JP2023533228A - 安定化コロナウイルススパイク（ｓ）タンパク質免疫原および関連ワクチン - Google Patents

安定化コロナウイルススパイク（ｓ）タンパク質免疫原および関連ワクチン Download PDF

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Abstract

本発明は、野生型可溶性Ｓ配列における特定の改変によって安定化される、再設計された可溶性コロナウイルスＳタンパク質由来免疫原を提供する。自己集合性ナノ粒子上にディスプレイされる再設計された可溶性Ｓ免疫原を含有するナノ粒子ワクチンも本発明において提供される。再設計された免疫原およびナノ粒子ワクチンをコードするポリヌクレオチド配列も本発明で提供される。本発明はさらに、様々な治療適用、例えばコロナウイルス感染症を予防または治療するためにワクチン組成物を使用する方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本特許出願は、米国特許出願第１７／０１９，８２５号（２０２０年９月１４日出願；現在係属中）および米国仮特許出願第６３／０４５，５５７号（２０２０年６月２９日出願；現在係属中）に対する優先権の利益を主張するものである。優先権出願の全開示は、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
政府支援の記載
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＡＩ１３９０９２およびＡＩ１３７４７２の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
コロナウイルス（ＣｏＶ）は、プラス鎖ＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスである。２００２年に、アジアで重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）がアウトブレークした。２００３年には、新型コロナウイルスがＳＡＲＳの原因因子であると同定され、その後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶと命名された。２００２～２００３年のアウトブレークの間、ＳＡＲＳ－ＣｏＶは８０００人を超える人々に感染し、死亡率は約１０％であった。２０１２年に、別のコロナウイルスである中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）が同定された。２０１２年以降、ＭＥＲＳ－ＣｏＶは、２７カ国で２０００人を超える人々に感染しており、死亡率は約３５％である。２０１９年１２月に、２０１９－ｎＣｏＶ（またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）と命名された新型コロナウイルスが中国の武漢に出現した。一部が１２月８日という早い時期に症状を示した最初に報告された感染個体は、武漢華南海鮮卸売市場の露店商に存在することが発見された。２０２０年１月１０日に、遺伝子配列決定により、この新型コロナウイルス（β－コロナウイルス）がＭＥＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶに関連することが判定された。２０２０年１月３０日に、ＷＨＯはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態（ＰＨＥＩＣ）であることを宣言し、２０２０年３月１１日には、この状況をパンデミックとして特徴付けた。２０２０年５月２４日に、ＷＨＯのコロナウイルス疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）ダッシュボードは、２１６の国、地域または地方で３４２，０２９人の死亡を含む、合計５，３０４，７７２の確認症例を示した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、β－コロナウイルス属に属し、高病原性の人畜共通ウイルスである。これらの３つの高病原性β－コロナウイルスに加えて、４つの低病原性β－コロナウイルス、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶＨＫＵ１、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３およびＨＣｏＶ－２２９Ｅはさらにヒトに固有のものである。
今日まで、いずれのヒト感染性コロナウイルスを治療または予防するための治療薬またはワクチンも承認されていない。コロナウイルスに対する効果的なワクチンが当技術分野で強く緊急に必要とされている。本発明は、当技術分野におけるこの、および他の差し迫った必要性に関する。
一態様では、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むコロナウイルスのスパイク（Ｓ）糖タンパク質に由来するか、またはそれから改変された操作された免疫原ポリペプチドを提供する。コロナウイルスの野生型可溶性Ｓタンパク質配列と比較して、本発明の免疫原ポリペプチドは、融合前Ｓ構造を安定化する改変を有する、変更された可溶性Ｓ配列を含有する。様々な実施形態では、この改変は、（ａ）Ｓ１／Ｓ２切断部位を不活性化する変異、および（ｂ）膜融合プロセス中にＨＲ１およびＣＨが直鎖ヘリックスを形成するのを妨げる、へプタッドリピート１（ＨＲ１）領域と中央ヘリックス（ＣＨ）領域との間のターン領域の変異（図１参照）を含む。いくつかの実施形態では、本発明の免疫原ポリペプチドは、上記の安定化変異に加えて、ヘプタッドリピート２領域（ＨＲ２）のトランケーションも含む。
本発明のいくつかの可溶性Ｓ免疫原ポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する。これらの実施形態のいくつかでは、Ｓ１／Ｓ２切断部位を不活性化する変異は、ｃｒｙｏ－ＥＭモデルＰＤＢ ＩＤ ６ＶＳＢに基づくアミノ酸ナンバリングを参照として使用して、６８２ＲＲＡＲ６８５（配列番号１９）のＧＳＡＧ（配列番号２０）による置換を含み得、ターン領域における変異は、二重変異Ｋ９８６Ｇ／Ｖ９８７Ｇ、Ｋ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｐ、Ｋ９８６Ｇ／Ｖ９８７ＰまたはＫ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｇを含み得る。いくつかの実施形態では、野生型可溶性Ｓ配列は、配列番号１４に示される配列、またはその実質的に同一な、もしくは保存的に改変された変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＨＲ２のトランケーションは、野生型可溶性Ｓ配列のＣ末端における配列番号９に示される残基の欠失を伴う。これらの実施形態のいくつかでは、免疫原ポリペプチドは、Ｃ末端における配列番号１０に示される残基のトランケーションをさらに含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、免疫原ポリペプチドは、野生型可溶性Ｓ配列のＣ末端における配列番号１０に示される残基の、残基ＧＮＳによる置換を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原ポリペプチドは、配列番号１５に示されるＮ末端リーダー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、免疫原ポリペプチドは、ＨＲ２と相互作用するＨＲ１の領域において、（ａ）１つ以上のプロリンまたはグリシン置換、および／または（ｂ）１つ以上のアミノ酸残基の挿入をさらに含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、免疫原ポリペプチドは、Ａ９４２Ｐ、Ｓ９４３Ｐ、Ａ９４４Ｐ、Ａ９４２Ｇ、Ｓ９４３ＧおよびＡ９４４Ｇから選択される１つ以上の置換を有することができる。これらの実施形態のいくつかでは、挿入は、Ａ９４２～Ａ９４４の任意の残基間へのＧまたはＧＳの挿入であり得る。いくつかの例示されている実施形態では、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原ポリペプチドは、配列番号３２～３７のいずれか１つに示されている配列、またはその実質的に同一な、もしくは保存的に改変された変異体を含む。
本発明のいくつかの可溶性Ｓ免疫原ポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶに由来する。これらの実施形態のいくつかでは、Ｓ１／Ｓ２切断部位を不活性化する変異は、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ５９５９４に基づくアミノ酸ナンバリングを参照として使用して、Ｒ６６７Ｇ置換であり得、ターン領域における変異は、二重変異Ｋ９６８Ｇ／Ｖ９６９Ｇ、Ｋ９６８Ｐ／Ｖ９６９Ｐ、Ｋ９６８Ｇ／Ｖ９６９ＰまたはＫ９６８Ｐ／Ｖ９６９Ｇを含む。いくつかの実施形態では、野生型可溶性Ｓ配列は、配列番号７に示される配列、またはその実質的に同一な、もしくは保存的に改変された変異体を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ由来免疫原ポリペプチドは、野生型可溶性Ｓ配列のＣ末端におけるＨＲ２（配列番号９）のトランケーションを含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、免疫原ポリペプチドは、Ｃ末端における配列番号１０に示される残基のトランケーションをさらに含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、免疫原ポリペプチドは、野生型可溶性Ｓ配列のＣ末端における配列番号１０に示される残基の、残基ＧＮＳによる置換を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ由来免疫原ポリペプチドは、配列番号８に示されるＮ末端リーダー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、免疫原ポリペプチドは、ＨＲ２と相互作用するＨＲ１の領域において、（ａ）１つ以上のプロリンまたはグリシン置換、および／または（ｂ）１つ以上のアミノ酸残基の挿入をさらに含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、免疫原ポリペプチドは、Ｓ９２４Ｐ、Ｔ９２５Ｐ、Ａ９２６Ｐ、Ｓ９２４Ｇ、Ｔ９２５ＧおよびＡ９２６Ｇから選択される１つ以上の置換を有することができる。これらの実施形態のいくつかでは、挿入は、Ｓ９２４～Ａ９２６における任意の残基の後へのＧまたはＧＳの挿入であり得る。
本発明のいくつかの可溶性Ｓ免疫原ポリペプチドは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶに由来する。これらの実施形態のいくつかにおいて、Ｓ１／Ｓ２切断部位を不活性化する変異は、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｒ９ＵＱ５３に基づくアミノ酸ナンバリングを参照として使用して、Ｒ７４８Ａ／Ｒ７５１Ｇ二重変異を含み得、ターン領域における変異は、二重変異Ｖ１０６０Ｇ／Ｌ１０６１Ｇ、Ｖ１０６０Ｐ／Ｌ１０６１Ｐ、Ｖ１０６０Ｇ／Ｌ１０６１ＰまたはＶ１０６０Ｐ／Ｌ１０６１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、野生型可溶性Ｓ配列は、配列番号１１に示される配列、またはその実質的に同一な、もしくは保存的に改変された変異体を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＭＥＲＳ－ＣｏＶ由来免疫原ポリペプチドは、野生型可溶性Ｓ配列のＣ末端におけるＨＲ２（配列番号１３）のトランケーションを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＭＥＲＳ－ＣｏＶ由来免疫原ポリペプチドは、配列番号１２に示されるＮ末端リーダー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、免疫原ポリペプチドは、ＨＲ２と相互作用するＨＲ１の領域において、（ａ）ＨＲ２と相互作用するＨＲ１の領域において、ＨＲ２と相互作用するＨＲ１の領域において、ＨＲ２と相互作用するＨＲ１の領域において１つ以上のプロリンまたはグリシン置換、および／または（ｂ）１つ以上のアミノ酸残基の挿入をさらに含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、免疫原ポリペプチドは、Ｔ１０１３Ｐ、Ｔ１０１４Ｐ、Ｔ１０１５Ｐ、Ｔ１０１３Ｇ、Ｔ１０１４ＧおよびＴ１０１５Ｇから選択される１つ以上の置換を有することができる。これらの実施形態のいくつかでは、挿入は、Ｔ１０１３～Ｔ１０１５における任意の残基の後への残基ＧまたはＧＳの挿入であり得る。
いくつかの実施形態では、本発明のコロナウイルスＳタンパク質由来免疫原ポリペプチドは、Ｃ末端に三量体化モチーフをさらに含むことができる。これらの実施形態のいくつかでは、三量体化モチーフは、フォルドン（ｆｏｌｄｏｎ）またはウイルスカプシドタンパク質ＳＨＰである。様々な実施形態では、使用される三量体化モチーフは、配列番号２６に示されるフォルドン配列もしくは配列番号２７に示されるＳＨＰ配列、またはその実質的に同一な、もしくは保存的に改変された変異体を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のコロナウイルスＳタンパク質由来免疫原ポリペプチドは、改変された可溶性Ｓ配列に融合した自己集合性ナノ粒子のサブユニット配列をさらに含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、変更された可溶性Ｓ配列のＣ末端は、ナノ粒子サブユニット配列のＮ末端に融合される。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のコロナウイルスＳタンパク質由来免疫原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。ポリヌクレオチド配列のいくつかは、自己集合性ナノ粒子のサブユニット配列のＮ末端に、Ｃ末端において融合された免疫原ポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする。
別の態様では、本発明は、自己集合性ナノ粒子の表面にディスプレイされる本明細書に記載の免疫原ポリペプチドを含むコロナウイルスワクチン組成物を提供する。これらの実施形態のいくつかでは、自己集合性ナノ粒子は三量体配列を含み、免疫原ポリペプチドのＣ末端がナノ粒子のサブユニット配列のＮ末端に融合されている。いくつかの実施形態では、使用される自己集合性ナノ粒子は、フェリチン、Ｅ２ｐまたはＩ３－０１から構成される。本発明のいくつかのナノ粒子ワクチンは、本明細書に記載の操作されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をディスプレイする。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子ワクチンは、（１）Ｎ末端からＣ末端に向かって以下を含むポリペプチド配列、（ａ）操作されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチド、ＧＳリンカー配列およびナノ粒子配列Ｉ３－０１ｖ９、（ｂ）操作されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチド、ＧＳリンカー配列およびナノ粒子配列Ｅ２ｐ、もしくは（ｃ）操作されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチド、ＧＳリンカー配列およびナノ粒子配列フェリチン、または（２）該ポリペプチド配列の保存的に改変された変異体を含む。これらの実施形態のいくつかでは、ディスプレイされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原ポリペプチドは、野生型スパイク配列と比較して、（ａ）Ｓ１／Ｓ２切断部位６８２ＲＲＡＲ６８５（配列番号１９）のＧＳＡＧ（配列番号２０）による置換、（ｂ）ターン領域における二重変異Ｋ９８６Ｇ／Ｖ９８７Ｇ、および（ｃ）Ｃ末端におけるＨＲ２（配列番号９）のトランケーションを含む。
本発明のいくつかのナノ粒子足場ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンでは、ディスプレイされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原ポリペプチドは、配列番号３３もしくは３４に示される配列、またはその保存的に改変された変異体を含有する。これらの実施形態のいくつかでは、足場ワクチンは、（１）Ｎ末端からＣ末端に向かって以下を含むサブユニット配列（ａ）配列番号３３に示される操作されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチド、リンカー配列（Ｇ４Ｓ）２（配列番号２２）、配列番号２３に示されるナノ粒子配列（Ｉ３－０１ｖ９）、配列番号２９に示されるロックドメイン（ＬＤ７）、および配列番号３０に示されるＴ細胞エピトープ（ＰＡＤＲＥ）、（ｂ）配列番号３３に示される操作されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチド、リンカー配列Ｇ４Ｓ（配列番号２１）、配列番号２４に示されるナノ粒子サブユニット配列（Ｅ２ｐ）、配列番号２８に示されるロックドメイン（ＬＤ４）、および配列番号３０に示されるＴ細胞エピトープ（ＰＡＤＲＥ）、もしくは（ｃ）配列番号３３に示される操作されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチド、リンカー配列Ｇ４Ｓ（配列番号２１）、配列番号２５に示されるナノ粒子配列（フェリチン）；または（２）該サブユニット配列の保存的に改変された変異体から構成される。いくつかの実施形態では、ナノ粒子足場ワクチンのサブユニットは、配列番号３８～４０のいずれか１つに示される配列、またはその実質的に同一な、もしくは保存的に改変された変異体を含む。
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載のワクチン組成物と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物を提供する。別の態様では、本発明は、対象におけるコロナウイルス感染症を予防または治療する方法を提供する。これらの方法は、薬学的有効量の本明細書に記載のワクチン組成物または医薬組成物を対象に投与することを含む。
本発明の性質および利点のさらなる理解は、本明細書の残りの部分および特許請求の範囲を参照することによって実現することができる。
図１は、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質の異なる構造モチーフの構成を示す図である。図に示すスキームは、本発明に包含される異なるコロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の構造を反映している。図に示されるＳタンパク質の構造ドメインおよびモチーフは、ＲＢＤ、ＨＲ１、ＣＨ１およびＨＲ２ドメインまたは領域、ならびにＳ２切断部位（別名Ｓ１／Ｓ２切断部位）およびＳ２’切断部位を含む。図に示される様々なＳ構造成分に加えて、ＨＲ１とＣＨとの間のアミノ酸残基は、本明細書では「ターン領域」と称される。 図２は、マウス免疫化プロトコルの概略図である。５匹のマウスの群を３週間間隔で４回免疫化した。すべてのワクチン抗原（５０ｕｇ／注射）を、Ｉ３－０１ｖ９を除いて、水中油型エマルジョンアジュバントであるＡｄｄａＶａｘと共に製剤化し、Ｉ３－０１ｖ９はリン酸アルミニウム（ＡＰ）と共に製剤化した。腹腔内（ＩＰ）経路を介して注射を行った。各注射の２週間後に血液試料を採取した。 図３は、マウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン誘導性抗体応答の結果を示す図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク／スパイク－ＮＰワクチン誘導性結合抗体応答。図には、５つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクベースのワクチン群（Ｓ２Ｐ－５ＧＳ－１ＴＤ０、Ｓ２ＧΔＨＲ２－５ＧＳ－１ＴＤ０、Ｓ２ＧΔＨＲ２－５ＧＳ－ＦＲ、Ｓ２ＧΔＨＲ２－５ＧＳ－Ｅ２ｐ－Ｌ４ＰおよびＳ２ＧΔＨＲ２－１０ＧＳ－Ｉ３－０１ｖ９－Ｌ７Ｐ）についての、３つの被覆抗原に対するＥＬＩＳＡで測定されたＥＤ５０力価の要約が列挙されている。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．４．３でＥＤ５０値を計算した。注目すべきことに、より高い精度を達成するために、ＯＤ４５０の下限／上限制約を０．０／３．２に設定することによって、ｗ２におけるＥＤ５０値を導出した。 図４は、マウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン誘導性抗体応答の追加の結果を示す図である。図には、５つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクベースのワクチン群（Ｓ２Ｐ－５ＧＳ－１ＴＤ０、Ｓ２ＧΔＨＲ２－５ＧＳ－１ＴＤ０、Ｓ２ＧΔＨＲ２－５ＧＳ－ＦＲ、Ｓ２ＧΔＨＲ２－５ＧＳ－Ｅ２ｐ－Ｌ４ＰおよびＳ２ＧΔＨＲ２－１０ＧＳ－Ｉ３－０１ｖ９－Ｌ７Ｐ）についての、２つの偽ウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１－ｐｐおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ｐｐに対する中和アッセイで測定されたＩＤ５０力価の要約が列挙されている。ＩＤ５０値をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．４．３で、中和％の下限／上限制約を０．０／１００．０に設定して計算した。 図５は、マウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン誘導性Ｔ細胞応答の結果を示す図である。（Ａ）－（Ｂ）：ワクチン誘導性ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫。ｗ１１のマウス由来の脾細胞を、Ｓ２ＰＥＣＴＯスパイク（１×１０－７ｍＭ）、Ｅ２ｐ ＳＡｐＮＰ（１×１０－７ｍＭ）およびＩ３－０１ｖ９ ＳＡｐＮＰ（１×１０－７ｍＭ）をパルスしたＤＣの存在下で、それぞれ（Ａ）１６時間および（Ｂ）４時間培養した。（Ｃ）＆（Ｄ）：ワクチン誘導性ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫。ｗ１１のマウス由来の脾細胞を、Ｓ２ＰＥＣＴＯスパイク（１×１０－７ｍＭ）、Ｅ２ｐ ＳＡｐＮＰ（１×１０－７ｍＭ）およびＩ３－０１ｖ９ ＳＡｐＮＰ（１×１０－７ｍＭ）をパルスしたＤＣの存在下で、それぞれ（Ｃ）１６時間および（Ｄ）４時間培養した。５匹のナイーブマウス由来の脾細胞を対照試料として使用し、ＰＢＳで培養した。プロットは、細胞画分の頻度を示す。Ｐ値を一方向ＡＮＯＶＡ分析によって決定した。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１。
Ｉ．概要
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（別名ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の場合、ウイルスゲノムはスパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）、およびヌクレオカプシド（Ｎ）構造タンパク質をコードし、その中でＳ糖タンパク質は、そのＳ１サブユニット内の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を介した宿主受容体の結合、ならびにその後の膜融合、およびそのＳ２サブユニットによって駆動されるウイルス侵入を担う。可能な膜融合プロセスが提案されている。受容体結合は、ＲＢＤを「直立」状態に保つのに役立ち、それによってＳ１サブユニットのＳ２サブユニットからの解離が促進される。Ｓ１サブユニットがＳ２サブユニットから解離すると、第２のＳ２’切断が融合ペプチドを放出することができる。接続領域、ＨＲ１領域および中心ヘリックスは、融合ペプチドを宿主細胞膜に挿入するための非常に長いヘリックス（≧２００Å）を形成する。最後に、ＨＲ１およびＨＲ２領域はコイル状構造を形成し、ウイルス膜と宿主膜とを融合するために６ヘリックスバンドルに集合する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について解明されたすべての融合前Ｓ構造において、ウイルス膜近位のＨＲ２領域は不可視であり、ＨＲ２の高い移動性を示す。ＲＢＤは、コアサブドメインと、受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）とを含む。コアサブドメインは３つのコロナウイルス間で非常に類似しているが、それらのＲＢＭは著しく異なり、異なる受容体特異性をもたらす：ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を認識するが、ＭＥＲＳ－ＣｏＶはジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）に結合する。Ｓ糖タンパク質は表面露出しており、宿主細胞への侵入を媒介するので、感染時の中和抗体（ＮＡｂ）の主な標的であり、ワクチン設計の焦点である。Ｓ三量体は、適切な折り畳みおよびＮＡｂへのアクセス可能性の調節に重要なＮ結合グリカンで広範囲に装飾されている。
本発明は、２つの合理的な戦略に基づいて３つの高病原性β－コロナウイルスである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のためのナノ粒子ワクチンを設計するために本発明者らが着手した研究に部分的に基づいている。第１の戦略では、本発明者らは、ナノ粒子上にディスプレイする前に、Ｓの様々な領域、特にＨＲ１およびＨＲ２における準安定性の原因を排除することによって、融合前コンフォメーションでＳ三量体を安定化させることを目的とした。第２のワクチン戦略では、本発明者らは、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質超接着系を利用して、ＲＢＤ提示ナノ粒子を作製した。いくつかのＳタンパク質由来免疫原ポリペプチドおよびナノ粒子ワクチン構築物を設計に基づいて作製し、活性について試験した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）スパイクタンパク質を用いて本明細書において例示されるように、本発明の操作されたスパイク免疫原ポリペプチドは、操作されていない対照ポリペプチドと比較してより安定であり、より最適なワクチン設計を表す。本明細書に記載のそれらの有利な生化学的および構造的特性は、それらが工業的環境における迅速かつ大規模なワクチン製造に適していることを示している。インビボで試験した場合、操作されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原（例えば、Ｓ２ＧΔＨＲ２）は、単独で、または自己集合性ナノ粒子プラットフォーム（ＳＡｐＮＰ）上に提示されて、強力な抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＡｂ応答を誘発するために、非操作対照タンパク質よりも有効であることが分かった。本明細書の実施例に詳述されているように、本発明の例示的なナノ粒子ワクチン、例えばＳ２ＧΔＨＲ２提示Ｉ３－０１ｖ９ ＳＡｐＮＰはまた、強力なＴｈ１応答ならびに細胞防御免疫に必要な他のタイプのＴ細胞応答を誘発することができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に関する本明細書の例示の研究から得られた結果は、本発明の操作されたスパイク免疫原ポリペプチドが、人体試験における評価のためのより効果的な次世代ワクチン候補を提供することを示している。
