JP2023539642A - ヒトＩｇＧ１の改変ＦＣ領域 及び少なくとも１つの異種抗原を含むポリペプチドをコードする核酸 - Google Patents

ヒトＩｇＧ１の改変ＦＣ領域 及び少なくとも１つの異種抗原を含むポリペプチドをコードする核酸 Download PDF

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Abstract

本発明は、核酸及び当該核酸がコードするペプチドに関する。特に、ペプチドは、改変ＩｇＧ１ Ｆｃ領域と、Ｂ細胞又はＴ細胞エピトープであってもよい１つ以上の異種エピトープとを含む。本発明の核酸は、(i) ヒトＩｇＧ１の改変Ｆｃ領域、及び、(i) 少なくとも１つの異種抗原を含むポリペプチドをコードしてもよく、ここで、(a) 前記改変Ｆｃ領域は、ＣＤ６４及び／又はＴＲＩＭ２１と結合できるＦｃの少なくとも一部を含み、(b) 前記Ｆｃ領域の残基の少なくとも１つが、マウスＩｇＧ３抗体の対応する残基に改変されており、かつ、(c) 前記改変Ｆｃ領域は、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に対するアビディティーが、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して増強されている。

Description

本発明は、核酸及び当該核酸がコードするペプチドに関する。特に、ペプチドは、改変ＩｇＧ１ Ｆｃ領域と、Ｂ細胞又はＴ細胞エピトープであってもよい１つ以上の異種エピトープとを含む。本発明の核酸及びペプチドは、高アビディティーＣＤ８ Ｔ細胞、Ｔｈ１ ＣＤ４ Ｔ細胞及び強力な抗体応答を刺激するワクチンとして使用できる。
がんに対するワクチンでは、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞応答の両者を含む強力な細胞性免疫の刺激が不可欠である。感染症に対するワクチンでは、細胞性免疫及び中和抗体の両者の刺激が重要である。
免疫系は、有害な病原体及び悪性腫瘍と戦うために使用できる強力な防御機構である。特に、悪性疾患や侵入する外来病原体（例．ウイルス）の特徴である、改変、変異又は過剰発現した自己抗原に対するワクチン接種により、適応免疫を教育できる。
免疫系ががん細胞を認識して排除できるという概念は、免疫監視と呼ばれている[1, 2]。がんと自己との間の免疫学的な差異は自然に検出でき、多くの個体で、がん細胞の排除につながる。この理論は、免疫系が自然にがん細胞を検出し、排除できることを示唆している。免疫のあるマウスによる研究では腫瘍の拒絶を示し、得られた保護は、Ｔ細胞の移入によりマウスに養子移入できる[3]。マウスのノックアウトモデルでは、発癌物質が誘発する肉腫や自然発生する上皮がんの発生の低下に、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）及びリンパ球が重要であることが示された[4]。黒色腫が自然退縮した患者は、腫瘍特異的なクローンＴ細胞増殖の徴候を示し、免疫監視の証拠を提供した[5]。最近の研究では、形質転換の間に腫瘍で生じた変異が、Ｔ細胞が効率的に標的とすることができるネオ抗原を生成できることが示された[6]。この研究は、免疫系は腫瘍と自己を区別できるものの、依然として、免疫が正常な多くの個体ではがんが発生するという事実を強調している。これは、最初の免疫応答は腫瘍を回避するものの、免疫応答は適応し、なおも腫瘍を攻撃できるという免疫平衡につながる可能性がある、腫瘍の高い変異頻度のためである。最終的に、腫瘍は「免疫編集」と呼ばれる過程で回避し、免疫応答にもかかわらず増殖する[7]。
免疫療法は、免疫細胞を腫瘍微小環境に動員し、抗腫瘍免疫を増強することを目指している。これが生じることを防ぐことが可能な主な理由は２つある。まず、腫瘍は、効果的な免疫応答を開始するのにふさわしい条件を示さない。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）又はダメージ関連分子パターン分子（ＤＡＭＰＳ）などのシグナルによって誘導される危険を刺激する共刺激がなく、又は、初回免疫の応答で腫瘍特異的エピトープの提示が不十分な場合、腫瘍を溶解できる高アビディティーＴ細胞は生成されない[8, 9]。腫瘍細胞を死滅できない低アビディティーＴ細胞による刺激は、初期の腫瘍ワクチンの多くの失敗の理由と考えられている。Ｔ細胞プライミングの欠如に対処し、腫瘍特異的免疫応答を誘導する戦略には、ワクチンが含まれる。効率的な抗がん免疫療法は、高アビディティーＴ細胞が認識できる抗原の効果的な標的化に依存している。腫瘍で発現する多くの抗原は、正常な組織でも発現しており、それを認識するＴ細胞は胸腺での寛容の影響を受ける。これは、高用量の免疫原によって刺激される低アビディティーＴ細胞のレパートリーを残すが、腫瘍細胞を死滅させるのに十分な標的を腫瘍細胞上に見つけることができない。目的は、胸腺では発現せず、腫瘍細胞では豊富に見られるが健康な組織では見られない抗原を見いだすことである。
ウイルスは、大まかに「ノンエンベロープ型」又は「エンベロープ型」のいずれかに分類できる。機能的には、ウイルスのエンベロープは、ウイルスが宿主に侵入することを可能にする。エンベロープ表面のウイルス糖タンパク質は、宿主の細胞膜上の受容体部位を認識し、結合する。これにより、ウイルスエンベロープと宿主の膜が融合し、ウイルスゲノムが侵入して放出され、宿主が感染する。ウイルス感染の初期には、ＣＤ４ Ｔ細胞応答及びＣＤ８ Ｔ細胞応答が生じ、ウイルスに感染した細胞を見つけて死滅させ、ウイルスの更なる複製を防ぐ。感染の後期には、ウイルス中和抗体（ＶＮＡｂ）が産生され、再感染を防ぐ。記憶Ｔ細胞応答とＶＮＡｂは、共に、同じ又は同類のウイルスに対する新たな感染を予防する上で重要である。同じ現象は他の病原体の感染にも当てはまる。ワクチンは、ウイルス／病原体にさらされる前に免疫応答を刺激する必要があり、また、宿主が迅速かつ効率的に応答して、わずかなウイルスを除去でき、ウイルスに関連する病的な状態を予防できるように設計されている。したがって、ワクチンは、わずかな抗原を認識する高アビディティーＴ細胞及びウイルスの細胞への侵入を防ぐ中和抗体を刺激する必要がある。Ｔ細胞は、感染細胞の表面のＭＨＣと共に提示されるウイルスタンパク質を認識できる。一方、中和抗体は、宿主細胞の受容体と接触してその細胞内への侵入を可能にするウイルスタンパク質に結合する必要がある。最も効率的なウイルスワクチンは、強力なＴ細胞応答及び抗体応答を刺激するが、罹患することはまれな弱毒化ウイルスである。すでに、天然痘、麻疹及びポリオを含むいくつか弱毒化ウイルスワクチンが認可されている。しかし、多くのウイルスは免疫認識を回避するように進化しており、したがって、弱毒化ウイルスワクチンは適切ではない。これは、ホルムアルデヒドのような化学物質や加熱による不活化で達成される不活化ウイルスを用いることで克服される可能性がある。このようなワクチンは、抗体応答は刺激できるものの、大量のウイルス／病原体を必要とし、高アビディティーＴ細胞応答の刺激は非常に苦手である。同様のアプローチは、集合してウイルスのように見えるが複製できないウイルス様粒子を使用することである。繰り返すが、これらのワクチンは強力な抗体応答を誘導し、ＨＰＶ感染を予防するために認可されている。弱毒化ウイルスに代わる方法は、ハイブリッドウイルスを用いることである。麻疹ウイルスやアデノウイルスなどのウイルスは、異種ウイルスからタンパク質を産生するように遺伝子改変されている。これらのウイルスは、病気を引き起こすことができないように弱体化又は無力化されており；細胞内で複製できるか、遺伝子を欠失させて複製できないようにされている。ウイルスベクターは安全性が良好な傾向があり、最近、エボラワクチンが承認された。しかし、ウイルスベクター（麻疹ウイルス、アデノウイルス）に対する既存の免疫の存在が、その有効性に影響を及ぼす可能性があり、低下する免疫応答を増強する能力を制限する。キャリアウイルスに対する免疫応答が確立されると、それらは、単一のウイルスに対してのみ使用でき、新しいウイルスのキャリアとして使用できない。ウイルスワクチンの利点は、タンパク質の発現を高レベルにできることで、強力な抗体応答を誘導する。これは、タンパク質ワクチンを使用しても達成できる。しかし、タンパク質ワクチンも、強力な免疫応答を刺激するためにアジュバントを必要とし；さらに、多くの場合、複数回の投与が必要である。タンパク質ワクチン及び異種ウイルスワクチンの両者は、高レベルの抗原を産生するが、Ｔ細胞が応答する前に、ウイルスによって溶解され、大量のウイルスが宿主に流出する可能性があるために危険であるウイルス量が多い細胞のみを死滅させる、低アビディティーＴ細胞応答を刺激する。
米国特許第7067110号は、抗原の全体又はドメインが抗体のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインと融合し、抗体による免疫及び細胞性免疫の両者を増強できるＦｃ－抗原融合タンパク質の使用を開示している。国際公開第2002/058728号は、ポリペプチド（抗原と融合したヒトＩｇＧ１のＦｃ）でＦｃγＲＩを標的化することが、高アビディティーＴ細胞応答を刺激できることを開示している。国際公開第2008/116937号は、非特異的プロモーターと免疫グロブリンの組換え重鎖をコードする少なくとも１つの配列とを含む核酸を開示しており、ここで、前記重鎖はその中に少なくとも１つの異種Ｔ細胞エピトープを有し、その結果、核酸が発現した場合、前記重鎖は天然の立体配座を取ることができない。
抗体の一次構造を破壊すること、折畳みを阻害すること、及び／又は分泌を重鎖のみに制限するか非常に少量のインタクトな抗体に制限することは、ヘルパーＴ細胞応答及び抗原特異的Ｔ細胞応答を強力に刺激する。
第１の側面では、本発明は、
(i) ヒトＩｇＧ１の改変Ｆｃ領域、及び
(i) 少なくとも１つの異種抗原
を含むポリペプチドをコードする核酸を提供し、
ここで、(a) 前記改変Ｆｃ領域は、ＴＲＩＭ２１と結合できるＦｃの少なくとも一部を含み、(b) 前記改変Ｆｃ領域の残基の少なくとも１つが、マウスＩｇＧ３抗体の対応する残基に改変されており、かつ、(c) 前記改変Ｆｃ領域は、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に対するアビディティーが、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して増強されている。
第２の側面では、本発明は、
(i) ヒトＩｇＧ１の改変Ｆｃ領域、及び
(i) 少なくとも１つの異種抗原
を含むポリペプチドをコードする核酸を提供し、
ここで、(a) 前記改変Ｆｃ領域は、ＣＤ６４と結合できるＦｃの少なくとも一部を含み、(b) 前記Ｆｃ領域の残基の少なくとも１つが、マウスＩｇＧ３抗体の対応する残基に改変されており、かつ、(c) 前記改変Ｆｃ領域は、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に対するアビディティーが、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して増強されている。
第３の側面では、本発明は、
(i) ヒトＩｇＧ１の改変Ｆｃ領域、及び
(i) 少なくとも１つの異種抗原
を含むポリペプチドをコードする核酸を提供し、
ここで、(a) 前記改変Ｆｃ領域は、ＣＤ６４及び／又はＴＲＩＭ２１と結合できるＦｃの少なくとも一部を含み、(b) 前記Ｆｃ領域の残基の少なくとも１つが、マウスＩｇＧ３抗体の対応する残基に改変されており、かつ、(c) 前記改変Ｆｃ領域は、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に対するアビディティーが、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して増強されている。
第４の側面では、本発明は、第１の側面の核酸を含むベクターを提供する。
第５の側面では、本発明は、第１の側面の核酸又は第２の側面のベクターがコードするペプチドを提供する。
本発明者らは、予想外にも、マウスＩｇＧ３（ｍＩｇＧ３）Ｆｃの特定の残基を抗原－Ｆｃ融合タンパク質のｈＩｇＧ１ Ｆｃ領域に導入すると、抗原の免疫原性が改善されることを見いだした。ｍＩｇＧ３は、ｍＩｇＧの中で、非共有結合オリゴマーを形成し、その生物活性に強く影響を及ぼし[10]、多価抗原に対する機能的親和性を高める唯一のアイソタイプである。隣接するｍＩｇＧ３ Ｆｃ領域間の非共有結合相互作用が、標的を長く占有し解離速度を低下させることで、この機能的親和性の増加を支持すると考えられる[11, 12]。ｍＩｇＧ３のオリゴマー化の性質は、多価抗原への結合がｍＩｇＧ３分子間相互作用を促進することを示したGreyら[13]によって最初に特定され、オリゴマー化によって、「分子間協同性」と呼ばれる特徴[12, 15, 16]である、抗原に対する機能的親和性の増加をもたらす[14, 15]。ＩｇＧ３ Ｆ（ａｂ’）２断片は抗原と協同的に結合しないので，この現象はＦｃに依存すると判明した[14]。オリゴマー化されたｈＩｇＧ１ Ｆｃは樹状細胞のＦｃγＲＩに結合するとは予測されないので、本発明で免疫原性が改善したことは驚くべきことである。予期せぬことに、本発明者らは、本発明によるＦｃ改変が、異種抗原に対する細胞性応答及び体液性応答の両者を改善することを示した。これは、ＦｃγＲＩに対する増強されたアビディティーが、更に効率的な抗原提示をもたらすことを示唆する。加えて、本発明のＦｃ改変ポリペプチドは、最初は単量体の形態で結合するので、免疫応答を阻害する低親和性のＦｃＲＩＩｂ及びＦｃＲＩＩＩｂ抑制性受容体と結合できない。分子間協同性結合を確立することにより、免疫原性が増強された改良ワクチンの創造は、並外れた臨床的有用性につながる可能性がある。
改変Ｆｃ領域は、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）、好ましくはＦｃγＲＩに対するアビディティーが、対応する野生型のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域と比較して、少なくとも１０％増強されていてもよい。改変Ｆｃ領域は、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）、好ましくはＦｃγＲＩに対するアビディティーが、対応する野生型のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、増強されていてもよい。
本発明のポリペプチドは、好ましくは、改変されていない野生型のヒトＩｇＧ１領域及び少なくとも１つの異種抗原を含む対応するペプチドと比較して、免疫原性及び／又は非共有結合によるオリゴマー化が増強されている。
本発明のポリペプチドの免疫原性及び／又は非共有結合によるオリゴマー化は、改変されていない野生型のヒトＩｇＧ１領域及び少なくとも１つの異種抗原を含む対応するペプチドと比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は少なくとも約１００％、増強されてもよい。
本発明では、改変Ｆｃ領域は、ＣＤ６４及び／又はＴＲＩＭ２１に結合するＦｃの一部を含む。それはＣＨ２及びＣＨ３を含んでいてもよく、場合によっては、ヒンジ領域を更に含んでいてもよい。ヒトＩｇＧ１のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインの１つ以上の残基は、マウスＩｇＧ３のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインの対応する残基で置換してもよい。本発明のいくつかの側面では、前記Ｆｃ領域の残基の少なくとも１つは、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインから選択される。いくつかの側面では、残基の少なくとも１つは、ＣＨ２ドメインから選択される。いくつかの側面では、残基の少なくとも１つは、ＣＨ３ドメインから選択される。
サブドメイン解析による結合ＣＨ２－ＣＨ３領域の詳細な分析によって、ＣＨ２及びＣＨ３の要素を含むｍＩｇＧ３の残基２８６－３０６及び３３９－３７８を含む不連続セクション－合計２３残基－を移動させることで、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＦｃγＲに対するアビディティーを増強できることが明らかになった。この２３残基は、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓである。これらの残基は、コンフォメーショナルな残基と同様、直接相互作用の複合効果に起因する分子間協同性を介した非共有結合によるオリゴマー化の増加に必要であり、コンフォメーショナルな残基は潜在的に許されるフレームワークを作り出す。Ｆｃ領域の改変の更なる詳細は、PCT/EP2020/071724に記載されており、その内容は参照により完全に組み込まれる。
ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域は、以下の残基：Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ａ３３９、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｋ３７０、Ｇ３７１、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８の１つ以上が改変されていてもよい。改変は、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓの１つ以上であってもよい。
ヒトＩｇＧ１の改変Ｆｃ領域は、Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ａ３３９、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｋ３７０、Ｇ３７１、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８位から選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３残基における改変を含んでいてもよい。好ましくは、ＩｇＧ１抗体の改変Ｆｃ領域は２３残基全てに改変を含む。
ヒトＩｇＧ１の改変Ｆｃ領域は、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３の改変を含んでいてもよい。好ましくは、ＩｇＧ１抗体の改変Ｆｃ領域は２３の改変全てを含む。
改変Ｆｃ領域は、以下の残基：Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｇ３７１、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８の１つ以上に改変を含んでいてもよい。改変は、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｇ３７１Ｎ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓの１つ以上であってもよい。
改変Ｆｃ領域は、Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｇ３７１、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８位から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５残基における改変を含んでいてもよい。好ましくは、ヒトＩｇＧ１抗体の改変Ｆｃ領域は１５残基全てに改変を含む。
改変Ｆｃ領域は、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｇ３７１Ｎ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５の改変を含んでいてもよい。好ましくは、改変Ｆｃ領域は１５の改変全てを含む。
改変Ｆｃ領域、以下の残基：Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｅ３４５、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｐ３７４、Ｄ３７６の１つ以上に改変を含んでいてもよい。改変は、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｐ３７４Ｓ、Ｄ３７６Ａの１つ以上であってもよい。
改変Ｆｃ領域は、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｅ３４５、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｐ３７４、Ｄ３７６位から選択される１、２、３、４、５、６又は７残基における改変を含んでいてもよい。好ましくは、改変Ｆｃ領域は７残基全てに改変を含む。
改変Ｆｃ領域は、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｐ３７４Ｓ、Ｄ３７６Ａから選択される１、２、３、４、５、６又は７の改変を含んでいてもよい。好ましくは、改変Ｆｃ領域は７の改変全てを含む。
改変Ｆｃ領域は、配列番号１で示すアミノ酸配列、又は配列番号１で示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。配列番号１は、代表的な改変Ｆｃ領域「ｉＶ１」のアミノ酸配列である（表４参照）。
本発明のポリペプチドの構造は、抗体の重鎖配列又はその実質的な部分の構造であってもよい。免疫グロブリンのドメインの構造と位置は、http://www.imgt.org/を参照して決定してもよい。
この明細書全体で、残基のナンバリングは、Lefranc et al., 2009 [17]に発表された、抗体配列のナンバリングのための標準化ＩＭＧＴ系による。他の適切なナンバリングは、当業者に知られている。改変ヒトＩｇＧ１抗体とその抗原の融合タンパク質間の対応する残基を特定するために、他の適切なナンバリングを使用してもよい。対応する残基の特定を可能にするナンバリングは、この発明での使用に適している。この明細書中で使用するナンバリングは、本発明の範囲を限定するものではなく、単に、改変される可能性がある残基を特定するために使用される。用語「対応する残基」は、比較する２つ以上の抗体又はその抗原結合断片における、構造的又は機能的に等価な位置の残基を意味することが意図される。場合によっては、対応する残基は、配列アラインメントによって特定してもよい。場合によっては、対応する残基は、構造を比較することによって特定してもよい。
本発明のいくつかの側面では、ポリペプチドは、Ｆｃ領域のアミノ酸残基の少なくとも１０個、Ｆｃ領域のアミノ酸残基の少なくとも２０個、Ｆｃ領域のアミノ酸残基の少なくとも３０個、Ｆｃ領域のアミノ酸残基の少なくとも４０個、Ｆｃ領域のアミノ酸残基の少なくとも５０個、Ｆｃ領域のアミノ酸残基の少なくとも７５個、Ｆｃ領域のアミノ酸残基の少なくとも１００個、Ｆｃ領域のアミノ酸残基の少なくとも２００個、Ｆｃ領域のアミノ酸残基の少なくとも３００個、Ｆｃ領域のアミノ酸残基の少なくとも４００個又はＦｃ領域のアミノ酸残基の少なくとも５００個を含んでいてもよい。好ましくは、ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１の全Ｆｃ領域を含む。
少なくとも１つの異種抗原は、（直接又はリンカーを介して）改変ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＮ末端と結合していてもよい。少なくとも１つの異種抗原が、（直接又はリンカーを介して）改変ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＣ末端と結合することは、あまり好ましくない。異種抗原がポリペプチドである場合、そのＮ末端で、より好ましくはそのＣ末端で、改変Ｆｃ領域と結合してもよい。本発明のポリペプチドのこの形式は、異種抗原がウイルス若しくは細菌タンパク質又はその免疫原性断片といった比較的大きな分子の場合に適用してもよい。好ましいそのような形式では、異種抗原のＣ末端が、必要に応じてリンカーを介して、改変Ｆｃ領域のＮ末端と結合する。
本発明のいくつかの側面では、少なくとも１つの異種抗原は、図２８～３３のいずれかに示すエピトープから選択される１つ以上のエピトープを含む。
本発明のいくつかの側面では、少なくとも１つの異種抗原は、表１又は２に示すエピトープから選択される１つ以上のエピトープを含む。
本発明のいくつかの側面では、少なくとも１つの異種抗原は、
(a) ＧＴＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹＨ（配列番号２９）；
(b) ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号３０）；及び
(c) ＷＮＲＱＬＹＰＥＷＴＥＡＱＲＬＤ（配列番号３１）
から選択される１つ以上のエピトープを含む。
本発明のいくつかの側面では、少なくとも１つの異種抗原は、
(a) ＧＴＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹＨ（配列番号２９）；
(b) ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号３０）；
(c) ＷＮＲＱＬＹＰＥＷＴＥＡＱＲＬＤ（配列番号３１）；及び
(d) ＶＰＬＤＣＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶＴＬＤＩＶＱＧ（配列番号３２）
から選択される１つ以上のエピトープを含む。
本発明のいくつかの側面では、少なくとも１つの異種抗原は、
(a) ＧＴＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹＨ（配列番号２９）；
(b) ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号３０）；
(c) ＷＮＲＱＬＹＰＥＷＴＥＡＱＲＬＤ（配列番号３１）；
(d) ＶＰＬＤＣＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶＴＬＤＩＶＱＧ（配列番号３２）；
(e) ＡＮＣＳＶＹＤＦＦＶＷＬＨＹＹＳＶＲＤＴＬＬＧＰＧＲＰＹＲ（配列番号３３）；及び
(f) ＱＣＴＥＶＲＡＤＴＲＰＷＳＧＰＹＩＬＲＮＱＤＤＲＥＬＷＰＲＫＦＦ（配列番号３４）
から選択される１つ以上のエピトープを含む。
本発明のいくつかの側面では、少なくとも１つの異種抗原は、
(a) ＬＬＭＷＩＴＱＣＦ（配列番号３５）；
(b) ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号３６）；
(c) ＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱ（配列番号３７）；及び
(d) ＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ（配列番号３８）
から選択される１つ以上のエピトープを含む。
本発明のいくつかの側面では、少なくとも１つの異種抗原は、
(a) ＬＬＭＷＩＴＱＣＦ（配列番号３５）；
(b) ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号３６）；
(c) ＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱ（配列番号３７）；
(d) ＰＥＳＲＬＬＥＦＹ（配列番号３９）；
(e) ＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰ（配列番号４０）；
(f) ＬＥＦＹＬＡＭＰＦ（配列番号４１）；
(g) ＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭ（配列番号４２）；
(h) ＭＰＦＡＴＰＭＥＡ（配列番号４３）；
(i) ＬＡＭＰＦＡＴＰＭ（配列番号４４）；
(j) ＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭ（配列番号４５）；
(k) ＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱ（配列番号４６）；
(l) ＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ（配列番号３８）；
(m) ＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬ（配列番号４７）；
(n) ＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴ（配列番号４８）；
(o) ＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩ（配列番号４９）；
(p) ＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲ（配列番号５０）；及び
(q) ＴＶＳＧＮＩＬＴＩ（配列番号５１）
から選択される１つ以上のエピトープを含む。
本発明のいくつかの側面では、少なくとも１つの異種抗原は、
(a) ＫＩＡＤＹＮＹＫＬ（配列番号５２）；
(b) ＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶ（配列番号５３）；
(c) ＥＬＬＨＡＰＡＴＶ（配列番号５４）；
(d) ＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＴＡＷＮＲ（配列番号５５）；
(e) ＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴ（配列番号５６）；
(f) ＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩ（配列番号５７）；
(g) ＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶ（配列番号５８）；
(h) ＡＬＮＴＰＫＤＨＩ（配列番号５９）；
(i) ＬＱＬＰＱＧＴＴＬ（配列番号６０）；
(j) ＬＬＬＤＲＬＮＱＬ（配列番号６１）；
(k) ＧＭＳＲＩＧＭＥＶ（配列番号６２）；
(l) ＩＬＬＮＫＨＩＤＡ（配列番号６３）；
(m) ＧＮＧＧＤＡＡＬＡＬＬＬＬＤＲＬＮＱＬＥ（配列番号６４）；及び
(n) ＫＨＷＰＱＩＡＱＦＡＰＳＡＳＡＦＦＧＭＳ（配列番号６５）
から選択される１つ以上のエピトープを含む。
本明細書では、用語「免疫原性断片」は、抗原又はタンパク質の全体よりも小さく、宿主動物（例．ヒト）で、その断片に特異的な体液性及び／又は細胞性免疫応答を誘導できる抗原又はタンパク質の一部分である。タンパク質の断片は、組換えなどの当技術分野における公知の技術を用い、タンパク質分解消化により、又は化学合成により、製造できる。ポリペプチドの内部又は末端の断片は、ポリペプチドをコードする核酸の一方の末端から（末端断片の場合）、又は両方の末端から（内部断片の場合）、１つ以上のヌクレオチドを除去することによって製造できる。
リンカー配列は、主に、可撓性（flexibility）を制限する可能性がある嵩高い側鎖を有さないグリシン、アラニン及びセリンのようなアミノ酸から構成されるので、通常、柔軟性である。あるいは、剛性の高いリンカーが所望される場合がある。リンカー配列の使用可能な長さ又は最適な長さは、簡単に決定できる。多くの場合、リンカー配列のアミノ酸長は、約１２未満（例えば１０未満）又は２～１０である。リンカーのアミノ酸長は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０であってもよい。使用可能な適切なリンカーの例には、ＧＧＧＧＳ（配列番号１０６）、ＧＧＧＳＧ（配列番号１０７）、ＧＧＳＧＧ（配列番号１０８）、ＧＳＧＧＧ（配列番号１０９）、ＧＳＧＧＧＰ（配列番号１１０）、ＧＧＥＰＳ（配列番号１１１）、ＧＧＥＧＧＧＰ（配列番号１１２）、ＧＧＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳ（配列番号１１３）及びＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１１４）が含まれるが、これらには限定されない。別のリンカーは、以下の配列モチーフ：ＧＧＧＳ（配列番号１１５）、ＴＶＬＲＴ（配列番号１１６）、ＴＶＳＳＡＳ（配列番号１１７）及びＴＶＬＳＳＡＳ（配列番号１１８）の１つ以上を有する配列を含んでいてもよい。この発明で使用される好ましいリンカーは、Ｉｇヒンジである。
