ka pēdējie piemēri attiecas uz rekombinantu VLP iegūšanu no visai komplicētām augu ekspresijas sistēmām, un VLP šajos gadījumos satur infekciozas vīrusu nukleīnskābes, kas sarežģī to tālāko izmantošanu ražošanā un medicīnas praksē.

Mazāk ir zināmi gadījumi, kad svešu polipeptīdu sekvences ir ievietotas filamento vīrusu CP Ν’galos. Jau pieminētā infekciozu vīrusu un augu saimniekorganismu sistēma izmantota, lai Poiexvirus PVX CP N-galā ievietotu īsus epitopus (6 aminoskābes) un panāktu relatīvi augstas imūnatbildes pret epitopu laboratorijas dzīvniekos [18], Ari jau pieminētā JGMV gadījumā virsmas proteīna N-gala 65 aminoskābes var tikt aizvietotas ar svešu proteīnu sekvencēm, netraucējot VLP veidošanos rekombinantu E.coli šūnās [19]. Tomēr šajā izgudrojumā nav datu par šādu VLP imunoloģiskajām īpašībām, kaut gan autori ir norādījuši uz šādi iegūtu VLP potenciālo pielietojumu kā vakcīnas. Šī darba autori ari apgalvoja, ka līdzīgā veidā iespējams daļēji vai pilnīgi aizvietot gan N-, gan C-gala aminoskābes visu Potyvirus virsmas proteīnu struktūrās, netraucējot VLP veidošanos. Pretrunā ar šiem datiem, N- un C-gala aminoskābju būtisko nozīmi Potpvirus VLP veidošanā raksturo cita Potyvirus grupas vīrusa PVBV (Pepper vein banding vīrus) virionu veidošanās mehānisma modelis. Saskaņā ar šo modeli, virionu veidošanās sākas ar CP N- un C-gala pozitīvi un negatīvi lādēto aminoskābju mijiedarbību, izveidojot gredzenveida struktūras, kuras tālāk izveido vīrusu filamentus. Izveidojot PVBV CP N- vai C-termināli saīsinātus klonus, VLP veidošanās E.coli šūnās ir traucēta [20], Tādējādi, apgalvojums, ka visu Poiyvirus grupas vīrusu virsmas proteīniem ir iespējams aizvietot gan N-, gan C-galu aminoskābes, nav pareizs.

Ja imunogēna virsmas struktūra ir vienveidīga, bez konformacionāliem variantiem, tad imunizāciju eksperimentos ar laboratorijas dzīvniekiem var tikt iegūtas augstas imūnatbildes pret piesaistītiem peptīdiem [21]., Tas attiecas kā uz ķīmiski piesaistītiem, tā ari uz rekombinantiem epitopiem, kas ir piesaistīti pie vīrusu vai VLP virsmas. Gadījumā, ja nepieciešams iegūt antivielas pret patogēnam raksturīgā proteīna N-gala epitopiem, tad ari šo epitopu prezentāciju ir nepieciešams nodrošināt nesējproteīna N-galā, jo, ievietojot šos epitopus iekšējos vai C-gala rajonos var tikt izmainīta epitopu konformācija. Tādu imunogēnu izmantošanas rezultātā iegūtās antivielas var neatpazīt attiecīgo patogēnam raksturīgo epitopu, un vakcīna būs neefektīva, t.i. nenodrošinās aizsardzību pret attiecīgo saslimšanu. Tā, ievietojot cilvēka imūndeficīta vīrusa HIV epitopu nesējproteīna struktūrā vairākās vietās, tika iegūtas dažāda līmeņa imūnatbildes,

-4tomēr neviena varianta antivielas nespēja neitralizēt HIV vīrusu. Tas liecina, ka nesējproteīna struktūrā ievietotā epitopa konformācija neatbilda tai, kāda tā ir HIV vīrusa sastāvā [22], Tādējādi, ir skaidri redzams, ka, neraugoties uz zināmajiem piemēriem, joprojām pastāv tehnoloģiska nepieciešamība pēc alternatīviem, uz VLP balstītiem polipeptīdu nesējiem, kuri var tikt iegūti no vienkāršām bakteriālām ekspresijas sistēmām un kuri, nonākot zīdītāju organismos, spēj izraisīt efektīvas imūnatbildes pret mākslīgi ievadītām aminoskābju sekvencēm.

Attēlu apraksti

1. att. Izgudrojumā aprakstītā PVY virsmas proteīna gēna cDNS nukleotīdu sekvences (PVY_CP) salīdzinājums ar publicētā tuvākā izolāta SASA-61 sekvenci (Genbank AJ5 8 5198).

2. att. Izgudrojumā aprakstītā PVY virsmas proteīna aminoskābju sekvences (PVY_CP) salīdzinājums ar publicētā tuvākā izolāta SASA-61 sekvenci (Genbank AJ585198).

3. att. Ekspresijas plazmīda, kas satur aprakstīto PVY virsmas proteīna gēnu. PVY-CP gēns iegūts ar RT-PCR palīdzību no inficētiem kartupeļu meristēmu augiem, klonēts E.coli ekspresijas vektorā pET-28a+ (Novagen). Norādīta PVY-CP gēna, T7 promotera (T7 prom), kanamicīna rezistences gēna (KmR) lokalizācija, kā arī daži nozīmīgākie restriktāžu šķelšanas saiti.

4. att. PVY-CP iegūšanas un attīrīšanas analīze SDS-poliakrilamīda gēlā.

M - proteīnu marķieris, T - kopējie proteīni, S - šķīstošie proteīni, P - nešķīstošie proteīni, Gs neizgulsnētie proteīni pēc PEG8000 izgulsnēšanās, Gp — PEG8000 nogulsnētie proteīni, Ss PEG 8000 frakcijas šķīstošie proteīni, Sp- PEG 8000 frakcijas nešķīstošie proteīni, 1-6 saharozes gradienta frakcijas.

5. att. pET-28a+ E.coli ekspresijas plazmīdas fragments, kas satur aprakstīto 5’-termināli saīsinātu PVY virsmas proteīna gēnu. Zem fragmenta attēlota N-teimināli saīsinātā PVY-CP proteīna aminoskābju sekvence, proteīna pirmās četras aminoskābes iezīmētas ar treknu druku.

6. att. ρΈ,Ί-2&a+ E.coli ekspresijas plazmīdas fragments, kas satur aprakstīto PVY virsmas proteīna gēnu ar glicīna-serina atkārtojumu cDNS gēna 5’ galā. Zem fragmenta attēlota PVY-CP proteīna aminoskābju sekvence, proteīna N-galā pievienotās aminoskābes iezīmētas ar treknu druku un pasvītrotas.

7. att. pET-28a+ E.coli ekspresijas plazmīdas fragments, kas satur aprakstīto PVY virsmas proteīna gēnu ar glicīna-seffna atkārtojumu cDNS gēna 3’ galā. Zem fragmenta attēlota PVY-CP proteīna aminoskābju sekvence, proteīna C-galā pievienotās aminoskābes iezīmētas ar treknu druku un pasvītrotas.