本発明は、本明細書に記載される研究および例示される設計によるコロナウイルス免疫原およびワクチン組成物を提供する。関連するポリヌクレオチド配列、発現ベクターおよび医薬組成物もまた本発明において提供される。様々な実施形態では、ウイルスベクターによって担持されるタンパク質または核酸（ＤＮＡ／ｍＲＮＡ）の形態の安定化Ｓ三量体およびＲＢＤタンパク質を、コロナウイルスのワクチンとして使用することができる。さらに、安定化Ｓ三量体およびＲＢＤを提示するナノ粒子は、ＶＬＰ型コロナウイルスワクチンとして使用することができる。
本発明のコロナウイルスＳタンパク質ベースの免疫原およびワクチンは、いくつかの有利な特性を有する。保存された中和エピトープをそれらの天然様コンフォメーションで提示する本明細書に記載のＳ三量体設計は、Ｓ三量体をワクチン抗原として使用すること、またはナノ粒子上に多価にディスプレイ可能にする。本発明のナノ粒子ワクチンは、３つの異なるコロナウイルスに由来するＳ三量体を、１２．２～２５．０ｎｍの範囲のサイズを有するフェリチン、Ｅ２ｐおよびＩ３－０１などの周知のナノ粒子プラットフォーム上にディスプレイ可能にする。さらに、高安定性中空ナノケージ（Ｅ２ｐおよび１ＶＬＷ／Ｉ３－０１変異体）の使用は、ナノケージ内のロックドメイン（ＬＤ）、Ｔ細胞エピトープ（例えばＰＡＤＲＥ）、およびペプチドアジュバントの操作を可能にし、したがってオールインワンワクチン溶液を提供する。すべてのＳ三量体提示ナノ粒子は、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞において高収率で産生され得る。ＣＨＯは、タンパク質治療薬およびワクチンの工業的製造に使用される主要な哺乳動物細胞株の１つであり、ＥｘｐｉＣＨＯはこのＣＨＯ細胞株の一過性バージョンであるため、ＥｘｐｉＣＨＯによる産生から得られるナノ粒子は、工業的ＣＨＯ生産によるナノ粒子と同じ特性を有すると予想される。さらに、抗体およびＳＥＣ精製ａを用いてＥｘｐｉＣＨＯ細胞で産生されたＳ提示ナノ粒子の高収率は、工業生産のための単純で堅牢で費用効果の高い製造プロセスの開発を可能にするものである。
本明細書において特に指定されない限り、本発明のワクチン免疫原、コードポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞、ならびに関連する治療適用はすべて、本明細書に例示される手順または当技術分野で周知の日常的に実施される方法に従って生成または実施することができる。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ２８９：Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊ．Ｎ．Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｍ．Ｉ．Ｓｉｍｏｎ，Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ（Ｅｄｉｔｏｒｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９７）（ＩＳＢＮ－１３：９７８－０１２１８２１９０６）；米国特許第４，９６５，３４３号および同第５，８４９，９５４号；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，（３ｒｄ ｅｄ．，２０００）；Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｒｉｎｇｂｏｕ ｅｄ．，２００３）；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９８６）；またはＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｖｏｌ．１５２，Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ａ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｒｌ Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ（１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ）（Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ．ａｌ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＣＢ）（Ｊｕａｎ Ｓ．Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ ｅｔ．ａｌ．ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、およびＣｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｂｙ Ｒ．Ｉａｎ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ；５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５７，Ｊｅｎｎｉｅ Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｂａｒｎｅｓ ｅｄｉｔｏｒｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９８）を参照されたい。以下のセクションは、本発明の組成物および方法を実施するためのさらなる指針を提供する。
特に明記しない限り、本明細書で使用される「少なくとも（ａｔ ｌｅａｓｔ）」または「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ ｏｆ）」という表現は、文脈および使用から特に理解されない限り、その表現の後の列挙された対象のそれぞれ、および列挙された対象の２つ以上の様々な組み合わせを個々に含む。３つ以上の列挙された対象に関連する「および／または」という表現は、文脈から特に理解されない限り、同じ意味を有すると理解されるべきである。
用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」の使用は、その文法上の等価物を含めて、一般に、制限のない非限定的なものとして理解されるべきであり、例えば、特に明記しない限り、または文脈から理解されない限り、列挙されていないさらなる要素またはステップを除外しない。
「約」という用語の使用が定量値の前にある場合、本発明は、特に明記しない限り、特定の定量値自体も含む。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特に指示または推論されない限り、公称値から±１０％の変動を指す。
特に明記しない限り、ステップの順序または特定の動作を実行するための順序は、本発明が依然として実施可能である限り重要ではない。さらに、２つ以上のステップまたは動作が同時に行われてもよい。
特に明記しない限り、本明細書におけるありとあらゆる例、または例示的な言語、例えば「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に不可欠な特許請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
ＩＩ．定義
他に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｒｒｉｓ（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１ｓｔ ｅｄ．，１９９２）；Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（ｒｅｖｉｓｅｄ ｅｄ．，２０００）；Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｃ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ（Ｅｄ．），Ａｎｍｏｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（３ｒｄｅｄ．，２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈｕｎｔ（Ｅｄ．），Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ（１ｓｔｅｄ．，１９９９）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｈｌｅｒ（Ｅｄ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｔｅｌｏｓ（１９９４）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ ａｎｄ Ａｎａｎｄａｎｄ（Ｅｄｓ．），Ａｎｍｏｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；およびＡ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｐａｐｅｒｂａｃｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ），Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｈｉｎｅ（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（４ｔｈｅｄ．，２０００）。本発明に具体的に適用されるこれらの用語のいくつかのさらなる明確化が、本明細書に提供される。
本明細書で使用される場合、「抗原」または「免疫原」という用語は互換的に使用され、対象において免疫応答を誘導することができる物質、典型的にはタンパク質を指す。この用語はまた、対象に投与されると（直接的に、またはタンパク質をコードするヌクレオチド配列もしくはベクターを対象に投与することによって）、そのタンパク質に対する体液性および／または細胞性の免疫応答を惹起することができるという意味で免疫学的に活性なタンパク質を指す。特に明記しない限り、「ワクチン免疫原」という用語は、「タンパク質抗原」または「免疫原ポリペプチド」と互換的に使用される。
「保存的に改変された変異体」という用語は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。ポリペプチド配列の場合、「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸残基が類似の電荷の側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換された、保存的アミノ酸置換を有する変異体を指す。類似の電荷の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有する（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有する（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有する（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有する（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖を有する（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有する（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）アミノ酸が含まれる。
エピトープとは、抗原決定基を指す。これらは、特異的免疫応答を誘発するような、抗原性である分子上の特定の化学基またはペプチド配列であり、例えば、エピトープは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原の領域である。エピトープは、連続アミノ酸またはタンパク質の三次折り畳みによって並置された非連続アミノ酸の両方から形成され得る。
ワクチンまたは他の薬剤の有効量は、肺炎などの状態または疾患の徴候または症状を軽減または排除するなど、所望の応答を生成するのに十分な量である。例えば、これは、ウイルス複製を阻害するため、またはウイルス感染の表面上の症状を測定可能に変化させるために必要な量であり得る。一般に、この量は、ウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の複製または感染性を測定可能に阻害するのに十分と思われる。対象に投与される場合、ウイルス複製のインビトロ阻害を達成することが示されている標的組織濃度を達成する投与量が一般に使用される。いくつかの実施形態では、「有効量」は、例えばコロナウイルス感染症を治療するために、障害または疾患のいずれかの１つ以上の症状および／または根本原因を治療する（予防を含む）ものである。いくつかの実施形態では、有効量は治療有効量である。いくつかの実施形態では、有効量は、特定の疾患または状態の１つ以上の徴候または症状、例えばコロナウイルス感染に関連する１つ以上の徴候または症状の発症を防ぐ量である。
特に明記しない限り、融合タンパク質は、単一のタンパク質を作製するためにペプチド結合を介して互いに連結された少なくとも２つの無関係なタンパク質由来のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質である。したがって、本明細書に記載の融合（Ｆ）タンパク質と呼ばれる天然に存在するコロナウイルス表面抗原を包含しない。無関係なアミノ酸配列は、互いに直接連結されても、またはリンカー配列を使用して連結されてもよい。本明細書で使用される場合、タンパク質は、それらのアミノ酸配列がそれらの天然環境（例えば、細胞の内部）においてペプチド結合を介して共に連結されていることが通常見出されない場合、無関係である。例えば、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ジヒドロリポイルアシルトランスフェラーゼ（Ｅ２ｐ）などの細菌酵素のアミノ酸配列と可溶性コロナウイルスＳ糖タンパク質のアミノ酸配列とは、通常、ペプチド結合を介して一緒に連結して見出されることはない。
免疫原は、哺乳動物、例えば、病原体に感染しているかまたは感染のリスクがある哺乳動物において免疫応答を誘導することができるタンパク質またはその一部である。免疫原の投与は、目的の病原体に対する防御免疫および／または予防免疫（ｐｒｏａｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）をもたらし得る。
免疫原性組成物とは、免疫原性ポリペプチドを発現するウイルスに対して測定可能なＣＴＬ応答を誘導するか、または免疫原性ポリペプチドに対して測定可能なＢ細胞応答（抗体の産生など）を誘導する免疫原性ポリペプチドを含む組成物を指す。
２つ以上の核酸配列または２つ以上のアミノ酸配列の間の配列同一性または類似性は、これらの配列間の同一性または類似性に関して表される。配列同一性は、同一性パーセントに関して測定することができる。パーセンテージが高いほど、配列はより同一である。２つの配列が、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または手動アライメントおよび目視検査によって測定して、比較ウィンドウまたは指定された領域にわたって最大の一致に関して比較およびアライメントされた場合、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドの指定されたパーセンテージ（すなわち、指定された領域にわたって、または指定されない場合、配列全体にわたって、６０％の同一性、任意選択で６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性）を有する場合、２つの配列は「実質的に同一」である。同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）長の領域にわたって、またはより好ましくは１００～５００もしくは１０００もしくはそれを超えるヌクレオチド（または２０、５０、２００以上のアミノ酸）長の領域にわたって存在してもよい。
核酸またはアミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準的な方法を使用してアライメントさせた場合、比較的高度の配列同一性／類似性を保有する。比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野において周知である。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ，７３：２３７－４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０８８１－９０，１９８８；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｓ．ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ８，１５５－６５，１９９２；およびＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２４：３０７－３１，１９９４に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０には、配列アラインメント方法および相同性計算の詳細な考察が提示されている。
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＳｐｙＴａｇとは、ストレプトコッカス・ピロゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＦｂａＢのＣｎａＢ２ドメインの、フィブロネクチン結合ＭＳＣＲＡＭＭ、と病原性因子との内部イソペプチド結合に基づくタンパク質ライゲーション系を指す。例えば、Ｔｅｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２；２７７：４７４２８－４７４３５；およびＺａｋｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１２；１０９：Ｅ６９０－Ｅ６９７を参照されたい。これは、同族の１３アミノ酸ペプチド（ＳｐｙＴａｇ）を認識するストレプトコッカス・ピロゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）表面タンパク質（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ）由来の改変ドメインを利用する。認識すると、２つは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのリジンの側鎖とＳｐｙＴａｇのアスパラギン酸との間に共有結合性イソペプチド結合を形成する。この技術は、他の用途の中でも、共有結合的に安定化された多タンパク質複合体を作製するため、モジュール式ワクチン製造のため、およびタンパク質を標識するため（例えば、顕微鏡検査用）に使用されてきた。ＳｐｙＴａｇ系は、タグが標的タンパク質の露出位置に遺伝的に融合することができる短い折り畳まれていないペプチドであるため汎用性があり、同様に、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、ＧＦＰなどのレポータータンパク質およびエピトープまたは精製タグに融合することができる。
「対象」という用語は、哺乳動物、例えばヒトおよび非ヒト哺乳動物として分類される任意の動物を指す。非ヒト動物の例としては、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどが挙げられる。特に明記しない限り、「患者」または「対象」という用語は本明細書では互換的に使用される。好ましくは、対象はヒトである。
「治療する」または「緩和する」という用語は、疾患（例えば、コロナウイルス感染症）の症状、合併症、または生化学的徴候の発症を予防または遅延させるため、疾患、状態もしくは障害の症状を緩和するため、またはさらなる発症を停止もしくは阻害するための、化合物または薬剤の対象への投与を含む。治療を必要とする対象には、疾患または障害に既に罹患している対象ならびに障害を発症するリスクがある対象が含まれる。治療は、疾患の発現後の症状の予防的（疾患の発症を予防もしくは遅延させるため、またはその臨床症状もしくは不顕性症状の発現を予防するため）または治療的抑制もしくは緩和であり得る。
ワクチンは、対象において予防的または治療的な免疫応答を誘発する医薬組成物を指す。場合によっては、免疫応答は防御免疫応答である。典型的には、ワクチンは、病原体、例えばウイルス病原体の抗原に対する、または病理学的状態と互いに関係がある細胞成分に対する抗原特異的免疫応答を誘発する。ワクチンは、ポリヌクレオチド（開示される抗原をコードする核酸など）、ペプチドまたはポリペプチド（開示される抗原など）、ウイルス、細胞または１つ以上の細胞成分を含み得る。本発明のいくつかの実施形態では、ワクチンまたはワクチン免疫原またはワクチン組成物は、融合構築物から発現され、表面に免疫原ポリペプチドまたはタンパク質をディスプレイするナノ粒子に自己集合する。
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）とは、いくつかのウイルスのいずれかに由来する非複製的ウイルスシェルを指す。ＶＬＰは、一般に、限定するものではないが、キャプシド、コート、シェル、表面および／もしくはエンベロープタンパク質と呼ばれるタンパク質、またはこれらのタンパク質に由来する粒子形成ポリペプチドなどの１つ以上のウイルスタンパク質で構成される。ＶＬＰは、適切な発現系におけるタンパク質の組換え発現時に自発的に形成し得る。特定のＶＬＰを作製する方法は、当技術分野において公知である。ウイルスタンパク質の組換え発現後のＶＬＰの存在は、当技術分野において公知の従来の技術を使用して、例えば電子顕微鏡法、生物物理学的特性評価などによって検出することができる。例えば、Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６０：１４４５－１４５６；およびＨａｇｅｎｓｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：４５０３－４５０５を参照されたい。例えば、ＶＬＰは、密度勾配遠心分離によって単離することができ、および／または特徴的な密度バンディングによって同定することができる。あるいは、問題のＶＬＰ調製物のガラス化水性試料に対して低温電子顕微鏡を実施し、適切な曝露条件下で画像を記録することができる。
自己集合性ナノ粒子とは、直径が数十ナノメートルであり、ＶＬＰと同様の外観を有するナノ粒子に自動的に集合することができる非ウイルス性タンパク質の同一のコピーによって形成される、明確な表面形状を有するボール形状タンパク質シェルを指す。公知の例としては、種にわたって保存されており、２４量体を形成するフェリチン（ＦＲ）、ならびにＢ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のジヒドロリポイルアシルトランスフェラーゼ（Ｅ２ｐ）、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）のルマジンシンターゼ（ＬＳ）、およびテルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）のエンカプスリン（これらはすべて６０量体を形成する）が挙げられる。自己集合性ナノ粒子は、適切な発現系におけるタンパク質の組換え発現時に自発的に形成し得る。ナノ粒子の生成、検出および特性評価のための方法は、ＶＬＰのために開発されたものと同じ技術を用いて行うことができる。
ＩＩＩ．再設計されたコロナウイルス可溶性Ｓ免疫原
本発明は、ワクチン組成物を生成するために使用することができる、コロナウイルスの再設計されたまたは改変された可溶性Ｓ配列を提供する。再設計された可溶性Ｓ三量体免疫原またはタンパク質は、コロナウイルスの野生型可溶性Ｓ配列に改変を導入することによって安定化される。特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株または分離株のいくつかの特定の野生型可溶性Ｓ配列、例えば、配列番号１～３が本明細書において例示される。所与のコロナウイルスの異なる分離株または株間の機能的類似性および配列相同性のために、他の公知のコロナウイルスＳタンパク質オルソログ配列に由来する再設計された可溶性Ｓ免疫原も、本明細書に記載の再設計戦略に従って作製することができる。文献に記載されている多くの公知のコロナウイルスＳタンパク質配列が存在する。例えば、Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４３２：３３０９－２５，２０２０；Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２６：４５０－４５２，２０２０；Ｗａｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １８０：２８１－２９２，２０２０；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．１９：１３５１－１３６０，２０２０；Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ ２１：１３１－１４３．；２０１７；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５４３－５５０，２０１４；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．１３３：１６５－１７７，２０１６；Ｂｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：８８０１－８８１１，２００３；Ｌｉｏ ｅｔ ａｌ．，ＴＲＥＮＤＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：１０６－１１１，２００４；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．２：７３，２００５；およびＬｉ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｖｉｒｏｌ．３：２３７－２６１，２０１６を参照されたい。