あるいは、本発明のポリペプチドは、異種抗原が挿入される又は異種抗原によって置換される抗体可変領域を含んでいてもよい。本発明のポリペプチドは、そのＦｃ領域が改変されたヒトＩｇＧ１重鎖を含んでいてもよい。可変領域のＣＤＲの１つ以上が異種抗原に置換される場合が好ましい。全てのＣＤＲを異種抗原で置換できるが、好ましいＣＤＲはＣＤＲ３である。本発明のポリペプチドのこの形式は、異種抗原が例えばがん抗原の場合に使用できる。
抗体可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ、以下の異種抗原：
(a) ＧＴＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹＨ（配列番号２９）、ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号３０）及びＶＰＬＤＣＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶＴＬＤＩＶＱＧ（配列番号３２）；又は
(b) ＬＬＭＷＩＴＱＣＦ（配列番号３５）、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号３６）及びＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱ（配列番号３７）
に置換された重鎖可変領域を含んでいてもよい。
本発明の核酸がコードするポリペプチドは、配列番号２又は配列番号３で示すアミノ酸配列を含んでいてもよい。配列番号２及び配列番号３は、それぞれ、ｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓ（図３１参照）及びｉＳＣＩＢ２（図３３参照）ベクターがコードする抗体重鎖全体のアミノ酸配列である。
異種抗原は、コロナウイルスのＮタンパク質又はその免疫原性断片であってもよい。好ましくは、Ｎタンパク質はSARS-CoV-2に由来する。例えば、Ｎタンパク質は、SARS-CoV-2のＡ系統武漢株、SARS-CoV-2のB.1.351変異株、又はSARS-CoV-2のB.1.617.2変異株由来であってもよい。Ｎタンパク質は、配列番号４で示すアミノ酸配列（武漢株）を含んでいてもよい。Ｎタンパク質は、配列番号５で示すアミノ酸配列（B.1.351変異株）を含んでいてもよい。Ｎタンパク質は、配列番号２６で示すアミノ酸配列（B.1.1.7変異株）を含んでいてもよい。
好ましくは、本発明の核酸がコードするポリペプチドは、配列番号６で示すアミノ酸配列を含む。配列番号６は、「ＳＮ１５」ベクターがコードするｉＶ１改変Ｆｃ領域と融合したＮタンパク質（武漢株）のアミノ酸配列である（図２７参照）。
好ましくは、本発明の核酸がコードするポリペプチドは、配列番号７で示すアミノ酸配列を含む。配列番号７は、「ＳＮ１７」ベクターがコードするｉＶ１改変Ｆｃ領域と融合したＮタンパク質（B.1.351変異株）のアミノ酸配列である（図４８参照）。
本発明の核酸がコードするポリペプチドは、配列番号２７で示すアミノ酸配列を含んでいてもよい。配列番号２７は、「ＳＮ１６」ベクターがコードするｉＶ１改変Ｆｃ領域と融合したＮタンパク質（B.1.1.7変異株）のアミノ酸配列である（図４７参照）。
本発明の核酸は、少なくとも１つの異種抗原を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸と（別々に又は結合して）組み合わせて提供されてもよい。第２のポリペプチドは、抗体軽鎖であってもよい。抗体軽鎖は、その中に挿入された又はその中で置換された１つ以上の異種抗原を有していてもよい。異種抗原によって、抗体軽鎖の１つ以上のＣＤＲを置換してもよい。全てのＣＤＲは、異種抗原による置換に使用できるが、好ましいＣＤＲはＣＤＲ３である。第２の核酸がコードする抗体軽鎖が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ、ＷＮＲＱＬＹＰＥＷＴＥＡＱＲＬＤ（配列番号３１）、ＡＮＣＳＶＹＤＦＦＶＷＬＨＹＹＳＶＲＤＴＬＬＧＰＧＲＰＹＲ（配列番号３３）及びＱＣＴＥＶＲＡＤＴＲＰＷＳＧＰＹＩＬＲＮＱＤＤＲＥＬＷＰＲＫＦＦ（配列番号３４）に置換された異種抗原を含んでいてもよい。
第２の核酸がコードする抗体軽鎖は、ＣＤＲ２がＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ（配列番号３８）で置換された配列を含んでいてもよい。
第２の核酸がコードする抗体軽鎖は、配列番号１０又は配列番号１１で示すアミノ酸配列を含んでいてもよい。配列番号１０及び１１は、それぞれ、ｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓベクター（図３１）及びｉＳＣＩＢ２ベクター（図３３）にコードされている抗体軽鎖のアミノ酸配列である。
好ましくは、本発明の核酸がコードするポリペプチドは、配列番号２で示すアミノ酸配列を含み、第２の核酸がコードする抗体軽鎖は、配列番号１０で示すアミノ酸配列を含む。
好ましくは、核酸がコードするポリペプチドは、配列番号３で示すアミノ酸配列を含み、第２の核酸がコードする抗体軽鎖は、配列番号１１で示すアミノ酸配列を含む。
本発明のいくつかの側面では、第２の核酸は、SARS-CoV-2の受容体結合ドメインをコードする。受容体結合ドメインは、配列番号８で示すアミノ酸配列（武漢株のＲＢＤ）を含んでいてもよい。受容体結合ドメインは、配列番号９で示すアミノ酸配列（B.1.351変異株のＲＢＤ）を含んでいてもよい。受容体結合ドメインは、配列番号２８で示すアミノ酸配列（B.1.1.7変異株のＲＢＤ）を含んでいてもよい。
好ましくは、本発明の核酸がコードするポリペプチドは、配列番号６で示すアミノ酸配列を含み、第２の核酸は、配列番号８で示すアミノ酸配列を含む受容体結合ドメインをコードする。
好ましくは、核酸がコードするポリペプチドは、配列番号７で示すアミノ酸配列を含み、第２の核酸は、配列番号９で示すアミノ酸配列を含む受容体結合ドメインをコードする。
核酸がコードするポリペプチドは、配列番号２７で示すアミノ酸配列を含んでいてもよく、第２の核酸は、配列番号２８で示すアミノ酸配列を含む受容体結合ドメインをコードする。
本発明の核酸配列がコードするポリペプチドは、これまでに述べた配列のいずれかと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。例えば、核酸配列がコードするポリペプチドは、これまでに述べた配列のいずれかと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％、同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本発明は、図２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、４７、４８、５４、５５、５６、５７、５８又は５９、それぞれで開示するアミノ酸配列の一方又は両方を提供する。本発明の好ましいポリペプチドを、図１２ｂ（必要に応じて図１２ａと組み合わせて）、図１３ｂ（必要に応じて図１３ａと組み合わせて）、図１４ｂ（必要に応じて図１４ａと組み合わせて）、図１５ｂ（必要に応じて図１５ａと組み合わせて）、図２７ｂ（必要に応じて図２７ａと組み合わせて）、図２９ａ（必要に応じて図２９ｂと組み合わせて）、図３１ａ（必要に応じて図３１ｂと組み合わせて）及び図３３ｂ（必要に応じて図３３ａと組み合わせて）に示す。特に好ましい配列は、図２７、３１、３３、４８及び５４～５９に開示している。
発明者らは、Ａ系統武漢株のＮタンパク質及びＲＢＤをコードするＳＮ１５による免疫が、この株に対する強力なＶＮＡｂを提供するが、B.1.351及びB.1.617.2変異株のＲＢＤとも交差反応することを示した。同様に、発明者らは、B.1.351変異株のＮタンパク質及びＲＢＤをコードするＳＮ１７による免疫が、この株に対する強力なＶＮＡｂを提供するが、Ａ系統武漢株及びB.1.617.2変異株のＲＢＤとも交差反応することを示した。
改変Ｆｃ領域を含む本発明のポリペプチド及び野生型Ｆｃ領域を含む対応するポリペプチドのアビディティーは、表面プラズモン共鳴（例．Biacore 3000/ T200、GE Healthcare）によって、例えば、適切なリガンド（例．ＦｃγＲＩ）を含むＣＭ５チップに本発明のポリペプチドの濃度を増加させながら（０．３ｎｍｏｌ／Ｌ～２００ｎｍｏｌ／Ｌ）注入し、適切なソフトウェア（例．BIAevaluation 4.1）を用いてデータを適切な結合モデルに適合させることによって決定できる。同じ条件の対応する実験を、野生型のＦｃ領域を有する対応するポリペプチドで行うことができる。本発明のいくつかの側面では、本発明のポリペプチドがリガンドを被覆したＣＭ５チップに強固に結合することを表面プラズモン共鳴のデータが示す場合、改変Ｆｃ領域を含む本発明のポリペプチドは、リガンドに対し、野生型のＦｃを有する対応するポリペプチドより機能的親和性が大きい。これまでに述べたように、リガンドはＦｃ受容体、特にＦｃγ受容体を含んでいてもよい。全てのＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、オプソニン化された（標識された）微生物の食作用を誘導する最も重要なＦｃ受容体である。このファミリーは、いくつかのメンバー、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）を含み、それらは、分子構造が異なるために抗体親和性が異なる。ＦｃγＲＩは、ＦｃγＲＩＩやＦｃγＲＩＩＩよりもＩｇＧに強力に結合する。ＦｃγＲＩは、ＦｃγＲＩＩ又はＦｃγＲＩＩＩが有するドメインよりも１つ多い、３つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインからなる細胞外領域を有する。この特性は、ＦｃγＲＩが単一（又は単量体）のＩｇＧ分子に結合することを可能にするが、全てのＦｃγ受容体は、活性化されるために免疫複合体内の複数のＩｇＧ分子に結合しなければならない。本発明のいくつかの側面では、好ましい受容体はＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）である。本発明のいくつかの側面では、好ましい受容体はＴＲＩＭ２１である。本発明のいくつかの側面では、本発明のポリペプチドは、ＣＤ６４及び／又はＴＲＩＭ２１と結合できる。ＴＲＩＭ２１は細胞質抗体受容体であり、Ｅ３ユビキチンリガーゼである。それは細胞内の抗体を検知し、それらの迅速なプロテアソーム分解を媒介する。抗体がその可変領域内にＴ細胞エピトープを発現するように改変されるか、又は、異種抗原がＦｃに連結され、そして抗原提示細胞を直接形質導入できるＤＮＡプラスミドを介して投与される場合、細胞内でタンパク質が翻訳され、ＴＲＩＭ２１によって標的化される。
抗ｈｉｓ抗体で被覆されたBiacoreのＣＭ５チップは、金の表面に共有結合したカルボキシメチル化デキストランを含む。分子は、アミン、チオール、アルデヒド又はカルボキシル基を介してセンサー表面に共有結合される。薬物候補のような小さな有機分子を含む相互作用から、大きな分子集合体又はウイルス全体までを研究できる。高い結合能力は高い応答を与え、捕捉アッセイ及び小さな分子が関与する相互作用に有利である。高い表面安定性は、正確性と精度を提供し、同じ表面で繰り返し分析することを可能にする。他の適切なチップは当業者に公知であり、表面プラズモン共鳴プロトコルは、当技術分野で公知の標準的な技術に適合できる。
本発明のポリペプチドの免疫原性を決定してもよい。ポリペプチドの改善された特性は、Ｆｃ領域に改変された残基を有さない対応するポリペプチドの対応する特性と比較して測定してもよい。改善された機能的特性は相対的な尺度であることから、本発明のポリペプチドの免疫原性又は他の機能的特性を求めるのに使用する正確な方法は、その機能的特性の相対的な変化に影響を及ぼさない。
理論に拘束されることを望むものではないが、免疫原性を増強する本発明のポリペプチドの能力は、改変されたヒトＩｇＧ１ Ｆｃと細胞表面受容体の結合の直接的な結果の可能性がある。本発明のポリペプチド及び／又は核酸は、通常、核酸／ポリペプチドに加え、少なくとも１つの成分を有していてもよい医薬組成物の形態で投与される。
本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの異種抗原を含む。本明細書では、「異種抗原」は、改変されたＦｃ領域に対して異種である抗原を意味することが意図される。抗原は、Ｔ細胞抗原又はＢ細胞抗原であってもよい。本発明のいくつかのポリペプチドは、Ｔ細胞抗原及びＢ細胞抗原の両者を含む。抗原は、比較的大きな分子（例．ウイルス若しくは細菌のタンパク質又はその免疫原性断片）に含まれていてもよい。あるいは、それは、抗原又は抗原内のエピトープを構成するアミノ酸配列であってもよい。このような抗原／エピトープの例は、この明細書の表２及び３に記載されている。
抗原は、がんに由来するものであっても、感染症に由来するものであってもよい。いくつかの側面では、抗原はがんに由来する。いくつかの側面では、抗原は感染症に由来する。抗原は、高アビディティーのＣＤ８ Ｔ細胞、Ｔｈ１ ＣＤ４ Ｔ細胞及び／又は強力な抗体応答を刺激してもよい。本発明が、がんワクチンとして使用される場合、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞応答の両者を含む強力な細胞性免疫の刺激が不可欠である。本発明が、感染症のワクチンとして使用される場合、細胞性免疫及び中和抗体の両者の刺激が重要である。
本発明のポリペプチド、核酸及びベクターは、ウイルス感染症、特にコロナウイルス感染症に対するワクチンとして使用できる。コロナウイルス（ＣｏＶ）は、コロナウイルス亜科（コロナウイルス科；ニドウイルス目）に属し、アルファコロナウイルス（α-ＣｏＶ）、ベータコロナウイルス（β-ＣｏＶ）、ガンマコロナウイルス（γ-ＣｏＶ）、デルタコロナウイルス（δ-ＣｏＶ）の４つの属に分類される[18, 19]。γ-ＣｏＶとδ-ＣｏＶは、一般に鳥に感染するが、哺乳類に感染するものもある。α-ＣｏＶ及びβ-ＣｏＶウイルスは、ヒト及び動物の両者に感染し、疾患を引き起こすことが知られている。SARS-CoV（β-ＣｏＶ）、２２９Ｅ（α-ＣｏＶ）、ＨＫＵ１（β-ＣｏＶ）、ＮＬ６３（α-ＣｏＶ）及びＯＣ４３（β-ＣｏＶ）ウイルスはいずれもヒトに感染を引き起こすことができ[18]、典型的には上気道感染症及び比較的軽微な症状を引き起こす[20]。β-ＣｏＶはヒトに対し最も病原性の高いウイルスであり、このグループにはSARS-CoV-2、MERS-CoV及びSARS-CoVも含まれ[18, 21, 22]；いずれも２１世紀に大流行を引き起こしている。コロナウイルスの中で、SARS-CoV-2はSARS-CoVと相同性が最も高く、７９％の遺伝的類似性を示す[23]。SARS-CoV-2は、コウモリコロナウイルスＲａＴＧ１３と最も類似しており、類似性が９８％である[24]。
ＣｏＶのゲノムは５’キャップ構造と３’ポリＡテールを有するポジティブセンス一本鎖ＲＮＡ（＋ｓｓＲＮＡ）である。ＲＮＡウイルスのゲノムは、通常、長さが１０ｋｂ未満であるが、ＣｏＶのゲノムは公知のＲＮＡウイルスで最大であり、約３０ｋｂである。ウイルスのゲノムＲＮＡが、ポリタンパク質１ａ／１ａｂを直接翻訳するために鋳型として使用され、これは、二重膜ベシクル（ＤＭＶ）中で複製転写複合体（ＲＴＣ）を形成する非構造タンパク質（ｎｓｐｓ）をコードする[25]。次いで、サブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の入れ子セット（nested set）が、不連続転写の様式でＲＴＣによって合成される[26]。サブゲノムメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、共通の５’リーダー配列及び３’末端配列を有する。転写の終結とそれに続くリーダーＲＮＡの獲得は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の間に位置する転写調節配列で生じる。これらのマイナス鎖ｓｇＲＮＡは、サブゲノムｍＲＮＡを産生する鋳型として働く[27, 28]。典型的なＣｏＶのゲノム及びサブゲノムは、少なくとも６つのＯＲＦを有する。全ゲノム長の約２／３である最初のＯＲＦ（ＯＲＦ１ａ／ｂ）は１６ｎｓｐｓ（ｎｓｐ１～１６）をコードし，３’末端近傍にあるゲノムの他のＯＲＦは少なくとも４つの主要な構造タンパク質：スパイク（Ｓ）、膜（Ｍ）、エンベロープ（Ｅ）及びヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質をコードする。これらの４つの主要な構造タンパク質に加え、さまざまなＣｏＶは、ＨＥタンパク質、３ａ／ｂタンパク質及び４ａ／ｂタンパク質といった別の特別な構造タンパク質及び補助タンパク質をコードする。
呼吸器感染症を引き起こす他のコロナウイルスと同様に、SARS-CoV-2は主に呼吸飛沫を介して感染する；SARS-CoV-2の感染率は、SARS-CoV及びＭＥＲＳと比較して高いようである。一部の人々では、感染は無症候性であり、これらの人々がSARS-CoV-2感染の潜在的な原因と考えられており[29]、SARS-CoV-2の急速な蔓延を引き起こす。感染後にCOVID-19疾患を発症する患者では、肺炎が最も一般的な症状であると思われ、他の症状には発熱、咳嗽、息切れも含まれ、胸部画像では両側性浸潤が認められる[30]。
SARS-CoV-2に感染すると、潜伏期間の中央値は約４～５日であるが、発症までに１４日かかることがあり[31-34]、症候性の患者の９７．５％が１１．５日以内に発症する[32]。ウイルス量は、発症後５～６日以内にピークに達し；これは、発症の１０日後にピークに達するＳＡＲＳウイルスと比較して著しく早い[35-38]。急性呼吸促迫症候群を発症する患者では、これは発症の約８～９日後に起こる[30, 39]。SARS-CoV-2は、気道に損傷を引き起こす攻撃的な炎症応答を引き起こし[40]、疾患の重症度はウイルス感染によるだけでなく、宿主の免疫応答にもよる。最も一般的な死因は呼吸不全（７０％）であり；さらに、サイトカインの放出は、二次感染及び敗血症を引き起こすサイトカインストームを誘発し[41]、多臓器不全及び死亡につながる。
感染の第一段階は、ウイルスが標的受容体を介して宿主細胞に結合することである。SARS-CoV-2は、密にグリコシル化されたスパイク（Ｓ）タンパク質を用いて宿主細胞に侵入する。Ｓタンパク質は、構造が再編成されてウイルス膜と宿主細胞膜が融合する準安定融合前コンフォメーションで存在する三量体のクラスＩ融合タンパク質であり[42, 43]；この工程は、Ｓ１サブユニットが宿主細胞受容体と結合した場合に誘発される。SARS-CoV-2ウイルスはアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体に結合し[24]；セリンプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２も、宿主細胞への侵入に重要な役割を果たすことが報告されている[44]。このウイルスは、ＡＣＥ２を発現する気道上皮細胞、肺胞上皮細胞、血管内皮細胞及び肺のマクロファージを標的とする[24, 45]。Ｓ１サブユニットはＮ末端ドメインと受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）からなる。ＲＢＤはＡＣＥ２に結合してSARS-CoV-2ウイルス粒子のエンドサイトーシスを誘発し、それをエンドソームプロテアーゼに曝露する[46]。Ｓ２サブユニットは融合ペプチド（ＦＰ）領域と２つの七重反復領域：ＨＲ１及びＨＲ２からなる[47, 48]。エンドソーム内では、Ｓ１サブユニットが切断されて融合ペプチドが露出し、それが宿主の膜に挿入される。次にＳ２領域が折り畳まれてＨＲ１領域とＨＲ２領域が一緒になる。これにより膜融合が生じ、ウイルスパッケージが宿主の細胞質に放出される。
SARS-CoV-2ウイルスが宿主細胞に侵入すると、ウイルスの構築には、４つの構造タンパク質、Ｓ、Ｍ、Ｅ及びＮタンパク質、が必要である。Ｓタンパク質のホモ三量体はウイルス表面のスパイクを構成して宿主受容体との結合に関与し[49, 50]、Ｍタンパク質はウイルス粒子を形成してＮタンパク質に結合する[51, 52]。Ｅタンパク質は、ウイルスの構築とその後の放出に関与し、疾患の病状において重要である[53, 54]。Ｎタンパク質は２つのドメインを有し、それぞれ異なる機構でウイルスＲＮＡゲノムに結合する。Ｎタンパク質は、ｎｓｐ３タンパク質に結合してゲノムを複製転写複合体（ＲＴＣ）につなぎ止めるのを助けることができ、カプセル化されたゲノムをビリオンにパッケージ化できることが報告されている[20, 55, 56]。
SARS-CoVのＲＢＤとSARS-CoV-2のＲＢＤは、アミノ酸配列の相同性が７２％で三次構造が高度に類似している。計算モデリング及び生物物理学的測定は、SARS-CoV-2のＲＢＤが、SARS-CoVのＲＢＤと比較して、高い親和性でＡＣＥ２に結合することを示している[57, 58]。SARS-CoV-2のＳタンパク質は、MERS-CoVやヒトコロナウイルスＯＣ４３と同様にフリン様切断部位も含むが、これはSARS-CoVには見られない[59]。これらの特徴は、SARS-CoV-2で観察された感染性の増加に寄与する可能性あり、最終的にウイルスの蔓延を助長した。
SARS-CoV-2に感染した個体の約８０％は無症状か軽症で[30]、効果的な免疫が確立されていることが示唆される。SARS-CoV及びＭＥＲＳと同様、重症の患者のほとんどは末梢リンパ球減少症の証拠を示し、これは血液から肺の感染部位へのリンパ球の移動によるものと考えられた[60, 61]。ウイルス感染に応答してＣＤ４ Ｔ細胞によって産生された、ＩＬ－６、ＩＦＮγ、ＩＰ-１０及びＭＣＰ-１といったＴｈ１サイトカインは、他のＴ細胞や単球を動員し[60]、ほとんどの場合、感染は首尾よく排除される。しかし、場合によっては、感染が進行し、より重度の肺の病変がみられる。これは、免疫応答の機能不全と、それに続くＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α及びＴＮＦαを含む高レベルの炎症性サイトカインによるサイトカインストームによるものと考えられ[30, 40, 62]、炎症性の単球のレベルの上昇及びマクロファージによって媒介される可能性がある。このサイトカインストームは、関連する重篤な病状の大部分の原因であるが、現在のところ、進行中の免疫介在性損傷を促進するためにウイルス感染の持続が必要であるかどうかは不明である。
SARS-CoV-2に対する免疫応答に関する詳細な情報はまだ収集されていないが、SARS-CoVとＭＥＲＳから類推できる。SARS-CoVとＭＥＲＳはいずれも、ウイルス感染に対するＩ型及びＩＩＩ型ＩＦＮ応答を阻害することが知られており、その結果、感染部位で炎症性好中球及びマクロファージが増加する[63, 64]。SARS-CoV-2も同様の免疫破壊機構を有する可能性が高い。疾患の重症度の上昇は、好中球の増加及びリンパ球の減少と相関する[65, 66]。ＭＥＲＳの場合、マクロファージ及びＤＣの感染はまた、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩのダウンレギュレーションにつながる可能性もあり、これは、感染部位におけるＴ細胞プライミングの劇的な減少につながる可能性がある[67]。同様の作用効果がSARS-CoV-2ウイルスによって引き起こされるか、また、これがウイルスの持続性の制御の失敗に寄与するのかは、まだ明らかにされていない。
重症のSARS-CoV及びＭＥＲＳでの末梢Ｔリンパ球の減少は、抗ウイルス免疫におけるこれらの細胞の重要な役割を示唆している。Ｔ細胞を介した免疫応答がウイルス感染の制御に不可欠であることは以前から知られていた[68]。重症な病状でのＴリンパ球の減少は、ＣＤ４ Ｔ細胞、特にＩＦＮγを産生するＴ細胞の多機能性の低下とも相関している[69]。持続的な抗原の活性化と組み合わされた最適には及ばない（suboptimal）Ｔ細胞応答は、機能的に消耗した状態につながる可能性がある[70]。興味深いことに、SARS-CoV-2患者の重症度と、Ｔ細胞枯渇の増加、機能的多様性の低下[71]及び活性化の低下[72]は相関を示し、Ｔ細胞応答の障害が疾患の進行及び重症度の一因である可能性が示唆される。これは、ウイルスによる免疫破壊又はウイルスが促進するＴ細胞枯渇の影響であるかもしれない。重症なコホートは、Ｔｈ１サイトカインよりも、むしろＴｈ２サイトカイン（ＩＬ-４、ＩＬ-５及びＩＬ-１０）が優勢であることが特徴のことも多く、Ｔｈ１型応答への分極化が有益であることを意味する[73]。Ｔｈ２サイトカイン応答の存在は、また、肺での好酸球浸潤を促進し、病状を悪化させる[74]。SARS-CoV感染では、強力なＴ細胞応答は、高力価のウイルス中和抗体とも関連している[73]。しかし、最新の文献には、Ｔ細胞応答はウイルスのクリアランスに重要であるが、感染部位での高いＴ細胞レベルも重症化と関連している可能性があることから、肺の病変を悪化させないように注意する必要があることが示されている[75]。モデルマウスを用いた多くの報告は、SARS-CoV及びＭＥＲＳの制御を成功させるためには、ウイルス特異的ＣＤ８応答及びウイルス特異的中和抗体とならんで、強力なＴｈ１応答が必要であることを示している[76, 77]。同じことがSARS-CoV-2についてもあてはまるかもしれない。SARS-CoV感染のモデルマウスにおいて、Ｔ細胞、特にＣＤ４ Ｔ細胞は、感染の制御に重要であると仮定されている。実際、モデルマウスでは、ＣＤ４ Ｔ細胞の枯渇により、ウイルスの持続期間が延長され、肺の病変が増加した[78]。マウスでの養子Ｔ細胞移入実験は、感染の予防において、以前のSARS-CoV特異的免疫の有益な効果も示した[79]。
SARS-CoV-2生存者の免疫応答に関する縦断的データが利用可能になるには時期尚早であるが、回復したSARS-CoV患者から得られたエビデンスは、Ｓ抗原及びＮ抗原の両者に対する長期記憶Ｔ細胞応答の感染後１１年間もの存在を示しており、ベータコロナウイルスに対する免疫記憶が可能であることを示唆している。モデルマウスは、記憶ＣＤ８ Ｔ細胞応答がSARS-CoV感染に対する保護を効率的に提供することを実証した[76]。いくつかのバイオインフォマティクス的アプローチにより、ＨＬＡ制限の可能性とSARS-CoV-2タンパク質の潜在的な免疫原性領域が特定されている[83-86]。SARS-CoV-2内のＴ細胞エピトープは現時点では明らかにされていないが、Ｓ、Ｎ及びＭウイルス抗原もＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞による免疫の標的であることが実証されている（[87]のプレプリント）。Grifoni et al.は、SARS-CoV-2患者における応答が、１００％の患者で、スパイク、Ｍ及びＮタンパク質に対する共優性のＣＤ４応答であることを特定した。主にＴｈ１応答が観察され、ＣＤ８応答のみならずこれらの強力なＴｈ１応答も、Ｓタンパク質に対する抗体応答とよく相関していた。約７０％の患者は、Ｓ及びＭタンパク質に対する優勢なＣＤ８応答を示したが、他の全ての抗原に対する応答も観察された。興味深いことに、Grifoni et al.によれば、試験したSARS-CoV-2抗原に対して、曝露されていない個体の４０～６０％が応答した（[87]のプレプリント）ことから、他のヒトコロナウイルス間の応答の交差反応性の証拠が観察された。
ＳＡＲＳ及びＭＥＲＳに関する研究では、発症から２週間後に患者の８０～１００％で、ウイルス特異的抗体が検出可能であったが、血中の抗体価は一般に短命で、徐々に低下し、数年後には回復したほとんどの個体では検出不能になったことが示された[88, 89]。SARS-CoV-2の場合、急性の抗ウイルス応答は、抗体分泌細胞（ＡＣＳ）、濾胞性ヘルパーＴ細胞（ＴＦＨ細胞）、活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の増加、並びに症状の回復前に血液中で検出可能なSARS-CoV-2のＩｇＭ及びＩｇＧ抗体と相関する[90]。Ｔ細胞応答だけではなく記憶Ｂ細胞も長期的な防御に寄与し、後者は血中に容易に維持及び検出されず、主に二次リンパ組織に残留する[76, 88, 91]。同様に、抗体応答の動態を分析した最近の研究は、ほとんど（＞９５％）のSARS-CoV-2患者は罹患してから１９日以内にセロコンバージョンを生じ、抗体は発症の最初の１週間の終わり頃に検出されることを示唆する[89, 92]。発症から１４日以上後の血清が入手できた患者の小規模なコホートでは、血清陽性率は抗Ｎ ＩｇＧで９４％（n=15）、抗Ｎ ＩｇＭで８８％（n=14）、抗ＲＢＤ ＩｇＧで１００％（n=16）、抗ＲＢＤ ＩｇＭで９４％（n=15）であった。Ｎ及びＲＢＤの両者に対するＩｇＧ力価は、ウイルス中和力価と相関していた[93]。
しかし、世界的には、SARS-CoV-2抗体応答及び疾患の進行におけるその影響は、初期の高い血清ＩｇＧ抗体価が重症度と相関することを示唆する報告によって示されるように、依然としてよく理解されていない[94]。具体的には、抗Ｓタンパク質力価の早期上昇は、抗体エフェクター機能媒介経路を介した創傷治癒の表現型ではなく、高度に炎症性の表現型への肺胞マクロファージの分極化によって特徴付けられるＡＲＤＳ（急性呼吸促迫症候群）の誘発による病状の悪化と関連している[95]。SARS-CoV-1も同様に、迅速ではあるが一過性の抗Ｓ及び抗Ｎ力価が、病状の悪化と相関することが示されている[96]。回復した患者は、発症から平均２０日後に力価のピークを示したのに対し、死亡した患者ではわずか１４．７日であった。
最近の研究では、ヌクレオカプシドタンパク質に対する抗体は、ウイルスが溶解している間に放出されたＮタンパク質又は感染細胞の表面に発現しているＮタンパク質と結合でき、免疫複合体は抗原提示細胞によって取り込まれる可能性があり、この場合、ＴＲＩＭ２１は、細胞質分解のためにＮタンパク質を標的とし、Ｎペプチドに対する細胞傷害性Ｔ細胞を生成する[97]。この応答は迅速で、中和抗体が確立される前にウイルスのクリアランスがもたらされる。これは、改変Ｆｃと結合したＮタンパク質を含むワクチンの主要な作用機序の可能性もあり、それによって、改変Ｆｃは、ＴＲＩＭ２１への増強された結合を示す。さらに、改変Ｆｃと融合したＮタンパク質を発現するＳＮ１１は、Ｎタンパク質に対して有意に良好なＴ細胞応答を示し、また、Ｎ－Ｆｃを除く同じＲＢＤ構築物を発現する同様の構築物よりも、ＲＢＤ、Ｓ１及びペプチドＲＢＤ４１７－４２５に対して優れた応答を示した。このことは、改変Ｎ－Ｆｃがアジュバントのように作用し、ＡＰＣを活性化して他の抗原に対するＴ細胞応答も増強することを示唆している。
非中和抗体もin vivo保護を提供できるが、中和抗体が最も注目されている[98]。例えば、ワクチンが接種され、病原体にさらされた非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の血清から濃縮したポリクローナルＩｇＧは、エボラウイルス（ＥＶ）に対してナイーブなＮＨＰを保護でき、初期の研究は、抗体応答がＥＶによる疾患からの生存と関連することを示し[99, 100]、エボラに対する３つのモノクローナル抗体のカクテルが、Regeneronによって最終的に得られた。ＳＡＲＳ／ＭＥＲＳウイルスのライフサイクルでは、中和抗体は、ウイルスの結合（ＲＢＤが標的）、膜融合（Ｓタンパク質が標的）又は排出（Ｍタンパク質が標的）を阻害する。重要なことに、回復期の患者の抗体又は血漿は現在、COVID-19患者が利用できる治療の選択肢の１つとして評価されており、軽度のCOVID-19から回復した患者の７０％以上が、再受診時に測定可能な中和抗体を有し、SARS-CoV-2抗体応答が疾患の消散に役割を果たすという考えを更に裏付ける[101]。