8. att. pET-28a+ E.coli ekspresijas plazmīdas fragments, kas satur aprakstīto PV Y virsmas proteīna gēnu ar glicīna-serīna atkārtojuma un hepatīta B preSl epitopa sekvences cDNS gēna 5’

-Γgalā. Zem fragmenta attēlota PVY-CP proteīna aminoskābju sekvence, proteīna N-galā pievienotās aminoskābes iezīmētas ar treknu druku, preSl aminoskābes attēlotas kursīvā.

9. att. pET-28a+£.co/i ekspresijas plazmīdas fragments, kas satur aprakstīto PVY virsmas proteīna gēnu ar glicīna-serīna atkārtojuma un rubredoksīna (RBX) sekvences cDNS gēna 5’ galā. Zem fragmenta attēlota PVY-CP proteīna aminoskābju sekvence, proteīna N-galā pievienotās aminoskābes iezīmētas ar treknu druku, RBX aminoskābes attēlotas kursīvā.

10. att. Kartupeļu vīrusam PVY līdzīgās daļiņas (VLP), kas iegūtas no rekombinantu E.coli pETPVY-CP šūnām. Labajā apakšējā stūri iezīmētā mēroga līnija atbilst 200 nm.

11. att. Kartupeļu vīrusam PVY līdzīgās daļiņas (VLP), kas iegūtas no rekombinantu E.coli pETPVY-CP-DVN šūnām. Labajā apakšējā stūri iezīmētā mēroga līnija atbilst 100 nm.

12. att. Kartupeļu vīrusam PVY līdzīgās daļiņas (VLP), kas iegūtas no rekombinantu E.coli pETPVY-CP-NG4S šūnām. Labajā apakšējā stūri iezīmētā mēroga līnija atbilst 200 nm.

13. att. Kartupeļu vīrusam PVY līdzīgās daļiņas (VLP), kas iegūtas no rekombinantu E.coli pETPVY-CP-CG4S šūnām. Labajā apakšējā stūri iezīmētā mēroga līnija atbilst 100 nm.

14. att. Kartupeļu vīrusam PVY līdzīgās daļiņas (VLP), kas iegūtas no rekombinantu E.coli pETPVY-CP-NG4S-preSī šūnām. Labajā apakšējā stūri iezīmētā mēroga līnija atbilst 200 nm.

15. att. Kartupeļu vīrusam PVY līdzīgās daļiņas (VLP), kas iegūtas no rekombinantu E.coli pETPVY-CP-NRBX Šūnām. Labajā apakšējā stūri iezīmētā mēroga līnija atbilst 200 mn.

16. att. PVY un PVY-CP-NG4S-preSl (PVY-preSl) reakcijas ar monoklonālajām antivielām MA18/7 konkurentās ELISA testā. Palielinoties ar preSl epitopu modificētu PVY VLP koncentrācijai, antivielu piesaistīšanās pie mikrotitru plates imobilizētā preSl pepffda samazinās.

17. att. Peļu imunizāciju ar PVV-CP (grupa 1) unPVY-CP-NG4S-preSl (grupa 2) vīrusiem līdzīgajām daļiņām. Peles tika imunizētas ar 0,05 mg antigēna bez adjuvanta PBS buferšķīdumā (grupa A) vai ar adjuvantu (CFA/EF A - grupa B) 0,14 un 28 dienā. Antivielu titri noteikti 42 dienā pēc imunizācijas.

Izgudrojuma apraksts

Šis izgudrojums parāda, ka no inficētiem kartupeļu augiem iegūta PVY vīrusa RNS virsmas proteīna (CP) gēna cDNS kopija (SEQID NO: 2), ja to ievietoE.coli ekspresijas plazmīdā (vektorā), ir spējīga izraisīt virsmas proteīna sintēzi ar augstu iznākumu baktēriju kultūrās. Kā ekspresijas vektors var tikt izmantots šeit pieminētais pĒT-28a+ vektors, kas satur T7 promotera sekvenci, ribosomu saistīšanās saitu, antibiotiķa (kanamictna) rezistences gēnu un ekspresiju regulējošo Lāci gēnu. Tādā gadījumā nepieciešams izmantot tādus rekombinantus T7 polimerāzes gēnu saturošus Ecoli celmus, kā BL21(DE3), C2566, C3010 vai ari citus, kas nodrošina aktīvu mērķproteīna sintēzi no T7 promotera pie dažādām kultivēšanas temperatūrām.

-6Principā ir iespējams izmantot ari citus vektorus un baktēriju celmus. Tos ir iespējams pārbaudīt līdzīgā veidā, kā aprakstīts 1. piemērā.

Baktēriju šūnās CP molekulas (SEQID NO: 1) sintēzes procesa laikā spontāni izveido vīrusiem līdzīgas daļiņas (VLP), kuras morfoloģiski ir līdzīgas natīvajiem PVY virioniem, kā to parāda elektronmikroskopijas analīžu rezultāti. Izgudrojums demonstrē paņēmienus, kā, izmantojot piemērotas E.coli saimniekšunas un ekspresijas vektorus, iegūt PVY vīrusiem līdzīgās daļiņas (VLP). Šo VLP sastāvā ar gēnu inženierijas metodēm var tikt ievadītas polipeptīdu sekvences, netraucējot VLP autopolimerizācijas procesam baktēriju šūnās, kā tas ir aprakstīts 2. piemērā.

Šie polipeptīdi var būt visdažādākās izcelsmes aminoskābju sekvences, kā dažādu slimību izraisītājiem raksturīgie antigēni - tādi kā hepatīta B preSl epitops (SEQ ĪD NO: 14) vai citi dabīgi proteīnu domēni vai pat veseli proteīni, piem., rubredoksīns (SEQ ID NO: 19), kā ari mākslīgi izveidotas sekvences atkarībā no to plānotā izmantošanas veida. Mūsu eksperimentāli iegūtie dati liecina, ka kartupeļu vīrusa PVY virsmas proteīna N-galā var tikt ievietotas papildus aminoskābju sekvences tā, lai netraucētu VLP veidošanos beterologu saimnieku, it īpaši rekombinantu Ecoli šūnās. N-termināli saīsinātu un C-termināli pagarinātu PVY virsmas proteīnu gadījumos VLP veidošanās ir traucēta. Arto PVY atšķiras no agrāk publicētajiem Potyvirus grupas vīrusu VLP, piem., JGMV, kura CP polimerizācija iespējama ari N- vai C-gala saīsinātu proteīnu gadījumos.

Fakts, ka iegūtās rekombinantās, svešus polipeptīdus saturošās VLP uzrāda augstu morfoloģisko līdzību ar natīvajiem vīrusiem, norāda uz iespēju, ka šie polipeptīdi izkārtoti VLP struktūrā regulāri organizētā veidā. PVY VLP gadījumā tas nodrošina vienmērīgu, regulāru polipeptīda izvietojumu uz pavedienveidīgās VLP virsmas. Šādi regulāri uz nesēja virsmas izvietoti epitopi vai proteīnu domēni ir nepieciešami kvalitatīvu antivielu iegūšanai imunizācijas procesā.