本明細書で詳述するように、本発明のいくつかの再設計された可溶性Ｓ免疫原ポリペプチドは、融合前Ｓ構造の安定性を高め得る変異を含む。これらには、Ｓ１／Ｓ２切断部位を不活性化する変異、およびＨＲ１とＣＨとの間のターン領域のすべての歪みを除去する、すなわち融合中の直鎖ヘリックスの形成を防止するＨＲ１の変異が含まれる。いくつかの実施形態では、放棄された（ｒｅｓｉｇｎｅｄ）可溶性Ｓ免疫原ポリペプチドは、ＨＲ２モチーフのトランケーションをさらに含み得る。ＨＲ２ドメインのトランケーションは、ＨＲ１／ＨＲ２融合コアの破壊をもたらし、融合前Ｓ構造を安定化する。
いくつかの操作された可溶性Ｓ免疫原ポリペプチドは、ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こしたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに由来する。これらのポリペプチドのいくつかは、改変されたＳ１／Ｓ２切断部位を含む。例示として、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原ポリペプチドを操作するために使用される野生型可溶性Ｓ配列を、配列番号３またはＮ末端リーダー短縮可溶性Ｓ配列（配列番号１４）に示す。他の実施形態では、使用される野生型可溶性Ｓ配列は、配列番号３または１４の変異体、例えば、その実質的に同一な、もしくは保存的に改変された変異体であり得る。ｃｒｙｏ－ＥＭモデルＰＤＢ ＩＤ ６ＶＳＢまたはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＮ９０８９４７．３に基づくアミノ酸ナンバリングを参照として使用すると、改変された切断部位は６８２ＧＳＡＧＳＶ６８７（配列番号１８）を含む。この切断部位の不活性化は、その部位の内または周囲のいくつかの配列変更（例えば、欠失または置換）によって達成することができる。タンパク質の構造に他の影響を与えることなく切断部位を不活性化する１つの変異は、本明細書中に例示されるように、切断部位の残基６８２ＲＲＡＲ６８５（配列番号１９）のＧＳＡＧ（配列番号２０）による置換である。切断部位の不活性化に加えて、可溶性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原性ポリペプチドは、直鎖ヘリックスの形成を妨げることによって融合中のターン領域（ＨＲ１モチーフとＣＨモチーフとの間）の歪みを除去する、ＨＲ１領域の二重変異をさらに含み得る。様々な実施形態では、この二重変異は、Ｋ９８６Ｇ／Ｖ９８７Ｇ、Ｋ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｐ，、Ｋ９８６Ｇ／Ｖ９８７ＰまたはＫ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｇであり得る。
融合前Ｓ構造を安定化する上記の変異への追加またはその代替として、本発明のいくつかのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原ポリペプチドは、ＨＲ２ドメインのかなりの部分または全体の欠失を含むことができる。例示するために配列番号３の例示的な可溶性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ配列を使用すると、この欠失はアミノ酸残基１１５０～１２０８（配列番号９）を包含し得る。様々な他の実施形態では、欠失は、配列番号３の最初の３５、４０、４５、５０、５５またはそれ以上のＣ末端残基のトランケーションであり得る。さらにいくつかの他の実施形態では、野生型可溶性Ｓ配列のＣ末端トランケーションは、ＨＲ２ドメインを超えて伸長し得る。これらの実施形態のいくつかでは、配列番号３の残基１１３９～１１４９（配列番号１０）からなる領域の１つ以上の残基も欠失させることができる。これらの実施形態のいくつかでは、Ｃ末端短縮可溶性Ｓ配列は、例えば、配列番号３の残基１１３９～１１４９をトリペプチドモチーフ、ＧＮＳで置換することによって、挿入されたこのモチーフを含み得る。本明細書に記載されるように、このトリペプチドモチーフは、免疫原ポリペプチドがナノ粒子上にディスプレイされると、タンパク質収量を増加させるように機能する。いくつかの他の実施形態では、可溶性Ｓ配列は、配列番号１５に示されるＮ末端リーダー配列を含み得る。
本発明のいくつかのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原ポリペプチドでは、野生型可溶性Ｓ配列のさらなる変異を導入して、融合後Ｓ構造を不安定化することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上のプロリンおよび／またはグリシン置換を、ＨＲ２と相互作用して融合コアを形成するＨＲ１の領域において操作することができる。これらの変異は、６ヘリックスバンドル融合コアを破壊するように機能する。様々な実施形態では、変異は、Ａ９４２Ｐ、Ｓ９４３Ｐ、Ａ９４４Ｐ、Ａ９４２Ｇ、Ｓ９４３ＧおよびＡ９４４Ｇを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなるアミノ酸残基を、ＨＲ２と相互作用して融合コアを形成するＨＲ１の領域内に挿入することができる。同様に、これらの挿入もまた、融合コアの螺旋パターンを破壊するように機能する。様々な実施形態では、挿入は、Ａ９４２～Ａ９４４の任意の残基間へのＧまたはＧＳの挿入であり得る。
本明細書の実施例に詳述されているように、いくつかの特定の操作されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原ポリペプチドは、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク外部ドメインポリペプチドまたは二重プロリン変異を含む周知のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチド（「Ｓ２Ｐ」）と比較して免疫原特性の増強を実証した。これらの例示的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチドの１つは、配列番号３２に示されるＳ２ＧΔＨＲ２である。野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク外部ドメイン配列（配列番号３）と比較して、Ｓ２ＧΔＨＲ２は、Ｓ１／Ｓ２切断部位配列６８２ＲＲＡＲＳＶ６８７（配列番号３１）がＧＳＡＧＳＶ（配列番号１８）で置き換えられる置換を含む。それはまた、ＨＲ１にＫ９８６Ｇ／Ｖ９８７Ｇ二重変異も含む。さらに、それはＨＲ２領域（Ｅ１１５０～Ｑ１２０８）が除去されている。本明細書に記載されるように、この操作されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原ポリペプチドは高純度三量体を生成し、スパイクの準安定性の実質的な低下を示した。これはまた、ＥＬＩＳＡアッセイおよびバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）アッセイの両方において、スパイクに特異的な代表的ｍＡｂに対してより高い親和性を示した。自己集合性ナノ粒子足場上にディスプレイされた場合、この操作されたタンパク質は、産生における満足のいく収率、純度、安定性および構造完全性を示したが、野生型スパイクおよび二重プロリン変異を有する広く使用されているスパイクは、いずれのＮＰ足場上でも発現することができなかった。ＮＰによりディスプレイされるＳ２ＧΔＨＲ２は、ｍＡｂ／Ｎａｂのパネルに対して試験した場合も、改善された抗原性を示した。インビボで試験した場合、この操作されたスパイクをディスプレイするＮＰワクチンはまた、対照ＮＰよりも最大１０倍強い中和抗体応答を誘発した。
操作されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質「Ｓ２ＧΔＨＲ２」（配列番号３２）の配列を以下に示す。この配列では、Ｎ末端リーダーはイタリック体で示し、変異したＳ１／Ｓ２切断部位には下線を付し、置換された９８６ＧＧ９８７残基は下線を付してイタリック体で示す。
ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＧＳＡＧＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＡＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＧＧＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫ
いくつかの操作された可溶性Ｓ免疫原ポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスに由来する。これらのポリペプチドのいくつかは、改変されたＳ１／Ｓ２切断部位を含む。例示として、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ免疫原ポリペプチドを操作するために使用される野生型可溶性Ｓ配列を、配列番号１またはＮ末端リーダー短縮可溶性Ｓ配列（配列番号７）に示す。他の実施形態では、使用される野生型可溶性Ｓ配列は、配列番号１または７の変異体、例えば、その実質的に同一な、もしくは保存的に改変された変異体であり得る。ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ５９５９４またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿８２８８５１に基づくアミノ酸ナンバリングを参照として使用して、改変された配列は、Ｓ１／Ｓ２切断部位の不活性化をもたらすＲ６６７Ｇ置換を含み得る。切断部位の不活性化に加えて、可溶性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ免疫原性ポリペプチドは、融合中の直鎖ヘリックスの形成を防止することによってターン領域の歪みを除去する、ＨＲ１領域における二重変異をさらに含み得る。様々な実施形態では、この二重変異は、Ｋ９６８Ｇ／Ｖ９６９Ｇ、Ｋ９６８Ｐ／Ｖ９６９Ｐ、Ｋ９６８Ｇ／Ｖ９６９ＰまたはＫ９６８Ｐ／Ｖ９６９Ｇであり得る。
融合前Ｓ構造を安定化する上記の変異への追加またはその代替として、本発明のいくつかのＳＡＲＳ－ＣｏＶ免疫原ポリペプチドは、ＨＲ２ドメインのかなりの部分または全体の欠失を含むことができる。例示するために配列番号１の例示的な可溶性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓ配列を使用すると、この欠失はアミノ酸残基１１３２～１１９０（配列番号９）を包含し得る。様々な他の実施形態では、欠失は、配列番号１の最初の３５、４０、４５、５０、５５またはそれ以上のＣ末端残基のトランケーションであり得る。さらにいくつかの他の実施形態では、野生型可溶性Ｓ配列のＣ末端トランケーションは、ＨＲ２ドメインを超えて伸長し得る。これらの実施形態のいくつかでは、配列番号１の残基１１２１～１１３１（配列番号１０）からなる領域の１つ以上の残基も欠失させることができる。これらの実施形態のいくつかでは、Ｃ末端短縮可溶性Ｓ配列は、例えば、配列番号１の残基１１２１～１１３１をトリペプチドモチーフ、ＧＮＳで置換することによって、挿入されたこのモチーフを含み得る。本明細書に記載されるように、このトリペプチドモチーフは、免疫原ポリペプチドがナノ粒子上にディスプレイされると、タンパク質収量を増加させるように機能する。いくつかの他の実施形態では、可溶性Ｓ配列は、Ｎ末端リーダー配列の短縮を有し得る。
本発明のいくつかのＳＡＲＳ－ＣｏＶ免疫原ポリペプチドでは、野生型可溶性Ｓ配列のさらなる変異を導入して、融合後Ｓ構造を不安定化することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上のプロリンおよび／またはグリシン置換を、ＨＲ２と相互作用して融合コアを形成するＨＲ１の領域において操作することができる。これらの変異は、６ヘリックスバンドル融合コアを破壊するように機能する。様々な実施形態では、変異は、Ｓ９２４Ｐ、Ｔ９２５Ｐ、Ａ９２６Ｐ、Ｓ９２４Ｇ、Ｔ９２５ＧおよびＡ９２６Ｇを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなるアミノ酸残基を、ＨＲ２と相互作用して融合コアを形成するＨＲ１の領域内に挿入することができる。同様に、これらの挿入もまた、融合コアの螺旋パターンを破壊するように機能する。様々な実施形態では、挿入は、Ａ９２４～Ａ９２６の任意の残基間へのＧまたはＧＳの挿入であり得る。
いくつかの操作された可溶性Ｓ免疫原ポリペプチドは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶウイルスに由来する。これらのポリペプチドのいくつかは、改変されたＳ１／Ｓ２切断部位を含む。例示として、本発明のＭＥＲＳ－ＣｏＶ免疫原ポリペプチドを操作するために使用される野生型可溶性Ｓ配列を、配列番号２またはＮ末端リーダー短縮可溶性Ｓ配列（配列番号１１）に示す。他の実施形態では、使用される野生型可溶性Ｓ配列は、配列番号２または１１の変異体、例えば、その実質的に同一な、もしくは保存的に改変された変異体であり得る。ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｒ９ＵＱ５３またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＸ８６９０５９．２に基づくアミノ酸ナンバリングを参照として使用して、改変された配列は、Ｓ１／Ｓ２切断部位の不活性化をもたらすＲ７４８Ａ／Ｒ７５１Ｇ二重変異を含み得る。切断部位の不活性化に加えて、可溶性ＭＥＲＳ－ＣｏＶ免疫原性ポリペプチドは、融合中の直鎖ヘリックスの形成を防止することによってターン領域の歪みを除去する、ＨＲ１領域の二重変異をさらに含み得る。様々な実施形態では、この二重変異は、Ｖ１０６０Ｇ／Ｌ１０６１Ｇ、Ｖ１０６０Ｐ／Ｌ１０６１Ｐ、Ｖ１０６０Ｇ／Ｌ１０６１ＰまたはＶ１０６０Ｐ／Ｌ１０６１Ｇであり得る。
融合前Ｓ構造を安定化する上記の変異への追加またはその代替として、本発明のいくつかのＭＥＲＳ－ＣｏＶ免疫原ポリペプチドは、ＨＲ２ドメインのかなりの部分または全体の欠失を含むことができる。例示するために配列番号２の例示的な可溶性ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓ配列を使用すると、この欠失はアミノ酸残基１２２９～１２９１（配列番号１３）を包含し得る。様々な他の実施形態では、欠失は、配列番号２の最初の３５、４０、４５、５０、５５、６０またはそれ以上のＣ末端残基のトランケーションであり得る。いくつかの他の実施形態では、可溶性Ｓ配列は、Ｎ末端リーダー配列の短縮を有し得る。
本発明のいくつかのＭＥＲＳ－ＣｏＶ免疫原ポリペプチドでは、野生型可溶性Ｓ配列のさらなる変異を導入して、融合後Ｓ構造を不安定化することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上のプロリンおよび／またはグリシン置換を、ＨＲ２と相互作用して融合コアを形成するＨＲ１の領域において操作することができる。これらの変異は、６ヘリックスバンドル融合コアを破壊するように機能する。様々な実施形態では、変異は、Ｔ１０１３Ｐ、Ｔ１０１４Ｐ、Ｔ１０１５Ｐ、Ｔ１０１３Ｇ、Ｔ１０１４ＧおよびＴ１０１５Ｇを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなるアミノ酸残基を、ＨＲ２と相互作用して融合コアを形成するＨＲ１の領域内に挿入することができる。同様に、これらの挿入もまた、融合コアの螺旋パターンを破壊するように機能する。様々な実施形態では、挿入は、Ｔ１０１３～Ｔ１０１５の任意の残基間へのＧまたはＧＳの挿入であり得る。
上記の様々な置換および欠失に加えて、本発明の操作されたコロナウイルス可溶性Ｓ免疫原ポリペプチドは、Ｃ末端に三量体化モチーフをさらに含むことができる。本発明に適した三量体化モチーフとしては、例えば、Ｔ４フィブリチンフォルドン（ＰＤＢ ＩＤ：４ＮＣＶ）およびウイルスカプシドタンパク質ＳＨＰ（ＰＤＢ：１ＴＤ０）が挙げられる。Ｔ４フィブリチン（フォルドン）は当技術分野において周知であり、バクテリオファージＴ４由来の三量体タンパク質フィブリチンのＣ末端３０アミノ酸残基を構成し、フィブリチンの折り畳みおよび三量体化を促進するのに機能する。例えば、Ｐａｐａｎｉｋｏｌｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：８９９１－８９９８，２００４；およびＧｕｔｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３７：９０５－９１５，２００４を参照されたい。同様に、ＳＨＰタンパク質および機能的三量体化モチーフ（ｍｏｔｉｓ）としてのその使用は、当技術分野において周知である。例えば、Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１１０：Ｅ８６９－Ｅ８７７，２０１３；およびＨａｎｚｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２４：１４０－１４７，２０１６を参照されたい。本明細書で例示される具体的なフォルドンおよびＳＨＰ配列は、ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（フォルドン；配列番号２６）およびＥＶＲＩＦＡＧＮＤＰＡＨＴＡＴＧＳＳＧＩＳＳＰＴＰＡＬＴＰＬＭＬＤＥＡＴＧＫＬＶＶＷＤＧＱＫＡＧＳＡＶＧＩＬＶＬＰＬＥＧＴＥＴＡＬＴＹＹＫＳＧＴＦＡＴＥＡＩＨＷＰＥＳＶＤＥＨＫＫＡＮＡＦＡＧＳＡＬＳＨＡＡ（１ＴＤ０；配列番号２７）である。いくつかの実施形態では、三量体化モチーフは、短いＧＳリンカーを介して再設計された可溶性Ｓ免疫原ポリペプチドに連結される。リンカーを含めることは、形成された三量体分子を安定化することを意図している。様々な実施形態では、リンカーは、ＧＳの１～６個のタンデムリピートを含み得る。いくつかの実施形態では、例えばニッケルカラムの使用によるタンパク質精製を容易にするために、Ｈｉｓ６タグを三量体化モチーフのＣ末端に付加することができる。
上記のＳ２ＧΔＨＲ２に加えて、本発明の他の例示的な操作されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を配列番号３３～３７に示す。配列番号３３は、Ｓ２ＧΔＨＲ２からそのＮ末端リーダーを差し引いた配列である。この配列を、三量体化モチーフのフォルドン（配列番号２６）および１ＴＤ０（配列番号２７）に融合した配列を、それぞれ配列番号３５および３６に示す。これらの２つの融合配列のそれぞれにおいて、制限部位ＡＳが、操作されたスパイクタンパク質のＣ末端に導入され、その後、Ｇ４Ｓリンカーを介して三量体化モチーフのＮ末端に接続される。配列番号３４は、ＨＲ１の交換を含有する配列番号３３の変異体である。具体的には、ＨＲ１領域Ｌ９２２～Ｓ９４３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイクタンパク質由来の等価領域に置き換えられる。本明細書に例示されるように、このＨＲ１が交換されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含有する、三量体化モチーフ（例えば、１ＴＤ０）との融合物は、ＨＲ２ストークが除去された場合にのみ満足のいく免疫原特性をディスプレイした。そのような融合物の一例を配列番号３７に示す。これらの例示された配列、実質的に同一な配列またはその保存的に改変された変異体のいずれも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン、例えばナノ粒子足場ワクチンを開発するために本発明で使用することができる。
操作されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクの配列：Ｓ２ＧΔＨＲ２（マイナスＮ末端リーダー）（配列番号３３）：
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Ｓ２ＧΔＨＲ２－フォルドン融合物の配列（配列番号３５）。当該配列において、導入された制限部位ＡＳはイタリック体で示して下線を付し、Ｇ４Ｓリンカーはイタリック体で示し、フォルドン配列には下線を付してある。
ＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＧＳＡＧＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＡＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＧＧＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＡＳＧＧＧＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ
Ｓ２ＧΔＨＲ２－１ＴＤ０融合物の配列（配列番号３６）。当該配列において、導入された制限部位ＡＳはイタリック体で示して下線を付し、Ｇ４Ｓリンカーはイタリック体で示し、１ＴＤ０配列には下線を付してある。
ＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＧＳＡＧＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＡＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＧＧＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＡＳＧＧＧＧＳＥＶＲＩＦＡＧＮＤＰＡＨＴＡＴＧＳＳＧＩＳＳＰＴＰＡＬＴＰＬＭＬＤＥＡＴＧＫＬＶＶＷＤＧＱＫＡＧＳＡＶＧＩＬＶＬＰＬＥＧＴＥＴＡＬＴＹＹＫＳＧＴＦＡＴＥＡＩＨＷＰＥＳＶＤＥＨＫＫＡＮＡＦＡＧＳＡＬＳＨＡＡ
ＨＲ１が交換されたＳ２ＧΔＨＲ２の配列（配列番号３４）：ＳＡＲｓ－ＣｏＶ－１由来のＨＲ１領域で置換した部分に下線を付してある。
ＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＧＳＡＧＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＱＩＡＮＱＦＮＫＡＩＳＱＩＱＥＳＬＴＴＴＳＴＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＧＧＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫ
ＨＲ１を交換したＳ２ＧΔＨＲ２と１ＴＤ０との融合配列（配列番号３７）。当該配列において、導入された制限部位ＡＳはイタリック体で示して下線を付し、Ｇ４Ｓリンカーはイタリック体で示し、１ＴＤ０配列には下線を付してある。
ＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＧＳＡＧＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＱＩＡＮＱＦＮＫＡＩＳＱＩＱＥＳＬＴＴＴＳＴＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＧＧＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＡＳＧＧＧＧＳＥＶＲＩＦＡＧＮＤＰＡＨＴＡＴＧＳＳＧＩＳＳＰＴＰＡＬＴＰＬＭＬＤＥＡＴＧＫＬＶＶＷＤＧＱＫＡＧＳＡＶＧＩＬＶＬＰＬＥＧＴＥＴＡＬＴＹＹＫＳＧＴＦＡＴＥＡＩＨＷＰＥＳＶＤＥＨＫＫＡＮＡＦＡＧＳＡＬＳＨＡＡ
ＩＶ．ナノ粒子ディスプレイコロナウイルスワクチン組成物
本発明は、コロナウイルスＳタンパク質に由来する少なくとも１つの免疫原ポリペプチドまたは三量体タンパク質をディスプレイする異種足場を含むワクチン組成物を提供する。いくつかの実施形態では、使用されるコロナウイルスＳ免疫原は、上記の様々な安定化変異を含む安定化可溶性Ｓポリペプチドである。いくつかの他の実施形態では、使用されるコロナウイルス免疫原は、コロナウイルスＳタンパク質のＲＢＤドメインを含有するか、またはそれに由来する。後者の実施形態では、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒライゲーション系が使用される。本明細書の実施例に詳述されているように、ＲＢＤ配列は、ＳｐｙＴａｇモチーフに融合することができ、ナノ粒子サブユニット配列は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒモチーフに融合することができる。あるいは、ＲＢＤ配列は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒモチーフに融合することができ、ナノ粒子サブユニット配列は、ＳｐｙＴａｇモチーフに融合することができる。例示されている実施形態では、使用されるＲＢＤ配列は、配列番号４～６のいずれか１つに示されている配列、またはその実質的に同一な、もしくは保存的に改変された変異体を含む。ＳｐｙＴａｇ融合物およびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合物を発現する２つの構築物を宿主細胞または産生細胞に導入すると、自己集合したナノ粒子へのＲＢＤタンパク質のＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ媒介ライゲーションの結果として、表面に一連のＲＢＤタンパク質をディスプレイするナノ粒子ワクチンが生成される。
本発明のワクチンの構築において免疫原タンパク質またはポリペプチドを提示するために、任意の異種足場を使用することができる。これには、バクテリオファージＱβ ＶＬＰなどのウイルス様粒子（ＶＬＰ）およびナノ粒子が含まれる。様々なナノ粒子プラットフォームを、本発明のワクチン組成物の作製に使用することができる。一般に、本発明で使用されるナノ粒子は、単一サブユニットの複数のコピーによって形成される必要がある。ナノ粒子は、典型的にはボール形状であり、および／または回転対称性（例えば、３倍軸および５倍軸を有する）を有し、例えば本明細書に例示される正二十面体構造を有する。追加的または代替的に、粒子サブユニットのアミノ末端は露出し、３倍軸に近接していなければならず、３つのアミノ末端の間隔は、ディスプレイされた三量体安定化可溶性Ｓタンパク質のカルボキシル末端の間隔と密接に一致しなければならない。