表面のＳ糖タンパク質は、宿主受容体との結合及びウイルス－宿主膜融合の仲介によるウイルス侵入に重要で、コロナウイルスの主要な抗原である。他の構造タンパク質には、Ｅ、Ｍ及びＮタンパク質があり、後者は他のタンパク質よりも最初に大量に生産される。４つのタンパク質全てをコードするＶＬＰによるウサギの免疫は、Ｓタンパク質及びＮタンパク質が他の２つのタンパク質より免疫原性で、Ｓタンパク質価よりもＮタンパク質価の方が一時的に急速に上昇することを示した[102]。SARS-CoV-2の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、MERS-CoV及びSARS-CoV-1のＲＢＤで示されているのと同様に、強力な中和応答を誘発する傾向が最も大きい[103]。これらの事実は、Ｓ１サブユニット中のＲＢＤは、一連のコンフォメーショナルエピトープを含み、抗体認識及び中和で主に標的となりやすい部位であることを示すが、これはまた、Ｓタンパク質で変異が最も自然に生じる領域でもある[103-105]。したがって、SARS-CoV-2に対する抗体の交差反応性の分析は、ある程度の交差反応性を示すＮに対する抗体とは対照的に、Ｓタンパク質に対する抗体の大部分がSARS-CoV-1と交差反応しないことを明らかにした。
まれに、病原体に特異的抗体が病状を促進し、外因性の抗体依存性増強（ＡＤＥ）として知られる現象を引き起こすことがある。ＡＤＥは、ジカウイルス及びデングウイルスを含むいくつかのフラビウイルス並びにＲＳウイルス（ＲＳＶ）のin vitroの研究で、十分に特徴付けられている。この作用は、Ｆａｂドメインを介してウイルス粒子に結合する低品質及び／又は少量の非中和抗体によって支配され、そのＦｃドメインは単球又はマクロファージ上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）と結合し、それによってウイルス侵入及び感染を促進する。ＡＤＥは、単球、マクロファージ及びＢ細胞を含むさまざまな免疫細胞で発現するＦｃ受容体（ＦｃＲ）の関与によって媒介され、そのカノニカルな受容体、エンドソームｐＨ又はプロテアーゼの非存在下でのウイルス細胞侵入を可能にする。コロナウイルスでは、以前の研究は、不活化された全SARS-CoV2によるマウスの免疫、ＭＶＡをコードしＳタンパク質によるアカゲザルの免疫、及び全長Ｓタンパク質をコードするＤＮＡワクチンによるマウスの免疫が、ある程度のＡＤＥ又は好酸球が媒介する免疫の病態を誘導する可能性があることを示す[95, 107]。後者の現象は、肺胞マクロファージの創傷治癒から炎症促進性表現型（ＩＬ-８産生）への変化及び炎症性単球／マクロファージの動員と蓄積を含むメカニズムを介し、産生される中和抗体の質と一時的な抗体応答の組合せによって引き起こされるようである（迅速な力価は重度の疾患につながる）；この過程の少なくとも一部は、Ｆｃγエフェクター機能によって駆動される。
ウイルスに対する既存の免疫を確立することは、免疫応答が機能不全になる前にウイルスを排除するのにある程度の価値がある。SARS-CoV-2に対する集団免疫を構築するためには、「集団免疫」を進展させるか、ワクチンを接種する必要がある。これらは両者とも、長期記憶応答の確立に依存する。トリ伝染性気管支炎ウイルス、イヌコロナウイルス及びネココロナウイルス（ＦＣｏＶ）を含む、コロナウイルスによって引き起こされるいくつかの疾患に対する動物用ワクチンが製造されている[108]。しかし、ワクチンによって増強される疾患（ＶＥＤ）の可能性は、ＦＣｏＶを含む呼吸器ウイルスに対するワクチンの開発を妨げている。ＦＣｏＶにおけるＶＥＤに関連する病態は、一部の患者でCOVID-19によって引き起こされる急性の肺損傷と類似している。現在開発中のCOVID-19ワクチンは、主にＳタンパク質をコードし、ＶＮＡｂ及びＴ細胞応答を刺激するサブユニットワクチンに集中している；それらが持続性の記憶応答を刺激するのか、免疫の病態を回避するのかは、まだ明らかにされていない。
ヒトに影響を及ぼすコロナウイルス科のウイルスに対するワクチンを開発するこれまでのプロジェクトは、ＳＡＲＳ及びＭＥＲＳを対象としていた。ＳＡＲＳ[109]及びＭＥＲＳ[110]に対するワクチンは、ヒト以外のモデル動物で試験されている。現在のところ、ヒトで安全かつ有効であることが示されているＳＡＲＳの治療又は予防用ワクチンはない[111]。
これまでの情報に照らして、ワクチン接種によって刺激される免疫は、強力なウイルス特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答及びＣＤ４ Ｔ細胞応答の両者並びに中和抗体応答を含む必要があるようである。強力な抗ウイルスＴ細胞応答の特徴は、多機能性と組み合わされた高い機能的アビディティーを含む。サイトカインＩＬ－１２及びＩＬ－１５[112, 113]、ＣＤ８αβ発現[114-116]、ＴＣＲ親和性[117]、抗原提示細胞によって発現される共刺激分子のレベル[112, 118]、ＤＣの成熟状態など、いくつかの因子が機能的アビディティーの調節に関与している。したがって、課題は、これらの条件を模倣するワクチンアプローチを見いだすことである。大きな免疫複合体は、低親和性ＦｃγＲＩＩａ（マウスではＦｃγＲＩＶ）によって交差提示できるが、これは、阻害性ＦｃγＲＩＩｂ受容体がブロックされているか下方制御されている場合に限られる[119]。したがって、課題は、高親和性のＦｃγＲＩを標的とし、潜在的に占有している血清ＩｇＧを置換する小さな遺伝子複合体を作り出すことである。
効果的なワクチン戦略は、(i) 独立した新たな事象で生じる異種ウイルス変異株に対して保護する能力－注目すべきことに、多くのＳを標的とする抗体が、異種のスパイク糖タンパク質に対する中和力価を大幅に低下させた、(ii) 免疫を付与することが困難で、SARS-CoV 2による罹患率及び死亡率のリスクが高い高齢者の集団に対し、強力な免疫応答を誘導する能力、(iii) ＳＡＲＳのＮタンパク質によるワクチン接種後に示されたワクチン誘発性免疫の病態などのワクチンの有害な結果の回避を、実証しなければならない[120]。戦略は、一般に、in vivo保護との相関が証明されている中和抗体の誘導に向けられるが、これは、ウイルス反応の狭い範囲のみをカバーする（すなわち、広範囲に中和しない）という犠牲を払う可能性がある。ウイルスの保存された部分に結合する抗体は、（in vitroアッセイにおいて）中和性が低い傾向があり、in vivo保護を提供するためにＦｃＲの結合に依存するものの、より広範な保護をカバーできる。完全なＳタンパク質は、ＲＢＤと比較して多くの抗原決定基を有するにもかかわらず、ＡＤＥのリスクがその使用に反対している[107]。構造的には、SARS-CoV-1のＲＢＤと同様、SARS-CoV-2のＲＢＤは、Ｓタンパク質三量体の既知の状態、すなわち、各ＲＢＤが他方のプロトマー上の類似体と対称的に接触する閉じた状態、及び、少なくとも１つのＲＢＤドメインがＡＣＥ２と接触するように伸長している開いた状態の両者にさらされている。ＲＢＤは、また、産生が容易で、高いレベルの中和抗体を生成するが、その大部分はコンフォメーショナルエピトープに対するもので、必ずしもＡＣＥ２結合部位と関連していない[104, 105]。
強力な中和能力を有する高親和性の抗体は、ＡＤＥのリスクを低下させることが示されている[107]ため、本発明による特定のポリペプチド、核酸及びベクターは、ＲＢＤに対する高親和性の抗体を誘導することを目的とする。同時に、Ｓタンパク質やＭタンパク質と比較して、Ｎタンパク質は最も早く発現するタンパク質で、豊富に存在する[89]。その保存された性質、従って異種保護の大きな可能性と組み合わせて、これも、本発明の有効な目標となる。
本発明は、ウイルスのＳタンパク質の重要なＲＢＤ及びＮタンパク質の両者を標的として、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞及びＶＮＡｂを生成できる。Ｓタンパク質は、ACE2との相互作用において三量体として提示され、中和表現型の抗体の誘発を最適化する。本発明者らはＲＢＤを多量体化し、これは、SARS-CoV-2の予防又は治療用のワクチンとして使用される可能性がある。
本発明の１つのポリペプチドは、改変ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域と融合したＮタンパク質又はその免疫原性断片を含む。Ｎタンパク質又はその免疫原性断片は、アミノ酸２－４１９又は１３８－１４６を含んでいてもよい。改変ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域は、本明細書に記載のマウスＩｇＧ３に改変されたヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３領域を含んでいてもよい。一例を図１２（ｂ）に示す。このポリペプチドは、ＲＢＤ又はその免疫原性断片を含む第２のポリペプチドと組み合わせてもよい。ＲＢＤはアミノ酸３１９－５４１又は３３０－５２５（アクセッション番号YP_009724390）を含むことができる。ＲＢＤは、(a) 単独で、(b) 例えばグリシンセリンリンカーを介して、フィブリチン三量体フォールドオン若しくはジスルフィド架橋モチーフなどの三量体化ドメインに結合していてもよく、又は (c) 本発明に従って、(i) ｈｕＩｇＧ１定常ドメインのヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン（アクセッション番号P01857）若しくは (ii) 本発明の変異株ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ｉＶ１とインフレームで融合していてもよい。これらの例を表４に示す。
ウイルス感染（これまでに説明）や細菌感染のような感染症に加えて、本発明は、腫瘍抗原の標的化に使用できる。このような抗原の例を表３に示す。
腫瘍は増殖と転移を促進する変異を蓄積する。これらの変異は、胸腺での選択を回避する固有のエピトープを表す。これらは「ネオエピトープ」と呼ばれ、個々の腫瘍に特異的であり、正常組織では認められない[121]。Lennerz et al.は、黒色腫から長期間生存した１人の患者の混合リンパ球－腫瘍細胞培養物において、８つの抗原（そのうち５つはネオ抗原）に対する応答物を特定した[122]。これは、ネオ抗原が長期生存者における応答と関連していることを示す初期の研究である。このため、研究者らは、特定されたネオエピトープに対する個別化ワクチンを開発するようになった。全ての変異がＴ細胞応答を刺激するものではないが、変異の頻度とＴ細胞エピトープを提示する可能性との間には相関がある。実際、変異率が高い腫瘍を有する患者は、チェックポイント遮断療法に対して良好に応答することが多く、チェックポイント遮断によって内因性ネオエピトープ応答が明らかにされることが示唆される[123]。ほとんどの変異は免疫応答を刺激しないので、標的に対する最も適切なエピトープの選択は困難であるかもしれない。しかし、候補エピトープの適切な選択に大きな進歩がみられている[124]。
ヒトの黒色腫では、質量分析を用いて原発腫瘍からネオエピトープを直接特定し、多くの潜在的な標的の特定につながっている[125]。これらのネオエピトープを標的とする治療法は臨床に応用されており、特異的免疫応答の効率的な誘導が示されている[126-128]。いくつかのグループは、複数のネオエピトープを標的とするワクチンで患者を治療している。Sahin et al.は、ＲＮＡポリエピトープワクチンの結節内送達による治療後に、複数のネオエピトープ特異的応答を生成できることを示した[127]。彼らは、転移の減少と無増悪生存期間の延長を示した。Ott et al.も、アジュバントのHiltonol（ポリ-L-リジン二本鎖ＲＮＡによるポリＩＣの安定化物）と組み合わせたペプチドポリエピトープワクチンで、６人の黒色腫の患者を治療した。彼らは、再発率の低下を伴う効率的なネオエピトープ特異的Ｔ細胞応答を認めた[128]。さらに、ワクチン接種後に疾患が再発した患者では、ネオエピトープ特異的Ｔ細胞応答の拡大と関連するその後の抗プログラム細胞死（ＰＤ-１）療法後に完全な退縮を示した。興味深いことに、これらの研究で特定されたネオエピトープは、ＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞の両者によって認識され、ヒトにおいて、ＣＤ８応答に加えてＣＤ４ Ｔ細胞応答の重要な役割が示唆された。これは、Kreiter et al.によってモデルマウスで得られた以前のデータを確認した[129]。ネオ抗原を標的とすることの欠点の１つは、患者に固有であるため高価で、かつ、腫瘍試料内及び同じ患者の腫瘍間で大きなばらつきがある可能性があることであり；これは、これ以上の変異を発現しない腫瘍の成長につながる可能性がある[130]。腫瘍形成過程で重要な「原動力（driver）」変異（例．BRAFV600E）、又は他の一般的な変異を克服するために、それらは特異的に標的化される可能性がある；しかし、これらは、非常にまれで、必ずＴ細胞応答を刺激するとは限らない。
自己抗原に特異的な高アビディティーＴ細胞は、発生中に胸腺で日常的に失われ、低アビディティーのレパートリーが残る。したがって、正常な発現が制限された抗原は、それらが同じ程度の寛容を受けなかった可能性があるので、良い標的として機能する可能性がある。退行を示すがん患者で自己抗原に特異的なＴ細胞が検出されたことは、胸腺寛容が必ずしも完全ではないことを示唆している。退行を示すがん患者は、主に、分化抗原ＴＲＰ－２やがん精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１といった正常組織での発現が制限された抗原に対して応答した[131, 132]。ＮＹ－ＥＳＯ－１[131, 133]及びメラノーマ抗原ＭＡＧＥ－１[134]を含む腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、免疫応答の良い標的となり、免疫寛容が破壊されたことを示唆する。
適切な抗原の選択後は、それを免疫系に提示する最善の方法を検討することが重要である。Ｔ細胞の刺激は、適切な活性化共刺激シグナルと共に、樹状細胞（ＤＣ）のようなプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原のプロセシング及び提示を必要とする。活性化共刺激シグナルには、ＴＬＲリガンドによって提供されるものが含まれる（[135]で総説されている）。ペプチドワクチンとＴＬＲリガンドの直接的な結合を調べる前臨床研究は、有望であることを示し始めている。これらは、エピトープ及びＴＬＲの両者をより効率的にＤＣに標的化すると考えられており、ＤＣの成熟と共刺激分子の発現の増加、サイトカイン及びケモカインの分泌、並びにＤＣ内の抗原デポの形成をもたらす[136, 137]。直接的な結合に加えて、ナノ構造に集まるＴＬＲリガンドと組み合わせた両親媒性ペプチドの使用が研究されており、前臨床研究において有望であることが示されている[138, 139]。ワクチンが提供する抗原の用量を考慮することも重要である。低用量は、親和性の最も高いＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を選択するのに十分で、したがって、高アビディティーのＣＤ８ Ｔ細胞を選択できる[140]が、そのエピトープ標的がＭＨＣ－ＩＩと親和性が低い結合を示すＣＤ４ Ｔ細胞を刺激するのには十分ではないかもしれない。
高頻度のＴ細胞応答の発生は、必ずしも効果的な免疫応答の誘導を示すものではないことは広く受け入れられている。以前に発表された研究から、Ｔ細胞の機能的アビディティーが臨床応答の良い指標であることは明らかである[141-145]。機能的アビディティーという用語は、しばしば親和性と混同される。親和性は、ＭＨＣ分子とＴ細胞受容体（ＴＣＲ）への結合の強さとして分類されることが最も多いのに対し、機能的アビディティーは、ＴＣＲ、共刺激分子、接着分子及びサイトカインによる刺激の組合せで、Ｔ細胞と標的との間の相互作用の全体的な強さ及びその機能的な結果を示す[146]。ウイルス感染及び腫瘍モデルの両者で、高アビディティーの細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のみがウイルスのクリアランスと腫瘍の根絶を媒介する[117, 141, 143, 147, 148]。in vivoでの免疫応答の発生の間に、ＣＴＬは、特定のクローン及びポリクローンの両者で、さまざまな機能的アビディティーを示すことができる。アビディティーはウイルス及び腫瘍の両者で重要であることが示されているが、ＴＣＲは体細胞超変異を受けることができないことから、高いアビディティーのＣＴＬ及び低いアビディティーのＣＴＬがin vivoで生成される機構は不明のままである。高用量又は低用量の抗原の存在下におけるＴＣＲトランスジェニックＣＴＬの培養は、それぞれ、低いアビディティー応答及び高いアビディティー応答の分極化につながることが、in vitroで実証されている[141, 143]。
腫瘍エピトープをコードするペプチドワクチンは、初期の動物モデルの研究において有望であり、マウスで特異的Ｔ細胞応答を刺激し腫瘍を治療することが示されている。これらのペプチドワクチンの臨床への導入は、反応が短期間で臨床効果が小さく、あまり成功していない。初期のワクチンは、短い（１５アミノ酸未満）ペプチドによるＣＤ８ Ｔ細胞応答の刺激に集中していた。しかし、最近の研究は、ＣＤ４ Ｔ細胞応答及びＣＤ８ Ｔ細胞応答の両者を刺激して、短いペプチドで以前に見られた寛容の問題を回避できる、長いペプチドの使用に集中している[149]。長いペプチドは、臨床研究で有望な結果を示し始めている[150, 151]。ネオエピトープをコードするペプチドも、強力な免疫応答の検出と全生存率の改善の証拠により、ある程度の可能性を示し始めている[152, 153]。Ott et al. (2017)による研究は、ＴＬＲ３リガンドであるHiltonolと混合した長さが２０のペプチドによるワクチン接種後に、ネオエピトープ特異的応答の増強を示した[128]。
合成ペプチドも、ＤＣベースのワクチンの一部として使用されている。in vitroで培養したＤＣを、ペプチド、タンパク質又は腫瘍溶解物でパルスした多くの研究が行われている。これらは、前臨床研究において効果的な免疫応答の刺激を示している（[154]で総説されている）。免疫応答を刺激するにもかかわらず、ＤＣワクチンの臨床における有効性は限られている。これまでに承認された唯一の自己細胞ベースの治療用ワクチンであるSipuleucel-T（Provenge（登録商標））は、３か月というわずかな生存ベネフィットを示すが、生産の費用と時間がその使用を厳しく制限している[155]。これは、ほとんどのＤＣ及び自己細胞ベースのワクチンの主要な制限因子である。ネオエピトープペプチドを組み込んだＤＣワクチンは、既存及びde novoのネオエピトープ特異的応答の両者の有望な拡大を示した[126]。未成熟なＤＣの使用は、それらの免疫原性に影響を与え、寛容誘導につながる可能性があるため、使用するＤＣの活性化の状態を注意深く監視する必要がある。ＤＣベースのワクチンを製造する広範な培養方法は、in vivoでのそれらの免疫原性にも影響を及ぼす可能性がある。in vitroでの操作を最小限としたex vivoでのＤＣサブセットの単離に焦点を当てた最近の研究が、有望な結果を示している[156]。
本発明の核酸は、クローニングによって得られたか、全体又は一部分が化学合成によって製造されたＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡのようなＲＮＡであってもよい。治療での使用のために、核酸は、好ましくは、治療する対象で発現可能な形態である。本発明の核酸は、単離され及び／又は精製された形態の、組換え体であってもよいし、単離物として提供されてもよい。それは、おそらく発現のための１つ以上の調節配列を除いて、ヒトゲノム中の遺伝子に隣接する核酸を（実質的に）含まなくてもよい。本発明による核酸がＲＮＡを含む場合、明細書で示す配列は、ＴをＵで置換したＲＮＡ等価物として解釈すべきである。
本発明の核酸は、核酸配列及びクローンが利用できれば、例えば、明細書に記載した情報及び参考文献並びに当該技術分野で公知の技術（例えば、Sambrook et al., (1989) [157]及びAusubel et al., (1992) [158]を参照）を用いて、当業者が容易く製造できる。これらの技術には、(i) 例えばゲノム源からのそのような核酸の試料を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、(ii) 化学合成、又は (iii) ｃＤＮＡ配列の製造が含まれる。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、コードされたＤＮＡの取得、発現される部分のいずれかの側の適切な制限酵素認識部位の同定、及びＤＮＡからの前記部位の切出しを含む、当業者に公知の適切な方法で製造し、使用されてもよい。次いで、この部位は、標準的な市販の発現系において適切なプロモーターと作動可能に連結してもよい。別の組換えのアプローチは、適切なＰＣＲプライマーを用いてＤＮＡの関連部分を増幅することである。例えば部位特異的変異誘発によって、配列を改変して、改変ペプチドの発現につなげることができ、又は、核酸の発現に使用する宿主細胞におけるコドン優先度を考慮できる。
核酸の発現させるために、核酸の配列を、核酸に作動可能に連結してその発現を制御する１つ以上の制御配列を有するベクターに組み込むことができる。ベクターは、挿入された核酸の発現を駆動させるプロモーター又はエンハンサーのような他の配列、ポリペプチドが融合物として産生される核酸配列、及び／又は宿主細胞中で産生されたポリペプチドを細胞から分泌する分泌シグナルをコードする核酸を含んでいてもよい。必要に応じて、次に、ベクターが機能する宿主細胞にベクターを形質転換し、ポリペプチドが産生されるように宿主細胞を培養し、宿主細胞又は培地からポリペプチドを回収して、ポリペプチドを得ることができる。原核細胞及び真核細胞が、この目的のために当技術分野において使用され、これらには、大腸菌、酵母、真核細胞（例．昆虫細胞）、動物細胞（例．ＣＯＳ、ＣＨＯ細胞）、Bowesメラノーマ及び他の適切なヒト細胞が含まれる。本発明が抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸に関する場合、それぞれの核酸は、同一若しくは異なるプロモーターによって駆動される同一の発現ベクター中に、又は別々の発現ベクター中に存在してもよい。
本発明の核酸は、ヒトを含む哺乳動物などの患者において、少なくとも１つの異種抗原に対する免疫応答を刺激するために使用してもよい。ヘルパーＴ細胞応答及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞応答が刺激されてもよい。本発明によって得られる特定のエピトープに対するＴ細胞応答は、単純なペプチドとしての同じエピトープでの免疫によって得られる応答、又はペプチド若しくは核酸のいずれかとしての抗原内にコードされる同じのエピトープでの免疫によって得られる応答よりもアビディティーが高くてもよい。本発明の核酸は、併用療法、すなわち、軽鎖をコードする核酸及び重鎖をコードする核酸として投与してもよい。核酸は、静脈内、皮内、筋肉内、経口又は他の経路で投与してもよい。皮膚及び筋肉内の組織は樹状細胞を含有するので、皮内又は筋肉内投与が好ましい。
本発明の別の側面は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。本発明のポリペプチドを得るための核酸の発現のためにベクターを使用してもよく、又は、それらは、それ自体で若しくはそれ自体のために治療用として使用（例．ワクチン）してもよい。
代表的なベクターには、ｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓ（図３１参照）、ｉＳＣＩＢ２（図３３参照）、ＳＮ１５（図２７参照）及びＳＮ１７（図４８参照）が含まれる。
本発明のベクターは、
(a) 配列番号１２及び配列番号１３；又は
(b) 配列番号１４及び配列番号１５
で示す塩基配列を含んでいてもよい。
配列番号１２及び配列番号１３で示す配列は、それぞれ、ｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓの重鎖全体及び軽鎖全体の発現カセットの塩基配列であり、いずれも、ＣＭＶプロモーター及びＢＧＨポリＡシグナルを含む。配列番号１４及び配列番号１５示す配列は、それぞれ、ｉＳＣＩＢ２の重鎖全体及び軽鎖全体の発現カセットの塩基配列であり、いずれも、ＣＭＶプロモーター及びＢＧＨポリＡシグナルを含む。
本発明のベクターは、配列番号１６及び配列番号１７で示す塩基配列を含んでいてもよい。
配列番号１６及び配列番号１７は、それぞれ、ＳＮ１５のＮタンパク質－Ｆｃ全体及びＳタンパク質全体の発現カセットの塩基配列であり、いずれも、ＣＭＶプロモーター及びＢＧＨポリＡシグナルを含む。
本発明のベクターは、配列番号１８及び配列番号１９で示す塩基配列を含んでいてもよい。
配列番号１８及び配列番号１９は、それぞれ、ＳＮ１７のＮタンパク質－Ｆｃ全体及びＳタンパク質全体の発現カセットの塩基配列であり、いずれも、ＣＭＶプロモーター及びＢＧＨポリＡシグナルを含む。
本発明のベクターは、配列番号２０、配列番号２１又は配列番号２２で示す塩基配列を含んでいてもよい。好ましくは、本発明のベクターは、配列番号２０、配列番号２１又は配列番号２２で示す塩基配列からなる。
配列番号２０で示す配列は、プラスミド形式のｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓ全体の塩基配列である。配列番号２１で示す配列は、ドギーボーン（ｄｂＤＮＡ）形式のｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓ全体の塩基配列である。配列番号２２で示す配列は、プラスミド形式のｉＳＣＩＢ２全体の塩基配列である。
本発明のベクターは、配列番号２３で示す塩基配列を含んでいてもよい。好ましくは、本発明のベクターは、配列番号２３で示す塩基配列からなる。配列番号２３で示す配列は、プラスミド形式のＳＮ１５ベクター全体の塩基配列である。
本発明のベクターは、配列番号２４又は配列番号２５で示す塩基配列を含んでいてもよい。好ましくは、本発明のベクターは、配列番号２４又は配列番号２５で示す塩基配列からなる。配列番号２４で示す配列は、プラスミド形式のＳＮ１７ベクター全体の塩基配列である。配列番号２５で示す配列は、ドギーボーン（ｄｂＤＮＡ）形式のＳＮ１７ベクター全体の塩基配列である。
本発明のベクターはＤＮＡであってもよい。プラスミドＤＮＡワクチンは、免疫付与部位に多数の炎症細胞を動員する固有のアジュバント活性を有するので、他の様式のワクチンよりも多くの利点を提供する。ＤＮＡワクチンが誘発する免疫の根底にあるメカニズムは複雑で、まだ完全には解明されていないものの、ＡＰＣによって発現される汎認識ＤＮＡセンサー及び特異的認識ＤＮＡセンサーが関与すると考えられている（表１）。ＣｐＧモチーフはＴＬＲ９を介してシグナル伝達し、ＤＣの活性化と成熟を促進する[159]。興味深いことに、ＤＮＡワクチン活性は、ＴＬＲ９ノックアウトマウスでも認められ、アジュバント活性をもたらす追加のエンドソーム及び細胞質ＤＮＡセンサーが示唆される[160]。ＴＢＫ－１及びＳＴＩＮＧといったＤＮＡセンサーは、ＴＬＲに依存しない経路を活性化し、Ｉ型インターフェロンを誘導する[161]。最近では、骨髄の樹状細胞においてヘリカーゼＤＤＸ４１が新しいＤＮＡセンサーとして特定された[162]。さらに、ＲＩＧ－１は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩと結合した細胞質ＤＮＡを感知することで、Ｉ型ＩＦＮを刺激することもできる[163]。ＩＦＮ調節因子のＤＮＡ依存性アクチベーター（ＤＡＩ／ＤＬＭ－１／ＺＢＰ１）は、細胞質ＤＮＡセンサーであり、自然免疫のアクチベーターである[164]。
ＨＭＧＢ－１は、自然免疫応答の核酸媒介性誘導のための汎認識センサーとして出現した[166]。ＨＭＧＢ－１（クロマチン結合タンパク質）は、その細胞内及び細胞外局在、酸化還元状態、並びに他の細胞表面受容体との相互作用に依存するさまざまな機能を有する。ＨＭＧＢ－１関連核酸は、細胞内複合体として、ＴＬＲ及び細胞質媒介センサーを介してＩ型ＩＦＮを刺激し、炎症性サイトカインを活性化し、（ＡＩＭ２を介して）インフラマソームを誘導する（[160]で総説されている）。ＨＭＧＢ－１の細胞外放出は、腫瘍細胞の（ベクリン－１結合及び免疫細胞の動員と活性化のためにｂｃｌ－２と競合することによる[167]）オートファジーの持続を含む、さまざまな結果をもたらす。最近、ＨＭＧＢ－１のさまざまな酸化還元状態が、ＨＭＧＢ－１活性に重要な役割を果たすことが示されている[167]。ＨＭＧＢ－１は、改変可能なＣ２３、Ｃ４５及びＣ１０６位に３つのシステインを有する。ＨＭＧＢ－１の全てのチオールが還元された形態は、白血球動員を実現する化学誘引物質である。ジスルフィド型は（ケモカインではなく）サイトカイン活性を有する。活性酸素種によって誘導されるＨＭＧＢ－１の完全に酸化された形態は不活性である。ＨＭＧＢ－１は、ＲＡＧＥ、ＴＬＲ４、ＴＬＲ２、ＣＤ２４、ＴＩＭ－３、トロンボスポンジン及びＴＲＥＭ１を含む他の免疫受容体、並びにサイトカインと複合体を形成する[168, 169]。ＨＭＧＢ－１／ＤＮＡ複合体はＲＡＧＥに結合し、アポトーシスからオートファジーへの交換を誘導する[169]。ＨＭＧＢ－１／ＣＸＣＬ１２は、炎症細胞を動員するＣＸＣＲ４と結合する[170]。
好ましくは、本発明のベクターはＤＮＡプラスミド又はドギーボーン（ｄｂＤＮＡ）ベクターである。そのようなベクター及びその製法は、当技術分野で周知である。とりわけ、ｄｂＤＮＡベクターとその製法は国際公開第2010/086626号に記載されている。
本発明のベクターはＲＮＡであってもよい。ｍＲＮＡワクチンには、非複製ｍＲＮＡを使用するものと自己複製ＲＮＡを使用するものの２つのカテゴリーがある。本発明は両者を考えている。非複製ｍＲＮＡワクチンは、対象とする抗原の転写物のみを含み、自己複製ＲＮＡワクチンは、対象とする抗原に加え、ｍＲＮＡの増幅に必要とされるＲＮＡ複製機構の転写物も含む。自己複製ＲＮＡワクチンは、わずかな量から大量の抗原の産生を誘導し；このことは、ワクチンの開発及び製造が、他のプラットフォームと比較して、複雑でなく、安価であるという利点がある。しかし、ＲＮＡワクチンは半減期が短いため、抗原の産生を持続できず、防御が短期間である。非複製及び自己複製ｍＲＮＡワクチンの両者とも、ｍＲＮＡの分解が防止されるように処方するか、宿主細胞に取り込まれる前にヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡを保護する担体内に封入する必要がある。多くの異なる担体が成功のうちに使用されており[171-174]、これらは主に、ｍＲＮＡをカプセル化し、細胞取り込みを促進する脂質ナノ粒子をもとにする。本発明は、これらのｍＲＮＡワクチンの使用を考えている。
本発明は、
・本発明のポリペプチド、核酸及び／又はベクターを、必要に応じてアジュバントと組み合わせて含むワクチン、
・医薬として使用するための本発明のポリペプチド、核酸、ベクター及び／又はワクチン、
・がん又は感染症の治療に使用するための本発明のポリペプチド、核酸、ベクター及び／又はワクチン、
・本発明のポリペプチド、核酸、ベクター及び／又はワクチンを、がん又は感染症の治療を必要とする対象に投与することを含む、がん又は感染症を治療する方法、
を提供する。
本明細書では、用語「治療」は、ヒト又はヒト以外の動物に利益をもたらすことができる任意の方法を含む。治療は、遺伝性又は後天性疾患の治療であってよい。好ましくは、治療は、がんのような細胞増殖又は感染症に関連する状態／障害の治療である。核酸で治療できるがんの種類の例には、任意の固形腫瘍、結腸直腸がん、肺がん、乳がん、胃がん、卵巣がん、子宮がん、肝がん、腎がん、膵がん、黒色腫、膀胱がん、頭頚部のがん、脳のがん、食道がん、膵がん及び骨の腫瘍、並びに軟部組織のがん及び白血病が含まれる。本発明で治療できる感染症の例には、細菌感染、若しくはコロナウイルス、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎などのウイルス感染、又はクリアランスのためのＴ細胞免疫及び再感染を予防するための中和ｍＡｂを必要とする感染が含まれる。