Bez tam, izgudrojums demonstrē ari efektīvu rekombinantu VLP attīrīšanas metodi, izmantojot vienkāršu pārgulsnēšanu un sekojošu vairākkārtēju frakcionēšanu ar ultracentrifugēšanas palīdzību.

Efektīva vīrusiem līdzīgo daļiņu veidošanās E.coli šūnās un VLP ar eksponētām heterologu proteīnu sekvencēm, it īpaši līdz 71 aminoskābēm CP N-galā kartupeļu vīrusa PVY gadījumā patentu un cita veida literatūrā nav atrasti. Tāpat nav aprakstīti antivielu iegūšanas paņēmieni, izmantojot PVY VLP ar eksponētām heterologu proteīnu sekvencēm.

Laboratorijas dzīvnieku imunizācija ar PVY VLP, kas satur slimību izraisītāju epitopus un kuru iegūšana ir aprakstīta šajā izgudrojumā, inducē spēcīgu imūnatbildi pret uz VLP izvietotiem» epitopiem. Tādēļ izgudrojumā aprakstītās VLP var tikt izmantotas kā imūnatbildi stimulējoši aģenti, ja tās ievada zīdītāju organismos. Kā parādīts 3.piemērā, augstas imūnatbildes var tikt sasniegtas ari bez papildus stimulējošiem aģentiem - adjuvantiem, un imunizācijas var tikt

-7veiktas, VLP izšķīdinot zīdītāju organismiem neitrālos, netoksiskos šķīdumos. Tādējādi šīs rekombinantās VLP var tikt izmantotas kā profilaktiskas vakcīnas pret attiecīgajiem slimību izraisītajiem.

Cits pielietojuma aspekts saistās ar izgudrojumā aprakstīto antivielu iegūšanas paņēmienu. Ar PVY rekombinanto VLP palīdzību iegūtās antivielas var tikt izmantotas kā slimību ārstēšanā un

V profilaksē, tā ari attiecīgo saslimšanu diagnosticēšanā. Šādi iegūtas antivielas var tikt izmantotas kā pamatkomponente diagnostikas reaģentu komplektos (kitos).

Kā tas ir saprotams tehnikas līmeņa speciālistiem, šis izgudrojums balstās uz tādām rekombinantu nukleīnskābju tehnoloģijām kā DNS un RNS attīrīšana no dažādu organismu šūnām, polimerāzes ķēdes un citām enzimātiskām reakcijām, klonēšanu, rekombinantu gēnu ekspresiju prokariotu šūnās un attiecīgo proteīnu attīrīšanu, kā ari uz laboratorijas dzīvnieku imunizācijas eksperimentiem un citām tehnoloģijām. Sīs tehnoloģijas nozares speciālistiem ir labi pazīstamas un to detalizēti apraksti ir atrodami populāros metožu krājumos [23-26], Izgudrojuma labākai izpratnei zemāk izklāstītajos piemēros ir parādīta PVY VLP iegūšana, polipeptīdu sekvenču ievietošana VLP struktūrā un to izmantošana imunizācijās ar mērķi iegūt specifiskas antivielas pret minētajiem polipeptīdiem.

1. piemērs. PV¥ virsmas proteīna gēna un tā atvasinājumu klonēšana, ekspresija E.coli šūnās, vīrusiem līdzīgo daļiņu iegūšana

Inficētu kartupeļu meristēmu augu kopējā RNS tika izolēta ar TRI reaģentu (Sigma, USA) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. PVY cDNS tika iegūta, izmantojot M-MuLV H(-) reverso transkriptāzi (Fermentas, Lietuva) ar „random” heksamēriem kā praimeriem. Praimeru sekvences cDNS klonēšanai tika izvēlētas, analizējot Genbank datu bāzē publicētās PVY sekvences virsmas proteīnu gēnu reģionos. Virsmas proteīna (CP) gēna klonēšanai tika izvēlēti praimeri no genoma reģioniem, kas iekļauj CP gēnu ar iespējami augstāko sekvenču identitāti starp zināmajiem izolātiem - PVY_CP1F (SEQID NO: 3) un PVY_CP1R (SEQ ID NO: 4). Tālāk PCR reakcijās ar šiem izvēlētajiem praimeriem ieguva CP gēna cDNS kopiju.

Iegūtais vīrusu virsmas proteīna cDNS PCR produkts tika izolēts no agarozes gēla un tieši ligēts pTZ57R/T PCR produktu klonēšanas pafigvektora (Fermentas, Lietuva). cDNS insertus saturošie kloni tika sekvencēti ar universālajiem praimeriem M13/pUC tiešais (-46) un M13/pUC reversais (-46), lai pārliecinātos par gēna atbilstību nepieciešamai sekvencei saskaņā ar Applied Biosystems protokolu. Lai izvairītos no RT-PCR reakciju iespējamajām kļūdām, tika sekvencēti vismaz 4 dažādi kloni un salīdzināti ar Genbank datu bāzē atrodamajām sekvencēm kā nukleotīdu, tā ari aminoskābju līmenī.

Mūsu izolāta PVY CP sekvence (SEQ iD N0:2) izrādījās oriģināla - tā atšķiras par 2 nukleotīdiem no tuvākā publicētā PVY izolāta (Genbank AJ585198), atlikušie 803 no 805 nukleotīdiem ir identiski, un gēns kodē proteīnu (SEQ ID NO: 1), kuram ir viena atšķirīga aminoskābe (ΥΖΗ- skat. ari 1. un 2. att.).

No iegūtajiem cDNS sekvenču datiem tika atvasināta praimera sekvence attiecīgo CP gēnu subklonēšanai ekspresijas vektora pET-28a+ (Novagen, USA) PVYCPNco_F (SEQ ED NO:

5). Šī praimera sekvencei 5’galā tika pievienots Met kodons, jo vīrusa dzīves ciklā PVY virsmas proteīns netiek sintezēts atsevišķi, bet veidojas no poliproteīna proteoīītiskas šķelšanas un tam nav oriģināla Met proteīna sākumā. Ar praimeriem (SEQ ID NO: 5/ SEQ ID NO: 4) iegūtos PCR produktus vēlreiz klonēja pTZ57R vektorā un pārbaudīja klonu cDNS atbilstību PVY CP ar sekvencēšanas palīdzību. Atbilstošo pTZ57R klonu ar PVY-CP sekvenci un E.coli ekspresijas vektoru pET-28a(+) šķēla pa restrikcijas saitiem (Ncol un EcoRI). Iegūtie vektora un PVY-CP fragmenti tika savienoti ar T4 ligāzi (Fermentas, Lietuva) . Ar iegūtajiem ligēšanas maisījumiem transformēja kompetentas E.coli XLI šūnas. Transformāciju maisījumi tika izsēti uz LB platēm ar kanamicīnu. Izolēto plazmīdu DNS tika pārbaudītas ar restrikciju analīzēm; kloniem ar atbilstošu restrikcijas ainu tika sagatavotas sekvenču reakcijas. Izanalizējot sekvencēšanas rezultātus, tika izvēlēta kartupeļu vīrusa PVY CP ekspresijas plazmīda virsmas proteīna iegūšanai no E.coīi preparatīvos daudzumos.