様々な実施形態では、使用される自己集合性ナノ粒子は、約２５ｎｍ以下（通常、１２、２４、または６０個のサブユニット（ｓｕｂｕｂｉｔ）から組み立てられる）の直径を有し、粒子表面に３倍軸を有する。このようなナノ粒子は、多価ワクチンを製造するのに適した粒子プラットフォームを提供する。いくつかの好ましい実施形態では、コロナウイルス免疫原タンパク質またはポリペプチドは、自己集合性ナノ粒子、例えば本明細書に例示されるフェリチン（ＦＲ）またはＥ２ｐに由来する自己集合性ナノ粒子上に提示され得る。本発明に適したナノ粒子の他の例としては、Ｉ３－０１に由来するナノ粒子が挙げられる。当技術分野において周知であり、日常的に使用されているフェリチンは、すべての動物、細菌および植物に見られる球状タンパク質である。当技術分野において周知のように、それは主に、水和鉄イオンおよびプロトンの石灰化コアへの、および石灰化コアからの輸送を介して多核Ｆｅ（ＩＩＩ）２Ｏ３形成の速度および位置を制御するように作用する。球状形態のフェリチンは、約１７～２０ ｋＤａの分子量を有するポリペプチドである単量体サブユニットタンパク質（単量体フェリチンサブユニットとも呼ばれる）で構成されている。Ｅ２ｐは、熱安定性６０量体ナノ粒子に自己集合することが示されている、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のジヒドロリポイルアシルトランスフェラーゼの再設計された変異体である。例えば、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．７：１２０４１，２０１６を参照されたい。同様に、Ｉ３－０１は、超安定ナノ粒子に自己集合することができる操作されたタンパク質である。例えば、Ｈｓｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５３５，１３６－１３９，２０１６を参照されたい。これらのタンパク質のサブユニットの配列は当技術分野において公知である。例えば、国際公開第２０１７／１９２４３４号を参照されたい。様々なナノ粒子足場の構造的および機能的特性、ならびに三量体タンパク質免疫原の提示におけるそれらの使用に関するより詳細な情報は、当技術分野において提供されている。例えば、国際公開第２０１７／１９２４３４号、国際公開第２０１９／０８９８１７号および国際公開第２０１９／２４１４８３号を参照されたい。様々な実施形態では、本発明のコロナウイルスワクチン組成物は、これらの公知のナノ粒子のいずれか、ならびにそれらの保存的に改変された変異体または実質的に同一な（例えば、少なくとも９０％、９５％または９９％同一）配列有する変異体を使用することができる。
上記のナノ粒子配列に加えて、当技術分野において公知の多くの他のナノ粒子またはＶＬＰも本発明の実施に使用することができる。これらには、例えば、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）のルマジンシンターゼ、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ Ｍａｒｉｔｉｍａ）のエンカプスリン、ミクソコッカス・キサンタス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ）のエンカプスリン、バクテリオファージＱベータウイルス粒子、フロックハウスウイルス（Ｆｌｏｃｋ Ｈｏｕｓｅ Ｖｉｒｕｓ）（ＦＨＶ）粒子、ＯＲＳＡＹウイルス粒子および感染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）粒子が含まれる。
いくつかの例示的な実施形態では、本発明のナノ粒子ワクチンは、配列番号２３（Ｉ３－０１ｖ９）、配列番号２４（Ｅ２ｐ）または配列番号２５（フェリチン）に示されるナノ粒子サブユニット配列、その保存的に改変された変異体または実質的に同一の配列を含有する。典型的には、操作されたコロナウイルス免疫原ポリペプチドのＣ末端は、自己集合性ナノ粒子（ＮＰ）のサブユニットのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、操作されたコロナウイルスのポリペプチドのＣ末端は、ＧＳリンカー配列、例えば、Ｇ４Ｓ（ＧＧＧＧＳ、配列番号２１）または（Ｇ４Ｓ）２（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号２２）を介して自己集合性ナノ粒子のナノ粒子サブユニット配列に融合される。
Ｉ３－０１ｖ９サブユニット配列（配列番号２３）
ＭＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＫＭＫＡＬＡＶＦＶＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＥＬＳＦＬＫＥＬＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＣＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＣＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤＮＶＣＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＩＡＥＶＡＡＫＡＡＡＦＶＥＫＩＲＧＣＴＥ
Ｅ２ｐサブユニット配列（配列番号２４）
ＡＡＡＫＰＡＴＴＥＧＥＦＰＥＴＲＥＫＭＳＧＩＲＲＡＩＡＫＡＭＶＨＳＫＨＴＡＰＨＶＴＬＭＤＥＡＤＶＴＫＬＶＡＨＲＫＫＦＫＡＩＡＡＥＫＧＩＫＬＴＦＬＰＹＶＶＫＡＬＶＳＡＬＲＥＹＰＶＬＮＴＡＩＤＤＥＴＥＥＩＩＱＫＨＹＹＮＩＧＩＡＡＤＴＤＲＧＬＬＶＰＶＩＫＨＡＤＲＫＰＩＦＡＬＡＱＥＩＮＥＬＡＥＫＡＲＤＧＫＬＴＰＧＥＭＫＧＡＳＣＴＩＴＮＩＧＳＡＧＧＱＷＦＴＰＶＩＮＨＰＥＶＡＩＬＧＩＧＲＩＡＥＫＰＩＶＲＤＧＥＩＶＡＡＰＭＬＡＬＳＬＳＦＤＨＲＭＩＤＧＡＴＡＱＫＡＬＮＨＩＫＲＬＬＳＤＰＥＬＬＬＭ
フェリチン配列（配列番号２５）
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ディスプレイされた可溶性Ｓ免疫原以外に、本発明のナノ粒子ワクチン組成物は、より良好な生物学的または薬学的特性のための追加のモチーフを含むことができる。これらの追加の構造成分は、ナノ粒子の表面上の免疫原ディスプレイを促進し、ディスプレイされた免疫原の安定性を増強し、および／または自己集合型タンパク質ワクチンの収量および純度を改善するように機能し得る。これらの実施形態では、１つ以上のリンカー（リンカー配列、モチーフまたは部分）を使用して、構築物中の様々な構造成分を接続することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子ワクチンは、免疫原ポリペプチドを安定化するのに役立つタンパク質ドメイン、例えば上記のＴ４フィブリチンの三量化モチーフ（「フォルドン」）、または免疫原ポリペプチドをナノ粒子表面から上昇させるのに役立つタンパク質ドメイン、例えば３ヘリックスバンドル（「ネックドメイン」）、または免疫親和性精製を促進するのに役立つタンパク質ドメイン、例えば公知の結合抗体を有するタンパク質ドメインのコード配列を含むことができる。これらの配列は、免疫原ポリペプチド配列とナノ粒子サブユニット配列との間に付加することができる。
これらの実施形態のいくつかでは、フォルドンおよびウイルスカプシドタンパク質ＳＨＰ（ＰＤＢ：１ＴＤ０）などの三量体化モチーフを、本明細書に例示する安定化可溶性Ｓタンパク質のＣ末端に付加することができる。上記のように、三量体化モチーフを短いＧＳリンカーを用いて挿入して、三量体をさらに安定化し、また総タンパク質収率内で三量体比率を増加させることができる。いくつかの実施形態では、化学的コンジュゲーションの活性部位として働くポリペプチド断片またはモチーフのコード配列を、構築物の適切な位置に挿入することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋ＴヘルパーエピトープまたはＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープなどの追加の構造成分もまた、ナノ粒子構築物の適切な位置に挿入することができる。これらには、例えば、本明細書中に例示されるようなＰＡＤＲＥ Ｔ－ヘルパーエピトープ（ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ；配列番号３０）が含まれる。いくつかの例示的実施形態では、Ｔヘルパーエピトープは、ロックドメインのＣ末端に挿入することができ、次いでロックドメインは、後述するＮＰサブユニット配列のＣ末端に融合される。
いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子ワクチンは、ナノ粒子を安定化するロックドメインを含むことができる。ロックドメインコード配列は、ナノ粒子サブユニットコード配列のＣ末端に直接または間接的に融合することができる。ロックドメインは、コロナウイルス免疫原ポリペプチドを提示するナノ粒子が製造、ワクチン製剤化および免疫化中に無傷のままであり得るように、ナノ粒子を内側から安定化する。このように構築されたナノ粒子ワクチン免疫原は、有意に増強された安定性を有する。一般に、本発明に適したロックドメインは、界面での非共有結合相互作用によって溶液中の別のタンパク質サブユニットと天然に二量体を形成することができるタンパク質サブユニットである。いくつかの好ましい実施形態では、２つのタンパク質サブユニットは、配列が同一であり、ホモ二量体を形成することができる。いくつかの他の実施形態では、２つのタンパク質サブユニットは、異なるタンパク質、または操作によって誘導された単一タンパク質の２つの異なるドメインであり得、界面での非共有結合相互作用によって溶液中でヘテロ二量体を形成することができる。典型的には、ロックドメインは、免疫原ポリペプチドが連結されているナノ粒子サブユニットに共有結合的に融合される。特定のロックドメインの例およびナノ粒子ディスプレイ三量体免疫原の構築におけるロックドメインの使用に関する指針は、当技術分野、例えば国際公開第２０１９／２４１４８３号に見出すことができる。いくつかの例示的実施形態では、使用されるＬＤは、配列番号２８（ＬＤ４）または２９（ＬＤ７）に示される配列、その保存的に改変された変異体または実質的に同一な配列を含む。
ロックドメインＬＤ４（配列番号２８）：
ＦＳＥＥＱＫＫＡＬＤＬＡＦＹＦＤＲＲＬＴＰＥＷＲＲＹＬＳＱＲＬＧＬＮＥＥＱＩＥＲＷＦＲＲＫＥＱＱＩＧＷＳＨＰＱＦＥＫ
ロックドメインＬＤ７（配列番号２９）：
ＳＰＡＶＤＩＧＤＲＬＤＥＬＥＫＡＬＥＡＬＳＡＥＤＧＨＤＤＶＧＱＲＬＥＳＬＬＲＲＷＮＳＲＲＡＤ
本明細書に記載の安定化コロナウイルス可溶性Ｓタンパク質免疫原のいずれかをディスプレイするナノ粒子（例えば、安定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２可溶性Ｓ三量体免疫原）は、免疫原ポリペプチドまたは多量体免疫原タンパク質のサブユニット（例えば、三量体免疫原）を、ナノ粒子のサブユニット（例えば、Ｅ２ｐまたはＩ３－０１サブユニット）、ならびに本明細書に記載の他の任意選択要素または代替要素（例えば、ロックドメインまたは三量化モチーフ）に融合することによって構築することができる。本発明のナノ粒子ディスプレイ融合ワクチン免疫原を構築するために、１つ以上のリンカーモチーフまたは部分を使用して、接続を容易にし、異なる成分の構造完全性を維持することができる。典型的には、リンカーモチーフは、短鎖ペプチド配列、例えばＧＳリッチペプチドを含む。様々な実施形態では、リンカーまたはリンカーモチーフは、それらの機能に干渉することなく２つのタンパク質ドメインまたはモチーフを接続する任意の柔軟なペプチドであり得る。例えば、使用されるリンカーは、（１）スパイクタンパク質およびナノ粒子足場配列、（２）スパイクタンパク質および三量体化モチーフ、ならびに／または（３）ナノ粒子足場配列およびロックドメイン配列を連結するための、本明細書に例示される５－ａａのＧ４Ｓリンカー（配列番号２１）または１０－ａａの（Ｇ４Ｓ）２リンカー（配列番号２２）であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に例示するように、ジペプチドＧＳリンカーを使用して、ロックドメインをＴエピトープに接続することができる。本発明のワクチン組成物の組換え生産のための詳細な手順は、本明細書に記載のプロトコルおよび／または当技術分野において記載されている他の方法、例えば、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．７，１２０４１，２０１６；Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．７，１２０４０，２０１６；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ａｄｖ．４（１１）：ｅａａｕ６７６９，２０１８；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０．２００８．２０２２．２６２６３４，２０２０；国際公開第２０１７／１９２４３４号；国際公開第２０１９／０８９８１７号および国際公開第２０１９／２４１４８３号に基づくことができる。
本発明のいくつかの特定のナノ粒子ディスプレイＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の配列を配列番号３８～４０に例示する。配列番号３８は、（Ｇ４Ｓ）２リンカーを介してナノ粒子配列Ｉ３－０１ｖ９（配列番号２３）に接続されているリーダーレスＳ２ＧΔＨＲ２（配列番号３３）を含む融合配列である。このナノ粒子ディスプレイスパイクは、そのＣ末端にロックドメインＬＤ７（配列番号２９）およびＰＡＤＲＥ Ｔエピトープ（配列番号３０）をさらに含む。配列番号３９は、Ｇ４Ｓリンカーを介してナノ粒子配列Ｅ２ｐ（配列番号２４）に接続されているリーダーレスＳ２ＧΔＨＲ２（配列番号３３）を含む融合配列である。このナノ粒子ディスプレイスパイクは、そのＣ末端にロックドメインＬＤ４（配列番号２８）およびＰＡＤＲＥ Ｔエピトープ（配列番号３０）をさらに含む。配列番号４０は、Ｇ４Ｓリンカーを介してナノ粒子配列フェリチン（配列番号２５）に接続されているリーダーレスＳ２ＧΔＨＲ２（配列番号３３）を含む融合配列である。これらの具体的に例示された融合構築物に加えて、本発明はまた、これらの例示されたナノ粒子ワクチン配列のいずれかと実質的に同一な変異体、または保存的に改変された変異体であるサブユニット配列を含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ナノ粒子ワクチンを包含する。
３つの例示的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ナノ粒子ワクチンの配列を以下の配列番号３８～４０に示す。これらの配列では、（１）スパイクタンパク質とナノ粒子サブユニット配列との間、（２）ナノ粒子サブユニット配列とロックドメインとの間、および（３）ロックドメインとＴエピトープとの間のＧＳリンカーを太字で示し、ナノ粒子サブユニット配列には下線を付し、導入された制限部位ＡＳをイタリック体で示して下線を付し、ロックドメイン配列はイタリック体で示し、Ｔエピトープ配列は下線を付して太字で示している。
Ｓ２ＧΔＨＲ２－１０ＧＳ－Ｉ３－０１ｖ９－ＬＤ７－ＰＡＤＲＥの配列（配列番号３８）。
ＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＧＳＡＧＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＡＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＧＧＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＭＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＫＭＫＡＬＡＶＦＶＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＥＬＳＦＬＫＥＬＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＣＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＣＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤＮＶＣＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＩＡＥＶＡＡＫＡＡＡＦＶＥＫＩＲＧＣＴＥＧＧＧＧＳＳＰＡＶＤＩＧＤＲＬＤＥＬＥＫＡＬＥＡＬＳＡＥＤＧＨＤＤＶＧＱＲＬＥＳＬＬＲＲＷＮＳＲＲＡＤＧＳＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ
ナノ粒子ワクチンＳ２ＧΔＨＲ２－５ＧＳ－Ｅ２ｐ－ＬＤ４－ＰＡＤＲＥの配列（配列番号３９）：
ＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＧＳＡＧＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＡＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＧＧＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＡＳＧＧＧＧＳＡＡＡＫＰＡＴＴＥＧＥＦＰＥＴＲＥＫＭＳＧＩＲＲＡＩＡＫＡＭＶＨＳＫＨＴＡＰＨＶＴＬＭＤＥＡＤＶＴＫＬＶＡＨＲＫＫＦＫＡＩＡＡＥＫＧＩＫＬＴＦＬＰＹＶＶＫＡＬＶＳＡＬＲＥＹＰＶＬＮＴＡＩＤＤＥＴＥＥＩＩＱＫＨＹＹＮＩＧＩＡＡＤＴＤＲＧＬＬＶＰＶＩＫＨＡＤＲＫＰＩＦＡＬＡＱＥＩＮＥＬＡＥＫＡＲＤＧＫＬＴＰＧＥＭＫＧＡＳＣＴＩＴＮＩＧＳＡＧＧＱＷＦＴＰＶＩＮＨＰＥＶＡＩＬＧＩＧＲＩＡＥＫＰＩＶＲＤＧＥＩＶＡＡＰＭＬＡＬＳＬＳＦＤＨＲＭＩＤＧＡＴＡＱＫＡＬＮＨＩＫＲＬＬＳＤＰＥＬＬＬＭＧＧＧＧＳＦＳＥＥＱＫＫＡＬＤＬＡＦＹＦＤＲＲＬＴＰＥＷＲＲＹＬＳＱＲＬＧＬＮＥＥＱＩＥＲＷＦＲＲＫＥＱＱＩＧＷＳＨＰＱＦＥＫＧＳＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ
ナノ粒子ワクチンＳ２ＧΔＨＲ２－５ＧＳ－フェリチンの配列（配列番号４０）：
ＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＧＳＡＧＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＡＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＧＧＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＡＳＧＧＧＧＳＤＩＩＫＬＬＮＥＱＶＮＫＥＭＱＳＳＮＬＹＭＳＭＳＳＷＣＹＴＨＳＬＤＧＡＧＬＦＬＦＤＨＡＡＥＥＹＥＨＡＫＫＬＩＩＦＬＮＥＮＮＶＰＶＱＬＴＳＩＳＡＰＥＨＫＦＥＧＬＴＱＩＦＱＫＡＹＥＨＥＱＨＩＳＥＳＩＮＮＩＶＤＨＡＩＫＳＫＤＨＡＴＦＮＦＬＱＷＹＶＡＥＱＨＥＥＥＶＬＦＫＤＩＬＤＫＩＥＬＩＧＮＥＮＨＧＬＹＬＡＤＱＹＶＫＧＩＡＫＳＲＫＳ
Ｖ．ポリヌクレオチドおよび発現構築物
本発明の安定化コロナウイルス可溶性Ｓ免疫原タンパク質および関連するワクチン組成物は、典型的には、本明細書に記載の様々な構造成分の作動可能に連結されたコード配列を含む発現構築物（すなわち、発現ベクター）を最初に作製することによって生成される。したがって、いくつかの関連する態様では、本発明は、本明細書に記載の免疫原またはナノ粒子ディスプレイ免疫原をコードする実質的に精製されたポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を提供する。本発明のいくつかのポリヌクレオチドは、本明細書に記載の操作されたスパイク免疫原ポリペプチドのうちの１つ、例えば、配列番号３２～３７に示される安定化ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２可溶性Ｓ免疫原をコードする。本発明のいくつかのポリヌクレオチドは、本明細書に記載のナノ粒子足場ワクチンの１つのサブユニット配列、例えば配列番号３８～４０に示される融合タンパク質配列をコードする。本発明の発現されたスパイク免疫原ポリペプチドは、典型的にはＮ末端リーダー配列を含まないが、本発明のポリヌクレオチド配列のいくつかは、天然スパイクタンパク質のリーダー配列をさらにコードする。したがって、例えば、操作されたＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイク免疫原ポリペプチド（例えば、配列番号３３～３７）またはナノ粒子足場ポリペプチド配列（例えば、配列番号３８～４０）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５に示される天然のリーダー配列、または実質的に同一な、もしくは保存的に改変された変異体配列をさらにコードすることができる。
本発明ではまた、そのようなポリヌクレオチドを有する発現ベクター（例えば、本明細書に例示されるＣＭＶベクター）およびワクチン免疫原を産生するための宿主細胞（例えば、本明細書に例示されるＨＥＫ２９３Ｆ、ＥｘｐｉＣＨＯおよびＣＨＯ－Ｓ細胞株）も提供される。ポリヌクレオチドによってコードされる、またはベクターから発現される融合ポリペプチドも本発明に含まれる。本明細書に記載されるように、可溶性Ｓ免疫原ポリペプチドに融合したナノ粒子サブユニットは、その表面に免疫原ポリペプチドまたはタンパク質をディスプレイするナノ粒子ワクチンに自己集合する。
ポリヌクレオチドおよび関連ベクターは、標準的な分子生物学技術または本明細書に例示するプロトコルを用いて容易に作製することができる。例えば、クローニング、トランスフェクション、一過性遺伝子発現および安定なトランスフェクト細胞株を得るための一般的なプロトコルは、当技術分野において記載されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，（３ｒｄｅｄ．，２０００）；およびＢｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｒｉｎｇｂｏｕ ｅｄ．，２００３）に記載されている。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への変異の導入は、例えば、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ（Ｅｄ．），Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０；Ｍａｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：９６７，１９９１；およびＥｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ１：１７，１９９１に記載のように実施することができる。
特定のベクターの選択は、融合ポリペプチドの意図される使用に依存する。例えば、選択されたベクターは、その細胞型が原核生物であるか真核生物であるかにかかわらず、所望の細胞型における融合ポリペプチドの発現を駆動することができなければならない。多くのベクターは、作動可能に連結された遺伝子配列の原核生物ベクター複製および真核生物発現の両方を可能にする配列を含む。本発明に有用なベクターは自律的に複製することができ、すなわち、ベクターは染色体外に存在し、その複製は必ずしも宿主細胞のゲノムの複製に直接連結されない。あるいは、ベクターの複製は、宿主の染色体ＤＮＡの複製に連結されてもよく、例えば、ベクターは、レトロウイルスベクターおよび安定にトランスフェクトされた細胞株によって達成されるように、宿主細胞の染色体に組み込まれてもよい。ウイルスに基づく発現ベクターおよび非ウイルス発現ベクターの両方を、哺乳動物宿主細胞において免疫原を産生するために使用することができる。非ウイルスのベクターおよび系には、プラスミド、典型的にはタンパク質またはＲＮＡを発現するための発現カセットを有するエピソーマルベクター、およびヒト人工染色体（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：３４５，１９９７）が含まれる。有用なウイルスベクターとしては、レンチウイルスまたは他のレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタイン・バーウイルスに基づくベクター、ワクシニアウイルスベクターおよびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）が挙げられる。Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．、上記；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：８０７，１９９５；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６８：１４３，１９９２を参照されたい。
融合ポリペプチドを発現させるために使用される特定のベクターに応じて、種々の公知の細胞または細胞株を本発明の実施に使用することができる。宿主細胞は、本発明の融合物を有担持する組換えベクターが導入され得る任意の細胞であり得、ベクターは、本発明に有用な融合ポリペプチドの発現を駆動することができる。それは、原核生物、例えばいくつかの細菌株のいずれかであってもよく、または真核生物、例えば酵母もしくは他の真菌細胞、昆虫もしくは両生類細胞、または例えばげっ歯類、サルもしくはヒト細胞を含む哺乳動物細胞であってもよい。本発明の融合ポリペプチドを発現する細胞は、初代培養細胞であってもよく、または確立された細胞株であってもよい。したがって、本明細書に例示される細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞）に加えて、当技術分野において周知の多数の他の宿主細胞株も本発明の実施に使用することができる。これらには、例えば、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、Ｓｆ９細胞、ＨＥＫ２９３、ＡｔＴ２０、ＢＶ２およびＮ１８細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマが含まれる。
ポリペプチドを発現させるための哺乳動物組織細胞培養物の使用は、一般に、例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．，１９８７で考察されている。融合ポリペプチド発現ベクターは、当業者に公知のいくつかの適切な方法のいずれかによって、選択された宿主細胞に導入され得る。融合ポリペプチドをコードするベクターの哺乳動物細胞への導入について、使用される方法はベクターの形態に依存する。プラスミドベクターの場合、融合ポリペプチド配列をコードするＤＮＡは、例えば、脂質媒介性トランスフェクション（「リポフェクション」）、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーションまたはリン酸カルシウム沈殿を含むいくつかのトランスフェクション方法のいずれかによって導入され得る。これらの方法は、例えば、Ｂｒｅｎｔら、上記に詳述されている。多種多様な形質転換細胞および非形質転換細胞または初代細胞の一過性トランスフェクションに適したリポフェクションの試薬および方法が広く利用可能であり、リポフェクションを、真核生物細胞、特に培養中の哺乳動物細胞に構築物を導入する魅力的な方法にしている。例えば、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＬｉｐｏＴａｘｉ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）キットが利用可能である。リポフェクションのための試薬および方法を提供する他の会社には、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＬＯＮＴＥＣＨ、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＪＢＬ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ＰａｎＶｅｒａ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈおよびＷａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡが含まれる。