いくつかの側面では、本発明は、対象におけるがんの予防又は治療に使用するための、明細書に記載した核酸、ペプチド、ベクター及び／又はワクチンを提供し、場合によっては、がんは黒色腫である。
他の側面では、本発明は、対象における感染症の予防又は治療に使用するための、明細書に記載した核酸、ペプチド、ベクター及び／又はワクチンを提供し、場合によっては、感染症はCOVID-19である。
２つ以上の異なる核酸、ベクター、ペプチド及び／又はワクチンを対象に投与してもよい。好ましくは、以下の核酸：
(a) 配列番号８で示すアミノ酸配列を含む受容体結合ドメインをコードする第２の核酸と組み合わせた配列番号６で示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸；及び
(b) 配列番号９で示すアミノ酸配列を含む受容体結合ドメインをコードする第２の核酸と組み合わせた配列番号７で示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸；
の両者を対象に投与する。
核酸、ポリペプチド及び／又はベクターは、薬学的に許容される担体と組み合わせて使用してもよい。このような担体には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、リポソーム、水、グリセリン、エタノール及びそれらの組合せが含まれるが、これらには限定されない。
本発明で有用な核酸、ポリペプチド及び／又はベクターは、医薬組成物に製剤化できる。これらの組成物は、１つ以上の上記物質に加え、薬学的に許容される添加剤、担体、緩衝剤、安定化剤又は当業者に周知の他の材料を含んでいてもよい。そのような材料は、無毒でなければならず、有効成分の効能を妨害してはならない。担体又は他の材料の正確な性質は、皮内、経口、静脈内、経皮又は皮下、鼻内、筋肉内、腹腔内といった投与経路に依存してもよい。製剤は、好ましくは、顕微鏡サイズの金粒子の表面上に析出した安定な乾燥粉末としての核酸であり、遺伝子銃又はＧＥＴペプチドと混合したＤＮＡの溶液による注入に適している。この製剤は、エレクトロポレーションによる皮内又は筋肉内投与に好適な可能性がある。この製剤は、無針注射を用いた投与に好適な可能性がある。
核酸を含む、又は核酸を送達するための組成物は、好ましくは、個体に利益を示すのに十分な量である「治療有効量」で個体に投与される。実際の投与量、投与速度及び投与の手順は、治療されるものの特性及び重症度に依存する。投薬量の決定などの治療の処方は、開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、通常、処置される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法及び医師に公知の他の因子を考慮する。本発明の核酸は、特に、既存のがんの治療及び初回の治療又は手術の後のがんの再発の予防に関連する。上記技術及びプロトコルの例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A. (ed), 1980に見いだすことができる。
好ましくは、本発明の核酸は、有効な量がヒトに投与された場合に、ウイルス感染細胞を著しく死滅させることができ、又はＶＮＡｂを生成してウイルスの侵入を防ぐことができるヘルパー及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞を刺激する。最適用量は、例えば、年齢、性別、体重、治療対象の重症度、投与される有効成分及び投与経路を含む多くのパラメーターに基づいて医師が決定できる。例えば、ＤＮＡの１～１０００μｇという用量は、ヘルパーＴ細胞応答及び細胞傷害性Ｔ細胞応答の両者を刺激するのに十分である。
組成物は、治療される状態に応じて、単独で、又は他の治療と組み合わせて、同時に、又は連続的に投与してもよい。他のがん治療には、モノクローナル抗体、化学療法剤、放射線療法又は当該技術分野で公知の免疫療法が含まれる。
核酸の用量は、使用する剤の特性、例えば、その結合活性とin vivoでの半減期、製剤中のポリペプチドの量、投与経路、投薬部位及び投与速度、患者の臨床的寛容、患者を苦しめる病状などに依存し、医師の技術の範囲内である。例えば、核酸の用量は、１回の投与につき、患者当たり２００μｇが好ましいが、用量は、約１０μｇ～８ｍｇであってもよい。一連の逐次接種で、異なる用量が利用され；開業医は、最初の接種を行った後、比較的少ない用量の核酸で追加の免疫を行ってもよい。
本発明の別の側面は、明細書に開示した核酸を含む宿主細胞を提供する。本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例．染色体）に組み込んでもよい。組込みは、標準的な技術に従い、ゲノムとの組換えを促進する配列を含めることで促進してもよい。核酸は、細胞内の染色体外のベクターにあってもよく、そうでなければ、細胞に対して識別可能に異種性又は外来性であってもよい。
更に別の側面は、本発明の核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。導入には、利用可能な任意の技術を使用してもよく、当該技術は、（特にin vitro導入では）一般に「形質転換」と称されることがあるが、これには限定されない。真核生物細胞では、適切な技術には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、リポソームによるトランスフェクション、及びレトロウイルス又は他のウイルス（例．ワクシニアウイルス、又は昆虫細胞ではバキュロウイルス）を用いる形質導入が含まれてもよい。細菌細胞では、適切な技術には、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション及びバクテリオファージを用いるトランスフェクションが含まれてもよい。別法として、核酸を直接注入することができる。
抗生物質耐性又は感受性遺伝子のようなマーカー遺伝子は、当技術分野で周知であるように、対象とする核酸を含むクローンの特定に使用してもよい。
導入に続いて、例えば遺伝子が発現する条件で（形質転換された細胞の子孫である可能性が高いが、実際に形質転換された細胞を含んでいてもよい）宿主細胞を培養することで、コードされたポリペプチド（又はペプチド）が産生されるように、核酸からの発現を引き起こしてもよく、又は発現を可能にしてもよい。適切なシグナルリーダーペプチドと結合させてポリペプチドを発現する場合、細胞から培地に分泌される可能性がある。発現による産生に続き、ポリペプチド又はペプチドは、場合に応じて、宿主細胞及び／又は培地から単離及び／又は精製してもよく、その後、所望により、例えば、１つ以上の薬学的に許容される添加剤、基剤、担体（例．以下を参照）を含む医薬組成物のような、１つ以上の追加の成分を含んでいてもよい組成物の製剤で使用できる。
医薬組成物は、有効成分に加え、薬学的に許容される添加剤、希釈剤、担体、緩衝剤、安定化剤又は当業者に周知の他の材料を含んでいてもよい。そのような材料は、無毒でなければならず、有効成分の効能を妨害してはならない。担体又は他の材料の正確な性質は、経口又は注射（例．皮内又は筋肉内）であってもよい投与経路に依存する。
カテーテル又は他の外科用チューブによる送達も使用されるが、注射が組成物の治療的投与の主要な経路と考えられる。適切な投与経路には、静脈内、皮下、腹腔内及び筋肉内投与が含まれる。粉末製剤から再構成した液体製剤を用いてもよい。好ましい投与経路は、皮内又は筋肉内投与である。
本発明の核酸、ベクター、ペプチド及び／又はワクチンは、無針注射で対象に投与してもよい。当業者に知られているように、無針注射器（「ジェット注射」としても知られている）は、皮膚の最外層（角質層）を貫通する液体の狭い高圧流を使用して、組成物を表皮若しくは真皮（皮内注射）、脂肪（皮下注射）又は筋肉（筋肉内注射）の下にある組織に送達する。
静脈内注射又は患部への注射では、有効成分は発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性及び安定性の非経口的に許容される水溶液の形態である。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、ラクトリンゲル注射液などの等張な溶媒を用いて、適切な溶液を調製できる。必要に応じて、保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／又は他の添加剤を含んでいてもよい。
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末又は液剤の形態であってもよい。錠剤は、ゼラチン又はアジュバントといった固体担体を含んでいてもよい。液体の医薬組成物は、通常、水、石油、動物油、植物油、鉱油又は合成油といった液体担体を含む。生理食塩水、デキストロース若しくは他の糖類溶液、又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールといったグリコール類を含んでいてもよい。製剤が液体である場合、それは、例えば、ｐＨが６．８～７．６の非リン酸緩衝液を含有する生理学的塩溶液、又は凍結乾燥粉末であってもよい。
この組成物は、また、マイクロスフェア、リポソーム、他の微粒子送達系、又は血液を含む特定の組織に配置された徐放性製剤によって送達してもよい。徐放性の担体の適切な例には、坐剤又はマイクロカプセルのような分割された物品の形態の半透過性ポリマーマトリックスが含まれる。埋め込み型又はマイクロカプセル型の徐放マトリックスには、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号；欧州特許出願公開第0058481号）、L-グルタミン酸とL-グルタミン酸γエチルとのコポリマー[43]、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)が含まれる。ポリペプチドを含有するリポソームは、周知の方法[175, 176]；欧州特許出願公開第0052522号；同第0036676号；同第0088046号；同第0143949号；同第0142541号；特開昭58-11808号；米国特許第4,485,045号；同第4,544,545号で製造される。通常、リポソームは、脂質含量が約３０モル％のコレステロールを超える、小さな（約２００～８００Å）ユニラメラで、その割合は、ポリペプチド漏出の最適な速度に調節される。組成物は、腫瘍部位又は他の所望の部位に局所的に投与してもよく、又は腫瘍又は他の細胞を標的とするように送達してもよい。
本発明のポリペプチドは、化学合成により、完全に又は部分的に製造できる。ポリペプチドは、十分に確立された標準的な液相、若しくは好ましくは固相ペプチド合成法によって容易に製造でき、その一般的な説明は広く入手可能である（例えば、J.M. Stewart and J.D. Young, (1984) [177]、M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, (1984) [178]を参照）；又は、液相法によって、若しくは、固相、液相及び溶液化学の任意の組合せによって、例えば、最初にそれぞれのペプチド部分を完成させ、次いで、必要に応じて存在する保護基を除去した後で、それぞれのカルボン酸若しくはスルホン酸又はそれらの反応性誘導体の反応による残基Ｘの導入によって、溶液中で製造できる。
本発明のポリペプチドを製造する別の簡便な方法は、発現系で核酸を使用し、それをコードする核酸を発現させることである。本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸も提供する。核酸にはＤＮＡとＲＮＡが含まれる。当業者は、本発明のポリペプチドをなおも提供するこのような核酸に対する置換、欠失及び／又は付加を決定できる。
本発明は、これまでに説明した少なくとも１つの核酸を含むプラスミド、ベクター、転写又は発現カセットの形態の構築物も提供する。本発明は、上記１つ以上の構築物を含む組換え宿主細胞も提供する。説明したように、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、ポリペプチドをコードする核酸からの発現を含むポリペプチドの製造方法と同様に、本発明の一つの側面を形成する。発現は、核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することで簡便に達成してもよい。発現による産生に続き、ポリペプチドは、適切な技術で単離及び／又は精製してもよく、次いで、適切に使用してもよい。種々の宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング及び発現のための系は周知である。適切な宿主細胞には、細菌、哺乳動物細胞、酵母及びバキュロウイルス系が含まれる。異種性ポリペプチドの発現で当技術分野において利用可能な哺乳動物細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞など、多くのものが含まれる。一般的な好ましい細菌宿主は大腸菌である。大腸菌のような原核細胞でのポリペプチドの発現は、当技術分野において十分に確立されている。総説は例えば[179]を参照。培養真核生物細胞での発現もまた、本発明のポリペプチド産生の選択肢として当業者に利用可能であり、最近の総説は例えば[180, 181]を参照。
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び必要に応じて他の配列を含む適切な調節配列を含有する適切なベクターを選択又は構築できる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス（例．ファージ）又はファージミドであってもよい。詳細については、例えば[157]を参照されたい。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入及び遺伝子発現、並びにタンパク質の分析における核酸の操作のための多くの公知の技術及びプロトコルは、Ausubel et al., 1992 [182]に詳細に記載されている。
したがって、本発明の別の側面は、本発明の核酸を含む宿主細胞を提供する。更に別の側面は、そのような核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。導入は、任意の技術を使用してもよい。真核生物細胞では、適切な技術には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、リポソームによるトランスフェクション、及びレトロウイルス又は他のウイルス（例．ワクシニアウイルス、又は昆虫細胞ではバキュロウイルス）を用いる形質導入が含まれてもよい。細菌細胞では、適切な技術には、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション及びバクテリオファージを用いるトランスフェクションが含まれてもよい。導入に続いて、例えば遺伝子が発現する条件で宿主細胞を培養することで、核酸からの発現を引き起こしてもよく、又は発現を可能にしてもよい。ある態様では、本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例．染色体）に組み込まれる。標準的な技術によってゲノムとの組換えを促進する配列を含めることで、組込みを促進してもよい。本発明は、上記ポリペプチドを発現するために、発現系で上記構築物を使用することを含む方法も提供する。
フラグメント結晶化領域（Ｆｃ領域）は、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体及び補体系のいくつかのタンパク質と相互作用する抗体の尾部の領域である。この特性により、抗体は免疫系を活性化できる。ＩｇＧ抗体アイソタイプでは、Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖の第２及び第３の定常ドメインに由来する２つの同じタンパク質の断片からなる。ＩｇＧのＦｃ領域は、高度に保存されたN-グリコシル化部位を含む。
ＩｇＧのＦｃ領域は、一対のＣＨドメインからなり、それぞれのドメインは、ＣＨ３と融合したＣＨ２を有し、構造が約５０ｋＤａである。「フラグメント、結晶化」（Ｆｃ）という名称は、血清由来のメラノーマＩｇＧ分画をパパインで切断した後に結晶化できた唯一の断片が、対になったＣＨ２－ＣＨ３断片であったという事実に由来する。
Ｆｃでは、２つのＣＨ３ドメインは互いに強固に結合するが、２つのＣＨ２ドメインは互いに直接的なタンパク質－タンパク質接触がない。オリゴ糖は、２つのＣＨ２ドメインそれぞれの内部のアスパラギン２９７（Ｎ２９７）に結合し、２つのＣＨ２の間の空間の一部分を埋める。いくつかの結晶構造では、水素結合が２本の糖鎖の間で、直接又は水分子の架橋を介して観察される。抗体は高度にセグメント化された分子のように見えるが、Ｆｃの構造は、抗原結合断片（Ｆａｂ）と標的抗原の結合に影響を与える可能性があり、同様に、Ｆａｂ中の可変鎖の内容は、Ｆｃとさまざまな受容体の結合に影響を与える可能性があることが実証されている。最近、円偏光二色性による研究で、ＦａｂアームとＩｇＧのＦｃとの間の重要な構造的結合が確認された。このように、ＩｇＧ分子は非常に複雑な分子で、その異なるドメインは、たとえ距離が離れていても意味のある相互作用をする。
アビディティーとは、個々の非共有結合相互作用（例えば、タンパク質受容体とそのリガンドとの間の相互作用）の複数の親和性の蓄積された強度を指し、「機能的親和性」とも呼ばれることがある。このように、アビディティーは、単一の相互作用の強さを表す固有の親和性とは異なる。しかし、個々の結合は、他の相互作用が生じる可能性を増加させる（すなわち、結合部位に近接する結合パートナーの局所濃度を増加させる）ので、アビディティーは、構成要素の親和性の単なる合計と考えるべきではなく、生体分子相互作用に関与する全ての親和性を組み合わせた効果と考えるべきである。「固有の親和性」と「機能的親和性」を区別することの有用性は、それぞれの用語に含まれる異なる強調点から生じる。前者は、抗体結合部位とリガンドの相補的領域との間の構造的関係を精査している場合、又は特異的相互作用の速度論的メカニズムを調査している場合に最も有用である。一方、後者は、本発明のように、親和性の増強を定量的に測定している場合に特に重要である。
「機能的親和性」及び「固有の親和性」は、以下の形式的には同じ可逆反応を指す。
ここで、Ｆ１は一価の抗体断片、Ｌ１は一価のリガンド、Ａｂｎは多価抗体、Ｌｍはｍ個のグループを有する多価リガンドである。いずれの場合も、２つの速度論的単位が可逆的に結合して１つの単位を形成し、各反応は原則として結合定数によって特徴付けることができる。会合定数は熱力学的親和性の尺度であることから、両者の反応に親和性の定量的な値を割り当てることができる。
本発明は、この明細書で開示したペプチド配列の変異体にも及ぶ。本明細書では、用語「変異株」は、類似のアミノ酸配列を有するタンパク質、及び／又は同じ機能を保持するタンパク質を指す。例えば、用語「変異株」は、１以上のアミノ酸の付加、欠失、置換などを含むタンパク質又はポリペプチドを包含する。本発明の変異株の例は、１つ以上のアミノ酸の１つ以上の他のアミノ酸による置換とは別に、以下に定義されるペプチドを含むタンパク質である。アミノ酸置換は、例えば、アミノ酸配列における不都合を低減又は排除するために行ってもよい。
当業者は、種々のアミノ酸が同様の特性を有することを認識している。物質の１つ以上のそのようなアミノ酸は、しばしば、その物質の所望の活性を消滅させることなく、１つ以上の他のアミノ酸によって置換できる。
したがって、多くの場合、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンは、相互に置換できる（脂肪族側鎖を有するアミノ酸）。これらの可能な置換のうち、（側鎖が比較的短いため）グリシンとアラニンを使用して相互に置換し、（疎水性の大きな脂肪族側鎖を有するため）バリン、ロイシン及びイソロイシンを使用して相互に置換することが好ましい。しばしば相互に置換できる他のアミノ酸には、以下のものがある：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びに、システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）。このような置換は、「保存的」又は「半保存的」アミノ酸置換と呼ばれることが多い。
３文字コード及び１文字コードを用いて、天然に存在するアミノ酸は、以下のように記載してもよい：グリシン（Ｇ又はＧｌｙ）、アラニン（Ａ又はＡｌａ）、バリン（Ｖ又はＶａｌ）、ロイシン（Ｌ又はＬｅｕ）、イソロイシン（Ｉ又はＩｌｅ）、プロリン（Ｐ又はＰｒｏ）、フェニルアラニン（Ｆ又はＰｈｅ）、チロシン（Ｙ又はＴｙｒ）、トリプトファン（Ｗ又はＴｒｐ）、リシン（Ｋ又はＬｙｓ）、アルギニン（Ｒ又はＡｒｇ）、ヒスチジン（Ｈ又はＨｉｓ）、アスパラギン酸（Ｄ又はＡｓｐ）、グルタミン酸（Ｅ又はＧｌｕ）、アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）、グルタミン（Ｑ又はＧｌｎ）、システイン（Ｃ又はＣｙｓ）、メチオニン（Ｍ又はＭｅｔ）、セリン（Ｓ又はＳｅｒ）及びトレオニン（Ｔ又はＴｈｒ）。残基がアスパラギン酸又はアスパラギンの可能性がある場合、記号Ａｓｘ又はＢを使用してもよい。残基がグルタミン酸又はグルタミンの可能性がある場合、記号Ｇｌｘ又はＺを使用してもよい。特にことわらない限り、アスパラギン酸といった場合アスパラギンを含み、グルタミン酸はグルタミンを含む。
アミノ酸の欠失又は挿入は、以下で言及する融合タンパク質のアミノ酸配列に対しても行うことができる。従って、例えば、ポリペプチドの活性に対して実質的な効果を示さないアミノ酸、又は、少なくともそのような活性を排除しないアミノ酸は、欠失できる。このような欠失は、活性を保持しながらポリペプチドの全長及び分子量を減少できるので、有利であるかもしれない。これにより、特定の目的に必要なポリペプチドの量を減少でき、例えば、投与量を減らすことができる。
いくつかの態様では、以下のアミノ酸が、保存的アミノ酸置換のために相互に交換できる。
したがって、「保存的」アミノ酸置換といった場合、抗体の（例えば、ＣＤＲ又はＶＨ若しくはＶＬの）配列中のアミノ酸の１つ以上が、上記同じクラスの別のアミノ酸で置換されるアミノ酸置換を指す。保存的アミノ酸置換は、抗体の機能に対する悪影響を最小限にするために、ＣＤＲ領域において好まれる可能性がある。しかし、保存的アミノ酸置換は、フレームワーク領域でも生じる可能性がある。
以下に示す配列に関連するアミノ酸の変更は、部位特異的変異又は固相合成といった適切な技術を用いることで行うことができる。
本発明の範囲内のアミノ酸の置換又は挿入は、天然に存在するアミノ酸が好ましい場合があるが、天然に存在するアミノ酸又は天然に存在しないアミノ酸を用いて行うことができることを理解されたい。天然のアミノ酸又は合成アミノ酸を使用するか否かにかかわらず、L-アミノ酸のみが存在することが好ましい。
本発明は、以下のものも提供する：
抗原が腫瘍特異的又は腫瘍関連抗原である核酸ワクチン、
抗原がウイルス又は細菌の抗原である核酸ワクチン、
抗原がＴ細胞応答及びＶＮＡｂの両者を生み出す２つのウイルスタンパク質である核酸ワクチン、
抗原が、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞及びＶＮＡｂを生み出す２つのウイルスタンパク質である核酸ワクチン、
抗原が、Ｔ細胞応答及びＶＮＡｂの両者を生み出すウイルスのヌクレオカプシドタンパク質及びスパイクタンパク質の重要な受容体結合ドメインである核酸ワクチン、
抗原が、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞及びＶＮＡｂを生み出すウイルスのヌクレオカプシドタンパク質及びスパイクタンパク質の重要な受容体結合ドメインである核酸ワクチン、
抗原が、Ｔ細胞応答及びＶＮＡｂの両者を生み出すコロナウイルスのヌクレオカプシドタンパク質及びスパイクタンパク質の重要な受容体結合ドメインである核酸ワクチン、
抗原が、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞及びＶＮＡｂを生み出すコロナウイルスのヌクレオカプシドタンパク質及びスパイクタンパク質の重要な受容体結合ドメインの両者である核酸ワクチン、
抗原が、Ｔ細胞応答及びＶＮＡｂの両者を生み出すSARS-CoV-2コロナウイルスのヌクレオカプシドタンパク質及びスパイクタンパク質の重要な受容体結合ドメインの両者である核酸ワクチン、
抗原が、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞及びＶＮＡｂを生み出すSARS-CoV-2コロナウイルスのヌクレオカプシドタンパク質及びスパイクタンパク質の重要な受容体結合ドメインの両者である核酸ワクチン、
高アビディティーのＣＤ８ Ｔ細胞を誘導するために低用量が送達される、上記核酸ワクチン、
受容体結合ドメインがフィブリチンで三量体化されている、上記核酸ワクチン、
受容体結合ドメインが、フレキシブルなＧＳリンカーが結合したフィブリチンで三量体化されている、上記核酸ワクチン、
受容体結合ドメインが追加のジスルフィド結合によって安定化されている、上記核酸ワクチン、
ヒト重鎖リーダー配列を伴うCOVID-19スパイク受容体結合ドメインａａ３１９－５４１、並びにヒト重鎖リーダー配列を伴うヒトＩｇＧ１ Ｆｃのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインと結合したヌクレオカプシドタンパク質をコードする核酸ワクチン、
ヒト重鎖リーダー配列を伴うフィブリチンと結合したCOVID-19スパイク受容体結合ドメインａａ３１９－５４１、並びにヒト重鎖リーダー配列を伴うヒトＩｇＧ１ Ｆｃのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインと結合したヌクレオカプシドタンパク質をコードする核酸ワクチン、
ヒト重鎖リーダー配列を伴うヒトＩｇＧ１ Ｆｃのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインと結合したCOVID-19スパイク受容体結合ドメインａａ３１９－５４１、並びにヒト重鎖リーダー配列を伴うヌクレオカプシドタンパク質をコードする核酸ワクチン、
ヒト重鎖リーダー配列を伴うCOVID-19スパイク受容体結合ドメインａａ３１９－５４１及びヒト重鎖リーダー配列を伴うヌクレオカプシドタンパク質をコードする核酸ワクチン、
ヒト重鎖リーダー配列を伴い、ＧＳリンカーとフィブリチンを有するCOVID-19スパイク受容体結合ドメインａａ３３０－５２５、及びヒト重鎖リーダー配列を伴うヒトＩｇＧ１ Ｆｃのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインと結合したヌクレオカプシドタンパク質をコードする核酸ワクチン、
ヒト重鎖リーダー配列を伴い、ＧＳリンカーと追加のシステイン残基を有するCOVID-19スパイク受容体結合ドメインａａ３３０－５２５、及びヒト重鎖リーダー配列を伴うヒトＩｇＧ１ Ｆｃのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインと結合したヌクレオカプシドタンパク質をコードする核酸ワクチン、
免疫グロブリンのＦｃ領域の１個以上の残基及び結合領域を含む改変ＩｇＧ１抗体又はその抗原結合断片であって、前記Ｆｃ領域の残基の１つ以上が、マウスＩｇＧ３抗体の対応する残基に改変されており、かつ、前記改変ＩｇＧ１抗体又はその抗原結合断片は、対応する野生型Ｆｃ領域の残基を含むＩｇＧ１抗体又はその抗原結合断片と比較して、機能的親和性が増強されている、改変ＩｇＧ１抗体又はその抗原結合断片、
免疫グロブリンのＦｃ領域の１個以上の残基及び結合領域を含む改変ＩｇＧ１抗体又はその抗原結合断片を含有する核酸ワクチンであって、前記Ｆｃ領域の残基の１つ以上が、マウスＩｇＧ３抗体の対応する残基に改変されており、かつ、前記改変ＩｇＧ１抗体又はその抗原結合断片は、対応する野生型Ｆｃ領域の残基を含むＩｇＧ１抗体又はその抗原結合断片と比較して、機能的親和性が増強されている、核酸ワクチン、
免疫グロブリンのＦｃ領域の１個以上の残基及び結合領域を含む改変ＩｇＧ１抗体又はその抗原結合断片であって、前記Ｆｃ領域の残基の１つ以上が、マウスＩｇＧ３抗体の対応する残基に改変されており、かつ、前記Ｆｃ領域の残基の１つ以上が、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｅ３４５、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｐ３７４、Ｄ３７６から選択され、任意に、前記Ｆｃ領域の改変された残基の１つ以上が、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｐ３７４Ｓ、Ｄ３７６Ａから選択される、改変ＩｇＧ１抗体又はその抗原結合断片、
免疫グロブリンのＦｃ領域の１個以上の残基及び結合領域を含む改変ＩｇＧ１抗体又はその抗原結合断片を含有する核酸ワクチンであって、前記Ｆｃ領域の残基の１つ以上が、マウスＩｇＧ３抗体の対応する残基に改変されており、かつ、前記Ｆｃ領域の残基の１つ以上が、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｅ３４５、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｐ３７４、Ｄ３７６から選択され、任意に、前記Ｆｃ領域の改変された残基の１つ以上が、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｐ３７４Ｓ、Ｄ３７６Ａから選択される、核酸ワクチン、
免疫グロブリンのＦｃ領域の１個以上の残基及び結合領域を含む改変ＩｇＧ１抗体又はその抗原結合断片であって、前記Ｆｃ領域の残基の１つ以上が、マウスＩｇＧ３抗体の対応する残基に改変されており、かつ、前記Ｆｃ領域の残基の１つ以上が、Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｇ３７１、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８から選択され、任意に、前記Ｆｃ領域の改変された残基の１つ以上が、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｇ３７１Ｎ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される、改変ＩｇＧ１抗体又はその抗原結合断片、
免疫グロブリンのＦｃ領域の１個以上の残基及び結合領域を含む改変ＩｇＧ１抗体又はその抗原結合断片を含有する核酸ワクチンであって、前記Ｆｃ領域の残基の１つ以上が、マウスＩｇＧ３抗体の対応する残基に改変されており、かつ、前記Ｆｃ領域の残基の１つ以上が、Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｇ３７１、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８から選択され、任意に、前記Ｆｃ領域の改変された残基の１つ以上が、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｇ３７１Ｎ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される、核酸ワクチン、
免疫グロブリンのＦｃ領域の１個以上の残基及び結合領域を含む改変ＩｇＧ１抗体又はその抗原結合断片であって、前記Ｆｃ領域の残基の１つ以上が、マウスＩｇＧ３抗体の対応する残基に改変されており、かつ、前記Ｆｃ領域の残基の１つ以上が、Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ａ３３９、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｋ３７０、Ｇ３７１、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８から選択され、任意に、前記Ｆｃ領域の改変された残基の１つ以上が、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される、改変ＩｇＧ１抗体又はその抗原結合断片、