Attiecīgā plazmīdu karte (pET-PVY-CP) parādīta 3. att. Iegūtās CP ekspresijas konstrukcijas transformēja E.coli C2566 (NEB, USA) ekspresijas šūnās. Lai atlasītu klonus ar visaugstāko ekspresijas līmeni, transformētās šūnas kultivēja analītiskos (20 ml) daudzumos 2xTY barotnē ar kanamicīnu (Km; 25 mg/1) uz kratītāja (200 apgr./min) pie +30°C līdz OD(600 nm) -0.8-1,.

Šūnas inducēja ar 0.2 mM IPTG, bez tam tika pievienoti 2 mM CaCI₂ un 5 mM MgO Kultūras pēc inducēšanas tika kultivētas vēl 18 h uz kratītāja pie +20°C. Ekspresijas līmenis tika noskaidrots, analizējot šūnu neattīrītus lizātus SDS-poliakrilamīda (SDS-PAA) gēlos. Klons ar visaugstāko ekspresijas līmeni tika kultivēts preparafivos daudzumos 200 ml kolbās tajos pašos apstākļos kā klonu atlases eksperimentos. Pēc fermentācijas iegūtā biomasa tika iesaldēta (20°C). Šķīstošās frakcijas proteīni PBS buferšķīdumā pēc šūnu sagraušanas ar ultraskaņas dezintegrāciju un nešķīstošo proteīnu un membrānu fragmentu atdalīšanas (13000 rpm, 30 min, +5°C) tika frakcionēti ultracentrifugā (Beckman, USA; SW28 rotors, 25000 rpm, 6h, +5°C), saharozes gradientā (20-60%). Gradients tika sadalīts sešās frakcijās, sākot no gradienta apakšas, kuras tālāk tika analizētas SDS-PAA gēlā (4. att.). Kā redzams no SDS-PAA gēlu analīzes, PVY virsmas proteīns tika sintezēts ievērojamos daudzumos un atrodams pārsvarā šķīstošo proteīnu frakcijās. PVY-CP proteīns pēc sadalīšanas gradientā tika konstatēts ari l.un 2. frakcijā (50/60% saharozes), kas norāda uz to iespējamo klātbūtni augstmolekulāru agregātu formā. PVY-CP 1. un

- 9 2. frakcija tika apvienotas un dializētas pret 100 tilpumiem lx PBS bufera, lai atbrīvotos no saharozes. Pēc dialīzes CP preparāti tika sakoncentrēti, izmantojot Amicon Ultra 15 centrifugējamu filtru (Millipore, USA). Koncentrētie vīrusu virsmas proteīnu preparāti tika analizēti ar elektronmikroskopijas palīdzību. Kā redzams no elektronmikroskopijas analīzē iegūtā attēla (10. att.), klonētā kartupeļu vīrusa PVY virsmas proteīnu gēns, ekspresējot E.coli, veido VLP. No E.coli izdalītās PVY-CP VLP Ecoli šūnās veido elastīgas, regulāras struktūras, kuru garums var pat pārsniegt dabisko PVY virionu garumu (līdz 2000 nm).

Optimizējot PVY VLP preparātu attīrīšanu, PVY-CP paraugi pirms saharozes gradienta tika izgulsnēti ar polietilēnglikola (4% gala koncentrācija) un NaCl (0,5M gala koncentrācija) maisījumu. Iegūtās nogulsnes izšķīdinot un sadalot saharozes gradienta, iegūst praktiski tīru preparātu (4. attēls, 1 un 2 gradienta frakcija). Lai iegūtu augsti attīrītu preparātu, gradienta frakcijas tika dializētas un sakoncentrētas līdz 1 ml. Kā pēdējā attīrīšanas stadija tika izvēlēta ultracentrifugēšana caur 2 ml urinvielas „spilvenu” (20% saharozes ar 1 M urinvielas) lh pie 72 000 apgr/min. Nogulsnes tika izšķīdinātas 1 ml 1 x PBS bufera, šķīdums nocentrifugēts pie 13000 apgr./min un analizēts SDS-PAA gēlā. Pat pēc vairākām attīrīšanas stadijām nebija iespējams atbrīvoties no proteīna, kas pēc izmēra ir īsāks nekā pats PVY-CP un varētu būt VLP degradācijas produkts.

Tā kā PVY-CP N-gals, acīmredzot tiek no VLP atšķelts, tad radās jautājums, vai tas ir nepieciešams VLP savākšanās procesā un vai ir iespējams iegūt daļiņas no N-termināli saīsinātiem PVY-CP. Lai pārbaudītu iespēju iegūt PVY VLP no nepilna garuma CP, tika izveidots saīsināts PVY-CP gēns, kurš kodē par 33 aminoskābēm īsāku PVY CP, sākot ar MDVN (5. att.). Šāds saasināts PVV-CP pēc sekvenču salīdzinājuma aptuveni atbilst pieminētā JGMV N-gala saīsinātajam variantam. PVY-CP saīsinātā atvasinājuma gēns tika amplificēts ar PCR palīdzību no izejas plazmīdas pET-PVY-CP ar praimeriem (SEQ ED NO: 6/ SEQ ĪD NO: 7). PCR produkti pēc attīrīšanas no agarozes gēla tika sagriezti ar Ncol un DraI un ligēti pa šiem pašiem saltiem sagrieztā vektora pET-PVY-CP, iegūstot plazmīdu pET-PVY-CP-DVN klonus. Pēc plazmīdu miniprepu iegūšanas kloni, kuri saskaņā ar sekvenču analīzi nesaturēja PCR kļūdas, tika atlasīti ar restrikcijas analīzes un sekvencēšanas palīdzību. Plazmīdas kartes fragments un gēna kodēto aminoskābju sekvence attēlota 5 att.

Plazmīdas pET-PVY-CP-DVN DNS tika ievadīta kompetentās E.coli ekspresijas celma C2566 šūnās. Inducējot kultūras ar IPTG pēc jau aprakstītās metodikas, atlasīja klonu ar labāko ekspresiju. Tālāk, pēc kultivēšanas un šķīstošo proteīnu iegūšanas, tie tika sadalīti ultracentrifugā, izmantojot saharozes gradientu. DVN proteīns (SEQ ED NO:7) gradienta tika atrasts arī tajās pašās frakcijās, kur gradienta lokalizējas PVY VLP filamentās daļiņas. Pēc dialīzes un sakoncentrēšanas, elektronu mikroskopijas attēlu analīze parādīja, ka DVN proteīns veido proteīnu agregātus, kuru vidū tika atrastas tikai dažas nepilnīgi izveidojušās filamentās VLP struktūras (11. att.). Šis piemērs parāda, ka PVY-CP N-gala aminoskābes ir nepieciešamas VLP autopolimerizācijas procesam un ka saīsinātais klons ir nepiemērots heterologu aminoskābju sekvenču eksponēšanai uz VLP virsmas.