組換え融合ポリペプチドの長期高収率生産のためには、安定な発現が好ましい。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）、および選択マーカーによって制御される融合ポリペプチドをコードする配列を用いて宿主細胞を形質転換することができる。組換えベクター中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がベクターをそれらの染色体に安定に組み込み可能にする。一般的に使用される選択マーカーには、アミノグリコシドＧ－４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１，１９８１）；およびハイグロマイシンに対する耐性（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３０：１４７，１９８４）を付与するｈｙｇｒｏが含まれる。適切な選択により、トランスフェクトされた細胞は、融合ポリペプチドコード配列の組み込まれたコピーを含み得る。
ＶＩ．医薬組成物および治療適用
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の再設計されたコロナウイルスＳ免疫原およびナノ粒子ワクチン組成物を使用する医薬組成物および関連する治療方法を提供する。様々な実施形態では、医薬組成物は、操作されたウイルススパイクタンパク質またはＲＢＤポリペプチド、ナノ粒子足場ウイルススパイク免疫原、ならびに本明細書に記載の操作されたウイルススパイク免疫原またはナノ粒子ワクチンをコードするポリヌクレオチド配列またはベクターを含有することができる。いくつかの実施形態では、異なるウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２）に対する可溶性Ｓ三量体免疫原を、対応するウイルス感染症を予防および治療するために使用することができる。様々な他の実施形態では、本明細書に記載の異なるウイルス性または非ウイルス性免疫原を含有するナノ粒子ワクチンを使用して、対応する疾患、例えば様々なコロナウイルスによって引き起こされる感染症を予防または治療することができる。本発明のいくつかの実施形態は、ヒト対象におけるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２感染症を予防または治療するためのＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２免疫原またはワクチンの使用に関する。本発明のいくつかの実施形態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染症を予防または治療するためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ免疫原またはワクチンの使用に関する。本発明のいくつかの実施形態は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染症を予防または治療するためのＭＥＲＳ－ＣｏＶ免疫原またはワクチンの使用に関する。
本発明の様々な治療方法の実施において、疾患または状態（例えば、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２感染症）の予防または治療を必要とする対象には、本明細書に記載の対応するナノ粒子ワクチン、免疫原タンパク質もしくはポリペプチド、またはコードポリヌクレオチドが投与される。典型的には、本明細書に開示のナノ粒子ワクチン、免疫原タンパク質またはコードポリヌクレオチドは、医薬組成物に含まれる。医薬組成物は、治療用製剤または予防用製剤のいずれかであり得る。典型的には、組成物は、１つ以上の薬学的に許容されるビヒクルおよび任意選択的に他の治療成分（例えば、抗ウイルス薬）をさらに含むことができる。様々な薬学的に許容される添加剤も組成物に使用することができる。
したがって、本発明の医薬組成物のいくつかはワクチン組成物である。ワクチン組成物の場合、適切なアジュバントをさらに含めることができる。適切なアジュバントの例としては、例えば、水酸化アルミニウム、レシチン、フロイントアジュバント、ＭＰＬ（商標）およびＩＬ－１２が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のワクチン組成物またはナノ粒子免疫原（例えば、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ワクチン組成物）は、制御放出製剤または持続放出製剤として製剤化することができる。これは、徐放性ポリマーを含有する組成物で、またはマイクロカプセル化送達系もしくは生体接着性ゲルを介して達成することができる。様々な医薬組成物は、当技術分野で周知の標準的な手順に従って調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９５；Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８）；米国特許第４，６５２，４４１号および第４，９１７，８９３号；米国特許第４，６７７，１９１号および第４，７２８，７２１号；ならびに米国特許第４，６７５，１８９号を参照されたい。
本発明の医薬組成物は、種々の治療的または予防的適用に、例えば、対象におけるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２感染症の治療またはＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２に対する免疫応答の誘発のために容易に使用することができる。様々な実施形態では、ワクチン組成物は、ナノ粒子ワクチン中のディスプレイされた免疫原ポリペプチドが由来する病原体によって引き起こされる感染症を治療または予防するために使用することができる。したがって、本発明のワクチン組成物は、様々なウイルスによって引き起こされる感染症を治療または予防するための多様な臨床状況で使用することができる。例示として、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ナノ粒子ワクチン組成物を対象体に投与して、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２に対する免疫応答を誘導する、例えばウイルスに対する広域中和抗体の産生を誘導することができる。ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２感染症を発症するリスクがある対象には、本発明のワクチン組成物を投与して、ウイルス感染症に対する予防的防御を提供することができる。本明細書に記載の他の免疫原に由来するワクチンの治療的および予防的適用も同様に行うことができる。具体的な対象および状態に応じて、本発明の医薬組成物は、当業者に公知の様々な投与様式、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、関節内、腹腔内または非経口経路によって対象に投与することができる。
一般に、医薬組成物は、そのような治療を必要とする対象に、選択された疾患もしくは状態またはその１つ以上の（１または複数の）症状を予防、阻害および／または改善するのに十分な時間および条件下で投与される。様々な実施形態では、本発明の治療方法は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはＭＥＲＳ－ＣｏＶ）の宿主細胞、例えばヒト宿主細胞への侵入を遮断する方法、コロナウイルスのＳタンパク質が宿主受容体に結合するのを防ぐ方法、およびコロナウイルス感染症にしばしば関連する急性呼吸窮迫を治療する方法に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療方法および組成物は、コロナウイルス感染症を治療または予防するのに有用な他の公知の治療剤および／またはモダリティと組み合わせて使用することができる。公知の治療剤および／またはモダリティには、例えば、ヌクレアーゼアナログまたはプロテアーゼ阻害剤（例えば、レムデシビル）、１つ以上のコロナウイルスに対するモノクローナル抗体、免疫抑制薬または抗炎症薬（例えば、サリルマブまたはトシリズマブ）、ＡＣＥ阻害薬、血管拡張薬、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。
治療適用のために、組成物は、治療有効量の本明細書に記載のナノ粒子免疫原を含有すべきである。予防適用のために、組成物は、予防有効量の本明細書に記載のナノ粒子免疫原を含有すべきである。免疫原の適切な量は、治療または予防される特定の疾患または状態、対象の重症度、年齢、および特定の対象の他の個人属性（例えば、対象の健康の一般的な状態および対象の免疫系のロバスト性）に基づいて決定することができる。有効投与量の決定は、動物モデル研究、続くヒト臨床試験によってよってさらに導かれ、対象における標的疾患の症状または状態の発生または重症度を有意に低下させる投与プロトコルによって導かれる。
予防適用のために、免疫原組成物は、任意の症状の前に、例えば感染の前に提供される。免疫原組成物の予防的投与は、任意のその後の感染症を予防または改善するのに役立つ。したがって、いくつかの実施形態では、治療される対象は、例えばウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２）への曝露または曝露の可能性のために、感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２感染症）を有するか、または感染症を発症するリスクがある対象である。治療有効量の開示の治療用組成物を投与した後、対象を、感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２感染症）、感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２感染症）に関連する症状、またはその両方についてモニターすることができる。
治療適用のために、免疫原組成物は、疾患または感染の症状の発症時または発症後、例えば感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２感染症）の症状の発症後、または感染症の診断後に提供される。したがって、免疫原組成物は、感染症および／または関連する疾患症状の予想される重症度、持続期間または程度を軽減するために、ウイルスへの予想される曝露の前に、ウイルスへの曝露もしくは曝露の疑いの後に、または感染症の実際の開始の後に提供することができる。本発明の医薬組成物は、関連する病原体による感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２感染症）を治療または予防するための当技術分野で公知の他の薬剤と組み合わせることができる。
本発明に記載の新規な構造成分を含有するナノ粒子ワクチン組成物（例えば、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ワクチン）または本発明の医薬組成物は、キットの構成要素として提供することができる。そのようなキットは、包装、取り扱い説明書および様々な他の試薬、例えば緩衝液、基質、抗体またはリガンド、例えば対照抗体またはリガンドおよび検出試薬を含む追加の構成要素を含んでもよい。任意選択の取り扱い説明シートをキットに追加で提供することができる。
［実施例］
以下の実施例は、本発明を例示するために提供されるが、本発明を限定するものではない。
［実施例１］
Ｓ抗原の安定化、生成および精製
この実施例は、再設計された安定で可溶性のコロナウイルスＳ三量体を記載する：
Ｉ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ：
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓタンパク質の配列を、ＧｅｎＢａｎｋからＩＤ ＮＰ＿８２８８５１で入手した。ナンバリングは、ＵｎｉＰｒｏ ＩＤ Ｐ５９５９４のＵｎｉＰｒｏｔの定義に基づく。可溶性Ｓ構築物は、Ｍ１－Ｑ１１９０として定義される。Ｑ１１９０は、１１９１ＹＩＫ１１９３モチーフで始まる予測された膜貫通領域のすぐ上流にある。短縮可溶性Ｓ構築物はＭ１－Ｋ１１３１として定義され、これはＨＲ２を欠いている。ＨＲ２の欠失は、ＨＲ１／ＨＲ２融合コアを破壊し、融合前Ｓ構造を安定化する。Ｓ構築物は、Ｙ１１２０においてさらに短縮し、Ｙ１１２０に３残基の「ＧＮＳ」モチーフ（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓ由来）を付加することができる。この改変は、ナノ粒子上にディスプレイされた場合、タンパク質収量を有意に増加させる。
切断されていない、融合前に最適化された（ＵＦＯ）Ｓ構築物は、（ａ）ＨＲ１と中心ヘリックス（ＣＨ）との間にＲ６６７Ｇ変異およびＫ９６８Ｐ／Ｖ９６９Ｐ（またはＫ９６８Ｇ／Ｖ９６９Ｇ）二重変異を加えることによって得ることができる。Ｒ６６７Ｇ変異はＳ１／切断部位を除去することを目的としているが、Ｋ９６８Ｐ／Ｖ９６９Ｐ二重変異は融合前Ｓ構造を安定化することが示されている。ＨＲ１－ターン－ＣＨを強固にする代わりに、Ｋ９６８Ｇ／Ｖ９６９Ｇ二重変異は、ターン領域のすべての歪みを除去し、その結果、融合前Ｓ構造を安定化することを目的とする。
上記のＵＦＯ Ｓ構築物は、ＨＲ２と相互作用して融合コアを形成するＨＲ１領域にプロリン変異（Ｓ９２４Ｐ、Ｔ９２５Ｐ、またはＡ９２６Ｐ）、グリシン変異（Ｓ９２４Ｇ、Ｔ９２５Ｇ、またはＡ９２６Ｇ）またはそれらの組み合わせを導入することによってさらに安定化することができる。これらの変異は、６ヘリックスバンドル融合コアを破壊し、融合後Ｓを不安定化するように機能する。領域Ｓ９２４～Ａ９２６に１つまたは２つの残基（例えば、ＧまたはＧＳ）を挿入して螺旋パターンを破壊するなどの他の変異も、融合後Ｓを不安定化し、コンフォメーション変化を防ぐことができる。
Ｔ４フィブリチンフォルドン（ＰＤＢ ＩＤ：４ＮＣＶ）およびウイルスカプシドタンパク質ＳＨＰ（ＰＤＢ：１ＴＤ０）などの三量体化モチーフを、短いＧＳリンカーを間に挟んで上記の再設計されたＳ構築物のＣ末端にさらに付加して、三量体を安定化することができる。さらに、ニッケルカラムを使用するタンパク質精製を容易にするために、Ｈｉｓ６タグを三量体化モチーフのＣ末端に付加することができる。
再設計されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＵＦＯ Ｓ構築物のＣ末端をナノ粒子形成サブユニット（フェリチン２４量体および２つの６０量体、Ｅ２ｐおよびＩ３－０１）のＮ末端に融合させることができ、その結果、融合構築物は、適切な細胞株で発現された場合、ナノ粒子表面に融合前Ｓ三量体をディスプレイしたナノ粒子に自己集合することができる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ可溶性Ｓ配列（配列番号１）：
ＭＦＩＦＬＬＦＬＴＬＴＳＧＳＤＬＤＲＣＴＴＦＤＤＶＱＡＰＮＹＴＱＨＴＳＳＭＲＧＶＹＹＰＤＥＩＦＲＳＤＴＬＹＬＴＱＤＬＦＬＰＦＹＳＮＶＴＧＦＨＴＩＮＨＴＦＧＮＰＶＩＰＦＫＤＧＩＹＦＡＡＴＥＫＳＮＶＶＲＧＷＶＦＧＳＴＭＮＮＫＳＱＳＶＩＩＩＮＮＳＴＮＶＶＩＲＡＣＮＦＥＬＣＤＮＰＦＦＡＶＳＫＰＭＧＴＱＴＨＴＭＩＦＤＮＡＦＮＣＴＦＥＹＩＳＤＡＦＳＬＤＶＳＥＫＳＧＮＦＫＨＬＲＥＦＶＦＫＮＫＤＧＦＬＹＶＹＫＧＹＱＰＩＤＶＶＲＤＬＰＳＧＦＮＴＬＫＰＩＦＫＬＰＬＧＩＮＩＴＮＦＲＡＩＬＴＡＦＳＰＡＱＤＩＷＧＴＳＡＡＡＹＦＶＧＹＬＫＰＴＴＦＭＬＫＹＤＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＳＱＮＰＬＡＥＬＫＣＳＶＫＳＦＥＩＤＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＶＰＳＧＤＶＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＫＦＰＳＶＹＡＷＥＲＫＫＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＴＦＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＡＴＫＬＮＤＬＣＦＳＮＶＹＡＤＳＦＶＶＫＧＤＤＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＶＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＭＧＣＶＬＡＷＮＴＲＮＩＤＡＴＳＴＧＮＹＮＹＫＹＲＹＬＲＨＧＫＬＲＰＦＥＲＤＩＳＮＶＰＦＳＰＤＧＫＰＣＴＰＰＡＬＮＣＹＷＰＬＮＤＹＧＦＹＴＴＴＧＩＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＮＡＰＡＴＶＣＧＰＫＬＳＴＤＬＩＫＮＱＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＰＳＳＫＲＦＱＰＦＱＱＦＧＲＤＶＳＤＦＴＤＳＶＲＤＰＫＴＳＥＩＬＤＩＳＰＣＡＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＡＳＳＥＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＤＶＳＴＡＩＨＡＤＱＬＴＰＡＷＲＩＹＳＴＧＮＮＶＦＱＴＱＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＤＴＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＨＴＶＳＬＬＲＳＴＳＱＫＳＩＶＡＹＴＭＳＬＧＡＤＳＳＩＡＹＳＮＮＴＩＡＩＰＴＮＦＳＩＳＩＴＴＥＶＭＰＶＳＭＡＫＴＳＶＤＣＮＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＡＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＳＧＩＡＡＥＱＤＲＮＴＲＥＶＦＡＱＶＫＱＭＹＫＴＰＴＬＫＹＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＬＫＰＴＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＭＫＱＹＧＥＣＬＧＤＩＮＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＤＭＩＡＡＹＴＡＡＬＶＳＧＴＡＴＡＧＷＴＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＱＩＡＮＱＦＮＫＡＩＳＱＩＱＥＳＬＴＴＴＳＴＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＫＶＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＡＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＳＱＥＲＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＥＧＫＡＹＦＰＲＥＧＶＦＶＦＮＧＴＳＷＦＩＴＱＲＮＦＦＳＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＩＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳＰＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ可溶性Ｓ配列マイナスＮ末端リーダー（配列番号７）：配列番号１の残基１４～１１９０。
リーダー配列（配列番号８）：ＭＦＩＦＬＬＦＬＴＬＴＳＧ（配列番号１の残基１～１３）。
ＨＲ２配列（配列番号９）：配列番号１の残基１１３２～１１９０
ＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳＰＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱ
さらなる短縮Ｃ末端配列（配列番号１０）：
ＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫ（配列番号１の残基１１２１～１１３１）。
ＩＩ．ＭＥＲＳ－ＣｏＶ：
ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓタンパク質の配列を、ＧｅｎＢａｎｋからＩＤ ＪＸ８６９０５９．２で入手した。ナンバリングは、ＵｎｉＰｒｏ ＩＤ Ｒ９ＵＱ５３のＵｎｉＰｒｏｔの定義に基づく。
可溶性Ｓ構築物は、Ｍ１－Ｙ１２９１として定義される。Ｙ１２９１は、１２９２ＹＮＫ１２９４モチーフで始まる予測された膜貫通領域のすぐ上流にある。短縮可溶性Ｓ構築物はＭ１－Ｓ１２２６として定義され、これはＨＲ２を欠いている。ＨＲ２の欠失は、ＨＲ１／ＨＲ２融合コアを破壊し、融合前Ｓ構造を安定化する。
切断されていない融合前最適化（ＵＦＯ）Ｓ構築物は、Ｒ７４８Ａ／Ｒ７５１Ｇ二重変異およびＶ１０６０Ｐ／Ｌ１０６１Ｐ（またはＶ１０６０Ｇ／Ｌ１０６１Ｇ）二重変異を加えることによって得ることができる。Ｒ７４８Ａ／Ｒ７５１Ｇ二重変異はＳ１／Ｓ２切断部位を除去することを目的としているが、Ｖ１０６０Ｐ／Ｌ１０６１Ｐ二重変異は融合前Ｓ構造を安定化することが示されている。ＨＲ１－ターン－ＣＨを強固にする代わりに、Ｖ１０６０Ｇ／Ｌ１０６１Ｇ二重変異は、ターン領域のすべての歪みを除去し、その結果、融合前Ｓ構造を安定化することを目的とする。
ＵＦＯ Ｓ構築物は、ＨＲ２と相互作用して融合コアを形成するＨＲ１領域にプロリン変異（Ｔ１０１３Ｐ、Ｔ１０１４ＰまたはＴ１０１５Ｐ）、グリシン変異（Ｔ１０１３Ｇ、Ｔ１０１４ＧまたはＴ１０１５Ｇ）またはそれらの組み合わせを導入することによってさらに安定化することができる。これらの変異は、６ヘリックスバンドル融合コアを破壊し、融合後Ｓを不安定化するものである。領域Ｔ１０１３～Ｔ１０１５に１つまたは２つの残基（例えば、ＧまたはＧＳ）を挿入して螺旋パターンを破壊するなどの他の変異も、融合後Ｓを不安定化し、コンフォメーション変化を防ぐものである。
Ｔ４フィブリチンフォルドン（ＰＤＢ ＩＤ：４ＮＣＶ）およびウイルスカプシドタンパク質ＳＨＰ（ＰＤＢ：１ＴＤ０）などの三量体化モチーフを、短いＧＳリンカーを間に挟んで上記の再設計されたＵＦＯ Ｓ構築物のＣ末端に付加して、三量体を安定化することができる。ニッケルカラムによるタンパク質精製を容易にするために、Ｈｉｓ６タグを三量体化モチーフのＣ末端に付加することができる。
再設計されたＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＵＦＯ Ｓ構築物のＣ末端をナノ粒子形成サブユニットのＮ末端に融合させることができ、その結果、融合構築物は、適切な細胞株で発現された場合、ナノ粒子表面に融合前Ｓ三量体をディスプレイしたナノ粒子に自己集合することができる。
ＭＥＲＳ－ＣｏＶ可溶性Ｓ（配列番号２）：
ＭＩＨＳＶＦＬＬＭＦＬＬＴＰＴＥＳＹＶＤＶＧＰＤＳＶＫＳＡＣＩＥＶＤＩＱＱＴＦＦＤＫＴＷＰＲＰＩＤＶＳＫＡＤＧＩＩＹＰＱＧＲＴＹＳＮＩＴＩＴＹＱＧＬＦＰＹＱＧＤＨＧＤＭＹＶＹＳＡＧＨＡＴＧＴＴＰＱＫＬＦＶＡＮＹＳＱＤＶＫＱＦＡＮＧＦＶＶＲＩＧＡＡＡＮＳＴＧＴＶＩＩＳＰＳＴＳＡＴＩＲＫＩＹＰＡＦＭＬＧＳＳＶＧＮＦＳＤＧＫＭＧＲＦＦＮＨＴＬＶＬＬＰＤＧＣＧＴＬＬＲＡＦＹＣＩＬＥＰＲＳＧＮＨＣＰＡＧＮＳＹＴＳＦＡＴＹＨＴＰＡＴＤＣＳＤＧＮＹＮＲＮＡＳＬＮＳＦＫＥＹＦＮＬＲＮＣＴＦＭＹＴＹＮＩＴＥＤＥＩＬＥＷＦＧＩＴＱＴＡＱＧＶＨＬＦＳＳＲＹＶＤＬＹＧＧＮＭＦＱＦＡＴＬＰＶＹＤＴＩＫＹＹＳＩＩＰＨＳＩＲＳＩＱＳＤＲＫＡＷＡＡＦＹＶＹＫＬＱＰＬＴＦＬＬＤＦＳＶＤＧＹＩＲＲＡＩＤＣＧＦＮＤＬＳＱＬＨＣＳＹＥＳＦＤＶＥＳＧＶＹＳＶＳＳＦＥＡＫＰＳＧＳＶＶＥＱＡＥＧＶＥＣＤＦＳＰＬＬＳＧＴＰＰＱＶＹＮＦＫＲＬＶＦＴＮＣＮＹＮＬＴＫＬＬＳＬＦＳＶＮＤＦＴＣＳＱＩＳＰＡＡＩＡＳＮＣＹＳＳＬＩＬＤＹＦＳＹＰＬＳＭＫＳＤＬＳＶＳＳＡＧＰＩＳＱＦＮＹＫＱＳＦＳＮＰＴＣＬＩＬＡＴＶＰＨＮＬＴＴＩＴＫＰＬＫＹＳＹＩＮＫＣＳＲＬＬＳＤＤＲＴＥＶＰＱＬＶＮＡＮＱＹＳＰＣＶＳＩＶＰＳＴＶＷＥＤＧＤＹＹＲＫＱＬＳＰＬＥＧＧＧＷＬＶＡＳＧＳＴＶＡＭＴＥＱＬＱＭＧＦＧＩＴＶＱＹＧＴＤＴＮＳＶＣＰＫＬＥＦＡＮＤＴＫＩＡＳＱＬＧＮＣＶＥＹＳＬＹＧＶＳＧＲＧＶＦＱＮＣＴＡＶＧＶＲＱＱＲＦＶＹＤＡＹＱＮＬＶＧＹＹＳＤＤＧＮＹＹＣＬＲＡＣＶＳＶＰＶＳＶＩＹＤＫＥＴＫＴＨＡＴＬＦＧＳＶＡＣＥＨＩＳＳＴＭＳＱＹＳＲＳＴＲＳＭＬＫＲＲＤＳＴＹＧＰＬＱＴＰＶＧＣＶＬＧＬＶＮＳＳＬＦＶＥＤＣＫＬＰＬＧＱＳＬＣＡＬＰＤＴＰＳＴＬＴＰＲＳＶＲＳＶＰＧＥＭＲＬＡＳＩＡＦＮＨＰＩＱＶＤＱＬＮＳＳＹＦＫＬＳＩＰＴＮＦＳＦＧＶＴＱＥＹＩＱＴＴＩＱＫＶＴＶＤＣＫＱＹＶＣＮＧＦＱＫＣＥＱＬＬＲＥＹＧＱＦＣＳＫＩＮＱＡＬＨＧＡＮＬＲＱＤＤＳＶＲＮＬＦＡＳＶＫＳＳＱＳＳＰＩＩＰＧＦＧＧＤＦＮＬＴＬＬＥＰＶＳＩＳＴＧＳＲＳＡＲＳＡＩＥＤＬＬＦＤＫＶＴＩＡＤＰＧＹＭＱＧＹＤＤＣＭＱＱＧＰＡＳＡＲＤＬＩＣＡＱＹＶＡＧＹＫＶＬＰＰＬＭＤＶＮＭＥＡＡＹＴＳＳＬＬＧＳＩＡＧＶＧＷＴＡＧＬＳＳＦＡＡＩＰＦＡＱＳＩＦＹＲＬＮＧＶＧＩＴＱＱＶＬＳＥＮＱＫＬＩＡＮＫＦＮＱＡＬＧＡＭＱＴＧＦＴＴＴＮＥＡＦＱＫＶＱＤＡＶＮＮＮＡＱＡＬＳＫＬＡＳＥＬＳＮＴＦＧＡＩＳＡＳＩＧＤＩＩＱＲＬＤＶＬＥＱＤＡＱＩＤＲＬＩＮＧＲＬＴＴＬＮＡＦＶＡＱＱＬＶＲＳＥＳＡＡＬＳＡＱＬＡＫＤＫＶＮＥＣＶＫＡＱＳＫＲＳＧＦＣＧＱＧＴＨＩＶＳＦＶＶＮＡＰＮＧＬＹＦＭＨＶＧＹＹＰＳＮＨＩＥＶＶＳＡＹＧＬＣＤＡＡＮＰＴＮＣＩＡＰＶＮＧＹＦＩＫＴＮＮＴＲＩＶＤＥＷＳＹＴＧＳＳＦＹＡＰＥＰＩＴＳＬＮＴＫＹＶＡＰＱＶＴＹＱＮＩＳＴＮＬＰＰＰＬＬＧＮＳＴＧＩＤＦＱＤＥＬＤＥＦＦＫＮＶＳＴＳＩＰＮＦＧＳＬＴＱＩＮＴＴＬＬＤＬＴＹＥＭＬＳＬＱＱＶＶＫＡＬＮＥＳＹＩＤＬＫＥＬＧＮＹＴＹ
ＭＥＲＳ－ＣｏＶ可溶性Ｓ配列マイナスＮ末端リーダー（配列番号１１）：配列番号２の残基１８～１２９１。
リーダー配列（配列番号１２）：ＭＩＨＳＶＦＬＬＭＦＬＬＴＰＴＥＳ（配列番号２の残基１～１７）。
ＨＲ２配列（配列番号１３）：配列番号２の残基１２２７～１２９１
ＴＧＩＤＦＱＤＥＬＤＥＦＦＫＮＶＳＴＳＩＰＮＦＧＳＬＴＱＩＮＴＴＬＬＤＬＴＹＥＭＬＳＬＱＱＶＶＫＡＬＮＥＳＹＩＤＬＫＥＬＧＮＹＴＹ
ＩＩＩ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２：
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の配列を、ＧｅｎＢａｎｋからＩＤ ＭＮ９０８９４７．３で入手した。アミノ酸ナンバリングは、ＰＤＢ ＩＤ ６ＶＳＢのｃｒｙｏ－ＥＭモデルに基づく。
可溶性Ｓ構築物は、Ｍ１－Ｑ１２０８として定義される。Ｑ１２０８は、１２０９ＹＩＫ１２１１モチーフで始まる予測された膜貫通領域のすぐ上流にある。短縮可溶性Ｓ構築物はＭ１－Ｋ１１４９として定義され、これはＨＲ２を欠いている。ＨＲ２の欠失は、ＨＲ１／ＨＲ２融合コアを破壊し、融合前Ｓ構造を安定化する。Ｓ構築物は、Ｙ１１３８においてさらに短縮し、Ｙ１１３８に３残基の「ＧＮＳ」モチーフ（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓ由来）を付加することができる。この改変は、ナノ粒子上にディスプレイされた場合、タンパク質収量を有意に増加させる。