免疫グロブリンのＦｃ領域の１個以上の残基及び結合領域を含む改変ＩｇＧ１抗体又はその抗原結合断片を含有する核酸ワクチンであって、前記Ｆｃ領域の残基の１つ以上が、マウスＩｇＧ３抗体の対応する残基に改変されており、かつ、前記Ｆｃ領域の残基の１つ以上が、Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ａ３３９、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｋ３７０、Ｇ３７１、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８から選択され、任意に、前記Ｆｃ領域の改変された残基の１つ以上が、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される、核酸ワクチン、
免疫グロブリンのＦｃ領域の１個以上の残基及び結合領域を含む改変ＩｇＧ１抗体又はその抗原結合断片であって、前記Ｆｃ領域の残基の１つ以上が、マウスＩｇＧ３抗体の対応する残基に改変されており、かつ、前記Ｆｃ領域の残基の１つ以上が、Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ｅ２９４、Ｙ３００、Ｖ３０５、Ａ３３９、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｋ３７０、Ｇ３７１、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８から選択され、任意に、前記Ｆｃ領域の改変された残基の１つ以上が、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｅ２９４Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｖ３０５Ａ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される、改変ＩｇＧ１抗体又はその抗原結合断片、
免疫グロブリンのＦｃ領域の１個以上の残基及び結合領域を含む改変ＩｇＧ１抗体又はその抗原結合断片を含有する核酸ワクチンであって、前記Ｆｃ領域の残基の１つ以上が、マウスＩｇＧ３抗体の対応する残基に改変されており、かつ、前記Ｆｃ領域の残基の１つ以上が、Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ｅ２９４、Ｙ３００、Ｖ３０５、Ａ３３９、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｋ３７０、Ｇ３７１、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８から選択され、任意に、前記Ｆｃ領域の改変された残基の１つ以上が、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｅ２９４Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｖ３０５Ａ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される、核酸ワクチン。
本発明の各側面の好ましい特徴は、必要な変更を加え、他の各側面と同様である。本明細書に記載した先行技術文献は、法律によって許容される最大限の範囲で組み込まれる。
本発明の態様の説明では、用語は、選択された特定の用語に限定されることを意図しておらず、各用語は、同様の目的を達成するために同様の方法で動作する全ての技術的同等物を含むことが理解される。
pVAXDCIB68マップ及びクローニング戦略 クローニング部位を示すＢａｍＨＩ＊／ＸｈｏＩ＊及びＨｉｎｄＩＩＩ＊＊／ＰｓｔＩ＊＊を、軽鎖及び重鎖の切り出しに利用し、Ｓ及びＮセクションでの置換は、それぞれ、１回目＊及び２回目＊＊のクローニングで行った。 pVAXDCSN1；ＳＮ１の配列 発現ベクターpVAXDC内のＳ糖タンパク質及びＮ全長鎖のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。Ｓ鎖はＲＢＤアミノ酸３１９－５４１及びマウスＩｇＫリーダーをコードする。核タンパク質鎖は、マウスＩｇＫリーダーとともにヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３とインフレームで融合したアミノ酸２－４１９をコードする。停止コドンは星印で示す。２つの鎖の導入に利用するＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｓｔ制限部位を太字で示す。 pVAXDCSN2；ＳＮ２の配列 発現ベクターpVAXDC内のＳ及びＮ全長鎖のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。いずれの鎖もマウスＩｇＫリーダーを含む。Ｓ鎖は、グリシンセリンを介してフィブリチン三量体モチーフと結合したＲＢＤアミノ酸３１９－５４１をコードする。Ｎ鎖は、ヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３とインフレームで融合したアミノ酸２－４１９をコードする。停止コドンは星印で示す。２つの鎖の導入に利用するＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｓｔ制限部位を太字で示す。 pVAXDCSN3；ＳＮ３の配列 発現ベクターpVAXDC内のＳ及びＮ全長鎖のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。いずれの鎖もマウスＩｇＫリーダーを含む。Ｓ鎖は、ヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３とインフレームで融合したＲＢＤアミノ酸３１９－５４１をコードする。Ｎ鎖はアミノ酸２－４１９をコードする。停止コドンは星印で示す。２つの鎖の導入に利用するＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｓｔ制限部位を太字で示す。 pVAXDCSN4；ＳＮ４の配列 発現ベクターpVAXDC内のＳ及びＮ全長鎖のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。いずれの鎖もマウスＩｇＫリーダーを含む。Ｓ糖タンパク質はＲＢＤアミノ酸３１９－５４１をコードし、Ｎ鎖は、アミノ酸２－４１９をコードする。停止コドンは星印で示す。２つの鎖の導入に利用するＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｓｔ制限部位を太字で示す。 pVAXDCSN5；ＳＮ５の配列 発現ベクターpVAXDC内のＳ及びＮ全長鎖のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。Ｓ鎖は、ＲＢＤアミノ酸３１９－５４１及びヒトＩｇＨリーダーをコードする。Ｎ鎖は、ヒトＩｇＨリーダーとともにヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３とインフレームで融合したアミノ酸２－４１９をコードする。停止コドンは星印で示す。２つの鎖の導入に利用するＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｓｔ制限部位を太字で示す。 pVAXDCSN6；ＳＮ６の配列 発現ベクターpVAXDC内のＳ及びＮ全長鎖のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。いずれの鎖もヒトＩｇＨリーダーを含む。Ｓ鎖は、グリシンセリンを介してフィブリチン三量体モチーフと結合したＲＢＤアミノ酸３１９－５４１をコードする。Ｎ鎖は、ヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３とインフレームで融合したアミノ酸２－４１９をコードする。停止コドンは星印で示す。２つの鎖の導入に利用するＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｓｔ制限部位を太字で示す。 pVAXDCSN7；ＳＮ７の配列 発現ベクターpVAXDC内のＳ及びＮ全長鎖のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。いずれの鎖もヒトＩｇＨリーダーを含む。Ｓ鎖は、ヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３とインフレームで融合したＲＢＤアミノ酸３１９－５４１をコードする。Ｎ鎖はアミノ酸２－４１９をコードする。停止コドンは星印で示す。２つの鎖の導入に利用するＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｓｔ制限部位を太字で示す。 pVAXDCSN8；ＳＮ８の配列 発現ベクターpVAXDC内のＳ及びＮ全長鎖のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。いずれの鎖もヒトＩｇＨリーダーを含む。Ｓ糖タンパク質鎖は、ＲＢＤアミノ酸３１９－５４１をコードし、Ｎ鎖はアミノ酸２－４１９をコードする。停止コドンは星印で示す。２つの鎖の導入に利用するＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｓｔ制限部位を太字で示す。 pVAXDCSN9；ＳＮ９の配列 発現ベクターpVAXDC内のＳ及びＮ全長鎖のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。いずれの鎖もヒトＩｇＨリーダーを含む。Ｓ鎖は、より長い（ＧＧＧＳ）３ＧＳグリシンセリンリンカーを介してフィブリチン三量体モチーフ（ＧＴＧＧＧＳＧ）と結合するＲＢＤアミノ酸３３０－５２５をコードする。Ｎ鎖は、ヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３とインフレームで融合したアミノ酸２－４１９をコードする。停止コドンは星印で示す。２つの鎖の導入に利用するＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｓｔ制限部位を太字で示す。 pVAXDCSN10；ＳＮ１０の配列 発現ベクターpVAXDC内のＳ及びＮ全長鎖のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。いずれの鎖もヒトＩｇＨリーダーを含む。Ｓ鎖は、（ＧＧＧＳ）３グリシンセリンリンカーを介してジスルフィド架橋モチーフと結合するＲＢＤアミノ酸３３０－５２５をコードする。Ｎ鎖は、ヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３とインフレームで融合したアミノ酸２－４１９をコードする。停止コドンは星印で示す。２つの鎖の導入に利用するＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｓｔ制限部位を太字で示す。 pVAXDCSN11；ＳＮ１１の配列 発現ベクターpVAXDC内のＳ及びＮ全長鎖のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。いずれの鎖もヒトＩｇＨリーダーを含む。Ｓ鎖は、より長い（ＧＧＧＳ）３ＧＳグリシンセリンリンカーを介してフィブリチン三量体モチーフ（ＧＴＧＧＧＳＧ）と結合するＲＢＤアミノ酸３３０－５２５をコードする。Ｎ鎖は、ヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ｉＶ１とインフレームで融合したアミノ酸２－４１９をコードし、マウスＩｇＧ３の２３個のアミノ酸置換は太字で強調して示す。停止コドンは星印で示す。２つの鎖の導入に利用するＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｓｔ制限部位を太字で示す。 pVAXDCSN12；ＳＮ１２の配列 発現ベクターpVAXDC内のＳ及びＮ全長鎖のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。いずれの鎖もヒトＩｇＨリーダーを含む。Ｓ鎖は、グリシンセリンを介してフィブリチン三量体モチーフと結合したＲＢＤアミノ酸３１９－５４１をコードする。Ｎ鎖は、ヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ｉＶ１とインフレームで融合したアミノ酸２－４１９をコードし、マウスＩｇＧ３の２３個のアミノ酸置換は太字で強調して示す。停止コドンは星印で示す。２つの鎖の導入に利用するＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｓｔ制限部位を太字で示す。 pVAXDCSN13；ＳＮ１３の配列 発現ベクターpVAXDC内のＳ及びＮ全長鎖のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。いずれの鎖もヒトＩｇＨリーダーを含む。Ｓ鎖は、ヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３とインフレームで融合したＲＢＤアミノ酸３１９－５４１をコードする。Ｎ鎖は、ヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ｉＶ１とインフレームで融合したアミノ酸２－４１９をコードし、マウスＩｇＧ３の２３個のアミノ酸置換は太字で強調して示す。停止コドンは星印で示す。２つの鎖の導入に利用するＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｓｔ制限部位を太字で示す。 pVAXDCSN14；ＳＮ１４の配列 発現ベクターpVAXDC内のＳ及びＮ全長鎖のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。いずれの鎖もヒトＩｇＨリーダーを含む。Ｓ鎖はＲＢＤアミノ酸３１９－５４１をコードし、Ｎ鎖はアミノ酸２－４１９をコードし、これらのアミノ酸は共にヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ｉＶ１定常領域とインフレームで融合しており、マウスＩｇＧ３の２３個のアミノ酸置換は太字で強調して示す。ＳＮ１４における２つのコドン最適化ヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ｉＶ１定常領域間の相同性を低下させるために、ヌクレオチド配列は同一ではない。停止コドンは星印で示す。２つの鎖の導入に利用するＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｓｔ制限部位を太字で示す。 それぞれのＳＮ構築物による一過性ＨＥＫ２９３トランスフェクションの６日後の順化培地中の、ＲＢＤ及びＮの（サンドイッチＥＬＩＳＡによる）分泌量。 １日、８日及び１５日目に、遺伝子銃を用いて、HHDIIマウスを、ＳＮ８、ＳＮ９、ＳＮ１０及びＳＮ１１のｐＤＮＡで（Ａ）、又はＳＮ８、ＳＮ１０及びＳＮ１１のｐＤＮＡで（Ｂ）、免疫した。２１日目に、培地（対照）、Ｓ１、ＲＢＤ及びＮタンパク質、Ｎ及びＲＢＤペプチドのプール、並びに個々のＮ及びＲＢＤペプチドについて、ELISpotアッセイによりＩＦＮγ応答について脾細胞を分析した。応答は、１００万個の脾細胞あたりの平均スポットとして示した。ペプチドに対する応答を塗りつぶしていない丸、タンパク質に対する応答を塗りつぶした丸、Ｎ抗原に対する応答を赤、Ｓ抗原、ＲＢＤ、Ｓ１に対する応答を青で示す。 １日、８日及び１５日目に、遺伝子銃を用いて、HHDII/DR1マウスを、ＳＮ８（Ａ）、ＳＮ９（Ｂ）、ＳＮ１０（Ｃ）及びＳＮ１１（Ｄ）のｐＤＮＡで免疫した。２１日目に、培地（対照）、Ｓ１、ＲＢＤ及びＮタンパク質、Ｎ及びＲＢＤペプチドのプール、並びに個々のＮ及びＲＢＤペプチドについて、ELISpotアッセイによりＩＦＮγ応答について脾細胞を分析した。応答は、１００万個の脾細胞あたりの平均スポットとして示した。ペプチドに対する応答を塗りつぶしていない丸、タンパク質に対する応答を塗りつぶした丸、Ｎ抗原に対する応答を赤、Ｓ抗原、ＲＢＤ、Ｓ１に対する応答を青で示す。 遺伝子銃を用いてＳＮ８、ＳＮ９又はＳＮ１１のｐＤＮＡで免疫したマウスの、Ｎタンパク質（Ａ）、Ｎ１３８－１４７ペプチド（Ｂ）、Ｓ１タンパク質（Ｃ）及びＲＢＤタンパク質（Ｄ）に対するＩＦＮγ応答のELISpotによる比較。データは２回の独立した実験で得た。応答はバックグラウンドの対照に対して正規化した。応答は、１００万個の脾細胞あたりの平均スポットとして示した。 １日、１５日及び２９日目に、遺伝子銃を用いて、HHDII/DP4マウスをＳＮ２（Ａ）、ＳＮ３（Ｂ）及びＳＮ４（Ｃ）のｐＤＮＡで免疫した。３５日目に、培地（対照）、Ｓ１、ＲＢＤ及びＮタンパク質、ＲＢＤペプチドのプール、並びに個々のＮ及びＲＢＤペプチドについて、ELISpotアッセイによりＩＦＮγ応答について脾細胞を分析した。応答は、１００万個の脾細胞あたりの平均スポットとして示した。ペプチドに対する応答を塗りつぶしていない丸、タンパク質に対する応答を塗りつぶした丸、Ｎ抗原に対する応答を赤、Ｓ抗原、ＲＢＤ、Ｓ１に対する応答を青で示す。 １日、１５日及び２９日目に、遺伝子銃を用いて、HHDII/DP4マウスを、ＳＮ２、ＳＮ３及びＳＮ４のｐＤＮＡで免疫した。ELISpotアッセイにより、３５日目に脾細胞をＳ１タンパク質の滴定量に対するＩＦＮγ応答について分析した。アビディティーは最大応答の５０％を誘発するタンパク質濃度として計算した。応答及びスポット／１００万脾細胞で示す滴定曲線は、最大応答曲線（％）として表示するために正規化した。 １日、８日及び１５日目に、遺伝子銃を用いて、HHDIIマウスをＳＮ１１のｐＤＮＡで免疫した。２１日目に、ELISpotアッセイにより、ＲＢＤ４１７－４２５ペプチドの滴定量に対するＩＦＮγ応答について脾細胞を分析した。アビディティーは最大応答の５０％を誘発するタンパク質濃度として計算した。滴定曲線はスポット／１００万脾細胞として示した。 １日、８日及び１５日目に、遺伝子銃を用いて、HHDIIマウスを、ＳＮ１０又はＳＮ１１のｐＤＮＡで免疫した。２１日目に、ELISpotアッセイにより、ＲＢＤ１３８－１４６ペプチドの滴定量に対するＩＦＮγ応答について脾細胞を分析した。アビディティーは最大応答の５０％を誘発するタンパク質濃度として計算した。滴定曲線はスポット／１００万脾細胞として示した。 遺伝子銃を用いて、HHDII/DP4マウスを、１日、１５日及び２９日目に、ＳＮ５、ＳＮ６、ＳＮ９、ＳＮ１０及びＳＮ１１のｐＤＮＡで（Ａ）、１日、１５日及び２９日目に、ＳＮ２、ＳＮ３及びＳＮ４のｐＤＮＡで（Ｂ）、又は、１日、８日及び１５日目に、ＳＮ３、ＳＮ８、ＳＮ１０及びＳＮ１１のｐＤＮＡで（Ｃ）、免疫した。Ｓ１、Ｎ及びＲＢＤタンパク質に対する抗体応答について、３５日目（Ａ及びＢ）又は２１日目（Ｃ）に、1/100、1/1000及び1/10000希釈の血清を、ＥＬＩＳＡで分析した。 １日、１５日及び２９日に、遺伝子銃を用いて、ＳＮ５、ＳＮ６、ＳＮ９、ＳＮ１０及びＳＮ１１で免疫したHHDII/DP4マウスの３５日目に採取した血清の、代わりの中和アッセイ（ＲＢＤ結合阻害試験）。ナイーブマウスの血清を陰性対照として使用し、マウスＳ１抗体（SinoBiological）を追加の陽性対照として使用した。 偽ウイルス中和アッセイ。１日、１５日及び２９日目に、遺伝子銃を用いて、HHDII/DP4マウスを、ＳＮ５、ＳＮ６、ＳＮ９、ＳＮ１０、ＳＮ１１、ＳＮ２、ＳＮ３及びＳＮ４のｐＤＮＡで免疫した。３５日目に採取した血清を、SARS-CoV-2（Ａ）又は関係のないウイルス（ＶＳＶ Ｇ）（Ｂ）の中和について1/100希釈で試験した。さまざまな希釈の血清でもウイルス中和を分析した（Ｃ）。５０％中和力価（ＩＤ５０）（Ｄ）。 pVAXDCSN15；ＳＮ１５の配列 発現ベクターpVAXDC内のスパイク及び核タンパク質全長鎖のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。いずれの鎖もヒトＩｇＨリーダーを含む。スパイク鎖は、アミノ酸３１９－５４１をコードする。核タンパク質鎖は、ヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ｉＶ１とインフレームで融合したアミノ酸２－４１９をコードし、マウスＩｇＧ３の２３個のアミノ酸置換は太字で強調して示す。停止コドンは星印で示す。２つの鎖の導入に利用するＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｓｔ制限部位を太字で示す。 pVAXDCIB68（ＳＣＩＢ１）の配列 発現ベクターpVAXDC内で、それぞれ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３定常領域及びヒトκ定常領域とインフレームでクローニングされる抗体重鎖及び軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。枠囲み内のアミノ酸は、Ｈ１及びＬ３におけるHLA-DR7、HLA-DR53及びHLA-DQ6拘束ｇｐ１００１７３－１９０ＣＤ４エピトープ（ＧＴＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹＨ）、Ｈ２におけるHLA-0201 ＴＲＰ２１８０－１８８エピトープ（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）、並びに、Ｈ３及びＬ１におけるHLA-DR4拘束ｇｐ１００４４－５９ＣＤ４エピトープ（ＷＮＲＱＬＹＰＥＷＴＥＡＱＲＬＤ）をコードする。重鎖及び軽鎖可変領域の導入に使用するＨｉｎｄＩＩＩ／Ａｆｅ Ｉ及びＢａｍＨＩ／ＢｓｉＷＩ制限部位を太字で示す。ヒトＩｇＧ１定常領域（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）を拡張ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ｉＶ１定常領域に直接置換するために、Ａｆｅ１及びＥｃｏＲＩを使用した。停止コドンは星印で示す。 pVAXDCIB68 iV1（ｉＳＣＩＢ１）の配列 発現ベクターpVAXDC内で、それぞれ、拡張ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ｉＶ１定常領域（マウスＩｇＧ３の２３個のアミノ酸置換は太字で強調して示す）及びヒトκ定常領域とインフレームでクローニングされる抗体重鎖及び軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。枠囲み内のアミノ酸は、Ｈ１及びＬ３におけるHLA-DR7、HLA-DR53及びHLA-DQ6拘束ｇｐ１００１７３－１９０ＣＤ４エピトープ（ＧＴＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹＨ）、Ｈ２におけるHLA-0201 ＴＲＰ２１８０－１８８エピトープ（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）、及びＨ３及びＬ１におけるHLA-DR4拘束ｇｐ１００４４－５９ＣＤ４エピトープ（ＷＮＲＱＬＹＰＥＷＴＥＡＱＲＬＤ）をコードする。重鎖及び軽鎖可変領域の導入に使用するＨｉｎｄＩＩＩ／Ａｆｅ Ｉ及びＢａｍＨＩ／ＢｓｉＷＩ制限部位を太字で示す。ヒトＩｇＧ１定常領域（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）を拡張ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ｉＶ１定常領域に直接置換するために、Ａｆｅ１及びＥｃｏＲＩを使用した。停止コドンは星印で示す。 pVAXDCIB238（ＳＣＩＢ１ｐｌｕｓ）の配列 発現ベクターpVAXDC内で、それぞれ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３定常領域及びヒトκ定常領域とインフレームでクローニングされる抗体重鎖及び軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。枠囲み内のアミノ酸は、pVAXDCIB68から保持されたＣＤＲ Ｈ１におけるHLA-DR7、HLA-DR53及びHLA-DQ6拘束ｇｐ１００１７３－１９０ＣＤ４エピトープ（ＧＴＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹＨ）、Ｈ２におけるHLA-0201 ＴＲＰ２１８０－１８８エピトープ（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）、及びＬ１におけるHLA-DR4拘束ｇｐ１００４４－５９ＣＤ４エピトープ（ＷＮＲＱＬＹＰＥＷＴＥＡＱＲＬＤ）を示す。追加のエピトープには、Ｈ３部位（ＶＰＬＤＣＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶＴＬＤＩＶＱＧ）に挿入されたｇｐ１００４７１－４９２配列内にネストされたHLA-A1、B35及び予測されるHLA-DP4エピトープが含まれる。ＴＲＰ２１７７－２０５及びＴＲＰ２６０－９１の配列を、それぞれ、軽鎖可変領域のＬ２及びＬ３部位にグラフトした。これらは、HLA-A2、A3、A31、A33、B35、B44、HLA-DR3及び別の場所で説明する他の潜在的なHLA-DP4エピトープをまとめて含んだ。重鎖及び軽鎖可変領域の導入に使用するＨｉｎｄＩＩＩ／Ａｆｅ Ｉ及びＢａｍＨＩ／ＢｓｉＷＩ制限部位を太字で示す。ヒトＩｇＧ１定常領域（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）を拡張ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ｉＶ１定常領域に直接置換するために、Ａｆｅ１及びＥｃｏＲＩを使用した。停止コドンは星印で示す。 pVAXDCIB238 iV1（ｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓ）の配列 発現ベクターpVAXDC内で、それぞれ、拡張ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ｉＶ１定常領域（マウスＩｇＧ３の２３個のアミノ酸置換は太字で強調して示す）及びヒトκ定常領域とインフレームでクローニングされる抗体重鎖及び軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。枠囲み内のアミノ酸は、pVAXDCIB68から保持されたＣＤＲ Ｈ１におけるHLA-DR7、HLA-DR53及びHLA-DQ6拘束ｇｐ１００１７３－１９０ＣＤ４エピトープ（ＧＴＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹＨ）、Ｈ２におけるHLA-0201 ＴＲＰ２１８０－１８８エピトープ（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）、及びＬ１におけるHLA-DR4拘束ｇｐ１００４４－５９ＣＤ４エピトープ（ＷＮＲＱＬＹＰＥＷＴＥＡＱＲＬＤ）を示す。追加のエピトープには、Ｈ３部位（ＶＰＬＤＣＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶＴＬＤＩＶＱＧ）に挿入されたｇｐ１００４７１－４９２配列内にネストされたHLA-A1、B35及び予測されるHLA-DP4エピトープが含まれる。ＴＲＰ２１７７－２０５及びＴＲＰ２６０－９１の配列を、それぞれ、軽鎖可変領域のＬ２及びＬ３部位にグラフトした。これらは、HLA-A2、A3、A31、A33、B35、B44、HLA-DR3及び他の潜在的なHLA-DP4エピトープをまとめて含んだ。重鎖及び軽鎖可変領域の導入に使用するＨｉｎｄＩＩＩ／Ａｆｅ Ｉ及びＢａｍＨＩ／ＢｓｉＷＩ制限部位を太字で示す。ヒトＩｇＧ１定常領域（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）に拡張ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ｉＶ１定常領域に直接置換するために、Ａｆｅ１及びＥｃｏＲＩを使用した。停止コドンは星印で示す。 pVAXDCIB178（ＳＣＩＢ２）の配列 発現ベクターpVAXDC内で、それぞれ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３定常領域及びヒトκ定常領域とインフレームでクローニングされる抗体重鎖及び軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。枠囲み内のアミノ酸は、ＣＤＲ Ｈ１及びＨ２におけるＮＹＥＳＯ－１１５８－１６６ HLA-A24エピトープ（ＬＬＭＷＩＴＱＣＦ）、及びＮＹＥＳＯ－１１５７－１６５ HLA-A2拘束エピトープ（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）を示す。ＮＹ－ＥＳＯ－１８３－１１１アミノ酸配列（ＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱ）及びＮＹ－ＥＳＯ－１１１９－１４３（ＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ）は、別の場所（xue et al. ONCOIMMUNOLOGY 2016, VOL. 5, NO. 6, e1169353）で説明する多くのネストされた追加のエピトープをまとめて含むＣＤＲ Ｈ３及びＬ１部位にグラフトした。重鎖及び軽鎖可変領域の導入に使用するＨｉｎｄＩＩＩ／Ａｆｅ Ｉ及びＢａｍＨＩ／ＢｓｉＷＩ制限部位を太字で示す。ヒトＩｇＧ１定常領域（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）を拡張ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ｉＶ１定常領域に直接置換するために、Ａｆｅ１及びＥｃｏＲＩを使用した。停止コドンは星印で示す。 pVAXDCIB178 iV1（ｉＳＣＩＢ２）の配列 発現ベクターpVAXDC内で、それぞれ、拡張ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ｉＶ１定常領域（マウスＩｇＧ３の２３個のアミノ酸置換は太字で強調して示す）及びヒトκ定常領域とインフレームでクローニングされる抗体重鎖及び軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。枠囲み内のアミノ酸は、ＣＤＲ Ｈ１及びＨ２におけるＮＹＥＳＯ－１１５８－１６６ HLA-A24エピトープ（ＬＬＭＷＩＴＱＣＦ）、及びＮＹＥＳＯ－１１５７－１６５ HLA-A2拘束エピトープ（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）を示す。ＮＹ－ＥＳＯ－１８３－１１１アミノ酸配列（ＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱ）及びＮＹ－ＥＳＯ－１１１９－１４３（ＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ）は、別の場所[183]で説明する多くのネストされた追加のエピトープをまとめて含むＣＤＲ Ｈ３及びＬ１部位にグラフトした。重鎖及び軽鎖可変領域の導入に使用するＨｉｎｄＩＩＩ／Ａｆｅ Ｉ及びＢａｍＨＩ／ＢｓｉＷＩ制限部位を太字で示す。ヒトＩｇＧ１定常領域（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）を拡張ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ｉＶ１定常領域に直接置換するために、Ａｆｅ１及びＥｃｏＲＩを使用した。