Lai izveidotu PVY CP konstrukciju, kas varētu kalpot par svešu epitopu nesēju, vispirms bija nepieciešams izveidot konstrukcijas, kurās ievietotie epitopi vai proteīnu domēni netraucētu CP aminoskābēm VLP savākšanās procesā. Tika nolemts PVY-CP N- un C-galos pievienot glicīnu un serīnu atkārtojumu sekvences (SEQ ĪD NO:8 un SEQID NO:9), kuras kalpotu kā elastīgi aminoskābju starpposmi starp CP un ievietojamo epitopu aminoskābēm un nodrošinātu netraucētu VLP veidošanos. Pēc jau aprakstītās metodikas ar PCR palīdzību pET-PVY-CP gēnā ar attiecīgajiem praimeriem (praimeri G4S linkera ievadīšanai C-galā - SEQ JD NO: 11/ SEQ ID NO: 12; praimeri G4S linkera ievadīšanai N-galā - SEQ ID NO: 13/ SEQ ID NO: 10) 5’ un 3’ galos tika ievestas (G4S)3 kodējošās sekvences un papildus BarnHI restriktāzes saits epitopu cDNS klonēšanai (6. un 7. att.). Iegūtās konstrukcijas ligēja pTZ57R/T PCR produktu klonēšanas palīgvektorā un transformēja XLI kompetentajās šūnās. Pēc plazmīdu izolēšanas no atsevišķu koloniju kultūrām ar sekvencēšanas palīdzību tika atlasīti kloni, kas atbilda attiecīgo gēnu sekvencēm. Ekspresijas vektoru pET-PV¥-CP un PCR produktus saturošos palīgvektorus šķēla pa restrikcijas saitiem (NG4S pa Ncol un DraI; CG4S pa DraI un EcoRI). Fragmenti tika izolēti no 0.8% agarozes gēla un ligēti ar T4 ligāzi; ar ligēšanas maisījumiem tika transformētas

E.coli XLI kompetentās šūnas. Pēc restrikcijas analīzes plazmīdas pET-PVY-CP-NG4S un pETPVY-CP-CG4S ar gaidīto restrikcijas ainu ievadīja E.coli C2566 ekspresijas celma šūnās. Gan PVY-CP-CG4S, ganPVY-CP-NG4S proteīni bija atrodami 50/60% saharozes gradienta frakcijās (frakcijas 1 un 2), kas liecina, ka tie veido lielmolekulāras struktūras..

Abi proteīni tika attīrīti saskaņā ar augstāk aprakstīto protokolu un sagatavoti elektronu mikroskopijas analīzēm. Pievienojot PVY~CP C-galā (G4S)3GS sekvenci, VLP veidošanās izrādījās traucēta, jo elektronu mikroskopiskā analīze uzrādīja tikai īsas, filamentas struktūras un proteīnu agregātus (13. att.). Tas fakts, ka pievienojot C-galam (G4S)3 starpposmu, VLP veidošanās tika traucēta, liecina ari par PVV-CP C-gala aminoskābju lomu VLP veidošanās iniciācijā. Tas nozīmē, ka C-galam nav iespējams pievienot svešu polipeptīdu sekvences, neizjaucot VLP veidošanos. Turpretī, PVY-CP ar (G4S)3 sekvenci N-galā veidoja tipiskas PVY vīrusiem līdzīgas daļiņas ar līdzīgu morfoloģiju (12. att.) jau iepriekš aprakstītajām PVY-CP daļiņām. Tādējādi, tika parādīts, kaPVY-CP N-galam var tikt pievienotas svešu peptīdu sekvences.

-112. piemērs. Heterologus polipeptīdus saturošu PVY VLP iegūšana

Kā modeļepitopu PVY VLP kā nesēja pārbaudei tika izvēlēts hepatīta B vīrusa preSl epitops (SEQ ĪD NO: 14), kura cDNS ir Latvijas Biomedicīnas centra kolekcijā [27].

Klonēšanai paredzētā preSl epitopa cDNS tika iegūta PCR reakcijā no preS 1 saturošas cDNS (SEQ ĪD NO: 15) ar specifiskiem praimeriem PVY-N20-47F (SEQ ED NO: 16) un PVY-20-47R (SEQID NO: 17). PCR produkts tika sagriezts ar Ncoī/BamHĪ restriktāzēm un ligēts tajos pašos saitos plazmidā pET-PVY-CP-NG4S. Ar ligācijas ligēšanas maisījumu transformēja XLĪ šūnas, izolēja plazmīdu DNS. Ar sekvencēšanas palīdzību tika atlasīts klons, kura sekvence atbilda plānotajai, tādējādi iegūstot ekspresijas vektoru pET-PVY-CP-NG4S-preSl (karte un aminoskābju sekvence - 8.att.), ko ar transformācijas palīdzību ievadīja C2566 ekspresijas šūnās. Pēc ekspresijas klonu atlases, kultūra ar augstāko ekspresiju tika kultivēta preparatīvos daudzumos, šūnu lizāts tika atSfīts saharozes gradienta, ultracentrifugējot to saskaņā ar augstāk aprakstīto protokolu. Līdzīgi kā PVY-CP gadījumā, mērķproteīns tika atrasts lielos daudzumos 50/60% saharozes frakcijās, kas liecina, ka tas, iespējams, veido multimēru struktūras. Jāatzīmē, ka an šī varianta gadījumā tika novērota proteīna degradācija, bet tomēr lielākā daļa no tā ir pilna garuma proteīnam atbilstoša. Lai pārliecinātos par VLP veidošanos no s ekspresijas varianta, minētās frakcijas tika apvienotas, dializētas un, pēc koncentrēšanas, sagatavotas elektronu mikroskopijas analīzei. Kā redzams no 14. attēla, izveidotā proteīna konstrukcija, kurāPVY virsmas proteīnam N-galā ir pievienotas HBV preSl 22 aminoskābes un 17 glicīna-serīna atlikumu linkeris, spēj veidot VLP, kuras morfoloģiski neatšķiras no jau aprakstītajām PVY-CP VLP. Tas norāda, ka PVY VLP struktūrā var tikt „iebūvētas” svešu epitopu sekvences un tās netraucē VLP veidošanās procesu.