切断されていない融合前最適化（ＵＦＯ）可溶性 Ｓ構築物は、改変されたＳ１／Ｓ２切断部位６８２ＧＳＡＧＳＶ６８７（配列番号１８）およびＫ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｐ（またはＫ９８６Ｇ／Ｖ９８７Ｇ）二重変異を有するＭ１－Ｑ１２０８として定義される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、Ｓ１／Ｓ２切断部位６８１ＰＲＲＡ６８４の前に４－ａａの挿入を有し、これにより切断効率が高まる。改変６８２ＧＳＡＧＳＶ６８７（配列番号１８）は、Ｓ１／Ｓ２切断部位を除去することを目的としており、Ｋ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｐ二重変異は融合前Ｓ構造を安定化することが示されている。ＨＲ１－ターン－ＣＨを強固にする代わりに、Ｋ９８６Ｇ／Ｖ９８７Ｇ二重変異は、ターン領域のすべての歪みを除去し、その結果、融合前Ｓ構造を安定化することを目的とする。
（ｂ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＵＦＯ Ｓ構築物は、ＨＲ２と相互作用して融合コアを形成するＨＲ１領域にプロリン変異（Ａ９４２Ｐ、Ｓ９４３ＰおよびＡ９４４Ｐ）、グリシン変異（Ａ９４２Ｇ、Ｓ９４３ＧおよびＡ９４４Ｇ）またはそれらの組み合わせを導入することによってさらに安定化することができる。これらの変異は、６ヘリックスバンドル融合コアを破壊し、融合後Ｓを不安定化するものである。領域Ａ９４２～Ａ９４４に１つまたは２つの残基（例えば、ＧまたはＧＳ）を挿入して螺旋パターンを破壊するなどの他の変異も、融合後Ｓを不安定化し、コンフォメーション変化を防ぐものである。
Ｔ４フィブリチンフォルドン（ＰＤＢ ＩＤ：４ＮＣＶ）およびウイルスカプシドタンパク質ＳＨＰ（ＰＤＢ：１ＴＤ０）などの三量体化モチーフを、短いＧＳリンカーを間に挟んで、（ｂ）および（ｃ）の再設計されたＳ構築物のＣ末端に付加して、三量体を安定化することができる。ニッケルカラムによるタンパク質精製を容易にするために、Ｈｉｓ６タグを三量体化モチーフのＣ末端に付加することができる。
上記の再設計されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＵＦＯ Ｓ構築物のＣ末端をナノ粒子形成サブユニットのＮ末端に融合させることができ、その結果、融合構築物は、適切な細胞株で発現された場合、ナノ粒子表面に融合前Ｓ三量体をディスプレイしたナノ粒子に自己集合することができる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２可溶性Ｓ（配列番号３）：
ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＲＲＡＲＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＡＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＫＶＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳＰＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２可溶性Ｓ配列マイナスＮ末端リーダー（配列番号１４）：配列番号３の残基１４～１２０８。
リーダー配列（配列番号１５）：ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳ（配列番号３の残基１～１３）。
ＨＲ２配列（配列番号９）：配列番号３の残基１１５０～１２０８
ＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳＰＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱ
さらなる短縮Ｃ末端配列（配列番号１０）：
ＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫ（配列番号３の残基１１２１～１１３１）
［実施例２］
コロナウイルスの設計されたＲＢＤドメイン
Ｉ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤベースのワクチン：
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓタンパク質の配列およびアミノ酸ナンバリングは上記に記載されている。ＲＢＤベースのワクチン設計に使用されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤは、Ｐ３１７～Ｄ５１８（配列番号４を参照されたい）として定義される。具体的には、三量体化モチーフであるウイルスカプシドタンパク質ＳＨＰ（ＰＤＢ：１ＴＤ０）を、短い５ＧＳリンカーを間に挟んで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤのＣ末端に付加して、ＲＢＤを三量体コンフォメーションにおいて安定化することができる。精製を容易にするために、Ｈｉｓ６タグを三量体化モチーフのＣ末端に１ＧＳリンカーを用いて付加することができる。
ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、ナノ粒子上のＲＢＤの多価ディスプレイを容易にするために、異なる組み合わせでＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤおよびナノ粒子サブユニットに結合させることができる。例えば、ＲＢＤのＣ末端が５ＧＳリンカーを用いてＳｐｙＴａｇのＮ末端に融合させる場合、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのＣ末端を５ＧＳリンカーを用いてナノ粒子サブユニットのＮ末端に融合させて対を作製することができる。ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、これらの２つの構築物で取り替えて、異なる対を作製することができる。ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、５ＧＳリンカーを用いてＲＢＤのＮ末端に融合することもできる。２つの構築物が宿主細胞に導入されて発現されると、ＳｐｙＴａｇモチーフとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒモチーフとの間の結合によって組換えワクチンタンパク質が形成される。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤ（配列番号４）
ＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＫＦＰＳＶＹＡＷＥＲＫＫＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＴＦＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＡＴＫＬＮＤＬＣＦＳＮＶＹＡＤＳＦＶＶＫＧＤＤＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＶＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＭＧＣＶＬＡＷＮＴＲＮＩＤＡＴＳＴＧＮＹＮＹＫＹＲＹＬＲＨＧＫＬＲＰＦＥＲＤＩＳＮＶＰＦＳＰＤＧＫＰＣＴＰＰＡＬＮＣＹＷＰＬＮＤＹＧＦＹＴＴＴＧＩＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＮＡＰＡＴＶＣＧＰＫＬＳＴＤ
ＳｐｙＴａｇ：ＶＰＴＩＶＭＶＤＡＹＫＲＹＫ（配列番号１６）。
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ：配列番号１７
ＡＭＶＴＴＬＳＧＬＳＧＥＱＧＰＳＧＤＭＴＴＥＥＤＳＡＴＨＩＫＦＳＫＲＤＥＤＧＲＥＬＡＧＡＴＭＥＬＲＤＳＳＧＫＴＩＳＴＷＩＳＤＧＨＶＫＤＦＹＬＹＰＧＫＹＴＦＶＥＴＡＡＰＤＧＹＥＶＡＴＡＩＴＦＴＶＮＥＱＧＱＶＴＶＮＧＥＡＴＫＧＤＡＨＴＡＳ
ＩＩ．ＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤベースのワクチン：
ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓタンパク質の配列およびアミノ酸ナンバリングは、上記で示されている。ＲＢＤベースのワクチン設計に使用されるＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤは、Ｅ３８２～Ｋ５８７（配列番号５を参照されたい）として定義される。三量体化モチーフであるウイルスカプシドタンパク質ＳＨＰ（ＰＤＢ：１ＴＤ０）を、短い５ＧＳリンカーを間に挟んで、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤのＣ末端に付加して、ＲＢＤを三量体コンフォメーションにおいて安定化することができる。精製を容易にするために、Ｈｉｓ６タグを三量体化モチーフのＣ末端に１ＧＳリンカーを用いて付加することができる。
ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、ナノ粒子上のＲＢＤの多価ディスプレイを容易にするために、異なる組み合わせでＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤおよびナノ粒子サブユニットに結合させることができる。例えば、ＲＢＤのＣ末端が５ＧＳリンカーを用いてＳｐｙＴａｇのＮ末端に融合させる場合、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのＣ末端を５ＧＳリンカーを用いてナノ粒子サブユニットのＮ末端に融合させて対を作製することができる。ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、これらの２つの構築物で取り替えて、異なる対を作製することができる。ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、５ＧＳリンカーを用いてＲＢＤのＮ末端に融合することもできる。２つの構築物が宿主細胞に導入されて発現されると、ＳｐｙＴａｇモチーフとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒモチーフとの間の結合によって組換えワクチンタンパク質が形成される。
ＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤ（配列番号５）
ＥＣＤＦＳＰＬＬＳＧＴＰＰＱＶＹＮＦＫＲＬＶＦＴＮＣＮＹＮＬＴＫＬＬＳＬＦＳＶＮＤＦＴＣＳＱＩＳＰＡＡＩＡＳＮＣＹＳＳＬＩＬＤＹＦＳＹＰＬＳＭＫＳＤＬＳＶＳＳＡＧＰＩＳＱＦＮＹＫＱＳＦＳＮＰＴＣＬＩＬＡＴＶＰＨＮＬＴＴＩＴＫＰＬＫＹＳＹＩＮＫＣＳＲＬＬＳＤＤＲＴＥＶＰＱＬＶＮＡＮＱＹＳＰＣＶＳＩＶＰＳＴＶＷＥＤＧＤＹＹＲＫＱＬＳＰＬＥＧＧＧＷＬＶＡＳＧＳＴＶＡＭＴＥＱＬＱＭＧＦＧＩＴＶＱＹＧＴＤＴＮＳＶＣＰＫ
ＳｐｙＴａｇ：ＶＰＴＩＶＭＶＤＡＹＫＲＹＫ（配列番号１６）。
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ：配列番号１７：
ＡＭＶＴＴＬＳＧＬＳＧＥＱＧＰＳＧＤＭＴＴＥＥＤＳＡＴＨＩＫＦＳＫＲＤＥＤＧＲＥＬＡＧＡＴＭＥＬＲＤＳＳＧＫＴＩＳＴＷＩＳＤＧＨＶＫＤＦＹＬＹＰＧＫＹＴＦＶＥＴＡＡＰＤＧＹＥＶＡＴＡＩＴＦＴＶＮＥＱＧＱＶＴＶＮＧＥＡＴＫＧＤＡＨＴＡＳ
ＩＩＩ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤベースのワクチン：
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の配列およびアミノ酸ナンバリングは上記に記載されている。ＲＢＤベースのワクチン設計に使用されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤは、Ｐ３３０～Ｎ５３２（配列番号６を参照されたい）として定義される。三量体化モチーフであるウイルスカプシドタンパク質ＳＨＰ（ＰＤＢ：１ＴＤ０）を、短い５ＧＳリンカーを間に挟んで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのＣ末端に付加して、ＲＢＤを三量体コンフォメーションにおいて安定化することができる。精製を容易にするために、Ｈｉｓ６タグを三量体化モチーフのＣ末端に１ＧＳリンカーを用いて付加することができる。
ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、ナノ粒子上のＲＢＤの多価ディスプレイを容易にするために、異なる組み合わせでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤおよびナノ粒子サブユニットに結合させることができる。例えば、ＲＢＤのＣ末端が５ＧＳリンカーを用いてＳｐｙＴａｇのＮ末端に融合させる場合、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのＣ末端を５ＧＳリンカーを用いてナノ粒子サブユニットのＮ末端に融合させて対を作製することができる。ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、これらの２つの構築物で取り替えて、異なる対を作製することができる。ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、５ＧＳリンカーを用いてＲＢＤのＮ末端に融合することもできる。２つの構築物が宿主細胞に導入されて発現されると、ＳｐｙＴａｇモチーフとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒモチーフとの間の結合によって組換えワクチンタンパク質が形成される。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ（配列番号６）：
ＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮ
ＳｐｙＴａｇ：ＶＰＴＩＶＭＶＤＡＹＫＲＹＫ（配列番号１６）。
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ：配列番号１７：
ＡＭＶＴＴＬＳＧＬＳＧＥＱＧＰＳＧＤＭＴＴＥＥＤＳＡＴＨＩＫＦＳＫＲＤＥＤＧＲＥＬＡＧＡＴＭＥＬＲＤＳＳＧＫＴＩＳＴＷＩＳＤＧＨＶＫＤＦＹＬＹＰＧＫＹＴＦＶＥＴＡＡＰＤＧＹＥＶＡＴＡＩＴＦＴＶＮＥＱＧＱＶＴＶＮＧＥＡＴＫＧＤＡＨＴＡＳ
［実施例３］
Ｓ三量体およびＲＢＤドメインの作製および精製
細胞株：すべての構築物をＨＥＫ２９３ Ｆ細胞およびＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現させ、ＥｘｐｉＣＨＯは有意に高い収率を示した。
精製：一過性発現後、Ｈｉｓ６－タグ／ニッケルカラムおよび抗原特異的抗体カラムを含む３つの方法を使用して、上清からＳ抗原を精製した。Ｓ２３０およびＣＲ３０２２抗体カラムを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＳおよびＲＢＤ抗原ならびにナノ粒子を精製することができる。ＭＣＡ１抗体カラムを使用して、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓ抗原およびＲＢＤ抗原ならびにナノ粒子を精製することができ、ＣＲ３０２２抗体カラムを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳおよびＲＢＤ抗原ならびにナノ粒子を精製することができる。
［実施例４］
足場ＲＢＤ三量体およびＲＢＤ提示ＳＡｐＮＰの合理的設計
本発明者らは、三量体足場に結合したＲＢＤが「ＲＢＤ－アップ型」スパイクコンフォメーションを模倣し、ＮＡｂを誘発してＡＣＥ２結合を遮断できると仮定した。この可能性を試験するために、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２ ＲＢＤ、短い５－ａａのＧ４Ｓリンカー（２－ａａの制限部位を有する）および三量体ウイルスカプシドタンパク質のＳＨＰ（ＰＤＢ：１ＴＤ０）を含む融合構築物を設計した。構造モデリングは、３つの繋がれたＲＢＤが９２Åの三角形を形成し（Ｌ４９２について測定）、これはそれぞれ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１「２－ＲＢＤ－アップ型」スパイク（ＰＤＢ：６ＣＲＸ、Ｌ４７８について測定）およびＭＥＲＳ－ＣｏＶ「全－ＲＢＤ－アップ型」スパイク（ＰＤＢ：５Ｘ５９、Ｌ５０６について測定）よりも１４Åおよび１８Å広く、各ＲＢＤへのＮＡｂアクセスを可能にすることを示した。次いで、本発明者らは、タグなしワクチン精製を容易にするためにイムノアフィニティークロマトグラフィー（ＩＡＣ）カラムを開発した。以前から、ＮＡｂ由来ＩＡＣカラムが、ＨＩＶ－１ Ｅｎｖ三量体／ＮＰ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ２コア／ＮＰ、およびエボラウイルス（ＥＢＯＶ）ＧＰ三量体／ＮＰを精製するために使用されてきた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＮＡｂであるＣＲ３０２２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤに結合し得ることが報告されていた（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．９，３８２－３８５，２０２０）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ／ＣＲ３０２２の構造により、２つのＳＡＲＳ－ＣｏＶによって共有されるエピトープが明らかになり、ＲＢＤへのＣＲ３０２２の結合を可能にするスパイクの呼吸運動（ｂｒｅａｔｈｉｎｇ ｍｏｔｉｏｎ）が示唆された。ここで、本発明者らは、ＩＡＣカラムにおけるＣＲ３０２２の有用性を調べた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２ ＲＢＤ－５ＧＳ－１ＴＤ０構築物を１００ｍｌ ＥｘｐｉＣＨＯ細胞において一過性に発現させ、ＣＲ３０２２抗体カラム、次いでＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で精製した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＲＢＤ構築物はＳＥＣプロファイルにおいて凝集体（８．６ｍｌ）および三量体（１２．７ｍｌ）の両方のピークを示したが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ構築物は１２．８ｍｌにおいて単一の三量体ピークを生成した。ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）では、還元条件下および非還元条件下でそれぞれ約３７ ｋＤのモノマーバンドおよび約１００ ｋＤの三量体バンドが観察された。抗原性を、２つの足場ＲＢＤ三量体について、ＣＲ３０２２／ＳＥＣ精製後に酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で評価した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１（ＣＲ３０２２、ｍ３９６、８０ＲおよびＳ２３０）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＳＡＲＳ生存者由来のＢ３８、ＣＢ６、Ｓ３０９、およびＰ２Ｂ－２Ｆ６）を標的とするＲＢＤ特異的ＮＡｂをＥＬＩＳＡで試験した。全体として、同様の５０％効果濃度（ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）（ＥＣ５０）値が、それらのそれぞれのＮＡｂに結合する２つのＲＢＤ三量体について観察された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＲＢＤ三量体は、そのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２対応物よりも高い結合親和性をＣＲ３００２に対して示し、ＥＣ５０値に１．３倍の差があった。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＡｂのうち、Ｂ３８はＣＲ３０２２と同様のＥＣ５０値をもたらした。抗体結合の動態を、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して測定した。全体として、試験したすべての抗体は、速い会合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）を示したが、解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）に目に見える差があった。例えば、Ｂ３８は、他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＡｂよりも速い解離速度を示したが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２ ＲＢＤタンパク質を精製するために使用される抗体であるＣＲ３０２２は、同等の動態プロファイルを示した。
次いで、本発明者らは、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（または単にＳＰＹ）系を使用してＲＢＤをＳＡｐＮＰに結合させ、より強力なＮＡｂ応答を誘発することができる多価ＲＢＤワクチンを作製できると仮定した。１３－ａａのＳｐｙＴａｇは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質と自発的に反応して不可逆的なイソペプチド結合を形成する。ＳＰＹ系は、抗原をＳＡｐＮＰおよびＶＬＰに結合させるために使用されてきた。ここでは、両方とも５－ａａのＧ４Ｓリンカーを用いて、ＳｐｙＴａｇをＲＢＤのＣ末端に融合し、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒをＳＡｐＮＰサブユニットのＮ末端に融合した。この設計を最初にＦＲについて試験した。本発明者らは、ＲＢＤ－５ＧＳ－ＳｐｙＴａｇとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－５ＧＳ－ＦＲとの同時発現と別々の発現後の上清混合物との２つの生成戦略を比較し、ＣＲ３０２２カラムで精製を行った。５０－ｍｌのＥｘｐｉＣＨＯ細胞における一過性トランスフェクションから得られたタンパク質を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬカラムでＳＥＣによって分析した。両方の生成戦略は、ＳＡｐＮＰに対応するピーク（１２ｍｌ）をもたらした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、粒子収率においてそのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１対応物よりも顕著に優れていたが（ＣＲ３０２２／ＳＥＣ後０．６～１．０ｍｇ対０．３～０．５ｍｇ）、上清混合物は共発現よりも優れているようであった。それにもかかわらず、結果は、両方の戦略が、優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）適合チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるＲＢＤコンジュゲートＳＡｐＮＰをの産生に使用できることを示唆している。ＳＥＣにより精製したＲＢＤ－５ＧＳ－ＳＰＹ－５ＧＳ－ＦＲ ＳＡｐＮＰについて抗原性を評価した。ＥＬＩＳＡにおいて、ＲＢＤ提示ＳＡｐＮＰは、より低いＥＣ５０値によって示されるように、わずかに改善されたｍＡｂ結合を示した。ＢＬＩでは、抗原性についての多価ディスプレイのより顕著な効果が観察され、顕著に増加した結合シグナルおよび定常解離を示した。
様々なＲＢＤ ＳＡｐＮＰの構造完全性を、ネガティブ染色ＥＭによって分析した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１については、ＳＡｐＮＰの産生が非常に少なかったＲＢＤ－１０ＧＳ－ＦＲ構築物を、比較のために含めた。対照的に、ＲＢＤ－５ＧＳ－ＳＰＹ－５ＧＳ－ＦＲ構築物は、目に見える表面装飾を有するＳＡｐＮＰを産生した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について、精製ＲＢＤ－５ＧＳ－ＳＰＹ－５ＧＳ－ＦＲ ＳＡｐＮＰは、生成戦略に関係なく、十分に形成されたナノ粒子に対応する形態を示した。同様の戦略に従って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２ ＲＢＤも多層Ｉ３－０１ｖ９ ＳＡｐＮＰに結合させた（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０．２００８．２０２２．２６２６３４，２０２０）。中程度の収率にもかかわらず、大きなＳＡｐＮＰがＥＭで観察された。
要約すると、本発明者らは、ＲＢＤベースのＳＡｐＮＰワクチンの迅速な開発のためのＳＰＹ系の有用性を実証する。２成分ＲＢＤ ＳＡｐＮＰと比較して、ここに提示されるＳＰＹ連結ＲＢＤ ＳＡｐＮＰは、安定性および製造可能性の点でより有利であり得る。
［実施例５］
準安定性を最小化することによる融合前スパイクの合理的設計
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクの準安定性を理解し、それに基づいてワクチン抗原として最適なスパイクを設計することが不可欠である。本発明者らは最初に、２Ｐ変異と、Ｇ４Ｓリンカーを用いてＣ末端に融合した三量化モチーフ（１ＴＤ０）との両方を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２のためのＨｉｓタグ化非切断スパイク外部ドメイン（ＳＥＣＴＯ）構築物を作製した。これらの２つの構築物を５０ｍｌのＥｘｐｉＣＨＯ細胞において一過性に発現させ、続いてニッケルカラムまたはＣＲ３０２２カラムで精製した。Ｓ２ＰＥＣＴＯ－５ＧＳ－１ＴＤ０－Ｈｉｓ６タンパク質を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬカラムでのＳＥＣによって特性評価した。ニッケルカラムの後、両方のＳ２ＰＥＣＴＯ構築物は、三量体ピーク（約１２ｍｌ）およびそれぞれ凝集体および二量体／単量体種を示す左右の肩部を示した。ＣＲ３０２２精製は、一貫した三量体ピークおよびより少ない二量体／単量体種をもたらした。次に、本発明者らは、二重グリシン変異（Ｖ１０６０Ｇ／Ｌ１０６１Ｇ、２Ｇと呼ばれる）を含む一対のＳＥＣＴＯ構築物を試験した。２Ｇ変異は、それぞれニッケルおよびＣＲ３０２２カラムによる精製後に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイクにはほとんど影響を及ぼさなかったが、異常なＳＥＣプロファイルを生成し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクについては収量を示さなかった。最後に、Ｓ２ＧΔＨＲ２と呼ばれる、ＨＲ２ストーク（Ｅ１１５０～Ｑ１２０８）を有さない一対のＳ２Ｇ変異体を試験した。ＨＲ２ストークの欠失は、ＣＲ３０２２精製時のＳＥＣプロファイルによって示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２三量体ピークを回復させ、両方のＳＡＲＳ－ＣｏＶについて凝集体を減少させた。