停止コドンは星印で示す。 １日、８日及び１５日目に、遺伝子銃を用いて、C57Bl/6又はHLA-DR4マウスを、ＳＣＩＢ１又はｉＳＣＩＢ１のｐＤＮＡで免疫した。２１日目に、ELISpotアッセイにより、ＴＲＰ２ １８０－１８８ペプチド（Ａ～Ｃ）又はｇｐ１００ ４４－５９ペプチド（Ｄ）に対するＩＦＮγ応答について脾細胞を分析した。ＴＲＰ２ １８０－１８８応答の頻度をさまざまなマウスで比較した（Ａ）。Ｂ及びＣ、ＴＲＰ２ １８０－１８８応答のアビディティーは最大応答の５０％を誘発するタンパク質濃度として計算した。滴定曲線は最大応答の割合（％）として示した。Ｄ、HLA-DR4マウスの０．１μｇ／ｍｌのｇｐ１００ ４４－５９ペプチドに対する応答の頻度。 １日、８日及び１５日目に、遺伝子銃を用いて、C57Bl/6、HHDII、HHDII/DP4又はHLA-DR4マウスを、ＳＣＩＢ１ｐｌｕｓ又はｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓのｐＤＮＡで免疫した。２１日目に、ELISpotアッセイにより、ＴＲＰ２ １８０－１８８ペプチド（Ａ～Ｃ）又はｇｐ１００ ４４－５９ペプチド（Ｄ）に対するＩＦＮγ応答について脾細胞を分析した。応答の頻度をさまざまなマウスで比較した（Ａ）。Ｂ及びＣ、ＴＲＰ２ １８０－１８８応答のアビディティーは最大応答の５０％を誘発するペプチド濃度として計算した。滴定曲線は最大応答の割合（％）として示した。Ｄ、HLA-DR4マウスの１μｇ／ｍｌのｇｐ１００ ４４－５９ペプチドに対する応答の頻度。 C57Bl6マウスに、１日目にB16F1腫瘍細胞を移植し、続いて４日、１１日及び１８日目に、ＳＣＩＢ１、ｉＳＣＩＢ１、ＳＣＩＢ１ｐｌｕｓ又はｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓのｐＤＮＡで免疫した。Ａ：腫瘍増殖曲線、Ｂ：１８日目の腫瘍体積の比較、Ｃ：全生存期間。 １日、８日及び１５日目に、遺伝子銃を用いて、HHDII又はHHDII/DR1マウスを、ＳＣＩＢ２又はｉＳＣＩＢ２のｐＤＮＡで免疫した。２１日目に、ELISpotアッセイにより、Ｎｙｅｓｏ１ １５７－１６５ペプチド（Ａ～Ｃ）又はＮｙｅｓｏ１ １１９－１４３ペプチド（Ｄ及びＥ）に対するＩＦＮγ応答について脾細胞を分析した。さまざまなマウスで比較したＮｙｅｓｏ１ １５７－１６５応答の頻度（Ａ）。Ｂ及びＣ、Ｎｙｅｓｏ１ １５７－１６５応答のアビディティーは最大応答の５０％を誘発するペプチド濃度として計算した。滴定曲線は最大応答の割合（％）として示した。Ｄ、HHDII/DR1マウスの１０μｇ／ｍｌのＮｙｅｓｏ１ １１９－１４３ペプチドに対する応答の頻度。Ｅ、HHDII/DR1マウスにおけるＮｙｅｓｏ１ １１９－１４３応答のアビディティーは最大応答の５０％を誘発するペプチド濃度として計算した。滴定曲線は最大応答の割合（％）として示した。 HHDIIマウスに、１日目にB16 HHDII Nyeso腫瘍細胞を移植し、続いて４日、８日及び１１日目に、ＳＣＩＢ２又はｉＳＣＩＢ２のｐＤＮＡで免疫し、無腫瘍生存期間を経時的にモニターした。 １日、８日及び１５日目に、遺伝子銃を用いて、HLA-A2トランスジェニックマウス又はBalb/cマウスを、ＳＮ１３又はＳＮ１４のｐＤＮＡで免疫した。２１日目に、脾細胞を、ＲＢＤのペプチドプールに対するＩＦＮγ応答の頻度（Ａ）又はＲＢＤ ４１７－４２５ペプチドに対するペプチド滴定によるアビディティーについて、ELISpotアッセイで分析した。アビディティーは最大応答の５０％を誘発するタンパク質濃度として計算した。滴定曲線は最大応答の割合（％）として示した。血清希釈物を、２１日目に、Ｓ１タンパク質に特異的な抗体応答についてＥＬＩＳＡアッセイで（Ｃ）、又はSARS-CoV-2中和抗体について偽ウイルス中和アッセイで（Ｄ）、分析した。 それぞれのＳＮ構築物による一過性ＨＥＫ２９３トランスフェクションの６日後の順化培地及び細胞溶解物中の、ＲＢＤ（Ａ）及びＮ（Ｂ）の（サンドイッチＥＬＩＳＡによる）分泌量。 １日、８日及び１５日目に、遺伝子銃を用いて、C57Bl/6マウス（Ｃ）又はBalb/cマウス（Ａ及びＢ）を、ＳＮ１１（短いＲＢＤ三量体）、ＳＮ１２（ＲＢＤ三量体）、ＳＮ１３（ＲＢＤ－Ｆｃ）、ＳＮ１５（ＲＢＤ単量体）（以上の構築物は全て改変Ｆｃ－Ｎも有する）のｐＤＮＡ又は全ＳのｐＤＮＡで免疫した。血清希釈物を、２１日目に、Ｓ１タンパク質に特異的な抗体応答についてＥＬＩＳＡアッセイで（Ａ）、又はSARS-CoV-2中和抗体について偽ウイルス中和アッセイで（Ｂ又はＣ）、分析した。 １日、８日及び１５日目に、遺伝子銃を用いて、HLA-A2トランスジェニックマウス、C57Bl/6マウス又はBalb/cマウスを、ＳＮ１１（短いＲＢＤ三量体）、ＳＮ１２（ＲＢＤ三量体）、ＳＮ１３（ＲＢＤ－Ｆｃ）、ＳＮ１５（ＲＢＤ単量体）（以上の構築物は全て改変Ｆｃ－も有する）で免疫した。２１日目に、ELISpotアッセイにより、ＲＢＤペプチドのプール（Ａｉ及びＢ）及びＲＢＤ４１７－４２５ペプチド（Ａｉｉ）に対するＩＦＮγ応答の頻度について脾細胞を分析した。 ＣＭ５チップに捕捉したＣＤ６４の増加についてのＲＢＤ－ＦｃとＲＢＤ－ｉＦｃｖ１の相互作用のリアルタイム結合曲線（ＳＰＲ、BiaT200）。 Ａ．健康なドナーのＴ細胞増殖応答（２０人のドナー）。バルク培養物のＰＢＭＣを採取し、ｉＴｖ１、ハーセプチン（登録商標）、ビデュリオン（登録商標）及びＫＬＨとのインキュベーション後、５日、６日、７日及び８日目に、増殖について評価した。対応のない２標本スチューデントｔ検定を用いて有意（p<0.05）であったＳＩが１．９０以上（赤色の点線で示す）の増殖反応を、陽性とみなした。Ｂ．ｉＴｖ１、ハーセプチン（登録商標）及びビデュリオン（登録商標）に対する健康なドナーＴ細胞の応答を示す箱ひげ図。図は経時的に得られたＣＤ４＋Ｔ細胞の最大増殖を示す。バーは１０～９０パーセンタイルを表す。Dunnの事後検定ペア比較を用いた一元配置反復測定ＡＮＯＶＡ（フリードマン検定）を統計解析のために示す。＊＊p<0.01。 Ａ．５０人の健康なドナーのＴ細胞増殖応答。バルク培養物のＰＢＭＣを採取し、ｉＴｖ１、ハーセプチン（登録商標）、ビデュリオン（登録商標）及びＫＬＨとのインキュベーション後、５日、６日、７日及び８日目に、増殖について評価した。対応のない２標本スチューデントｔ検定を用いて有意（p<0.05）であったＳＩが１．９０以上（赤色の点線で示す）の増殖反応を、陽性とみなした。Ｂ．ｉＴｖ１、ハーセプチン（登録商標）及びビデュリオン（登録商標）に対する健康なドナーＴ細胞の応答を示す箱ひげ図。図は経時的に得られたＣＤ４＋Ｔ細胞の最大増殖を示す。バーは１０～９０パーセンタイルを表す。Dunnの事後検定ペア比較を用いた一元配置反復測定ＡＮＯＶＡ（フリードマン検定）を統計解析のために示す。＊＊p<0.01、＊＊＊＊p<0.0001。 １日、８日及び１５日目に、遺伝子銃を用いて、ＮＰ、ＮＰ Ｆｃ又はＮＰ ＦｃｉＶ１で免疫したマウスの血清を、２１日目に、Ｎタンパク質特異的抗体応答についてＥＬＩＳＡアッセイで分析した。 pVAXDCSN16；ＳＮ１６の配列 発現ベクターpVAXDC内のスパイク及び核タンパク質全長鎖のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。いずれの鎖もヒトＩｇＨリーダーを含む。スパイク鎖は、Kent変異株／B.1.1.7系統（UK-VOC 202012/01）のＮ５０１Ｙ変異を有するアミノ酸３１９－５４１をコードする。核タンパク質鎖は、変異株のＤ３Ｌ及びＳ２３５Ｆ変異を有し、ヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ｉＶ１とインフレームで融合したアミノ酸２－４１９をコードし、マウスＩｇＧ３の２３個のアミノ酸置換を太字で示す。停止コドンは星印で示す。Kent変異株／B.1.1.7系統（UK-VOC 202012/01）の変異を太字で示し、灰色で強調した。２つの鎖の導入に利用するＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ制限部位を太字で示す。 pVAXDCSN17；ＳＮ１７の配列 発現ベクターpVAXDC内のスパイク及び核タンパク質全長鎖のヌクレオチド及びアミノ酸の配列。いずれの鎖もヒトＩｇＨリーダーを含む。スパイク鎖は、南アフリカ変異株VOC 501Y.V2/B1.351のＫ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ及びＮ５０１Ｙ変異を有するアミノ酸３１９－５４１をコードする。核タンパク質鎖は、変異株のＴ２０５Ｉ変異を有し、ヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ｉＶ１とインフレームで融合したアミノ酸２－４１９をコードし、マウスＩｇＧ３の２３個のアミノ酸置換を太字で示す。停止コドンは星印で示す。南アフリカ変異株VOC 501Y.V2/B1.351の変異を太字で示し、灰色で強調した。２つの鎖の導入に利用するＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｓｔ制限部位を太字で示す。 １日、８日及び１５日目に、遺伝子銃を用いて、Balb/cマウスを、ＳＮ１５（ＲＢＤ単量体及び改変Ｆｃ（ＦｃｉＶ１）と結合したＮ）で免疫した。２１日目に、Ａ系統（武漢）、B.1.351及びB.1.1.7のＳ１タンパク質変異株に対する抗体の反応性について、血清をＥＬＩＳＡで逆数血清希釈により分析した。ＥＣ５０の値を示す。 １日、８日及び１５日目に、遺伝子銃を用いて、Balb/cマウスを、ＳＮ１５（ＲＢＤ単量体及び改変Ｆｃ（ＦｃｉＶ１）と結合したＮ）、ＳＮ１６（ＲＢＤ単量体及び改変Ｆｃ（ＦｃｉＶ１）－B.1.1.7変異株と結合したＮ）、ＳＮ１７（ＲＢＤ単量体及び改変Ｆｃ（ＦｃｉＶ１）－B.1.351変異株と結合したＮ）又は全ＳのＤＮＡで免疫した。ＳＮ１６及びＳＮ１７で免疫したマウス（Ａ）又はＳＮ１５、ＳＮ１７及び全ＳのＤＮＡで免疫したマウス（Ｂ）の血清を、２１日目に、Ａ系統（武漢）、B.1.351及びB.1.1.7のＳ１タンパク質変異株に対する抗体の反応性について、ＥＬＩＳＡで逆数血清希釈により分析した。ＥＣ５０の値を示す。Ｃ．ＳＮ１５、ＳＮ１７、全ＳのＤＮＡ、ナイーブなマウス及び対象であるNIBSC 20/136の血清を、ＭＳＤ技術を使用して、1/100の希釈で、変異株ＲＢＤタンパク質(i)及びＳ１タンパク質(ii)のＡＣＥ２結合の阻害について評価した。ＢＳＡ－ＰＢＳを陰性対照として使用した。 １日、８日及び１５日目に、BALB/cマウスを、ＳＮ１５又はＳＮ１７のＤＮＡ構築物で免疫し、２１日目に採取した血清を、Ａ系統若しくはB.1.351偽ウイルスに対する偽ウイルス中和アッセイ（Ａ）、又はＡ系統ウイルスに対する生ウイルス中和アッセイ（Ｂ）で分析した。データはさまざまな血清における値で、複数の実験からのものである。 １日、８日及び１５日目に、BALB/cマウスを、ＳＮ１５又はＳＮ１７のＤＮＡ構築物で免疫し、２１日目に脾細胞を採取し、ＲＢＤ又はＮペプチドのプールに対しＩＦＮγELISpotアッセイによってＴ細胞応答について分析した。記号は個々のマウスの平均の応答を表し、線はマウス間の平均値を表す。データは複数の独立した実験からのものである。 １日目及び２９日目に、Balb/cマウスを、ＳＮ１５（ＲＢＤ単量体及び改変Ｆｃ（ＦｃｉＶ１）と結合したＮ）又はＳＮ１７（ＲＢＤ単量体及び改変Ｆｃ（ＦｃｉＶ１）－B.1.351変異株と結合したＮ）のいずれかで免疫し、続いて８５日目にＳＮ１７のＤＮＡでブーストした。免疫したマウスの血清を、４２目、８２目又は９８日目に、Ａ系統（武漢）及びB.1.351のＳ１タンパク質変異体（Ａ）、又はB.1.351及びB.1.617.2のＲＢＤタンパク質変異体（Ｂ）に対する抗体の反応性について、ＥＬＩＳＡで逆数血清希釈により分析した。ＥＣ５０の値を示す。 ＳＮ１５プラスミドベクターの全配列（配列番号２３） ＳＮ１７プラスミドベクターの全配列（配列番号２４） ＳＮ１７ドギーボーン（ｄｂＤＮＡ）ベクターの全配列（配列番号２５） ｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓプラスミドベクターの全配列（配列番号２０） ｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓ全ドギーボーン（ｄｂＤＮＡ）ベクターの全配列（配列番号２１） ｉＳＣＩＢ２プラスミドベクターの全配列（配列番号２２）
以下、実施例及び図面を参照して本発明を更に説明する。エレクトロポレーションにより、ＶＮＡｂ及び強力なＴ細胞の両者を誘導するように操作された新規なｐＤＮＡワクチンで免疫した健康なボランティアからの今後のデータ収集は、実施例の最終結果の直接的な成り行きとして通知されている。
方法
材料、動物、細胞及び抗体
ペプチド及びタンパク質
Covid19ペプチドを、HLA-A＊0201、HLA-DR＊0101及びHLA-DP＊0401のＩＥＤＢデータベース（http://www.iedb.org/）による結合予測及びHLA-A＊0201のSYFPEITHI（http://www.syfpeithi.de）による結合予測に基づいて選択した。がん抗原ペプチドは、公表された配列、ＩＥＤＢデータベース（http://www.iedb.org/）による結合予測及びSYFPEITHI（http://www.syfpeithi.de）による結合予測に基づいて選択した。ペプチド（表２）を９０％を超える純度で合成し（Genscript）、単回使用バイアルに分注し、－８０℃で凍結乾燥して保存し、次いで、使用する日にＰＢＳで再構成した。組換えＮ、Ｓ１及びＨｉｓタグＲＢＤタンパク質は、Genescript（USA）から購入した。ＮペプチドプールはMiltenyi Biotec（UK）から購入し、ＲＢＤペプチドプールはJPT Peptide Technologie（Germany）から購入した。
プラスミド
全てのCOVID-19プラスミドpVAXDCSN1-SN14（ＳＮ１～１５）のバックボーンは、ヒトで使用するＦＤＡ規制に準拠したベクターpVAX1（Invitrogen）のバックボーンに由来する。挿入のための全てのヌクレオチドセクションは、ヒトにおける発現のために最適化されたコドンであった。ＳＮ１～ＳＮ４はマウスＩｇＫリーダーを含み、ＳＮ５～１５はヒトＩｇＨリーダーを含む。それぞれ、５’末端及び３’末端に挿入されたＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位で、リーダーと、Ｓ糖タンパク質のＲＢＤドメイン３１９－５４１若しくは３３０－５２５のアミノ酸（アクセッション番号YP_009724390）の単独、ｈｕＩｇＧ１定常ドメイン（アクセッション番号P01857）のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン若しくは改変したヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ｉＶ１（２３個のアミノ酸がマウスＩｇＧ３残基で置換されている）のいずれかとインフレームで融合したもの、又は、グリシンセリンリンカーを介してフィブリチン三量体折畳み若しくはジスルフィド架橋モチーフと結合したものをコードするコドン最適化ヌクレオチドのセクションを合成した。１回目のクローニングで、これらのセクションを第１の発現カセットの軽鎖κ鎖を直接置換し、図１に示すpVAXDCIB68構築物のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入して、中間プラスミドを生成した。
２回目のクローニングで、リーダーと、全長核タンパク質アミノ酸２－４１９の単独、又はｈｕＩｇＧ１定常ドメインのヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン若しくは改変したヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ｉＶ１とインフレームで融合させたものをコードするコドン最適化ヌクレオチドのセクションを合成し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩに隣接させた。重鎖を１回目に得た中間ベクターからＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩを利用して切り出し、図１に示す第２の発現カセット中のＮセクションで、適切なＳセクションの傍らに置き換えた。
ImmunoBody（登録商標）ベクターpVAXDCIB68（ＳＣＩＢ１）、pVAXDCIB238（ＳＣＩＢ１ｐｌｕｓ）及びpVAXDCIB178（ＳＣＩＢ２）を拡張するために、ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインをコードする抗体重鎖のｈｕＩｇＧ１定常領域を、特定の部位で２３残基を置換したマウスＩｇＧ３をコードする同じセクションで置換した。これは、ＡｆｅＩ及びＥｃｏＲＩに隣接するＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ｉＶ１をコードするヌクレオチドのセクションの合成によって達成した。ｈｕＩｇＧ１定常ドメインをベクターから切り出し、これらの制限部位を利用して、セクションを重鎖可変領域と共にフレーム内に挿入した。
ＳＮ１－１５、pVAXDCIB68 iV1、pVAXDCIB238 iV1及びpVAXDCIB178 iV1のpVAXDCベクターの各発現カセット内の２つの鎖の配列をジデオキシ法で確認した[185]。プラスミドＳＮ１－ＳＮ１５並びに拡張ImmunoBody（登録商標）ベクターpVAXDCIB68 iV1、pVAXDCIB238 iV1及びpVAXDCIB178 iV1内にコードする２つの鎖のＤＮＡ及び翻訳されたタンパク質の配列を、それぞれ、図２～１５、２７並びに２９、３１及び３３に示す。
使用したSARS-CoV2アミノ酸１－１２７３（アクセッション番号YP_009724390 /QHD43416.1）由来の全長スパイクをコードするプラスミドpCMV3-2019-nCoV-スパイク(S1+S2)-longは、Sino Biological（カタログ番号VG40589-UT）から入手した。これは、高レベル発現哺乳動物ヒト増強サイトメガロウイルス前初期（ＣＭＶ）プロモーターの下で哺乳動物発現ベクターpCMV3-タグなしが、ＫｐｎＩ／ＸｂａＩ部位に挿入された哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現のためにコドン最適化ｃＤＮＡを有していた。
pVAXDCSN16-17（ＳＮ１６～１７）を構築するために、連続する２回のクローニングが必要であった。ヒトＩｇＨリーダー（ＭＤＷＩＷＲＩＬＦＬＶＧＡＡＴＧＡＨＳ）を含むスパイク鎖と、それぞれ、５’末端及び３’末端でＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位に隣接する、ＳＮ１６ではKent変異株／B.1.1.7系統（UK-VOC 202012/01）のＮ５０１Ｙ変異を有し、ＳＮ１７では南アフリカ変異株／系統VOC 501Y.V2/B1.351のＫ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ及びＮ５０１Ｙ変異を有するスパイク糖タンパク質のＲＢＤドメイン３１９－５４１のアミノ酸（アクセッション番号YP_009724390）をコードする２つのコドン最適化ヌクレオチドのセクションを合成した。１回目のクローニングで、これらのセクションを、第１の発現カセットのpVAXDCIB68（ＳＣＩＢ１）軽鎖κ鎖を直接置換し、ＳＣＩＢ１プラスミドのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入して、２つのプラスミドを生成した。２回目のクローニングで、ヒトＩｇＨリーダーを有する核タンパク質鎖、ＳＮ１６ではKent変異株／B.1.1.7系統（UK-VOC 202012/01）のＤ３Ｌ及びＳ２３５Ｆ変異を有し、ＳＮ１７では南アフリカ変異株／系統VOC 501Y.V2/B1.351のＴ２０５Ｉ変異を有する全長核タンパク質アミノ酸２－４１９（アクセッション番号YP_009724397）、改良した改変ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ｉＶ１ヒトＩｇＧ１定常ドメイン（２３個のアミノ酸がマウスＩｇＧ３残基で置換されている）とインフレームで融合させたものをコードする２つのコドン最適化ヌクレオチドのセクションを合成し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩに隣接させた。ＳＣＩＢ１のｈｕＩｇＧ１重鎖を、１回目に得た中間プラスミドからＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩを利用して切り出し、第２の発現カセット中の核タンパク質セクションで、ＳＮ１６及びＳＮ１７に至る適切なスパイクセクションの傍らに置き換えた。
ＳＮ１６及びＳＮ１７のpVAXDCベクターの各発現カセット内の２つの鎖の配列をジデオキシ法で確認した。ＳＮ１６及びＳＮ１７内にコードする２つの鎖のＤＮＡ及び翻訳されたタンパク質の配列を、図４７及び４８に示す。
動物及び細胞株
８～１６週齢のC57Bl/6J、Balb/c（Charles River）、HLA-DR4マウス（Model # 4149, Taconic）、HHDII/HLA-DP4マウス（EM:02221, European Mouse Mutant Archive）、HHDIIマウス（Pasteur Institute）又はHHDII/HLA-DR1マウス（Pasteur Institute）を用いた。全ての作業は、内務省が承認したプロジェクトライセンスの倫理的な承認を得て行った。全ての実験で、マウスは無作為に異なる群に無作為に割り付け、研究者には盲検化されなかった。
関連するＭＨＣＩ及びＩＩアレルを発現するＢ１６メラノーマを含む細胞（[140, 183, 186, 187]に記載）を、１０％ＦＣＳ及びプラスミドを維持するための適切な抗生物質を含むL-グルタミン（２ｍｍｏｌ／ｌ）を含むＲＰＭＩ培地１６４０中で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔヒト胎児腎細胞（ATCC CRL1573）を、以前に説明[188]したように増殖させた。マウス脾細胞を、１０％のＦＢＳ（Sigma）、２ｍＭのグルタミン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１０－５Ｍの2-メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ１６４０中で培養した。利用した細胞株は、供給者（STR profiling）がマイコプラズマフリーであることを認証し、１０継代以内に使用した。
一過性のＨＥＫ２９３トランスフェクション
ｐＤＮＡ構築物からの分泌量を、ExpiFectamine（登録商標）293トランスフェクションキット（Gibco, LifeTechnologies）を用いるExpi293F（登録商標）細胞の一過性トランスフェクション後に評価した。簡単に述べると、懸濁液中のＨＥＫ２９３細胞（１００ｍｌ、２×１０６／ｍｌ）に１００μｇのＤＮＡをトランスフェクトし、その後６日目に順化培地を回収した。上清を０．２２μｍのボトルトップフィルター（Merck Millipore）で濾過し、アジ化ナトリウムを最終濃度０．２ｗ／ｖ％まで加えた。細胞のペレットを、製造業者の指示に従い、適切な量のＲＩＰＡ緩衝液（Sigma Aldrich, R0278）に溶解し、分析の前に遠心分離で清澄化した。
免疫プロトコル
別途説明しない限り、１日、８日及び１５日目、又は、１日、１５日及び２９日目に、遺伝子銃を用い、１μｇのＤＮＡをマウスの皮内に免疫し、それぞれ、２１日目又は３５日目に応答を分析した。腫瘍治療試験では、１日目に、マウスの皮下に２．５×１０４個のB16F1又はB16 HHDII Nyeso1腫瘍細胞を皮下移植し、４日、１１日及び１８日目にワクチンを接種した。腫瘍を３～４日間隔で測定した。マウスの腫瘍成長は、腫瘍の大きさ（長さ及び幅）をキャリパーで測定して分析した。体積は次の式：
体積＝（π／６）×（幅×長さ２）
で推定した。
偽ウイルス中和アッセイ
SARS-CoV-2のスパイクタンパク質プラスミドを調製してクローニングし、[189]でＣ型肝炎ウイルスについて記載の方法に従って偽粒子を作製した。プラスミドの非存在下で調製した偽粒子を陰性対照として使用した。SARS-CoV-2偽粒子の感染性及び中和試験のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を白色９６ウェル組織培養プレート（Corning）に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、SARS-CoV-2偽粒子を適切な量の抗体と混合し、次いで、細胞を加える前に３７℃で１時間インキュベートした。７２時間後、３７℃で、各ウェルに１００μｌのBright-Glo（Promega）を添加し２分間インキュベートするか、又は細胞を細胞溶解緩衝液（カタログ番号E1500；Promega）で溶解し、１５分間静置した。次いで、ルシフェラーゼ活性を、SoftMax Pro6ソフトウェア（Bright-Glo protocol）を備えたSpectraMax M3マイクロプレートリーダー（Molecular Devices）を用いて相対的光単位（ＲＬＵ）で測定するか、又はウェルに５０μｌのルシフェラーゼ基質を個々に注入し、MARSソフトウェアを備えたFLUOstar Omegaプレートリーダー（BMG Labtech）を用いて読み取った。SARS-CoV-2偽粒子による感染は、抗SARS-CoV-2 ｍＡｂ、試験動物の血清、免疫前の動物の血清及び非特異的ＩｇＧの存在下で、同じ希釈で測定した。各試料について、二重又は三重で試験した。中和活性を、５０％阻害希釈（ＩＤ５０）値として報告し、曲線フィッティングを補助するための限定として下限及び上限（０％及び１００％阻害）を用い、非線形回帰（GraphPad Prism version 7）によって計算した。
生ウイルス中和アッセイ
感染性のSARS-CoV-2ウイルス（CVR-GLA-1）は、National Centre for AIDS Reagents, NIBSC, UKから入手した。生ウイルス中和アッセイは、７９０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌのSARS-CoV-2ウイルスを各血清希釈液に添加したことを除いて、以前に説明した方法[190]で行った。さらに、一部の実験では、血清を1:81,920まで希釈した。
ＡＣＥ２結合阻害活性
Meso Scale Diagnostics LLCのV-PLEX COVID-19 ＡＣＥ２中和キットを使用して、ワクチン誘発抗体のＡＣＥ２とＲＢＤ又は全Ｓタンパク質との結合を阻害する能力を調査した。Ｓ１のＲＢＤ並びにＡ系統（最初に武漢で同定）及び変異（B1.1.7、B1.351、P.1）SARS-CoV-2株の全Ｓタンパク質を含むV-plex SARS-CoV-2 Panel 7マルチスポットプレートをブロックした後、製造業者の指示に従い、1/100希釈の血清及びSulfoタグを有するヒトＡＣＥ２タンパク質とインキュベーションした。結果を、血清でインキュベートした試料と希釈剤を含むウェル（阻害なし）との比較によるＡＣＥ２結合の阻害率として表す。
ＲＢＤ結合阻害活性（代わりの中和アッセイ）
Genescript（USA）で購入したキットを用い、ＲＢＤ結合阻害を評価した。簡潔に説明すると、免疫したマウスのさまざまな希釈度の血清を、組換えＨＲＰタグ付きＲＢＤタンパク質と混合した。混合物をＡＣＥ２受容体で事前に被覆したプレートに加え、ＴＭＢ基質を使用してＲＢＤ結合を検出した。ＲＢＤ結合阻害は、陰性対照を０％とする比色シグナルの損失として計算した
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
ELISpotアッセイは、マウスＩＦＮγ捕捉及び検出試薬を用い、製造業者（Mabtech AB, Nacka Strand, Sweden）の指示に従って行った。簡潔に説明すると、９６ウェルImmobilin-Pプレートのウェルを抗ＩＦＮγ抗体でコーティングし、４つのウェルを一組として各ウェルに５×１０５個の脾細胞を播種し、別途説明しない限り、最終濃度が１０μｇ／ｍｌの合成ペプチド、１μｇ／ｍｌの組換えタンパク質又は１μｇ／ｍｌのペプチドのプールを添加した。プレートを、５％ＣＯ２の雰囲気中、３７℃で４０時間インキュベートした。インキュベーション後、捕捉されたＩＦＮγをビオチン化抗ＩＦＮγ抗体で検出し、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ及び発色基質で発色させた。スポットを分析し、自動プレートリーダー（Cellular Technologies Ltd Europe GmbH, Aalen, Germany）で計数した。機能的アビディティーは、ペプチドの濃度に対するエフェクターの機能のグラフ作成し、最大エフェクター機能の５０％における濃度として計算した。
抗Ｓ抗体及び抗Ｎ抗体のＥＬＩＳＡ
市販のＮ、Ｓ１及びＲＢＤタンパク質（Genescript, USA）をＰＢＳで希釈し、４℃で一晩、タンパク質高結合９６ウェルプレートに０．５μｇ／ウェルでコーティングした。プレートを洗浄し、室温で少なくとも１時間、２００μｌ／ウェルのカゼインブロッカー（Thermo Scientific Ref: 37528）でブロックした後、ＰＢＳ（２％ＢＳＡ）で希釈（種々の希釈物）したマウス血清を室温で１時間添加した。プレートを洗浄し、ＰＢＳ（２％ＢＳＡ）中の抗マウスＩｇ ＨＲＰ抗体（２工程ＥＬＩＳＡ）、又は抗マウスＦｃ－ビオチン次いでＨＲＰ標識ストレプトアビジン（３工程ＥＬＩＳＡ）と共に室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、１ＮのＨ２ＳＯ４で反応を停止した。対照（Ｎ＋ｖｅ及びＳ１＋ｖｅ）として、市販のマウスＩｇＧ Ｎ及びＳ１特異的抗体（Sino Biological）を使用した。ナイーブマウス由来の血清を陰性対照とした。吸光度を波長４５０ｎｍで読み取った。
分泌されたＲＢＤ及びＮタンパク質を検出するサンドイッチＥＬＩＳＡ
いずれの場合も市販のキット／抗体のペアを使用した。ＮＰは、BiossのSARS-CoV-2 ＮＰ ＥＬＩＳＡキットを用いて供給者の指示に従い、順化培地及び（トランスフェクションの６日後の）細胞溶解物中で検出した。定量は、キット中のＮＰ標準を用いた標準曲線によった。SARS-CoV-2のＳタンパク質ＲＢＤ抗体のペア（Epigentek A73682）からのＨＲＰ標識検出抗体と、SARS-CoV-2のスパイク中和マウスｍＡｂ（Sino Biological, 40591-MM43）との組合せの捕捉抗体からなるサンドイッチＥＬＩＳＡで、（分泌された及び細胞溶解物中の）ＲＢＤを検出した。捕捉抗体は２００ｎｇ／ウェルでコーティングし；検出抗体は1:1000希釈で使用した。
Ｆｃ－融合構築物のＣＤ６４との結合のＳＰＲ分析
解析はBiaT200で行った。ＨｉｓタグＣＤ６４（Acrobiosystems, FCA-H52H1）を、抗Ｈｉｓ抗体が結合したＣＭ５チップに捕獲した。チップは４つのフローセルを有し、３つは密度を増やしたＣＤ６４を捕捉するために使用し、１つは参照セルであった。Ｆｃ構築物を濃度５０．０ｎＭ～０．７８ｎＭで滴定し、流速３０μｌ／’で、会合と解離を、それぞれ、２１０秒と７００秒間モニターした。データを１：１一価結合モデルに適合させ、速度論的パラメーターを推定した。
改変Ｆｃ（ｉＦｃｖ１）構築物の免疫原性分析