Lai pārbaudītu garāku, N-galā ievietotu polipeptīdu ietekmi uz PVY-CP autopolimerizāciju, kā heterologs polipeptīds tika izvēlēts rubredoksīns (RBX, Genbank NC003413), kas ir termostabils 54 aminoskābes garš proteīns un tā cDNS kopija var tikt sekmīgi ekspresēta E.coli šūnās [28]. RBX gēna cDNS gēnu sintēzes kopija (SEQ ID NO: 18), ar saitiem Ncol un BamHI tiešai klonēšanai pET-PVY-CP-NG4S, tika saņemta no SIA ASLABiotech (Latvija). Attiecīgais plazmīdas kartes fragments un aminoskābju sekvence attēlota 9. att. pET-PVY-CP-NRBX ekspresijas celms tika iegūts pēc analoģiska protokola, kā pārējie PVY-CP atvasinājumi. Arī šajā gadījumā saharozes gradienta attīrītais proteīns saskaņā ar elektronu mikroskopijas analīzēm ir autopolimerizējies vīrusiem līdzīgo daļiņu formā (15. att), kuru morfoloģija neatšķiras no PVYCP VLP. Tādējādi, ir parādīts, ka PVY N-galā var tikt pievienota vismaz 71 aminoskābi gara polipeptīdu sekvence, kas sastāv no 54 RBX aminoskābēm (SEQ ID NO: 19) un 17 GS(G₄S)₃ aminoskābēm (SEQ ED NO: 14), netraucējot VLP veidošanās procesam.

-/23. piemers. Heterologus polipeptidus saturošu PVV VLP imunoloģiskais raksturojums

Lai pārbaudītu, vai PVY-CP struktūrā ievietotais polipeptīds (preSl epitops) atrodas uz PVY CP virsmas, veicām konkurences ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) testu. Insertētā peptīda lokalizācija uz daļiņas virsmas jeb antigēna prezentācija ir svarīga B šūnu atbildes izraisīšanā un specifisku antivielu producēšanā pēc preparātu injicēšanas laboratorijas

V dzīvniekos. Sim nolūkam tika izmantotas peļu monoklonālas antivielas (MA18/7) no Latvijas Biomediīnas pētījumu un studiju cetra antivielu kolekcijas, kuru galvenais raksturojums ir to specifiskums pret hepatīta B vīrusa vienu antigēno determinanti - preSl rajona fragmentu 31DPAF-34. Testa pamatā ir princips, ja preSl rajons atrodas uz VLP virsmas, tad MA18/7 antivielas piesaistās pie VLP sastāvā esošā preSl epitopa. Tādā gadījumā daļa no antivielām vairs nespēj saistīties ar ķīmiski sintezētu preSl peptīda reaģentu, kurš ir imobilizēts uz mikrotitra plates materiāla (cietās fāzes). Testa rezultāts ir novērojams gan vizuāli, gan spektrofotometriski - pozitīva rezultāta gadījumā pētāmās VLP, saistoties ar MA18/7 antivielām, vājina krāsu reakciju. Pētāmais proteīns tiek titrēts, lai noteiktu proteīna koncentrāciju paraugā.

Konkurences ELISA reakcijas metodika ir sekojoša:

- Vispirms tiek veikta antigēna adsorbcija uz cietās virsmas - preSl peptīdu (aminoskābes 20-47) atšķaida karbonāta buferi līdz koncentrācijai 10 pg/ml un katrā no mikrotitra plates lauciņiem ienes 100 μΐ antigēna šķīduma, inkubē 16 h pie +4°C;

- mikrotitra plati mazgā ar mazgājošo šķīdumu (Sigma, USA, Cat.As P-5927) 3x un ar destilēto ūdeni 2x;

- tālāk plates lauciņos iepilda 150 μΐ 1% BSA, inkubē 30 min pie +37°C, pēc tam mazgā 3x ar mazgājošo šķīdumu un 2x ar destilēto ūdeni; sagatavo VLP paraugu atšķaidījumus ar sākuma koncentrāciju 60pg/50ul.

- inkubācijai ar antivielām sagatavo VLP atšķaidījumus ar aprēķinu, ka pētāmā proteīna koncentrācija samazinās 2x ; katram lauciņam ar iztitrēto pētāmo proteīnu pievieno iepriekš atšķaidītas noteiktas koncentrācijas MA18/7 antivielas; plates inkubē 1 stundu termostatā pie +37°C; plates mazgā 3x ar mazgājošo šķīdumu un 2x ar destilēto ūdeni.

- Platēm pievieno truša antipeļu antivielu konjugāta šķīdumu 1:4000 atšķaidījumā pa 100 μΐ; inkubē 1 stundu pie +37°C; plates mazgā 3x ar mazgājošo šķīdumu un 2x ar destilēto ūdeni. Pēc tam pievienolO ml citrāta buferi atšķaidītus 5mg o-fenilēndiamma, tieši pirms uznešanas uz plates pievieno 15μ1 30% H2O2, labi samaisa; ienes pa 100 μΐ katrā lauciņā; inkubē pie istabas temperatūras tumšā vietā 20 min.; reakciju pārtrauc katram lauciņam pievienojot 50 μΐ 1,2 N

-/3H2SO4; rezultātus (OD pie 492nm) nolasa ar mikrotitra plašu spektrofotometra (BDSL Immunoscan LS, Somija) palīdzību.

Konkurentās ELISA rezultātus novērtē, pētāmajam paraugam zīmējot titrēšanas līkni (16. att.) Paralēli pētāmajam proteīnam PVY-CP-NG4S-preSl kā negatīvā kontrole tika izmantots pats VLP nesējs PVY-CP, kurš nesatur preSl sekvenci un tādējādi nav spējīgs veidot imunokompleksu ar MA18/7 antivielām.

Kā redzams no ELISA rezultātiem, pieaugot antigēna PVY-CP-NG4S-preSl koncentrācijai, samazinās brīvo MA18/7 antivielu daudzums, kas piesaistās pie preSl peptīda, kurš ir mobilizēts mikrotitra plates bedrītēs. Tas apliecina, ka PVY VLP struktūrā preSl epitops ir lokalizēts uz daļiņu virsmas, respektīvi, ir pieejams laboratorijas dzīvnieku imūnsistēmas komponentēm antivielu veidošanās stimulēšanai.

Lai pārbaudītu iegūtā PVY-CP-NG4S-preSl imunogēnās īpašības, tika veikti imunizācijas eksperimenti. Imunizācijai tika izmantotas Balb/C peles, pa 5 dzīvniekiem katrā grupā. Peļu imunizācija tika veikta izmantojot standarta shēmu: Imunizācijas deva vienam dzīvniekam:

A. Grupa - 50 pg proteīna, kas izšķīdināts sterilā PBS buferī;

B. Grupa- 50 pg proteīna, kas izšķīdināts sterilā PBS buferī, klāt pievienojot adjuvantu ( eļļas emulsiju) 50% tilpumā - Complete Freund’s Adjuvant (Sigma, kat.N® F-5881, ASV) pirmējā imunizācijā t.i. O-jā dienā un Incomplete Freund’s adjuvant (Sigma, katJfe F-5506, ASV) - 14. un 28. dienā.

Antigēna tilpums vienam dzīvniekam - 0,2 ml; imunizācijas vieta - subkutāni (zem ādas); imunizācijas laiks — 0.; 14. un -28. diena; asins noņemšana un serumu sagatavošana-; 42. dienā jeb divas nedēļas pēc 3-šās imunizācijas. Asinis noņemtas no peles acs retroorbitālā sinusa vēnas - ar sterila kapilāra palīdzību tiek notecināts aptuveni 100 μΐ asins parauga. Paraugi ar peļu asinīm tiek ievietoti uz 30 min termostatā pie 37°C., tad ledusskapī pie +4°C uz 1-2 stundām. Tālāk paraugus centrifugē (2500 apgr./min, 30 min, +4°C). Serumu paraugi tiek glabāti ledusskapī pie -20°C.