本発明者らは、ＨＲ２がＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクの準安定性の重要な決定因子であり得ると仮定した。２つの隣接スパイクのＨＲ１とＨＲ２との間の相互作用は、ＡＣＥ２結合およびＳ１解離に加えて、融合前から融合後への移行を促進し得る可能性がある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１と比較したＨＲ１の広範な変異（合計９）を考慮して、本発明者らは、２つのＨＲ１交換スパイク構築物を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクの準安定性におけるＨＲ１の役割を調べることを試みた。興味深いことに、ＨＲ１交換は効果的でないことが証明されたが、ＨＲ２ストークの欠失は再び三量体ピークを回復させる。したがって、Ｓ２ＧΔＨＲ２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２およびおそらく他のＣｏＶの一般的なスパイク設計を提供する。３００ｍｌのＥｘｐｉＣＨＯ細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２ＧΔＨＲ２－５ＧＳ－１ＴＤ０の４回の個別の生成実行は、０．８～１．０ｍｇの三量体収率でほぼ同一のＳＥＣプロファイルをもたらした。青色天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＢＮ－ＰＡＧＥ）により、ＳＥＣ画分にわたるＳ２ＧΔＨＲ２スパイクの純度が確認された。新たに生成されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２ＰＥＣＴＯおよびＳ２ＧΔＨＲ２スパイクについて抗原性を評価した。ＥＬＩＳＡでは、Ｓ２ＧΔＨＲ２スパイクは、５つの代表的なｍＡｂに対してＳ２ＰＥＣＴＯスパイクよりも一貫して高い親和性を示した。３つの新たに同定されたＮＡｂである、Ｃ１０５およびＣＣ１２．１／ＣＣ１２．３に対して試験した場合、２つのスパイクは同様のＥＣ５０値をもたらした。ＢＬＩでは、Ｓ２ＧΔＨＲ２スパイクは、最高濃度においてＳ２ＰＥＣＴＯスパイクよりも高い結合シグナルを示したが、同様の結合動態を示した。スパイク精製のためにＮＡｂ Ｐ２Ｂ－２Ｆ６を使用すると、ＳＥＣ画分にわたってＣＲ３０２２カラムと同様の純度ではるかに高い三量体収率をもたらした。
まとめると、本発明者らは、ＨＲ２ストークの欠失がスパイク特性を改善すると思われ、Ｓ２ＧΔＨＲ２が２Ｐ変異を改善するより良好なスパイク抗原を提供し得ることを実証する。
［実施例６］
単一成分で多層のＳＡｐＮＰの合理的設計
ＳＰＹ系を使用して三量体ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクをＳＡｐＮＰにコンジュゲートさせることが可能であることが証明されたが、ランダムかつ不可逆的な化学的連結は、表面上に占有されていないが空間的に閉塞された固定部位を有する不規則なディスプレイをもたらす。ＳＰＹ系は、おそらくＲＢＤなどの個々の抗原により適している。したがって、本発明者らは、遺伝子融合アプローチを使用して、単一成分、多層、自己集合性スパイクナノ粒子の合理的な設計を得ることに着手した。
天然のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオンは、融合前および融合後の両方のスパイクを表面に提示する。本発明者らのワクチン戦略は、それぞれ免疫系に８個または２０個の安定なＳ２ＧΔＨＲ２スパイクを提示する単一成分多層ＳＡｐＮＰを開発することを目的とする。この可能性を探索するために、本発明者らは、５－ａａのＧ４Ｓリンカーを用いてＦＲ上、５－ａａのＧ４Ｓリンカーを用いてＥ２ｐ上、および１０－ａａの（Ｇ４Ｓ）２リンカーを用いてＩ３－０１ｖ９上のＳ２ＧΔＨＲ２スパイクをモデル化し、それぞれ４７．９ｎｍ、５５．９ｎｍおよび５９．３ｎｍの直径を有する大きなＳＡｐＮＰを得た。３つのＳ２ＧΔＨＲ２ ＳＡｐＮＰ構築物を４００ｍｌのＥｘｐｉＣＨＯ細胞において一過性に発現させ、続いてＣＲ３０２２精製およびＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬカラムでのＳＥＣを行った。ＦＲおよびＥ２ｐ ＳＡｐＮＰについて低ｍ．ｗ．の不純物の変動が観察されたにもかかわらず、３つの別個の生成実行は、３つすべての構築物について非常に一貫したＳＥＣプロファイルを生成した。ＣＲ３０２２／ＳＥＣ精製後、本発明者らは、Ｓ２ＧΔＨＲ２－５ＧＳ－ＦＲ、Ｓ２ＧΔＨＲ２－５ＧＳ－Ｅ２ｐ－ＬＤ４－ＰＡＤＲＥ（またはＥ２ｐ－Ｌ４Ｐ）、およびＳ２ＧΔＨＲ２－１０ＧＳ－Ｉ３－０１ｖ９－ＬＤ７－ＰＡＤＲＥ（またはＩ３－０１ｖ９－Ｌ７Ｐ）について、平均０．３～０．４ｍｇ、０．１５～０．２５ｍｇ、および０．３～０．３５ｍｇのＳＡｐＮＰを得た。全体として、Ｓ２ＧΔＨＲ２－１０ＧＳ－Ｉ３－０１ｖ９－Ｌ７Ｐは、収率、純度および製造の安定性の点で最も優れていると思われた。
ＣＲ３０２２／ＳＥＣ精製ＳＡｐＮＰの構造完全性はネガティブ染色ＥＭによって特性評価され、モデリングと一致した４０～６０ｎｍの範囲の良好に形成された粒子を示した。スパイクは、ＳＡｐＮＰ表面上に容易に認識することができる。Ｓ２ＧΔＨＲ２提示ＳＡｐＮＰの抗原性を、ｍＡｂ／ＮＡｂの同じパネルを使用して評価した。ＥＬＩＳＡでは、３つのＳＡｐＮＰは、個々のスパイクと比較して、すべてではないが一部の抗体への結合がわずかに改善されたことを示した。ＢＬＩでは、本発明者らは、ピーク結合シグナルと抗原価との間の明確な相関を観察し、順位はＥ２ｐ／Ｉ３－０１ｖ９＞ＦＲ＞スパイクであった。二つの６０量体のディスプレイは、２４量体のＦＲと比較して抗体結合が有意に改善された。
要約すると、表面に８個または２０個のスパイクを有するこれらの大きなＶＬＰサイズのＳＡｐＮＰは、インビボ評価のための有望なワクチン候補を提供する。
［実施例７］
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２ワクチン誘導性結合抗体応答
選択されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２ ＲＢＤベースの免疫原およびスパイクベースの免疫原をＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて評価して、ワクチン誘導性抗体応答を評価した（図２）。５匹のマウスの群を３週間間隔で４回免疫化した。すべてのワクチン抗原を、Ｉ３－０１ｖ９ ＳＡｐＮＰを除いて、水中油型エマルジョンアジュバントであるＡｄｄａＶａｘと共に製剤化し、Ｉ３－０１ｖ９ ＳＡｐＮＰはリン酸アルミニウム（ＡＰ）と共に製剤化した。本発明者らは最初に、２つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤワクチン群において５０％効果希釈（ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）（ＥＤ５０）によって測定される結合抗体応答の長期分析を行った。この研究の結果を図３に示す。ＲＢＤ ＳＡｐＮＰ（ＲＢＤ－５ＧＳ－ＳＰＹ－５ＧＳ－ＦＲ）は、被覆抗原にかかわらず、ｗ２およびｗ５において、足場ＲＢＤ三量体（ＲＢＤ－５ＧＳ－１ＴＤ０）よりも有意に高いＥＤ５０力価を誘発し、ＲＢＤが被覆された場合、ｗ８において０．０００９のＰ値を示した。安定化スパイク（Ｓ２ＧΔＨＲ２－５ＧＳ－１ＴＤ０）と比較して、ＲＢＤ ＳＡｐＮＰは、ｗ２、ｗ５、およびｗ８においてＲＢＤに対して有意に高いＥＤ５０力価を誘発し、強い「エピトープ集束」効果を実証した。マウス血清は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクよりＥＤ５０力価が低いが、同様のパターンでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイクに結合した。次いで、本発明者らは、２つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク、Ｓ２ＰＥＣＴＯ－５ＧＳ－１ＴＤ０およびＳ２ＧΔＨＲ２－５ＧＳ－１ＴＤ０、ならびにそれぞれ８個または２０個のＳ２ＧΔＨＲ２スパイクをディスプレイする３つのＳＡｐＮＰによって誘導された結合抗体応答の長期分析を行った。Ｓ２ＧΔＨＲ２スパイクは、被覆抗原に関係なく、Ｓ２ＰＥＣＴＯスパイクよりも２～３倍高い平均ＥＤ５０力価を誘発し、より大きな免疫原性を示した（注、公平な比較を容易にするために、２つのスパイク群からのマウス血清をそれぞれのスパイクに対して試験した）。
３つのＳＡｐＮＰは、被覆抗原に応じて異なる時間的パターンを示した。スパイクを被覆抗原として使用した場合、Ｉ３－０１ｖ９群は、経時的に平均ＥＤ５０力価の着実な増加を示した。このＳＡｐＮＰは、ｗ２およびｗ８の２つの時点で最も高い平均ＥＤ５０力価をもたらし、すべての時点でＳ２ＰＥＣＴＯスパイクを有意に上回った。より小さいＦＲは、低い平均ＥＤ５０力価で同様の時間的パターンを示し、これは依然としてＳ２ＰＥＣＴＯ群のそれよりも有意に高い。３つのＳＡｐＮＰの中で、Ｅ２ｐは、ｗ２において最も低い平均ＥＤ５０力価を示し、ｗ５において最も高くなり、ｗ８においてわずかに減少した。ＲＢＤ特異的応答に関して、５つの群は、それらの平均ＥＤ５０力価に基づいて明確な順位付けを示し、これは時間点にわたって一貫したままであった。ｗ２において、Ｉ３－０１ｖ９は１７５の平均ＥＤ５０力価を誘発したが、他のすべてのスパイクベースのワクチン群はＲＢＤ特異的応答をほとんど示さなかった。ｗ５およびｗ８において、Ｓ２ＧΔＨＲ２は、Ｓ２ＰＥＣＴＯよりも高いＥＤ５０力価（平均で２倍）を誘発したが、３つすべてのＳＡｐＮＰは、個々のＳ２ＧΔＨＲ２スパイクよりも優れており、ＥＤ５０力価の順位付けはそれらのサイズと相関していた（ＦＲ＜Ｅ２ｐ＜Ｉ３－０１ｖ９）。血清は、より低いレベルではあるが、同様にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイクと反応した。
最後に、本発明者らは、３つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ワクチン、Ｓ２ＰＥＣＴＯ スパイク（Ｓ２ＰＥＣＴＯ－５ＧＳ－１ＴＤ０）、足場ＲＢＤ三量体（ＲＢＤ－５ＧＳ－１ＴＤ０）、およびＲＢＤ ＳＡｐＮＰ（ＲＢＤ－５ＧＳ－ＳＰＹ－５ＧＳ－ＦＲ）によって誘導された結合抗体応答を比較した。ＥＤ５０力価に基づいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ Ｓ２ＰＥＣＴＯ スパイクはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２ＧΔＨＲ２スパイクよりも免疫原性が高いように見えたが、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－１ ＲＢＤ ＳＡｐＮＰはそのＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２対応物よりも有利ではなかった。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２ＰＥＣＴＯスパイクとの血清反応性は、３つすべてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ワクチン群で観察された。
したがって、本発明者らの結果は、ＲＢＤ ＳＡｐＮＰがスパイクと比較して同様またはより高いレベルでＲＢＤ特異的抗体力価を誘発できることを示している。さらに、Ｓ２ＧΔＨＲ２スパイクは、その優れたインビトロ特性に加えて、広く使用されているＳ２ＰＥＣＴＯスパイクよりも免疫原性が高い。大きな多層Ｅ２ｐおよびＩ３－０１ｖ９ ＳＡｐＮＰは、本発明者らの以前のＨＩＶ－１、ＨＣＶ、およびエボラワクチン研究における知見と一致して、すべてのスパイクベースのワクチンの中で最も優れている。
［実施例８］
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２ワクチン誘導性ＮＡｂ応答
ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン開発における１つの主要な目標は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症から防御できる強力なＮＡｂ応答を生成することである。偽粒子（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２－ｐｐ）中和アッセイを使用して、異なるワクチン候補によって誘発された血清ＮＡｂ応答を評価した。図４に示す結果から示されるように、本発明者らは最初に、２つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤワクチン群において５０％阻害希釈（ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）（ＩＤ５０）によって測定されるＮＡｂ応答の長期分析を行った。ＲＢＤ ＳＡｐＮＰは、ｗ２という早い時期に自己ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して低力価のＮＡｂ応答を誘発し、その後の２つの時点でその利点を保持し、このことは、そのようなＲＢＤ ＳＡｐＮＰワクチンがワクチン接種時に迅速なＮＡｂ応答を誘発し得ることを示唆している。足場ＲＢＤ三量体群は、ｗ５において最も低い平均ＩＤ５０力価を示したが、ｗ８において安定化Ｓ２ＧΔＨＲ２スパイクによって誘導されたものに匹敵するＮＡｂ応答を示した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１－ｐｐアッセイでは、幾分異なるパターンが観察された。最初の時点ｗ２では、いずれのワクチン群も検出可能な異種ＮＡｂ応答を示さなかった。ｗ５およびｗ８において、Ｓ２ＧΔＨＲ２スパイクは、両方のＲＢＤベースのワクチンよりも強力なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＮＡｂ応答を誘発し、非ＲＢＤエピトープが交差中和に寄与し得ることを示唆した。
次いで、本発明者らは、５つのスパイクベースのワクチンによって誘導されたＮＡｂ応答の長期分析を行った。自己中和に関して、スパイクベースのワクチンは、１回目の注射後のｗ２においていかなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ｐｐ ＮＡｂ応答も誘発しなかった。しかし、ｗ５およびｗ８においては血清中和について一貫したパターンが観察された：現在人体試験でほとんどすべてのワクチン候補に使用されるＳ２ＰＥＣＴＯスパイクは、ｗ５およびｗ８でそれぞれ８７９および２４８１の最低平均ＩＤ５０力価を示し；新たに設計されたＳ２ＧΔＨＲ２スパイクは、平均ＩＤ５０力価がＳ２ＰＥＣＴＯスパイクよりも２．８～６．７倍高い、より強いＮＡｂ応答を誘導し、２Ｐから２Ｇへの置換およびＨＲ２ストークの欠失の有益な効果が確認された；３つのＳＡｐＮＰの中で、Ｅ２ｐがｗ５において最も優れており、Ｓ２ＰＥＣＴＯより９．７倍高く、Ｓ２ＧΔＨＲ２より１．４倍高い８４９３の平均ＩＤ５０力価を示し、一方、Ｉ３－０１ｖ９はｗ８において最も強力なＮＡｂ応答を示し、Ｓ２ＰＥＣＴＯおよびＳ２ＧΔＨＲ２よりそれぞれ７倍および２．５倍高い１７３５１の平均ＩＤ５０力価を示した。ＮＡｂ応答の同様の時間的パターンが異種ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１－ｐｐアッセイで観察された。Ｉ３－０１ｖ９ ＳＡｐＮＰは、ｗ２において３５１の平均ＩＤ５０力価でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＮＡｂ応答を誘発したが、他のすべての群は検出可能な中和を示さなかったことは注目に値する。それにもかかわらず、本発明者らの結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２ＧΔＨＲ２ベースのワクチン、特にＳＡｐＮＰが両方のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２に対する防御を提供し得ることを示唆している。最後に、本発明者らは、３つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ワクチンによって誘導されたＮＡｂ応答の長期分析を行った。自己ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１－ｐｐアッセイでは、Ｓ２ＰＥＣＴＯスパイクおよびＲＢＤ ＳＡｐＮＰは、ｗ２およびｗ５において、足場ＲＢＤ三量体よりも有意に強力なＮＡｂ応答を誘導し、３つすべてのワクチン群は、ｗ８において同様のＩＤ５０力価を示した。しかしながら、異種ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和は、ｗ２、ｗ５およびｗ８において３つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ワクチンについてベースラインレベル未満またはベースラインレベルであった。
したがって、本発明者らの結果は、ＮＡｂ誘発におけるＳ２ＰＥＣＴＯスパイクに対するＳ２ＧΔＨＲ２スパイクおよびＳ２ＧΔＨＲ２提示ＳＡｐＮＰの利点を実証する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤおよびＳ２ＧΔＨＲ２提示ＳＡｐＮＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＮＡｂ応答の誘発において同等であるが、後者は、ＳＡＲＳ関連ＣｏＶに対するより広範な防御を提供し得る。
［実施例９］
Ｔ細胞応答およびワクチン安全性
体液性免疫は、宿主－ウイルス相互作用を遮断し、ウイルス感染を防止するために必要であるが、細胞性免疫は、ウイルス感染を制御するために感染した宿主細胞を排除するために不可欠である。新たに出てきた証拠は、早期Ｔ細胞応答ならびにＴ細胞メモリーがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する防御に重要であることを示している。しかし、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンは、ＣＤ４＋Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）Ｔ細胞応答を誘導し、Ｔｈ２型を誘導しない必要があるが、、これは後者がワクチン関連呼吸器疾患の増強（ＶＡＥＲＤ）に関連しているためである。さらに、濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ）は、ＮＡｂの成熟および産生において重要な役割を果たす。したがって、Ｔ細胞応答を理解することは、有効かつ安全なＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの開発にとって重要である。
インターフェロン（ＩＦＮ）－γ産生Ｔｈ１細胞は、最適な抗体応答を生成するため、およびウイルスのクリアランスに対する細胞性免疫の誘導のために重要である。本発明者らは、最初に、メモリーＴ細胞が脾臓に既に発生していた場合の、スパイクタンパク質に特異的なＣＤ４＋Ｔｈ１応答の誘導に対する様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン製剤の影響を、４回目の免疫化の２週間後であるｗ１１に調べた。Ｓ２Ｐ群および２つのＳＡｐＮＰ群（Ｅ２ｐおよびＩ３－０１ｖ９）のマウス脾細胞を、陰性対照としてナイーブ試料を使用してフローサイトメトリー（ＦＣ）によって分析した。この研究の結果を図５に示す。Ｉ３－０１ｖ９は、それぞれＳ２ＰおよびＥ２ｐよりも約１．５倍および２．３倍高い頻度のＩＦＮ－γ産生ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞を誘導した。特に、わずか４時間のそれぞれの抗原での再刺激後、Ｅ２ｐおよびＩ３－０１ｖ９群の両方が、Ｓ２Ｐおよびナイーブ対照群よりも約２倍高い頻度でＣＤ１０７ａ産生細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞を産生した。ＩＦＮ－γ／ＩＬ－４（インターロイキン－４）二重陽性細胞は、Ｔｈ１条件下でＩＦＮ－γを産生する能力を依然として保持しながら、ＩＬ－４を産生する能力を獲得したメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞である。Ｉ３－０１ｖ９は、Ｓ２ＰおよびＥ２ｐよりも３倍および５倍多いＩＦＮ－γ／ＩＬ－４二重陽性メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導したように見えた。これらの結果は、Ｉ３－０１ｖ９が強力なＣＤ４＋Ｔｈ１細胞およびＩＦＮ－γ／ＩＬ－４二重陽性メモリーＣＤ４＋細胞の両方を誘導し得ることを示唆する。
さらに、図５に示すように、Ｉ３－０１ｖ９は、Ｓ２ＰおよびＥ２ｐよりも多くのＩＦＮ－γ／ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）二重陽性ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を誘導した。これらのデータは、防御ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、Ｉ３－０１ｖ９ ＳＡｐＮＰで免疫化したマウスにおいても生じたことを示唆している。注目すべきことに、Ｓ２ＰおよびＥ２ｐではなく、Ｉ３－０１ｖ９で免疫化したマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗原再刺激時にＩＦＮ－γを迅速に産生する能力を獲得し、Ｉ３－０１ｖ９応答性エフェクター／メモリーＴ細胞の生成を示唆した。まとめると、本発明者らの所見は、Ｓ２ＧΔＨＲ２ Ｉ３－０１ｖ９ ＳＡｐＮＰが、マウスにおいてＣＤ４＋Ｔｈ１細胞、ＩＦＮ－γ／ＩＬ－４二重陽性メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞からなる強力なＴ細胞応答を誘導することができ、したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する有効なワクチンに必要とされる防御的細胞性免疫を提供することを示している。
［実施例１０］
いくつかの例示的な方法
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤおよびスパイク抗原の設計、発現および精製：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１分離株Ｔｏｒ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００４７１８）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＮ９０８９４７）のスパイク（Ｓ）遺伝子を使用して、哺乳動物細胞における発現のためのコドン最適化後にすべてのＲＢＤおよびスパイク構築物を設計した。ＲＢＤ配列は、それぞれＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１および２についてＰ３１７～Ｄ５１８およびＰ３３０～Ｎ５３２として定義される。ＳＥＣＴＯ配列は、それぞれＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１および２についてＭ１～Ｑ１１９０およびＭ１～Ｑ１２０８として定義される。Ｓ１／Ｓ２切断部位を除去するために、Ｒ６６７Ｇ変異および６８２ＧＳＡＧＳＶ６８７（配列番号１８）の改変を、それぞれＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１および２に導入した。２Ｐ（または２Ｇ）変異は、それぞれ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１および２のスパイクのＫ９６８／Ｖ９６９およびＫ９８６／Ｖ９８７になされた。ＨＲ２ストークを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｃ末端領域（Ｅ１１５０～Ｑ１２０８）をＳ２ＧＥＣＴＯから除去し、Ｓ２ＧΔＨＲ２と呼ばれるＨＲ２欠失スパイク構築物を得た。ウイルスキャプシドタンパク質ＳＨＰ（ＰＤＢ：１ＴＤ０）を、免疫化のためのスパイク構築物中の三量体化モチーフとして使用し、バクテリオファージＴ４フィブリチン由来のフォルドンドメイン（ＰＤＢ：１ＲＦＯ）を、ＥＬＩＳＡのためののスパイク抗原の被覆に使用して、１ＴＤ０由来の抗体応答をマスクした。すべての構築物をＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）において一過性に発現させた。簡潔には、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞を解凍し、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と共に３７℃、１３５ＲＰＭおよび８％ ＣＯ２においてシェーカーインキュベーター中でインキュベートした。細胞が１０×１０６ｍｌ－１の密度に達したら、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地を添加して、トランスフェクションのために細胞密度を６×１０６ｍｌ－１に低下させた。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ複合体を、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞における１００ｍｌのトランスフェクションのために製造業者の使用説明書に従って調製した。所与の構築物について、１００μｇのプラスミドおよび３２０μｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬を７．７ｍｌの冷ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中で混合した。１日目の最初の供給後、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞を、Ｍａｘ Ｔｉｔｅｒプロトコルに従って、３３℃、１１５ＲＰＭおよび８％ＣＯ２においてシェーカーインキュベーター中で培養し、５日目に追加の供給をした（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）。トランスフェクションの１３～１４日後に培養上清を回収し、４０００ＲＰＭで２５分間の遠心分離によって清澄化し、０．４５μｍフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて濾過した。ＣＲ３０２２抗体カラムを使用して上清からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２抗原を抽出し、これに続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラム（足場ＲＢＤ三量体用）またはＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬカラム（ＲＢＤ－ＳＰＹ－ＮＰ、スパイク、およびスパイク提示ＮＰ用）でＳＥＣを行った。比較のために、固定化Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して上清からＨｉｓタグ化ＳＥＣＴＯ－５ＧＳ－１ＴＤ０スパイクタンパク質を抽出し、５００ｍＭイミダゾールで溶出し、その後ＳＥＣを行った。タンパク質濃度を、ＵＶ２８０吸光度および理論的吸光係数を使用して決定した。