分析は、ＨＴＡ基準に従いAbzena (Cambridge) Ltdが実施した。ＰＢＭＣは、（商業ベンダーからの同意の下で得た）健康なドナーのバフィーコートから単離した。細胞を、リンパ球分離培地（Corning, Amsterdam, The Netherlands）を用いる密度遠心分離で分離し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ８＋RosetteSep（登録商標）（StemCell Technologies Inc, London, UK）を用いて枯渇させた。ドナーは、HISTO Spot SSO ＨＬＡタイピング（MC Diagnostics, St. Asaph, UK）により、HLA-DR及びHLA-DQハプロタイプを４桁の解像度まで識別した。ネオ抗原であるＫＬＨ（Invitrogen, Paisley, UK）に対するＴ細胞応答も測定した。次いで、ＰＢＭＣを凍結し、必要となるまで窒素中で保存した。ＨＬＡアレルの７７％をカバーする最大５０人のドナーのコホートを選択した。各ドナーのＰＢＭＣを解凍し、計数し、トリパンブルー（Merck Life Science UK Ltd, Gillingham, UK）色素排除によりて生存率を評価した。各ドナーについて、１ｍｌの増殖細胞ストックを２４ウェルプレートの適切なウェルに添加して、バルク培養物を樹立した。１ｍｌの試料（ｉＴｖ１）をＰＢＭＣに添加して、最終試料濃度０．３μＭとした。各ドナーについて、再現性対照ウェル（０．３μＭのＫＬＨとインキュベートした細胞）、臨床ベンチマーク対照ウェル（５μＭのビデュリオン（登録商標）とインキュベートした細胞）、低免疫原性対照（０．３μＭのハーセプチン（登録商標）とインキュベートした細胞）及び培地のみのウェルも含めた。培養物を５％ＣＯ２と共に３７℃で合計８日間インキュベートした。５日、６日、７日及び８日目に、各ウェル中の細胞を、電子ピペットを用いて５回混合して穏やかに再懸濁し、３×１００μｌアリコートを丸底９６ウェルプレートの各ウェルに移した。培養物を、１００μｌのAIM-V（登録商標）培地中の０．７５μＣｉ［３Ｈ］－チミジン（Perkin Elmer（登録商標）、Beaconsfield, UK）でパルスし、更に１８時間インキュベートした後、TomTec Mach III細胞採取器を用いてフィルターマット（Perkin Elmer（登録商標）, Beaconsfield, UK）上に採取した。各ウェルのＣＰＭは、1450 Microbeta Wallac Trilux Liquid Scintillation Counter（Perkin Elmer（登録商標）, Beaconsfield, UK）でのMeltilex（登録商標）（Perkin Elmer（登録商標）,Beaconsfield, UK）シンチレーション計数により、パラルクス（paralux）、低バックグラウンド計数で測定した。１．９以上のＳＩの経験的閾値が以前に確立されており、この閾値を超える応答を誘導する試料を陽性とみなした。
統計解析
核酸プラスミドに対する応答の統計解析は、GraphPad Prismソフトウェアバージョン７を用いて行った。ELISpotの結果の比較分析は、適宜、対応のある若しくは対応のないＡＮＯＶＡ又はスチューデントｔ検定を適用し、ｐ値とともに計算して行った。アビディティー曲線／生存率の比較は、GraphPad Prismソフトウェアを用いたＦ検定、又はログランク検定を適用して評価した。p<0.05の値は統計的に有意であるとみなした。Dunnの多重比較検定を用いたKruskal-Wallis分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、グループ間の中和力価（ＩＤ５０値）の統計解析及び比較を行った。データ解析は盲検化しなかった。上述したように、０．０５未満のｐ値で差が統計的に有意であるとみなし、GraphPad Prism 8ソフトウェアを用いて統計解析を行った。
前臨床試験
実施例１ ｐＤＮＡによる一過性ＨＥＫ２９３トランスフェクションからのＲＢＤタンパク質及びＮタンパク質の分泌
ｐＤＮＡ構築物のトランスフェクション効率を評価するために、HEK293細胞を、Thermofisher社のExpi293系を用いてｐＤＮＡで一時的にトランスフェクトし、培地へのタンパク質分泌を、ＲＢＤタンパク質及び核タンパク質についてサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて評価した（図１６）。この分析は、ＲＢＤタンパク質では、ＲＢＤ－Ｆｃ融合体を含む構築物（ＳＮ３及びＳＮ７）からの分泌が最も多く、未改変のＲＢＤ（ＳＮ４、ＳＮ５、ＳＮ８）がすぐ後に続くことを示した。三量体ＲＢＤ（ＳＮ２、ＳＮ６、ＳＮ９、ＳＮ１０、ＳＮ１１）からの分泌は最も少なかった。核タンパク質分泌では、未改変のＮＰ（ＳＮ３、ＳＮ４、ＳＮ７、ＳＮ８）を含む構築物で最も多かった。後者の標的は、中和抗体の誘導と比較して、Ｔ細胞の応答との関連性が高いので、Ｔ細胞応答が高くなる（Ｎ Ｆｃ融合タンパク質で見られるような）少ない分泌が望ましい。
実施例２ 遺伝子銃を用いてHHDIIマウスに送達したｐＤＮＡによるＲＢＤ及びＮタンパク質（ＮＰ）に対するＴ細胞応答
遺伝子銃を用いて、HHDIIマウスにｐＤＮＡを毎週投与し、３回免疫した後、pVAXDC スパイクＲＢＤ＋ＮＰ（ＳＮ８）、pVAXDC スパイクＲＢＤ ｖ２三量体＋ＮＰ ＦＣ（ＳＮ９）、pVAXDC スパイクＲＢＤ ｖ３三量体＋ＮＰ ＦＣ（ＳＮ１０）及びpVAXDC スパイクＲＢＤ ｖ２三量体＋ＮＰ ＦＣｉＶ１（ＳＮ１１）に対するＴ細胞の応答を測定した。全てのＲＢＤ構築物に対するＩＦＮγELISpot応答の頻度を、予測された又は以前に特定されたＴ細胞エピトープ及びＳ１タンパク質全体、ＲＢＤ組換えタンパク質及びＲＢＤペプチドのプールを用いて測定した。４つの構築物は全て、Ｓ１タンパク質、並びに、ＲＢＤペプチドのプール及びＲＢＤペプチドのプールに応答するＲＢＤａａ４１７－４２５ペプチドに対して強力に応答し、ＲＢＤａａ４１７－４２５ペプチドは全ての構築物で有意であった（図１７Ａ）。Ｎ抗原に対する応答の頻度を、オーバーラッピングペプチドのプール、組換えＮタンパク質及び特定されたＴ細胞エピトープを用いて測定した。全ての構築物は、組換えＮタンパク質に対して強力に応答したが、Ｎａａ１３８－１４７ペプチドに対しては構築物ＳＮ１０及びＳＮ１１のみが有意であった（図１７Ａ）。
別の実験では、遺伝子銃を用いて、HHDIIマウスにｐＤＮＡを毎週投与し、３回免疫した後、pVAXDC スパイクＲＢＤ＋ＮＰ（ＳＮ８）、pVAXDC スパイクＲＢＤ ｖ３三量体＋ＮＰ ＦＣ（ＳＮ１０）及びpVAXDC スパイクＲＢＤ ｖ２三量体＋ＮＰ ＦＣｉＶ１（ＳＮ１１）に対する応答を比較した。3つの構築物は全て、Ｓ１タンパク質及びＲＢＤペプチドのプールに対して有意な応答を示したが、ＳＮ１１で免疫したマウスのみが、ＲＢＤａａ４１７－４２５ペプチドに対して有意な応答を示した（図１７Ｂ）。Ｎタンパク質に特異的な応答については、全ての構築物は、Ｎタンパク質に対して強力に応答するが、ＳＮ１１で免疫したマウスのみが、Ｎ１３８－１４６ペプチドに対して有意な応答を示す（図１７Ｂ）。
実施例３ 遺伝子銃を用いてHHDII/DR1マウスに送達したｐＤＮＡによるＲＢＤ及びＮタンパク質（ＮＰ）に対するＴ細胞応答
遺伝子銃を用いて、HHDII/DR1マウスにｐＤＮＡを毎週投与し、３回免疫した後、pVAXDC スパイクＲＢＤ＋ＮＰ（ＳＮ８）、pVAXDC スパイクＲＢＤ ２三量体＋ＮＰ ＦＣ（ＳＮ９）、pVAXDC スパイクＲＢＤ ３三量体＋ＮＰ ＦＣ（ＳＮ１０）及びpVAXDC スパイクＲＢＤ ２三量体＋ＮＰ ＦＣｉＶ１（ＳＮ１１）に対するＴ細胞の応答を測定した。全てのＲＢＤ構築物に対するＩＦＮγELISpot応答の頻度を、特定されたＴ細胞エピトープ（ＲＢＤａａ４１７－４２５）、全Ｓ１タンパク質、全ＲＢＤタンパク質及びＲＢＤペプチドのプールを用いて測定した。構築物ＳＮ８、ＳＮ９及びＳＮ１０は、全Ｓ１タンパク質に対してのみ有意に応答し、構築物ＳＮ１１は、Ｓ１及びＲＢＤタンパク質、ＲＢＤペプチドのプール並びにＲＢＤａａ４１７－４２５ペプチドに対して応答した（図１８）。Ｎ抗原に対する応答の頻度を、オーバーラッピングペプチドのプール、Ｎタンパク質及び特定されたＴ細胞エピトープ（Ｎａａ１３８－１４７）を用いて測定した。構築物ＳＮ１０及びＳＮ１１は、全Ｎタンパク質に対して有意に応答したが、構築物ＳＮ１１のみが、Ｎａａ１３８－１４７ペプチドに対して有意に応答した（図18）。
実施例４ ＮＰ ＦＣｉＶ１を含む構築物はＮタンパク質に対し高い頻度で応答する
Ｎ抗原（ＳＮ８）、Ｆｃと結合したＮ（ＳＮ９）又は改変ｉＶ１Ｆｃと結合したＮ（ＳＮ１１）を含む構築物によるＴ細胞応答を比較するために、データを組み合わせて、バックグラウンドの対照に対して正規化した。構築物ＳＮ８又はＳＮ９と比較して、構築物ＳＮ１１はＮタンパク質及びＮ１３８－１４７ペプチドの両者に対する応答が有意に増加した。（それぞれ、＊＊p<0.01、＊p<0.05）（図１９Ａ及びＢ）。興味深いことに、構築物ＳＮ１１は、Ｓ１タンパク質に対する応答が、構築物ＳＮ８と比較して高頻度で（＊p<0.05）、かつ、ＲＢＤタンパク質に対する応答が、ＳＮ８及びＳＮ９と比較して高頻度であった（＊＊＊p<0.001）（図１９Ｃ及びＤ）。
実施例５ 遺伝子銃を用いてHHDII/DP4Iマウスに送達したｐＤＮＡによるＲＢＤ及びＮタンパク質に対するＴ細胞応答
遺伝子銃を用いて、HHDII/DP4マウスにｐＤＮＡを隔週投与し、３回免疫した後、pVAXDC スパイクＲＢＤ 三量体＋ＮＰ ＦＣ（ＳＮ２）、pVAXDC スパイクＲＢＤ ＦＣ＋ＮＰ（ＳＮ３）及びpVAXDC スパイクＲＢＤ＋ＮＰ（ＳＮ４）に対するＴ細胞の応答を測定した。全てのＲＢＤ構築物に対するＩＦＮγELISpot応答の頻度を、予測され、特定されたＴ細胞エピトープ、全Ｓ１タンパク質及びＲＢＤタンパク質を用いて測定した。有意な応答が、構築物ＳＮ２で、ＲＢＤａａ４１７－４２５ペプチド、ＲＢＤタンパク質及びＲＢＤペプチドのプールに対して、並びに、構築物ＳＮ４で、Ｓ１及びＲＢＤタンパク質に対して見られた（図２０）。Ｎ構築物に対するELISpot応答の頻度を、Ｎタンパク質及び予測され特定されたＴ細胞エピトープを用いて測定した。構築物ＳＮ２及びＳＮ４は、Ｎタンパク質に対して強力に応答した（＊＊＊p<0.001）が、ＳＮ３では有意に達しなかった。（図２０）。
実施例６ 遺伝子銃を用いて送達したｐＤＮＡによるＳ１タンパク質に対するＴ細胞応答のアビディティーは、ＲＢＤ Ｆｃ及びＲＢＤ三量体構築物よりも優れている
遺伝子銃を用いて、HHDII/DP4マウスにｐＤＮＡを隔週投与し、３回免疫した後、pVAXDC スパイクＲＢＤ 三量体＋ＮＰ ＦＣ（ＳＮ２）、pVAXDC スパイクＲＢＤ ＦＣ＋ＮＰ（ＳＮ３）及びpVAXDC スパイクＲＢＤ＋ＮＰ（ＳＮ４）に対するＴ細胞の応答を、Ｓ１タンパク質滴定に対するアビディティーについて評価した。ＳＮ２及びＳＮ３で免疫したマウスの応答は、ＳＮ４で免疫したマウスと比較して、アビディティーの応答が有意に高い（p<0.0001）（図２１）。アビディティーは、最大応答の５０％を誘発する濃度として正規化したデータを用いて測定した。これは、ＳＮ２では０．０００１μｇ／ｍｌ、ＳＮ３では０．０００００８μｇ／ｍｌ、ＳＮ４では０．１７μｇ／ｍｌに相当する。
実施例７ ｐＤＮＡによる免疫は、ＲＢＤ４１７－４２５エピトープに対する高アビディティーのペプチド特異的応答を生じる
遺伝子銃を用いてHHDIIマウスにｐＤＮＡを毎週投与し、３回免疫した後のpVAXDC スパイクＲＢＤ ｖ２三量体＋ＮＰ ＦＣｉＶ１（ＳＮ１１）に対するＴ細胞の応答を、ペプチド滴定により、ＲＢＤ４１７－４２５ペプチドに対するアビディティーについて評価した。ＳＮ１１で免疫したマウスの応答は、０．０００１μｇ／ｍｌより大きい高いアビディティーを示した（図２２）。
実施例８ 遺伝子銃を用いて送達したｐＤＮＡによるＮ１３８－１４６ペプチドに対するＴ細胞応答の頻度及びアビディティーは、ＮＰ ＦＣｉＶ１構築物よりも優れている
遺伝子銃を用いて、HHDIIマウスにｐＤＮＡを毎週投与し、３回免疫した後、pVAXDC スパイクＲＢＤ ｖ３三量体＋ＮＰ ＦＣ（ＳＮ１０）、pVAXDC スパイクＲＢＤ ｖ２三量体＋ＮＰ ＦＣｉＶ１（ＳＮ１１）に対するＴ細胞の応答を、ペプチド滴定により、Ｎ１３８－１４６ペプチドに対するアビディティーについて評価した。ＳＮ１１で免疫したマウスの応答は、ＳＮ１０で免疫したマウスと比較して、応答の頻度が高く、アビディティーがわずかに強力である（図２３）。ＮＰ ＦＣｉＶ１構築物（ＳＮ１１）は、ＮＰ ＦＣ構築物（ＳＮ１０）と比較して、高い頻度とアビディティーのＴ細胞を誘導したことを示す。
実施例９ 遺伝子銃を用いて送達したｐＤＮＡによるＲＢＤ及びＮタンパク質に対する抗体応答
遺伝子銃を用いて、HHDII/DP4マウスにｐＤＮＡを隔週投与し、３回免疫した後、pVAXDC スパイクＲＢＤ＋ＮＰ ＦＣ（ＳＮ５）、pVAXDC スパイクＲＢＤ 三量体＋ＮＰ ＦＣ（ＳＮ６）、pVAXDC スパイクＲＢＤ ｖ２三量体＋ＮＰ ＦＣ（ＳＮ９）、pVAXDC スパイクＲＢＤ ｖ３三量体＋ＮＰ ＦＣ（ＳＮ１０）、pVAXDC スパイクＲＢＤ ｖ２三量体＋ＮＰ ＦＣｉＶ１（ＳＮ１１）、又はpVAXDC スパイクＲＢＤ 三量体＋ＮＰ ＦＣ（ＳＮ２）、pVAXDC スパイクＲＢＤ ＦＣ＋ＮＰ（ＳＮ３）及びpVAXDC スパイクＲＢＤ＋ＮＰ（ＳＮ４）に対する抗体の応答を測定した。Ｓ１、ＲＢＤ及びＮタンパク質に対するＡｂ力価を、単量体ＲＢＤ構築物、Ｆｃ融合タンパク質として提供される二量体ＲＢＤ、フィブリチン構築物として提供される三量体としてのＲＢＤ構築物及びフィブリチン構築物として提供される三量体としての短いＲＢＤで免疫したマウスの血清で比較した。抗体は、1/100～1/10,000希釈の血清中で評価した。全ての免疫マウスの血清で、Ｎタンパク質に対する強力な応答が、1/10,000希釈であっても観察された（図２４）。Ｓ１及びＲＢＤタンパク質に対する応答は、1/100及び1/1000希釈の血清で見られ、単量体（ＳＮ５）又は三量体（ＳＮ６）としての長いＲＢＤ構築物及び短いＲＢＤ ｖ３三量体（ＳＮ１０）を含む、構築物ＳＮ５、ＳＮ６及びＳＮ１０で最も高かった（図２４Ａ）。Ｓ１及びＮタンパク質に対する同様の抗体応答が、ＳＮ２、ＳＮ３及びＳＮ４で免疫したマウスの血清で検出された（図２４Ｂ）。
遺伝子銃を用いて、HHDIIマウスにｐＤＮＡを毎週投与し、３回免疫した後、pVAXDC スパイクＲＢＤ ＦＣ＋ＮＰ（ＳＮ３）、pVAXDC スパイクＲＢＤ＋ＮＰ（ＳＮ８）、pVAXDC スパイクＲＢＤ ｖ３三量体＋ＮＰ ＦＣ（ＳＮ１０）及びpVAXDC スパイクＲＢＤ ｖ２三量体＋ＮＰ ＦＣｉＶ１（ＳＮ１１）に対する抗体の応答を、ＥＬＩＳＡアッセイで測定した。抗体は、1/100～1/10,000希釈の血清中で評価した。全ての免疫マウスの血清で、Ｎタンパク質に対する強力な応答が、1/10,000希釈であっても観察された。Ｓ１タンパク質に対する応答は1/100及び1/1000希釈の血清で見られ、短いＲＢＤ ｖ３三量体（ＳＮ１０）を含む構築物ＳＮ１０で最も高かったが、全長ＲＢＤ単量体を含む構築物ＳＮ８では1/1000希釈の血清でも検出可能であった。（図２４Ｃ）。
実施例１０ 遺伝子銃を用いて送達したｐＤＮＡは、総抗体測定と同様の力価でウイルス中和抗体応答を誘発する
ウイルス中和抗体は、プレートに結合したＡＣＥ２受容体とＲＢＤの結合の阻害についての代わりの中和アッセイで評価した。それぞれ、長いＲＢＤ単量体、長いＲＢＤ三量体又は短いＲＢＤ ｖ３三量体を含有する、構築物ＳＮ５、ＳＮ６及びＳＮ１０で免疫したマウスの血清は、1/100希釈で５０％を超える阻害を示し、構築物ＳＮ９及びＳＮ１１の力価は低かった（図２５）。血清試料は、偽ウイルス中和アッセイによるウイルス中和についても試験した。ＳＮ２、ＳＮ３及びＳＮ４免疫マウスの血清は、２回の免疫後の２１日目に評価し、ＳＮ５、ＳＮ６、ＳＮ９、ＳＮ１０及びＳＮ１１の血清は、終了時（３５日目）に評価した。このアッセイでは、構築物ＳＮ３、ＳＮ５及びＳＮ６で免疫したマウスの血清のみが、1/100希釈で５０％を超えるウイルス中和を示し、ＳＮ５は９０％に近い中和を示し、ＳＮ３は８０％に近い中和を示した（図２６Ａ）。関係のないウイルスに対しては、ウイルス中和は見られなかった（図２６Ｂ）。Ｎタンパク質に対する強力なＡｂ力価が、ＮＰ、ＮＰ ＦＣ及びＮＰ ＦＣｉＶ１含有構築物で見られる。Ｆｃ融合体として提供されるＲＢＤ単量体又はＲＢＤ二量体を含む構築物は、Ｓタンパク質を標的とする最高のＡｂ力価、及び総Ｉｇ抗体と同様の力価である最高のウイルス中和抗体を示す。
ウイルス中和は、偽ウイルス中和アッセイにおいてさまざまな血清希釈でも分析した（図２６Ｃ）。滴定データは、構築物ＳＮ５で免疫したマウスの血清が、1/3517希釈の血清で５０％中和力価（ＩＤ５０）であることを示す。構築物ＳＮ６で免疫したマウスの力価は、1/236希釈であり、構築物ＳＮ３で免疫したマウスの力価は、1/600希釈である（図２６Ｄ）。
全てのCOVID-19構築物は、単量体、三量体又はＦｃ融合タンパク質のいずれかとしてのＳタンパク質ＲＢＤ、及び、単量体、Ｆｃ融合タンパク質又は細胞表面での抗原－Ｆｃ融合タンパク質の非共有結合を可能にするように改変されたＦｃ融合タンパク質のいずれかとしてのＮタンパク質を含んでいた（表５及び６）。
改変Ｆｃと融合したＮタンパク質を発現するＳＮ１１は、未改変のＦｃと融合したＮタンパク質又はＮタンパク質単独と比較して、Ｎタンパク質及びHLA-A2エピトープＮ１３８－１４６に対する著しく良好なＴ細胞応答を示した。さらに興味深いことに、この構築物は、Ｎ－Ｆｃを除く同じＲＢＤ構築物を発現する同様の構築物よりも、ＲＢＤ、Ｓ１及びペプチドＲＢＤ４１７－４２５に対して優れた応答も示した。このことは、改変したＮ－Ｆｃがアジュバントのように作用し、ＡＰＣを活性化して他の抗原に対するＴ細胞応答も増強することを示唆する。
対照的に、最良のＶＮＡｂは、ＲＢＤ単量体（ＳＮ１、ＳＮ４、ＳＮ５、ＳＮ８、ＳＮ１５）、ＲＢＤ三量体（ＳＮ２、ＳＮ６、ＳＮ９、ＳＮ１１、ＳＮ１２）及びＲＢＤ－Ｆｃ（ＳＮ３、ＳＮ７、ＳＮ１３、ＳＮ１４）で刺激された。ＲＢＤ三量体を、ＲＢＤ－Ｆｃ及びＦｃ改変Ｎタンパク質と組み合わせたＲＢＤ増強Ｆｃと比較する構築物を製造した。増強Ｆｃ領域と別個に融合したＲＢＤ単量体及びＮタンパク質（ＳＮ１５）、又は、増強Ｆｃ領域と別個に融合したＲＢＤ及びＮタンパク質（ＳＮ１４）のいずれかを含む構築物は、最も強い抗体応答及びＴ細胞応答を生じた。
この例は、スパイクタンパク質のＲＢＤを組み込むことにより中和抗体及びＴ細胞応答を刺激するのみならず、Ｎタンパク質は高度に保存され変異がまれであるため、Ｎタンパク質も組み込むことにより、COVID19だけではなく新たに出現するコロナウイルスに対する保護も提供する記憶Ｔ細胞応答を誘導するワクチンを示す。
実施例１１ Ｆｃ改変ｈｕＩｇＧ１構築物（ｉＳＣＩＢ１）のＣＤＲ内のＴ細胞エピトープをコードするｐＤＮＡは、強力なＴ細胞応答を生じる
遺伝子銃を用いて、従来のC57Bl/6又はＨＬＡトランスジェニックマウス（HLA-DR4）を、ｉＳＣＩＢ１（図２９）をコードするｐＤＮＡで免疫し、免疫応答をＩＦＮγELISpotアッセイで評価して、ＳＣＩＢ１（国際公開第2008/116937号、図２８）と比較した。図３４Ａは、免疫したC57Bl/6及びHLA-DR4マウスで、ＳＣＩＢ１及びｉＳＣＩＢ１のＤＮＡの両者から高頻度のＴＲＰ２ １８０－１８８応答が生じたことを示す。ペプチド滴定による応答のアビディティーの分析は、C57Bl/6及びHLA-DR4マウスでは、ｉＳＣＩＢ１のＤＮＡによる免疫が、ＳＣＩＢ１のＤＮＡによる免疫よりも、高アビディティーのＴＲＰ２ １８０－１８８特異的ＣＤ８応答を生じることを明らかにする（図３５Ｂ及びＣ）。HLA-DR4マウスをｇｐ１００ ４４－５９エピトープに対する応答の頻度についても分析したところ、ｉＳＣＩＢ１のＤＮＡで免疫したマウスでは応答頻度が高くなる傾向が示された（図３４Ｄ）。
実施例１２ Ｆｃ改変ｈｕＩｇＧ１構築物（ｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓ）のＣＤＲ内のＴ細胞エピトープをコードするｐＤＮＡは、強力なＴ細胞応答を生じる
遺伝子銃を用いて、ＨＬＡトランスジェニックマウス（HLA-DR4、C57Bl/6又はHHDII/DP4）を、ｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓ（図３１）をコードするｐＤＮＡで免疫し、免疫応答をＩＦＮγELISpotアッセイで評価して、ＳＣＩＢ１ｐｌｕｓ（図３０）と比較した。図３５Ａは、免疫したC57Bl/6、HHDII、HDII/DP4及びHLA-DR4マウスで、ＳＣＩＢ１ｐｌｕｓ及びｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓのＤＮＡの両者から高頻度のＴＲＰ２ １８０－１８８応答が生じたことを示す。ペプチド滴定による応答のアビディティーの分析は、C57Bl/6及びHLA-DR4マウスでは、ｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓのＤＮＡによる免疫が、ＳＣＩＢ１ｐｌｕｓのＤＮＡによる免疫よりも、高アビディティーのＴＲＰ２ １８０－１８８特異的ＣＤ８応答を生じることを明らかにする（図３５Ｂ及びＣ）。HLA-DR4マウスでのｇｐ１００ ４４－５９特異的応答の頻度の分析は、ｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓのＤＮＡで免疫したマウスにおいて応答の頻度が高い傾向を示す（図３５Ｄ）。
実施例１３ Ｆｃ改変ｈｕＩｇＧ１構築物（ｉＳＣＩＢ１及びｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓ）のＣＤＲ内のＴ細胞エピトープをコードするｐＤＮＡは、効果的な腫瘍治療をもたらす
従来のC57Bl/6又はＨＬＡトランスジェニックマウス（HHDII/DP4）に、適切なＭＨＣアレルを発現するＢ１６メラノーマ細胞を移植した後、ｉＳＣＩＢ１（図２９）又はｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓ（図３１）をコードするｐＤＮＡで免疫し、それぞれ、ＳＣＩＢ１（図２８）又はＳＣＩＢ１ｐｌｕｓ（図３０）と比較した。腫瘍の増殖と生存をモニターした。C57Bl/6マウスでの腫瘍治療試験を図３６に示す。ｉＳＣＩＢ１のＤＮＡで免疫したマウスは、ＳＣＩＢ１のＤＮＡで免疫したマウスよりも腫瘍の増殖が遅く、対照マウスよりも腫瘍増殖が有意に遅い（p=0.0012）（図３６Ａ）。ｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓのＤＮＡ又はｉＳＣＩＢｐｌｕｓのＤＮＡで免疫したマウスは、対照よりも腫瘍増殖が有意に遅い（p<0.0001）（図３６Ｂ）。１８日目における腫瘍体積の分析は、ｉＳＣＩＢｐｌｕｓのＤＮＡによる免疫が、ＳＣＩＢ１ｐｌｕｓのＤＮＡと比較して腫瘍増殖が遅いことを示す（図３６Ｂ）。ｉＳＣＩＢ１、ＳＣＩＢ１ｐｌｕｓ及びｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓのＤＮＡで免疫したマウスは、対照マウスと比較して、全生存期間が有意に増加したことを示す（それぞれ、p=0.0143、p=0.0143及びp<0.0001）（図３６Ｃ）。ＳＣＩＢ１ｐｌｕｓ及びｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓによる免疫は、いずれも腫瘍治療を提供するが、ｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓのＤＮＡによる免疫は、ＳＣＩＢ１ｐｌｕｓと比較して、全生存期間が有意に増加した（p=0.0003）（図３６Ｃ）。
実施例１４ Ｆｃ改変ｈｕＩｇＧ１構築物（ｉＳＣＩＢ２）のＣＤＲ内のＴ細胞エピトープをコードするｐＤＮＡは、強力なＴ細胞応答を生じる
遺伝子銃を用いて、ＨＬＡトランスジェニックマウス（HHDII又はHHDII/DR1）を、ｉＳＣＩＢ２（図３３）をコードするｐＤＮＡで免疫し、免疫応答をＩＦＮγELISpotアッセイで評価して、ＳＣＩＢ２（図３２）と比較した。図３７Ａは、免疫したHHDII及びHHDII/DR1マウスで、ＳＣＩＢ２のＤＮＡ及びｉＳＣＩＢ２のＤＮＡの両者から高頻度のＮｙｅｓｏ－１ １５７－１６５応答が生じたことを示す。ペプチド滴定による応答のアビディティーの分析は、HHDIIマウスでは、ＳＣＩＢ２のＤＮＡ及びｉＳＣＩＢ２のＤＮＡによる免疫は、いずれも高アビディティーのＮｙｅｓｏ１ １５７－１６５特異的ＣＤ８応答を生じるが、HHDII/DR1マウスでは、ｉＳＣＩＢ２は、ＳＣＩＢ２よりも高アビディティーの応答を生じることを明らかにする（図３７Ｂ及びＣ）。Ｎｙｅｓｏ１１９－１４３配列は、既知のHLA-DR1エピトープを含むことから、HHDII/DR1マウスにおけるＮｙｅｓｏ１１９－１４３エピトープに対する応答を分析した。その結果、ＳＣＩＢ２と比較して、ｉＳＣＩＢ２による応答頻度が有意に増加したことを示した（p=0.0338）（図３７Ｄ）。アビディティー分析は、HHDII/DR1マウスでは、ｉＳＣＩＢ２によるＮｙｅｓｏ１１９－１４３応答も、ＳＣＩＢ２によるものよりもアビディティーが強力であることを示す（p=0.0363）（図３７Ｅ）。
実施例１５ Ｆｃ改変ｈｕＩｇＧ１構築物（ｉＳＣＩＢ２）のＣＤＲ内のＴ細胞エピトープをコードするｐＤＮＡは、効果的な腫瘍治療をもたらす
ＨＬＡトランスジェニックマウス（HHDII）に、適切なＭＨＣアレルを発現するＢ１６メラノーマ細胞を移植した後、遺伝子銃を用いてｉＳＣＩＢ２（図３３）をコードするｐＤＮＡで免疫し、ＳＣＩＢ２（図３２）と比較した。腫瘍の増殖と生存をモニターした。ＳＣＩＢ２及びｉＳＣＩＢ２の両者で免疫したマウスは、対照マウスと比較して無腫瘍生存期間が有意に増加し（それぞれ、p<0.0001及びp=0.0010）、両者の間で有意な差はなかった（図３８）。
実施例１６ 遺伝子銃を用いて送達したｐＤＮＡからのCOVID-19特異的Ｔ細胞及び中和抗体応答は、ＲＢＤ Ｆｃ構築物と比較してＲＢＤ ＦｃｉＶ１構築物の方が優れている
Balb/c及びHLA-A2トランスジェニックマウスを、改変Ｆｃと融合したＮタンパク質（ＮＰ ＦＣｉＶ１）とＦｃと融合したＲＢＤドメインを有するｐＤＮＡ（ＲＢＤ ＦＣ、ＳＮ１３、図１４）、又は、改変Ｆｃと融合したＮタンパク質（ＮＰ ＦＣｉＶ１）と改変Ｆｃと融合したＲＢＤドメインを有するｐＤＮＡ（ＲＢＤ ＦＣｉＶ１、ＳＮ１４、図１５）で免疫した。Ｔ細胞応答を、ＩＦＮγELISpotアッセイで評価し、ＲＢＤタンパク質のオーバーラッピングペプチドのプールに対する応答の頻度は、ＲＢＤ ＦｃｉＶ１、ＳＮ１４で免疫したマウスでは、ＲＢＤ Ｆｃ、ＳＮ１３と比較して、有意に高かった（図３９Ａ）。HLA-A2トランスジェニックマウスにおけるＲＢＤのHLA-A2エピトープ（ＲＢＤ４１７－４２５）に対する応答のアビディティーの分析は、ＳＮ１３（ＲＢＤ Ｆｃ）で免疫したマウスと比較して、ＳＮ１４（ＲＢＤ ＦｃｉＶ１）で免疫したマウスにおいてより高いアビディティー応答が生じたことを示した（図３９Ｂ）。
免疫したBalb/cマウスの抗体応答をＥＬＩＳＡで評価したところ、Ｓ１タンパク質に特異的な抗体の力価は、ＳＮ１３で免疫したマウスとＳＮ１４で免疫したマウスで同様であった（図３９Ｃ）。偽ウイルス中和アッセイにおける中和抗体応答の分析によれば、ＳＮ１４（ＲＢＤ ＦＣｉＶ１）で免疫したマウスの血清は、ＳＮ１３（ＲＢＤ ＦＣ）で免疫したマウスの血清と比較して、中和ＩＤ５０力価が高かった（図３９Ｄ）。このデータは、改変Ｆｃと融合した抗原を有するｐＤＮＡ構築物によるＴ細胞応答及び中和抗体応答の両者が優れていることの証拠を示す。
実施例１７ ＳＮ１１、１２、１３、１４及び１５のｐＤＮＡによる一過性ＨＥＫ２９３トランスフェクションからのＲＢＤタンパク質及びＮタンパク質の分泌
ＳＮ５のｐＤＮＡと比較した、ＳＮ１１、１２、１３、１４及び１５のｐＤＮＡ構築物のトランスフェクション効率を評価するために、HEK293細胞を、Thermofisher社のExpi293系を用いてｐＤＮＡで一時的にトランスフェクトし、培地へのタンパク質分泌及び細胞溶解物中のタンパク質を、ＲＢＤタンパク質及び核タンパク質についてサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて評価した（図４０）。この分析は、ＲＢＤタンパク質では、ＲＢＤ－Ｆｃ融合体を含む構築物（ＳＮ１３）からの分泌が最も多く、未改変のＲＢＤ単量体（ＳＮ５及びＳＮ１５）及び改変Ｆｃと結合したＲＢＤ単量体（ＳＮ１４）がすぐ後に続くことを示した。（図４０Ａ）。改変Ｆｃと結合した核タンパク質を有する未改変のＲＢＤ単量体（ＳＮ１５）は、細胞溶解物でＲＢＤタンパク質の量が最も多かった（図４０Ａ）。溶解物における核タンパク質は、構築物（ＳＮ１１、１２、１３、１４及び１５）で同様であったが、分泌タンパク質の量は、ＲＢＤ三量体（ＳＮ１２）及びＲＢＤ単量体（ＳＮ１５）の構築物でわずかに多かった（図４０Ｂ）。
実施例１８ 遺伝子銃を用いて送達したＳＮ１５のｐＤＮＡからのCOVID-19特異的中和抗体応答は、全ＳのｐＤＮＡからの応答よりも優れている
Balb/c及びC57Bl/6マウスを、改変Ｆｃと融合したＮタンパク質（ＮＰ ＦＣｉＶ１）と、ＲＢＤ単量体（ＳＮ１５）、ＲＢＤ三量体（ＳＮ１２）若しくはＦｃと結合したＲＢＤ単量体（ＳＮ１３）のいずれかを含むｐＤＮＡ、又は全ＳのｐＤＮＡで免疫した。免疫したBalb/cマウスの抗体応答をＥＬＩＳＡで評価したところ、Ｓ１タンパク質に特異的な抗体及びＳ１タンパク質に特異的な総ＩｇＧの力価は、全ＳのＤＮＡ又はＳＮ１１で免疫したマウスと比較して、ＳＮ１５及びＳＮ１３で免疫したマウスで高かった（図４１Ａ）。偽ウイルス中和アッセイにおける中和抗体応答の分析によれば、ＳＮ１５（ＲＢＤ単量体及びＮＰ ＦＣｉＶ１）で免疫したマウスの血清は、ＳＮ１２（ＲＢＤ三量体及びＮＰ ＦＣｉＶ１）又はＳＮ１３（ＲＢＤ ＦＣ及びＮＰ ＦＣｉＶ１）で免疫したマウスの血清と比較して、中和ＩＤ５０力価が高かった（図４１Ｂ）。偽ウイルス中和アッセイにおけるＳＮ１５のｐＤＮＡ又は全ＳのｐＤＮＡのいずれかで免疫したC57Bl/6マウスの抗体応答の比較は、ＳＮ１５のｐＤＮＡで免疫したマウスの中和力価が全ＳのｐＤＮＡと比較して高いことを明らかにした（図４１Ｃ）。したがって、２つのマウスモデルでは、ＳＮ１５のｐＤＮＡによる免疫後に優れた中和抗体が達成されることが示唆される。
実施例１９ 遺伝子銃を用いて送達したＳＮ１５のｐＤＮＡによるCOVID-19特異的Ｔ細胞応答は、全ＳのｐＤＮＡによる応答よりも優れている
Balb/cマウス、HLA-A2トランスジェニックマウス及びC57Bl/6マウスを、改変Ｆｃと融合したＮタンパク質（ＮＰ ＦＣｉＶ１）と、ＲＢＤ単量体（ＳＮ１５）、ＲＢＤ三量体（ＳＮ１２）、短いＲＢＤ三量体（ＳＮ１１）若しくはＦｃと結合したＲＢＤ単量体（ＳＮ１３）のいずれかを含むｐＤＮＡ、又は全ＳのｐＤＮＡで免疫した。免疫したマウスのＴ細胞応答をＩＦＮγELISpotアッセイで評価したところ、ＳＮ１５、ＳＮ１３、ＳＮ１２及びＳＮ１１のｐＤＮＡで免疫したマウスでは、ＲＢＤタンパク質に由来するオーバーラッピングペプチドペプチドのプールに対して応答の頻度が高かった（図４２Ａｉ）。ＳＮ１５、ＳＮ１１及びＳＮ１２免疫マウスでの応答は、ＳＮ１３免疫マウスでの応答よりも有意に高かった（p<0.0001）。HLA-A2トランスジェニックマウスにおけるペプチド特異的応答の分析では、同様の応答のパターンが観察された（p=0.0002）（図４２Ａｉｉ）。ＳＮ１５のｐＤＮＡで免疫したBalb/cマウス及びC57Bl/6マウスと、全ＳのｐＤＮＡで免疫したマウスとの比較では、ＳＮ１５で免疫したマウスで、ＲＢＤタンパク質のオーバーラッピングペプチドペプチドのプールに対する応答が有意に増加したことが示された（p=0.0002）（図４２）。このデータは、ＳＮ１５のｐＤＮＡ構築物によるＴ細胞応答が、全Ｓタンパク質をコードするものよりも優れていることの証拠を示す。
実施例２０ Ｆｃ改変ｈｕＩｇＧ１構築物は、未改変のＦｃと比較してより強力にＣＤ６４と結合する
抗原を高親和性のＦｃγＲ１（ＣＤ６４）にターゲティングすることは、抗原の内在化の増加とＡＰＣ活性の改善の組合せによって、良好な体液性応答及びＴ細胞応答を誘導する。改変Ｆｃを有する精製したＲＢＤ構築物は、未改変のＲＢＤ－Ｆｃ構築物と比較して、ＣＤ６４との長期間の相互作用を示し、この現象は、ＣＤ６４受容体密度が高いほど顕著で、アビディティーの増加を示唆する（図４３、リアルタイムＳＰＲ結合曲線）。これは、高いＣＤ６４密度（３００及び９００ＲＵ）では、未改変のＦｃ構築物と比較して、改変Ｆｃで、解離が遅く（ｋｄのオーダーが、ＲＢＤ－Ｆｃの１０－３ １／ｓと比較してＲＢＤ－ｉＦｃｖ１は１０－４ １／ｓである）、最大結合（Ｒｍａｘ）が大きいことが観察される表7の速度論的パラメーターから明らかである。