Iegūtie asins paraugi tika analizēti ar ELISA testu palīdzību. Tās princips pamatojas uz to specifisku antivielu noteikšanu, kuras saistās ar adsorbētiem uz cietaās fāzes antigēniem, veidojot imunokompleksu. Piesaistījušās antivielas nosaka ar specifiskām sekundārām antiimunoglobulīna un konjugāta kompleksa palīdzību. ELISA testi tika veikti pēc sekojoša protokola:

- Antigēnu (PVY-CP, PVY-CP-NG4S-preSl un kontroles) atšķaida karbonāta buferī līdz koncentrācijai 10 pg/ml; katrā no mikrotitra plates lauciņiem iepilda 100 μΐ antigēna šķīduma; inkubē nakti pie +4°C;

- plati mazgā ar mazgājošo šķīdumu 3x un ar destilēto ūdeni 2x;

-/9- katrā lauciņā ienes 150 μΐ 1% BSA šķīduma;

- inkubē 30 min pie +37°C;

- plates mazgā 3x ar mazgājošo šķīdumu, 2x ar destilēto ūdeni.

Katram paraugam uz plates atvēlē 1 kolonnu, katrā platē vienu kolonnu atvēlot arī negatīvai kontrolei (neimunizētu peļu serums, kuru atšķaida analoģiski paraugu serumiem); 96-lauciņu plates pirmās rindas lauciņos ienes pa 150 μΐ sagatavoto serumu šķīdumus; pārējās lauciņus aizpilda ar 100 μΐ 0,5% BSA šķīdumu. Gatavo pārbaudāmo serumu atšķaidījumus; no pirmās rindas pārnes 50 μΐ seruma Šķīduma uz otras rindas lauciņa un samaisa ar tur jau esošo 0,5% BSA šķīdumu; paņem 50 μΐ un pārnes uz trešo rindu utt.; rezultātā katrā rindā antivielu koncentrācija samazinās 3x. Plates inkubē 1 stundu termostatā pie +37°C, tad mazgā 3x ar mazgājošo šķīdumu 2x ar destilēto ūdeni. Tālāk pievieno 100 μΐ sekundāro antivielu konjugātu ( Sigma, kat.Ks A 9044; atšķaidījums 1:1000) inkubē 1 stundu pie +37°C; plates mazgā 3x ar mazgājošo šķīdumu un 2x ar destilētu ūdeni. Pievieno reakcijas substrātu (o-fenilēndiamīns; Sigma, USA) 100 μΐ, kuru sagatavo sekojoši: 5mg o-fenilendiamīna izšķīdina lOml citrāta buferī, tieši pirms uznešanas uz plates šķīdumam pievieno 15 μΐ 30% 1ΤΟ₂ un rūpīgi samaisa. Tālāk plates inkubē 20 min. tumsā pie istabas temperatūras, reakciju pārtrauc katram lauciņam pievienojot 50 μΐ 1,2 M H2SO4. Krāsu reakcijas optisko blīvumu (OD) nolasa pie viļņa garuma 492 nm ar ELISA nolasītāja palīdzību. Rezultātus novērtē katram pētāmajam paraugam zīmējot titrēšanas līkni: par titru skaita atšķaidījumu, pie kura nolasītā OD vērtība ir vienāda ar 3x lielāku OD fona vērtību. Par fonu uzskata neimunizētas peles seruma viszemāko OD vērtību, kas atkārtojas vismaz 3x.

Kā redzams no imunizācijas rezultātiem (17. att.), PVY filamentās daļiņas ir spēcīgs imunogēns, kas var kalpot par adjuvantu, jo izraisa spēcīgu antivielu veidošanos ari bez adjuvantu pievienošanas (1A). Uz PVY VLP virsmas izvietotie preSl epitopi izraisa nozīmīgu antivielu daudzuma veidošanos eksperimentālo dzīvnieku organismos (1:8620) ari bez adjuvantu pielietojuma. Svarīgi, ka antivielu daudzums, kas izveidojies pret pašu nesēju (PVY-CP) eksperimentā ar preSl saturošām VLP ir būtiski samazinājies - no 1:24300 uz 1:10650. Tas norāda, ka preSl epitops daļēji maskē paša PVY epitopus. Šie eksperimenti liecina, ka kartupeļu vīrusa PVY mākslīgi iegūtas autopolimerizējošas daļiņas ar slimību izraisītāju epitopiem var tikt izmantotas kā vakcīnas. Aprakstītajā veidā iegūtās antivielas var tikt izmantotas kā pamatkomponentes cilvēka slimību (hepatīts B) un kartupeļu slimību (PVY) diagnostikas līdzekļu (reaģentu komplektu - kitu) izveidē.

-O

Atsauces

1. Pumpens, P., Grens, E. Artificial genes for chimeric virus-like pārticies. In: Artificial DNA: Methods and Applications. Edited by Y.E.Khudyakov & H. AFields. CRC Press LLC, Boca Raton, pp. 249-327, 2002.

2. Bachmann, M.F., Hengartner, LL and Zinkernagel, R.M. T helper cell-independent neutralizing B celi response against vesicular stomatitis virus: role of antigen patterns in B celi induction. Eur JImrmmol., 25, 3445-3451, 1995.

3. Fifis, T., Gamvrellis, A., Crimeen-Invin, B., Pietersz, G.A, Li J., Mottram, P.L., McKenzie, I.F., Plebanski, M. Size-dependent immunogenicity: Therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors. J. Immunol., 173, 3148-3154,

2004.

4. Lenz, P., Thompson, C.D., Day, P.M., Bacot, S.M., Lowy, D.R., Schiller, J.T. Interaction of papillomavirus virus-like pārticies with human myeloid antigen-presenting celis. Clin Immunol., 106, 231-237,2003.

5. Chow, M., Yabrov, R., Bittle, L, Hogle, L, Baltimore, D. Synthetic peptides from four separate reģions of the poliovirus type 1 capsid protein VP1 inducē neutralizing antibodies. Proc. Nati Acad. Sci. USA, 82,910-914,1985.

6. Haynes, J.R., Cunningham, J., von Seefried, A., Lennick, M., Garvin, R.T., Shen, S.H. Development of a genetically-engineered, candidate polio vaccine employing the selfassembling properties of the tobacco mosaic virus coat protein. Bio/Technology, 4, 637641, 1986.

7. A Zeltiņš. Plant virus biotechnology platforms for expression of medicīnai proteīns. In: Medicīnai Protein Engineering, Y.E.Khudyakov, Ed., CRC Press, pp. 481-517, 2009.

8. Fauquet, C.M., Mayo, M.A, Maniloff J., Desselberger, U., Bail, L.A. Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses. 8th Report of the International Conunittee on the Taxonomy of Viruses. New York: Elsevier-Academic Press, 2005.