青色天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクおよびスパイク提示ＮＰを、青色天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＢＮ－ＰＡＧＥ）により分析し、クーマシーブルーで染色した。タンパク質を試料緩衝液およびＧ２５０ローディング色素と混合し、４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ（商標）ゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に添加した。ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ（商標）泳動緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、製造業者の使用説明書に従って使用して、ＢＮ－ＰＡＧＥゲルを１５０ Ｖで２～２．５時間泳動させた。
酵素結合免疫吸着アッセイ：Ｃｏｓｔａｒ（商標）９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェルを、最初に、０．２μｇの適切な抗原を含有する５０μｌのＰＢＳで被覆した。プレートを４℃において一晩インキュベートし、次いで、ＰＢＳおよび０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含む洗浄緩衝液で５回洗浄した。次いで、各ウェルを、ＰＢＳ、４０ｍｇｍｌ－１のブロッティンググレードの遮断薬（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、および５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳからなるブロッキング緩衝液１５０μｌで被覆した。プレートをブロッキング緩衝液と共に室温で１時間インキュベートし、次いで洗浄緩衝液で５回洗浄した。抗原結合のために、抗体をブロッキング緩衝液で最大濃度５μｇｍｌ－１に希釈し、次いで１０倍希釈系列に希釈した。各抗体希釈物について、合計５０μｌ容量を適切なウェルに添加した。マウス試料分析のために、血清または血漿をブロッキング緩衝液で２０倍希釈し、１０倍希釈系列に供した。各試料希釈物について、合計５０μｌ容量をウェルに添加した。各プレートを室温で１時間インキュベートした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで５回洗浄した。次いで、抗体結合のために、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）の１：５０００希釈液、またはマウス試料分析のために、ホースラッディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の１：３０００希釈液を洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）中で調製し、この希釈二次抗体５０μｌを各ウェルに添加した。プレートを二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄した。最後に、ウェルを５０μｌのＴＭＢ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で３～５分間発色させた後、５０μｌの２ Ｎの硫酸で反応を停止した。得られたプレート読み取りを４５０ｎｍの波長で測定した。注目すべきことに、ｗ２血清結合は、ＥＤ５０力価の正確な決定を可能にするプラトー（または飽和）に達しなかった。それにもかかわらず、最初の時点での異なるワクチン群の比較を容易にするために、ＯＤ４５０ の下限／上限を０．０／３．２に設定することによって、ｗ２におけるＥＤ５０値を導出した。
バイオレイヤー干渉法：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２ワクチン抗原、ＲＢＤ対ＲＢＤ－提示ＮＰならびにスパイク対スパイク提示ＮＰ、公知の抗原のパネルへの結合の動態を、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。すべてのアッセイを、ＦｏｒｔｅＢｉｏ １×動態緩衝液（ｋｉｎｅｔｉｃ ｂｕｆｆｅｒ）中で、１０００ＲＰＭに設定して撹拌しながら実施した。すべての溶液の最終容量は２００μｌ／ウェルであった。アッセイを、ソリッド黒９６ウェルプレート（Ｇｅｉｇｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）において３０℃で行った。Ｓ２ＧΔＨＲ２－ＮＰを除くすべての抗原について、１×動態緩衝液中５μｇｍｌ－１の抗体を抗ヒトＦｃ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（ＡＨＣ）の表面に３００秒間負荷した。Ｓ２ＧΔＨＲ２－ＮＰについては、抗ヒトＦｃ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（ＡＨＱ）を使用した。６０秒間のバイオセンサーベースラインステップを適用した後、バイオセンサー上の抗体と溶液中の抗原との会合を２００秒間分析した。足場ＲＢＤ三量体については９５０ｎｍ、ＲＢＤ－５ＧＳ－ＳＰＹ－５ＧＳ－ＦＲ ＮＰについては３７ｎｍ、スパイク三量体については１５０ｎｍ、ＦＲ／Ｅ２ｐ／Ｉ３－０１ｖ９ ＮＰ上に提示されたＳ２ＧΔＨＲ２については９／３．５／３．５ｎｍから開始して、抗原の二倍の濃度勾配を、６つの滴定シリーズで使用した。相互作用の解離を３００秒間追跡した。ベースラインドリフトの補正は、抗体を負荷したが抗原とインキュベートしなかったセンサおよび抗体を負荷しなかったが抗原とインキュベートしたセンサについて記録されたシフトの平均値を差し引くことによって行った。Ｏｃｔｅｔデータは、ＦｏｒｔｅＢｉｏのデータ取得ソフトウェアｖ．８．１によって処理された。実験データを、最適なフィッティングを達成するために２：１相互作用を説明する結合方程式にフィッティングさせた。注目すべきことに、Ｓ２ＧΔＨＲ２提示ＮＰとの抗体結合の比較を容易にするために、ＡＨＱを使用してＳ２ＧΔＨＲ２三量体結合も測定した。
ナノ粒子構築物の電子顕微鏡（ＥＭ）評価：ＲＢＤおよびＳ２ＧΔＨＲ２提示ＮＰの初期ＥＭ分析は、スクリプス研究所（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のコア顕微鏡施設で行った。簡潔には、ＮＰ試料を０．０１ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。炭素コーティングされた銅グリッド（４００メッシュ）をグロー放電させ、各試料８μＬを２分間吸着させた。過剰な試料を吸い上げ、グリッドを２％ギ酸ウラニルで２分間ネガティブ染色した。過剰な染色を吸い上げ、グリッドを乾燥させた。Ｔａｌｏｓ Ｌ１２０Ｃ透過型電子顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて試料を８０ｋＶで分析し、ＣＥＴＡ １６Ｍ ＣＭＯＳカメラで画像を取得した。
動物免疫化および試料採取：同様の免疫化プロトコルが、本発明者らの以前のＮＰワクチン研究で報告されている。簡潔には、動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）のガイドラインに従って、動物被験体を免疫研究で試験した。８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスをＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、承認されたＩＡＣＵＣプロトコルおよびＡＡＡＬＡＣ（国際動物ケア評価認証協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ））の国際ガイドラインを遵守して、スクリプス研究所（Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の環境制御室の換気ケージに収容した。マウスを、０、３、６および９週目に、５０μｇのワクチン抗原および１００μｌのアジュバント、ＡｄｄａＶａｘまたはＡｄｊｕ－Ｐｈｏｓ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を含有する２００μｌの抗原／アジュバント混合物で、腹腔内（ｉ．ｐ．）経路によって免疫化した。各免疫化の２週間後に血液を採取した。すべての血液採取は、後眼窩洞を介してヘパリン処理した毛細管を使用してＥＤＴＡ被覆管に行った。試料を等体積のＰＢＳで希釈し、次いで、１５ｍｌ ＳｅｐＭａｔｅ（商標）チューブ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の４．５ｍｌのＦｉｃｏｌｌに重層し、１２００ＲＰＭで１０分間、２０℃において回転させて、血漿と細胞を分離した。血漿を５６℃で３０分間熱不活性化し、１２００ＲＰＭで１０分間回転させ、滅菌濾過した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いで、１ｍｌのＡＣＫ赤血球溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁した。ＰＢＳで洗浄した後、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を２ｍｌのＢａｍｂａｎｋｅｒ凍結培地（Ｌｙｍｐｈｏｔｅｃ）に再懸濁した。脾臓も採取し、７０μｍのセルストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）で粉砕して脾細胞を細胞懸濁液中に放出した。脾細胞を遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、５ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ）で処理し、３ｍｌのＢａｍｂａｎｋｅｒ凍結培地と共に凍結した。血清を、ＥＬＩＳＡ結合および偽ウイルス中和アッセイのために熱不活性化した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２偽ウイルス中和アッセイ：偽粒子（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２－ｐｐ）中和アッセイを利用して、以前に報告された抗体の中和活性およびワクチン誘導性マウス抗体応答を評価した。ＨＩＶ－１ｐＮＬ４－３．ｌｕｃＲ－Ｅ－プラスミド（ＮＩＨ ＡＩＤＳ試薬プログラム）と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１分離株Ｔｏｒ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００４７１８）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＮ ９０８９４７）のＳ遺伝子をコードする発現プラスミドとを、リポフェクタミン３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって４：１の比でＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクションすることによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２－ｐｐを生成した。４８～７２時間後、４０００ＲＰＭで１０分間遠心分離することによって上清からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２－ｐｐを収集し、アリコートを取り、使用前に－８０℃で保存した。０．１～１０μｇ／ｍｌの出発濃度のｍＡｂまたは１００倍の出発希釈度のマウス血清を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２－ｐｐを含有する上清と混合し、白ソリッドボトム９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中３７℃で１時間インキュベートした。３倍希釈系列をアッセイに使用した。ＨＥＫ２９３Ｔ－ｈＡＣＥ２細胞株（カタログ番号：ＮＲ－５２５１１）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク遺伝子を含有するベクターｐｃＤＮＡ３．１（－）（カタログ番号：ＮＲ５２４２０）をＢＥＩ ＲＥＳＯＵＲＣＥＳから入手し、偽ウイルス中和アッセイに使用した。簡潔には、１×１０４のＨＥＫ２９３Ｔ－ｈＡＣＥ２細胞を各ウェルに加え、プレートを３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、上にある培地を除去し、細胞を溶解した。感染細胞からのホタルルシフェラーゼシグナルを、製造者の使用説明書に従って、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して決定した。データをＧｅｎ ５ソフトウェアを搭載したＢｉｏＴｅｋマイクロプレートリーダーから取得し、一連の非感染ウェルからの平均バックグラウンド発光を各ウェルから減算し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８．４．３を使用して、ウェルからの値を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２－ｐｐのみを含むウェルと比較して中和曲線を作成した。ＭＬＶ－ｐｐと呼ばれるマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）Ｅｎｖ遺伝子で偽化された同じＨＩＶ－１ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞において生成し、陰性対照として中和アッセイに含めた。
樹状細胞（ＤＣ）の生成：マウス骨髄（ＢＭ）を、１０％ウシ胎児血清および組換えマウスＦｌｔ３Ｌ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＳＣＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地で９日間培養した。ＤＣ活性化を誘導するために、未成熟ＤＣをリポ多糖（ＬＰＳ、１００ｎｇ／ｍＬ）、Ｒ８４８（レジキモド、１００ｎｇ／ｍＬ）またはＣｐＧ（ＯＤＮ １５８５、１μＭ）と共に一晩インキュベートし、これによりＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４、ＴＬＲ７／８またはＴＬＲ９シグナル伝達がそれぞれ活性化された。実験のために細胞を回収した。ｐＤＣを選別して、ＦＡＣＳセルソーターおよび磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ－Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＣＡ）を使用してＣＤ１１ｃ＋Ｂ２２０＋細胞を単離した。
抗体（Ａｂ）およびフローサイトメトリー分析：免疫蛍光染色に使用されるすべての抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ），ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）またはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から購入した。磁気マイクロビーズ結合Ａｂおよびストレプトアビジンは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ－Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）から購入した。組換えヒトＩＬ－２タンパク質は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入した。組換えマウスＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）およびマウスＳＣＦは、Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｗａｒｗｉｃｋ、ＰＡ）から購入した。細胞を適切な濃度のｍＡｂで染色した。ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）製のＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅを用いて死細胞を除外した。フローサイトメトリー分析を、ＬＳＲＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＡ）およびＣａｎｔｏサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＮＪ）を使用して行った。細胞をＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＡ）で選別した。
Ｔ細胞の培養および活性化：免疫化マウス由来の脾臓単核細胞を、ＩＬ－２（５．０ｎｇ／ｍｌ）を含有する完全ＩＭＤＭ培地中で、Ｓ２Ｐ、Ｅ２ＰおよびＩ３－０１をパルスした、またはパルスしなかったＤＣの存在下で培養した。細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー分析のために、１６時間後に細胞を収集した。
統計：抗体力価分析では、異なるワクチン群の比較を、両側対応のないスチューデントｔ検定を使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８．４．３で行った。Ｔ細胞分析では、両側対応のないスチューデントｔ検定、ＡＮＯＶＡ、次いで事後ｔ検定を使用して平均の比較を行った。０．０５以下のＰ値を有意とみなした。
＊＊＊
したがって、本発明は、上記の代表的な実施形態を参照して広く開示され、例示されている。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に様々な改変を加え得るが理解されよう。
本明細書で引用されるすべての刊行物、配列アクセッション番号、特許および特許出願は、それぞれが個別にその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に明示的に示されているかのように、そのように組み込まれることにさらに留意されたい。参照により組み込まれる本文に含まれる定義は、本開示における定義と矛盾する限り除外される。

Claims (25)

  1. コロナウイルスの野生型可溶性Ｓ配列と比較して融合前Ｓ構造を安定化する改変を有する、変更された可溶性Ｓ配列を含み、前記改変が、（ａ）Ｓ１／Ｓ２切断部位を不活性化する変異、および（ｂ）ヘプタドリピート１（ＨＲ１）領域と中央ヘリックス（ＣＨ）領域との間のターン領域における、融合中にＨＲ１およびＣＨが直鎖ヘリックスを形成するのを妨げる変異、を含む、コロナウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質由来の操作された免疫原ポリペプチド。
  2. ヘプタドリピート２領域（ＨＲ２）のトランケーションをさらに含む、請求項１に記載の免疫原ポリペプチド。
  3. 前記コロナウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、ｃｒｙｏ－ＥＭモデルＰＤＢ ＩＤ ６ＶＳＢに基づくアミノ酸ナンバリングで、Ｓ１／Ｓ２切断部位を不活性化する変異が、６８２ＲＲＡＲ６８５（配列番号１９）のＧＳＡＧ（配列番号２０）による置換を含み得、前記ターン領域における変異が、二重変異Ｋ９８６Ｇ／Ｖ９８７Ｇ、Ｋ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｐ、Ｋ９８６Ｇ／Ｖ９８７ＰまたはＫ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｇを含む、請求項１に記載の免疫原ポリペプチド。
  4. 前記野生型可溶性Ｓ配列が、配列番号１４、またはその実質的に同一な、もしくは保存的に改変された変異体を含む、請求項３に記載の免疫原ポリペプチド。
  5. 前記野生型可溶性Ｓ配列のＣ末端におけるＨＲ２（配列番号９）のトランケーションをさらに含む、請求項４に記載の免疫原ポリペプチド。
  6. 配列番号１５に示されるＮ末端リーダー配列をさらに含む、請求項５に記載の免疫原ポリペプチド。
  7. 前記Ｃ末端に三量体化モチーフをさらに含む、請求項５に記載の免疫原ポリペプチド。
  8. 前記三量体化モチーフが、フォルドン（配列番号２６）もしくはウイルスカプシドタンパク質ＳＨＰ（配列番号２７）、またはその実質的に同一な、もしくは保存的に改変された変異体を含む、請求項７に記載の免疫原ポリペプチド。
  9. 配列番号３２～３７のいずれか１つに示される配列、またはその実質的に同一な、もしくは保存的に改変された変異体を含む、請求項５に記載の免疫原ポリペプチド。
  10. 前記変更された可溶性Ｓ配列のＣ末端に融合された自己集合性ナノ粒子のサブユニット配列をさらに含む、請求項１に記載の免疫原ポリペプチド。
  11. 請求項３に記載の免疫原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。
  12. 前記免疫原ポリペプチドがＮ末端リーダーをさらに含む、請求項１１に記載のポリヌクレオチド配列。
  13. 自己集合性ナノ粒子のサブユニット配列のＮ末端に、Ｃ末端において融合された免疫原ポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする、請求項１１に記載のポリヌクレオチド配列。
  14. 自己集合性ナノ粒子の表面にディスプレイされた、請求項１に記載の免疫原ポリペプチドを含む、コロナウイルスワクチン組成物。
  15. 前記自己集合性ナノ粒子が三量体配列を含み、前記免疫原ポリペプチドのＣ末端が前記ナノ粒子のサブユニット配列のＮ末端に融合されている、請求項１４に記載のワクチン組成物。
  16. 前記自己集合性ナノ粒子がＩ３－０１、Ｅ２ｐまたはフェリチンを含む、請求項１４に記載のワクチン組成物。
  17. 前記ナノ粒子サブユニット配列のＣ末端に融合されたロックドメインおよび／またはＴ細胞エピトープをさらに含む、請求項１４に記載のワクチン組成物。
  18. （１）Ｎ末端からＣ末端に向かって以下を含むポリペプチド配列、（ａ）操作されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチド、ＧＳリンカー配列およびナノ粒子配列Ｉ３－０１ｖ９、（ｂ）操作されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチド、ＧＳリンカー配列およびナノ粒子配列Ｅ２ｐ、もしくは（ｃ）操作されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチド、ＧＳリンカー配列およびナノ粒子配列フェリチン、または
    （２）前記ポリペプチド配列の保存的に改変された変異体
    を含む、請求項１４に記載のワクチン組成物。
  19. 前記操作されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原ポリペプチドが、ｃｒｙｏ－ＥＭモデルＰＤＢ ＩＤ ６ＶＳＢに基づくアミノ酸ナンバリングで、（ａ）前記Ｓ１／Ｓ２切断部位６８２ＲＲＡＲ６８５（配列番号１９）のＧＳＡＧ（配列番号２０）による置換、（ｂ）前記ターン領域における二重変異Ｋ９８６Ｇ／Ｖ９８７Ｇ、および（ｃ）前記野生型可溶性Ｓ配列のＣ末端におけるＨＲ２（配列番号９）のトランケーション、を含む、請求項１８に記載のワクチン組成物。
  20. 前記操作されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原ポリペプチドが、配列番号３３もしくは３４、またはその保存的に改変された変異体を含む、請求項１８に記載のワクチン組成物。
  21. （１）Ｎ末端からＣ末端に向かって以下を含むポリペプチド配列（ａ）配列番号３３に示される操作されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチド、リンカー配列（Ｇ４Ｓ）２（配列番号２２）、配列番号２３に示されるナノ粒子配列（Ｉ３－０１ｖ９）、配列番号２９に示されるロックドメイン（ＬＤ７）、および配列番号３０に示されるＴ細胞エピトープ、（ｂ）配列番号３３に示される操作されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチド、リンカー配列Ｇ４Ｓ（配列番号２１）、配列番号２４に示されるナノ粒子サブユニット配列（Ｅ２ｐ）、配列番号２８に示されるロックドメイン（ＬＤ４）、および配列番号３０に示されるＴ細胞エピトープ、もしくは（ｃ）配列番号３３に示される操作されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリペプチド、リンカー配列Ｇ４Ｓ（配列番号２１）、配列番号２５に示されるナノ粒子配列（フェリチン）；または（２）前記ポリペプチド配列の保存的に改変された変異体；を含む、請求項２０に記載のワクチン組成物。
  22. 配列番号３８～４０のいずれか１つに示される配列、またはその実質的に同一な、もしくは保存的に改変された変異体を含む、請求項２０に記載のワクチン組成物。
  23. 請求項１５に記載のワクチン組成物のサブユニット配列を含むポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列。
  24. 請求項１４に記載のワクチン組成物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  25. 対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を予防または治療する方法であって、薬学的有効量の請求項１４に記載のワクチン組成物を前記対象に投与することを含む方法。
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