9. Gibbs, A.J. Ohshima, K., Phillips, M.J., Gibbs, M.J. The Prehistoiy of Potyviruses: Their Initial Radiation Was during the Dawn of Agriculture. PLoS ONE 3(6): e2523, 2008.

10. Khan J.A., Dijkstra J, Description of positive-sense, single-stranded RNA viruses. In: Handbook of Plant Virology. Binghamton, Haworth Press. 2006.

11. Nemykh M.A., Efimov, A.V., Novikov, V.K., Orlov, V.N., Arutyunyan, AM., Drachev, V. A., Lukashina, E.V., Baratova, L.A., Dobrov E.N. One more probable structural transition in potato virus X virions and a revised modei of the virus coat protein structure. Virology 373, 61-71,2008.

-/612. Denis, J., Majeau, N., Acosta, R, Savadr, C., Bedards, M.C., Simard, S., Lecours, K., Bolduc, M., Pare, C., Willems, B., Shoukry, N., Tessier, P., Lacasse, P., Lamarre, A., Lapointe, R, Lopez Macias C., Leclerc D. Immunogenicity ofpapaya mosaic virus-like pārticies fused to a hepatitis C viras epitope: Evidence for the critical function of multimerization. Virology 363, 59-68, 2007.

13. Leclerc, D., Lopez-Macias C.R. Adjuvant virai particle. USA Patent appl. 20090280145,

2009.

14. Saini M., Vrati, S. A Japanese encephalitis viras peptide present on Johnson grass mosaic virus-like pārticies inducēs virus-neutralizing antibodies and protects mice against lethal challenge. J. Virol. Π, 3487-3494, 2003.

15. Staczek, J., Gilleland, H.E., Gilleland, L.B., Staczek, J., Harty, R.N., Garcia-Sastre, A, Palese, P, Brennan, F.R, Hamilton, W.D., Bendahmane, M., Beachy, R.N. Immunization with a chimeric tobacco mosaic viras containing an epitope of outer membrane protein F of Pseudomonas aeruginosa provides protection against challenge with P. aeraginosa. Vaccine, 18, 2266-2274, 2000.

16. Ooi, A.S., Tan, S., Mohatned, R, Rahman, N.A., Othman, RY. The full-length clone of cucumber green mottle mosaic viras and its application as an expression system for hepatitis B surface antigen. J. Biotechnol., 121, 471-481, 2006.

17. Pokoma, D. Cerovska, N., Smahel, M., Moravec, T., Ludvikova, V., Mackova, J., Synkova, H., Duskova, M., Hozak, P., Veleminsky J. DNA vaccines based on chimeric potyvirus-like pārticies canying HPV16 E7 peptide (aa 44-60). Oncology Rep., 14, 1045-1053, 2005.

18. Marusic, C. Rizza, P., Lattanzi, L., Mancini, C., Spada, M., Belardelli, F., Benvenuto, E., Capone, I. Chimeric plant vīrus pārticies as immunogens for inducing murine and human immune responses against human immunodeficiency viras type 1. J Virol., 75, 84348439,2001.

19. Jagadish, M.N., Ward, C. W., Shukla, D. D. Self-polymerising expression system based on modified potyvirus coat proteīns. World patent WO/1991/015587, 1991.

20. Anindya R, Savithri H.S. Surface-exposed amino- and carbox-terminal residues are crucial for the initation of assembley in Pepper vein banding viras: a flexuous rod-shaped viras. Virology 316: 325-336,2003.

21. van Houten, N.E., Henry, K.A., Smith, G.P., Jamie K. Engineering filamentous phage carriers to improve focusing of antibody responses against peptides Vaccine, 28, 21742185. 2010.

-/7 22. Coēffier, E., Clement. J.M., Cussac, V., Khodaei-Boorane, N., Jehanno, M., Rojas, M., Dridi, A., Latour Μ., E1 Habib, R., Barre-Sinoussi, F., Hofnung, M., Leclerc, C. Antigenicity and immunogenicity of the HIV-1 gp41 epitope ELDKWA inserted into permissive sites of the MalE protein. Vaccine, 19,684-693, 2000.

23. Sambrook, J. et al., eds., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd. edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, Ν.Υ. 1989.

24. Ausubel, F. et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John H. Wiley & Sons, Inc. 1997.

25. Harlow, E. and Lane, D., Antibodīes: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ν.Υ. 1988.

26. Scopes, R. K., Protein Purification Principles and Practice, 3 ^rded., Springer-Verlag, New York 1994.

27. Bichko, V., Pushko, P., Dreilina, D., Pumpen, P., Gren, E. Subtype ayw variant of hepatitis B virus. DNA primary structure analysis. FEBSLett. 185, 208-212, 1985.

28. Richie, K.A., Teng, Q., Elkin, C.J., Kurtz, D.M. 2D 1H and 3D lH-15NNMRof zincrubredoxins: contributions of the beta-sheet to thermostability. Protein Sci., 5, 883-94, 1996.

Claims (7)

1. Patenta pretenzijas

   1. Kartupeļu vīrusa PVY virsmas proteīnu kodējoša nukleīnskābes molekula saskaņā ar SEQID NO: 2.
2. 2. Pavedienveida vīrusiem līdzīgo daļiņu iegūšanas paņēmiens, kas ietver sevī:

   (a) kartupeļu vīrusa PVY nukleīnskābes molekulas SEQ ID NO: 2 sagatavošanu;

   (b) minētās nukleīnskābes ievadīšanu saimniekšūnās;

   (c) saimniekšūnu kultivēšanu tādos apstākļos, lai iegūtu proteīnu, kas spēj veidot vīrusiem līdzīgas daļiņas.
3. 3. Pavedienveida vīrusiem līdzīgo daļiņu iegūšanas paņēmiens, kur 2. punktā minētās saimniekšūnas ir Escherichia coli, kuras tiek kultivētas pie +20°C.
4. 4. Pavedienveida vīrusiem līdzīgas daļiņas, kas sastāv no vismaz viena proteīna no sekojošas grupas:

   (a) proteīna, kura sastāvā ietilpst aminoskābes 1-267 no SEQ ID NO:1;

   (b) proteīna, kura sastāvā ietilpst aminoskābes 1-267 no SEQ ID NO:1 un kuram N-galā starp 3. un 4. aminoskābi ir ievietota līdz 71 aminoskābju gara polipeptīda sekvence
5. 5. Pavedienveida vīrusiem līdzīgas daļiņas, kur 4. punktā minētā polipeptīda sekvence ir hepatīta B preSl sekvence no SEQ ID NO: 14.
6. 6. Imūnatbildes izraisīšanai piemērots Šķīduma sastāvs, kas satur vismaz vienu no 4. un 5. punktā minētajām vīrusiem līdzīgajām daļiņām un citus vakcinēšanas praksē atzītus komponentus.
7. 7. Imūnatbildes izraisīšanai piemērots šķīduma sastāvs, kas atšķiras no 6. punktā minētā ar to, ka tas nesatur adjuvantus.