実施例２１ ２０人のドナーにおける改変ｉＦｃｖ１構築物の免疫原性の欠如
臨床でヒトのボランティアに投与した場合、改変Ｆｃ（ｉＦｃｖ１）の残基が変化すると理論的には免疫原性を誘導する可能性がある。そのため、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））を対照として、Abzena（ＵＫ）が実施した試験でこの点を検討した。ｉＦｃｖ１融合構築物が、免疫原性の重要な原動力であるヒトにおけるＣＤ４ Ｔ細胞応答を誘導する可能性があるかどうかを評価するために、改変ｉＦｃｖ１を含むトラスツズマブ構築物「ｉＴｖ１」を製造した。免疫原性ｉＴｖ１は、ＨＬＡアレルの約７７％をカバーする欧州及び北米の集団を代表する２０人のドナーのＣＤ８枯渇末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いた増殖アッセイ（３Ｈ－チミジン取込み）で評価した。Ｔ細胞応答を、ｉＴｖ１又は野生型のトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））及びビデュリオン（登録商標）対照とのインキュベーション後、５～８日目に評価した（図４４Ａ）。改変Ｆｃ構築物であるｉＴｖ１は、２０人中３人で増殖をわずかに増加させた；これは、２０人中２人で増殖のわずかな増加が観察されたAbzenaの低免疫原性対照であるハーセプチン（登録商標）で見られた結果と同等である。患者の４５％で抗薬物抗体を誘導することが知られているビデュリオン（登録商標）又は陽性対照であるＫＬＨのいずれかで観察されたものよりもはるかに低い、２～２．５という刺激指数が両者で見られた。ＣＤ８枯渇ＰＢＭＣの最大増殖応答の比較は、ｉＴｖ１とハーセプチン（登録商標）（図４４Ｂ）の間に有意差がないことを示し、これは、ｉＴｖ１（ＳＮ１５も同様）におけるＦｃ改変が、ヒトで強力なＣＤ４ Ｔ細胞応答を刺激する可能性が低いことを示す。
実施例２２ ５０人のドナーにおける改変ｉＦｃｖ１構築物の免疫原性の欠如
２０人のドナーで行った実験を、広範なＨＬＡの型に及ぶ５０人のドナーに拡大して繰り返し実施した。改変Ｆｃ構築物であるｉＴｖ１は、５０人中３人で増殖をわずかに増加させた；これは、２０人中２人で増殖のわずかな増加が観察され、５０人中１人で増殖の大幅な増加が観察されたAbzenaの低免疫原性対照であるハーセプチン（登録商標）で見られた結果と再び同等である（図４５Ａ）。患者の４５％で抗薬物抗体を誘導することが知られているビデュリオン（登録商標）又は陽性対照であるＫＬＨのいずれかで観察されたものよりもはるかに低い、２～２．４という刺激指数がｉＴｖ１で見られた。ＣＤ８枯渇ＰＢＭＣの最大増殖応答の比較は、ｉＴｖ１とハーセプチン（登録商標）（図４５Ｂ）の間に有意差がないことを示し、これは、ｉＴｖ１（ＳＮ１５、ＳＮ１７、ｉＳＣＩＢ１、ｉＳＣＩＢ１ｐｌｕｓ及びｉＳＣＩＢ２も同様）におけるＦｃ改変が、ヒトで強力なＣＤ４ Ｔ細胞応答を刺激する可能性が低いことを示す。
実施例２３ COVID-19のＮタンパク質特異的抗体応答は、遺伝子銃を用いて送達したＮＰ、ＮＰ Ｆｃ及びＮＰ ＦｃｉＶ１をコードするｐＤＮＡから誘発される
ｐＤＮＡをコードするＮＰ、ＮＰ Ｆｃ又はＮＰ ＦｃｉＶ１で免疫したマウスの血清を、SARS-CoV-2のＮタンパク質に対する抗体反応性についてＥＬＩＳＡで分析した。同様の抗体応答及びＥＣ５０値が、それがＦｃと融合しているか否かにかかわらず、全ての構築物で観察された（図４５）。
実施例２４ ＳＮ１５のｐＤＮＡのワクチン接種により、変異株と交差反応する抗体応答が誘導される
改変Ｆｃと融合したＮタンパク質（ＮＰ ＦＣｉＶ１）をＲＢＤ単量体と共に含むｐＤＮＡ（ＳＮ１５）で、Balb/cマウスを免疫し、武漢（Ａ系統）、B.1.351及びB.1.1.7ウイルス株の変異Ｓ１タンパク質に対する血清中の抗体の応答をＥＬＩＳＡで評価した。Ａ系統、B.1.1.7変異株及びB.1.351変異株に由来するＳ１タンパク質に特異的な高力価の抗体が観察され、検出可能な応答が、1/100,000以上に希釈した血清中でバックグラウンドを超えて認められた。系統ＡとB.1.1.7変異株のＳ１タンパク質に対する反応性に有意な差は認められなかった（図４９）。B.1.351変異株ではＥＣ５０の低下が観察されるが、このデータは、B.1.1.7変異株及びB.1.351変異株の両者に対する交差反応性抗体応答の誘導を示す。
実施例２５ ＳＮ１５、ＳＮ１６及びＳＮ１７のｐＤＮＡのワクチン接種により、変異株と交差反応し、ＡＣＥ２結合も阻害する抗体応答が誘導される
ＲＢＤ単量体（ＳＮ１５）、B.1.1.7変異株のＲＢＤ単量体（ＳＮ１６、図４７）又はB.1.351変異株のＲＢＤ単量体（ＳＮ１７、図４８）を、改変Ｆｃと融合した対応する株のＮタンパク質（ＮＰ ＦＣｉＶ１）と共に含むｐＤＮＡで、Balb/cマウスを免疫した。武漢（Ａ系統）、B.1.351及びB.1.1.7ウイルス株の変異型Ｓ１タンパク質に対する血清中の抗体の応答をＥＬＩＳＡで評価した。ＳＮ１７及びＳＮ１６の両者で、Ａ系統、B.1.1.7変異株及びB.1.351変異株に由来するＳ１タンパク質に特異的な高力価の抗体が観察され、検出可能な応答が、1/100,000以上に希釈した血清中でバックグラウンドを超えて認められた。ＳＮ１７では、Ａ系統、B.1.351変異株及びB.1.1.7変異株のＳ１タンパク質に対する反応性に有意な差は認められなかった（図５０Ａｉ）。同様の応答が、ＳＮ１６（図５０Ａｉｉ）からＳＮ１５（図４９）の応答に観察される。B.1.351変異株ではＥＣ５０の低下が観察される（図５０Ａｉｉｉ）が、このデータは、B.1.1.7及びB.1.351変異株の両者に対する交差反応性抗体応答の誘導を示す。Ａ系統及びB.1.351変異株ワクチン構築物で免疫したマウスの血清を、全ＳのＤＮＡで免疫したマウスの血清と比較すると、Ａ系統のＳ１タンパク質及びB.1.351のＳ１タンパク質の両者に対し、高い力価の応答が示される（図５０Ｂ）。
免疫したマウスの血清のＡＣＥ２受容体と変異株のＲＢＤ又は全Ｓタンパク質との結合を阻害する能力を、MesoScale Discoveryプラットフォームを用いて評価した。ＡＣＥ２とＲＢＤの結合の阻害は、対照であるNIBSC 20/136と比較して、Ａ系統ワクチン構築物（ＳＮ１５）及びB.1.351変異株ワクチン構築物（ＳＮ１７）で免疫したマウスの血清で、より高かった（図５０Ｃｉ）。これに対して、全ＳのＤＮＡで免疫したマウスの血清は、ＡＣＥ２結合を阻害する能力が低く、対照であるNIBSC 20/136と同様であった。Ａ系統のワクチン構築物（ＳＮ１５）で免疫したマウスの血清は、Ａ系統及びB.1.1.7変異株のＲＢＤとのＡＣＥ２結合の８０～１００％を阻害し、B.1.351及びP.1変異株のＲＢＤに対しては５０～６０％に低下した。B.1.351変異株ワクチン（ＳＮ１７）で免疫したマウスの血清では逆のことが見られる。B.1.351及びP.1変異株のＲＢＤとＡＣＥ２の結合の阻害の減少にもかかわらず、阻害のレベルは、全ＳのＤＮＡで免疫したマウスの血清で見られるものよりも高いままである。同様の傾向は、変異型の全Ｓタンパク質を用いたＡＣＥ２受容体結合阻害アッセイでも観察される（図５０Ｃｉｉ）。
実施例２６ ＳＮ１５及びＳＮ１７で免疫したマウスの血清は、偽ウイルス及び生ウイルス中和アッセイにおいてウイルスを中和する
Ａ系統（ＳＮ１５）又はB.1.351（ＳＮ１７）変異株のワクチンで免疫したBalb/cマウスの血清は、Ａ系統及びB.1.351変異株に対する偽ウイルス及び生ウイルス中和試験でも評価した。Ａ系統及び変異株のワクチンで免疫したマウスの血清は、Ａ系統の偽ウイルスを強力に中和したが、B.1.351変異株のワクチンの効力は低かった（ＩＤ５０値は、それぞれ６２３２及び２１３７）（図５１Ａ）。Ａ系統及び変異株のいずれかのワクチンで免疫したマウスの血清は、B.1.351の偽ウイルス変異株を中和し、差はほとんど認められなかった（ＩＤ５０値は、それぞれ９４８及び９９７）。生ウイルス中和アッセイでは、Ａ系統（ＳＮ１５）又はB.1.351（ＳＮ１７）変異株のワクチンのいずれかで免疫したマウスの血清は、Ａ系統ウイルスを、ＩＤ５０値がそれぞれ４９６４及び１３３４で中和し、両者とも対照であるNIBSCよりも優れている（図５１Ｂ）。
実施例２７ Ｔ細胞応答は、ウイルス株の変異による影響を受けない
Ｔ細胞応答がさまざまなウイルス変異株における変異によって影響されるかどうかを調べるために、Ａ系統ワクチン（ＳＮ１５）又はB.1.351ワクチン（ＳＮ１７）のいずれかで免疫したマウスの脾細胞を、元の配列のＲＢＤ及びＮペプチドのプールによってex vivoで刺激した。ＲＢＤ及びＮに特異的なＴ細胞応答が検出されたが、２つの異なるワクチン構築物によって誘導された応答の間に差はほとんどなかった（図５２）。これらの結果は、B.1.351変異株における変異は、Ｔ細胞応答に対する影響が少ないことを示唆する。
実施例２８ 抗体応答は、変異株に特異的なワクチンによって効率的に増強され、B.1.351変異株及びB.1.617.2変異株に対して交差反応性を示す
ＳＮ１５ワクチンを用いＡ系統のウイルスに対して誘発した抗体応答が、B.1.351変異株（ＳＮ１７）を標的とするワクチンによって増強されるかどうかを調べるために、１日目及び２９日目に、Balb/cマウスをＳＮ１５ワクチンで免疫し、続いて８５日目にＳＮ１７ワクチンでブーストした。４２日、８２日及び９８日目に採取した血清中の抗体応答を、Ａ系統及びB.1.351のＳ１タンパク質に対する反応性についてＥＬＩＳＡで調べた。比較として、マウスをＳＮ１７ワクチンのみで免疫した。抗体応答は、いずれのセットでも、1/100,000まで希釈した血清において検出可能である（図５３Ａ）。４２日目と比較した８２日目における応答力価の低下がいずれのセットでも認められるが、Ａ系統のＳ１タンパク質のＥＣ５０値は1/3500を超えている。ＳＮ１７ワクチンによる８５日目のブーストは、いずれのセットでも９８日目までにＡ系統のＳ１タンパク質に対する応答を効率的に増強することから、ＳＮ１５ワクチン又はＳＮ１７ワクチンがプライミングした応答のいずれも、ＳＮ１７ワクチンが効率的に増強することが示唆される。B.1.351のＳ１タンパク質に対する反応性は、いずれのセットの場合も、Ａ系統のＳタンパク質と比較して低下し、小さなＥＣ５０値であり、これは、ＳＮ１５＋ＳＮ１７ブーストのマウスにおいてより顕著である。にもかかわらず、ＳＮ１７ワクチンによるブーストは、ＳＮ１５ワクチンによるプライミング群の応答を、ＳＮ１７プライミングのマウスで見られるのと同様のレベルまで上昇させることができる。
これらのプライム－ブースト法で免疫したマウスの血清を、B.1.351変異株及びB.1.617.2変異株のＲＢＤタンパク質に対する反応性について、ＥＬＩＳＡで分析した（図５３Ｂ）。いずれのマウスの血清も、B.1.351のＲＢＤタンパク質に対する抗体力価及びＥＣ５０値は、B.1.351のＳ１タンパク質に対するものと比較して高い。ＳＮ１５又はＳＮ１７のいずれかでプライミングしたマウスにおけるB.1.351のＲＢＤタンパク質に対する応答は、８２日目と比較した９８日目に示されるように、ＳＮ１７ブースターで効率的に増強される。ブースト後の高い力価が、ＳＮ１７ワクチンでプライミングしたマウスで認められる。B.1.617.2変異株のＲＢＤタンパク質に対する交差反応性の分析は、８２日目に高い力価応答を示し、ＳＮ１５でプライミングしたマウスのＥＣ５０値は８３５５で、ＳＮ１７でプライミングしたマウスのＥＣ５０値は５７３８であった。これは、B.1.351のＲＢＤタンパク質に対する同じ血清で見られるものよりも反応性が高く、両者のワクチンのこの変異株に対する良好な交差反応性を示唆する。ＳＮ１７ワクチンによるブーストは、力価及びＥＣ５０値をいずれのマウスでも同様のレベルまで増加させ、ＳＮ１７ブースターが、ＳＮ１５ワクチン又はＳＮ１７ワクチンのプライミングによって誘導されるB.1.617.2変異株交差性ＲＢＤ特異的応答を増強できることを示唆する。
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Claims (57)

  1. ポリペプチドをコードする核酸であって、前記ポリペプチドは、
    (i) ヒトＩｇＧ１の改変Ｆｃ領域、及び
    (ii) 少なくとも１つの異種抗原
    を含み、
    ここで、(a) 前記改変Ｆｃ領域は、ＣＤ６４と結合できるＦｃの少なくとも一部を含み、(b) 前記Ｆｃ領域の残基の少なくとも１つが、マウスＩｇＧ３抗体の対応する残基に改変されており、かつ、(c) 前記改変Ｆｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に対するアビディティーが増強されている
    、核酸。
  2. ポリペプチドをコードする核酸であって、前記ポリペプチドは、
    (i) ヒトＩｇＧ１の改変Ｆｃ領域、及び
    (ii) 少なくとも１つの異種抗原
    を含み、
    ここで、(a) 前記改変Ｆｃ領域は、ＴＲＩＭ２１と結合できるＦｃの少なくとも一部を含み、(b) 前記Ｆｃ領域の残基の少なくとも１つが、マウスＩｇＧ３抗体の対応する残基に改変されており、かつ、(c) 前記改変Ｆｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に対するアビディティーが増強されている、
    核酸。
  3. ポリペプチドをコードする核酸であって、前記ポリペプチドは、
    (i) ヒトＩｇＧ１の改変Ｆｃ領域、及び
    (ii) 少なくとも１つの異種抗原
    を含み、
    ここで、(a) 前記改変Ｆｃ領域は、ＣＤ６４及び／又はＴＲＩＭ２１と結合できるＦｃの少なくとも一部を含み、(b) 前記Ｆｃ領域の残基の少なくとも１つが、マウスＩｇＧ３抗体の対応する残基に改変されており、かつ、(c) 前記改変Ｆｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に対するアビディティーが増強されている、
    核酸。
  4. Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に対するアビディティーが、対応する野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域と比較して、少なくとも約１０％増強されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸。
  5. 前記Ｆｃ領域の残基の少なくとも１つが、Ｎ２８６、Ｋ２８８、Ｋ２９０、Ａ３３９、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｌ３５８、Ｔ３５９、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｋ３７０、Ｇ３７１、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ａ３７８から選択され、任意に、前記改変された残基の少なくとも１つが、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓから選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸。
  6. 前記ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域は、Ｎ２８６Ｔ、Ｋ２８８Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ａ３３９Ｐ、Ｑ３４２Ｒ、Ｐ３４３Ａ、Ｒ３４４Ｑ、Ｅ３４５Ｔ、Ｌ３５１Ｉ、Ｓ３５４Ｐ、Ｄ３５６Ｅ、Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３５９Ｓ、Ｎ３６１Ｋ、Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３７０Ｔ、Ｇ３７１Ｎ、Ｙ３７３Ｆ、Ｐ３７４Ｓ、Ｓ３７５Ｅ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｓの全ての改変を含む、請求項５に記載の核酸。
  7. 前記改変Ｆｃ領域は、配列番号１で示すアミノ酸配列、又は配列番号１で示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の核酸。
  8. 前記少なくとも１つの異種抗原は、直接又はリンカーを介して、前記改変ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＮ末端と結合している、請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸。
  9. 前記ポリペプチドは、前記少なくとも１つの異種抗原が挿入される又は前記少なくとも１つの異種抗原によって置換される抗体可変領域を更に含み、場合によっては、前記抗体可変領域のＣＤＲが前記少なくとも１つの異種抗原に置換される、請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸。
  10. 前記少なくとも１つの異種抗原は、Ｔ細胞エピトープ及び／又はＢ細胞エピトープを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸。
  11. 前記少なくとも１つの異種抗原は、がん又は感染症に由来する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸。
  12. 前記少なくとも１つの異種抗原は、図２８～３３のいずれかに示すエピトープから選択される１つ以上のエピトープを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の核酸。
  13. 前記少なくとも１つの異種抗原は、表１又は２に示すエピトープから選択される１つ以上のエピトープを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の核酸。
  14. 前記少なくとも１つの異種抗原は、
    (a) ＧＴＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹＨ（配列番号２９）;
    (b) ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号３０）；及び
    (c) ＷＮＲＱＬＹＰＥＷＴＥＡＱＲＬＤ（配列番号３１）
    から選択される１つ以上のエピトープを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の核酸。
  15. 前記少なくとも１つの異種抗原は、
    (a) ＧＴＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹＨ（配列番号２９）：
    (b) ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号３０）；
    (c) ＷＮＲＱＬＹＰＥＷＴＥＡＱＲＬＤ（配列番号３１）；及び
    (d) ＶＰＬＤＣＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶＴＬＤＩＶＱＧ（配列番号３２）
    から選択される１つ以上のエピトープを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の核酸。
  16. 前記少なくとも１つの異種抗原は、
    (a) ＧＴＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹＨ（配列番号２９）；
    (b) ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号３０）；
    (c) ＷＮＲＱＬＹＰＥＷＴＥＡＱＲＬＤ（配列番号３１）；
    (d) ＶＰＬＤＣＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶＴＬＤＩＶＱＧ（配列番号３２）；
    (e) ＡＮＣＳＶＹＤＦＦＶＷＬＨＹＹＳＶＲＤＴＬＬＧＰＧＲＰＹＲ（配列番号３３）；及び
    (f) ＱＣＴＥＶＲＡＤＴＲＰＷＳＧＰＹＩＬＲＮＱＤＤＲＥＬＷＰＲＫＦＦ（配列番号３４）
    から選択される１つ以上のエピトープを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の核酸。
  17. 前記少なくとも１つの異種抗原は、
    (a) ＬＬＭＷＩＴＱＣＦ（配列番号３５）；
    (b) ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号３６）；
    (c) ＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱ（配列番号３７）；及び
    (d) ＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ（配列番号３８）
    から選択される１つ以上のエピトープを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の核酸。
  18. 前記少なくとも１つの異種抗原は、
    (a) ＬＬＭＷＩＴＱＣＦ（配列番号３５）；
    (b) ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号３６）；
    (c) ＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱ（配列番号３７）；
    (d) ＰＥＳＲＬＬＥＦＹ（配列番号３９）；
    (e) ＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰ（配列番号４０）；
    (f) ＬＥＦＹＬＡＭＰＦ（配列番号４１）；
    (g) ＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭ（配列番号４２）；
    (h) ＭＰＦＡＴＰＭＥＡ（配列番号４３）；
    (i) ＬＡＭＰＦＡＴＰＭ（配列番号４４）；
    (j) ＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭ（配列番号４５）；
    (k) ＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱ（配列番号４６）；
    (l) ＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ（配列番号３８）；
    (m) ＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬ（配列番号４７）；
    (n) ＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴ（配列番号４８）；
    (o) ＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩ（配列番号４９）；
    (p) ＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲ（配列番号５０）；及び
    (q) ＴＶＳＧＮＩＬＴＩ（配列番号５１）
    から選択される１つ以上のエピトープを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の核酸。
  19. 前記少なくとも１つの異種抗原は、
    (a) ＫＩＡＤＹＮＹＫＬ（配列番号５２）；
    (b) ＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶ（配列番号５３）；
    (c) ＥＬＬＨＡＰＡＴＶ（配列番号５４）；
    (d) ＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＴＡＷＮＲ（配列番号５５）；
    (e) ＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴ（配列番号５６）；
    (f) ＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩ（配列番号５７）；
    (g) ＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶ（配列番号５８）；
    (h) ＡＬＮＴＰＫＤＨＩ（配列番号５９）；
    (i) ＬＱＬＰＱＧＴＴＬ（配列番号６０）；
    (j) ＬＬＬＤＲＬＮＱＬ（配列番号６１）；
    (k) ＧＭＳＲＩＧＭＥＶ（配列番号６２）；
    (l) ＩＬＬＮＫＨＩＤＡ（配列番号６３）；
    (m) ＧＮＧＧＤＡＡＬＡＬＬＬＬＤＲＬＮＱＬＥ（配列番号６４）；及び
    (n) ＫＨＷＰＱＩＡＱＦＡＰＳＡＳＡＦＦＧＭＳ（配列番号６５）
    から選択される１つ以上のエピトープを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の核酸。
  20. 前記抗体可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ、以下の異種抗原：
    (a) ＧＴＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹＨ（配列番号２９）、ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号３０）及びＶＰＬＤＣＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶＴＬＤＩＶＱＧ（配列番号３２）；又は
    (b) ＬＬＭＷＩＴＱＣＦ（配列番号３５）、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号３６）及びＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱ（配列番号３７）
    に置換された重鎖可変領域を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の核酸。
  21. 前記核酸がコードするポリペプチドが、配列番号２又は配列番号３で示すアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の核酸。
  22. 前記感染症は、ウイルス、場合によってはコロナウイルス、場合によってはSARS-CoV-2によって引き起こされる、請求項１１に記載の核酸。
  23. 前記異種抗原は、コロナウイルスのＮタンパク質又はその免疫原性断片である、請求項２２に記載の核酸。
  24. 前記Ｎタンパク質は、配列番号４で示すアミノ酸配列を含む、請求項２２又は２３に記載の核酸。
  25. 前記Ｎタンパク質は、配列番号５で示すアミノ酸配列を含む、請求項２２又は２３に記載の核酸。
  26. 前記核酸がコードするポリペプチドが、配列番号６で示すアミノ酸配列を含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の核酸。
  27. 前記核酸がコードするポリペプチドが、配列番号７で示すアミノ酸配列を含む、請求項２２，２３又は２５のいずれか一項に記載の核酸。
  28. 少なくとも１つの異種抗原をコードする第２の核酸と組み合わせる、請求項１～２７のいずれか一項に記載の核酸。
  29. 前記第２の核酸が、コロナウイルス又はその免疫原性断片の受容体結合ドメインをコードする、請求項２３を引用する請求項２８に記載の核酸。
  30. 前記第２の核酸が、SARS-CoV-2の受容体結合ドメインをコードする、請求項２３を引用する請求項２８に記載の核酸。
  31. 前記受容体結合ドメインが、配列番号８で示すアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の核酸。
  32. 前記受容体結合ドメインが、配列番号９で示すアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の核酸。
  33. 前記核酸がコードするポリペプチドが配列番号６で示すアミノ酸配列を含み、かつ、前記第２の核酸が、配列番号８で示すアミノ酸配列を含む受容体結合ドメインをコードする、請求項３０に記載の核酸。
  34. 前記核酸がコードするポリペプチドが配列番号７で示すアミノ酸配列を含み、かつ、前記第２の核酸が配列番号９で示すアミノ酸配列を含む受容体結合ドメインをコードする、請求項３０に記載の核酸。
  35. 前記第２の核酸が、前記少なくとも１つの異種抗原が挿入される又は前記少なくとも１つの異種抗原によって置換される抗体軽鎖をコードし、場合によっては、前記抗体軽鎖のＣＤＲが前記少なくとも１つの異種抗原に置換される、請求項２８に記載の核酸。
  36. 前記第２の核酸がコードする抗体軽鎖が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ、ＷＮＲＱＬＹＰＥＷＴＥＡＱＲＬＤ（配列番号３１）、ＡＮＣＳＶＹＤＦＦＶＷＬＨＹＹＳＶＲＤＴＬＬＧＰＧＲＰＹＲ（配列番号３３）及びＱＣＴＥＶＲＡＤＴＲＰＷＳＧＰＹＩＬＲＮＱＤＤＲＥＬＷＰＲＫＦＦ（配列番号３４）に置換された異種抗原を含む、請求項３５に記載の核酸。
  37. 前記第２の核酸がコードする抗体軽鎖が、ＣＤＲ２がＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ（配列番号３８）で置換された配列を含む、請求項３５に記載の核酸。
  38. 前記第２の核酸がコードする抗体軽鎖が、配列番号１０又は配列番号１１で示すアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載の核酸。
  39. 前記核酸がコードするポリペプチドが配列番号２で示すアミノ酸配列を含み、かつ、前記第２の核酸がコードする抗体軽鎖が配列番号１０で示すアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載の核酸。
  40. 前記核酸がコードするポリペプチドが配列番号３で示すアミノ酸配列を含み、かつ、前記第２の核酸がコードする抗体軽鎖が配列番号１１で示すアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載の核酸。
  41. 請求項１～４０のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
  42. 少なくとも１つの異種抗原をコードする第２の核酸を更に含む、請求項４１に記載のベクター。
  43. (a)配列番号１２及び配列番号１３；又は
    (b)配列番号１４及び配列番号１５
    で示す塩基配列を含む、請求項４１又は４２に記載のベクター。
  44. 配列番号１６及び配列番号１７で示す塩基配列を含む、請求項４１又は４２に記載のベクター。
  45. 配列番号１８及び配列番号１９で示す塩基配列を含む、請求項４１又は４２に記載のベクター。
  46. 配列番号２０、配列番号２１又は配列番号２２で示す塩基配列を含む、請求項４１又は４２に記載のベクター。
  47. 配列番号２３で示す塩基配列を含む、請求項４１又は４２に記載のベクター。
  48. 配列番号２４又は配列番号２５で示す塩基配列を含む、請求項４１又は４２に記載のベクター。
  49. ＤＮＡプラスミド又はドギーボーン（ｄｂＤＮＡ）ベクターである、請求項４１～４８に記載のベクター。
  50. 請求項１～４０のいずれか一項に記載の核酸又は請求項４１～４９のいずれか一項に記載のベクターがコードするペプチド。
  51. 請求項１～４０のいずれか一項に記載の核酸、請求項４１～４９のいずれか一項に記載のベクター及び／又は請求項５０に記載のペプチドを、必要に応じてアジュバントと組み合わせて、含むワクチン組成物。
  52. 医薬として使用するための、請求項１～４０のいずれか一項に記載の核酸、請求項４１～４９のいずれか一項に記載のベクター、請求項５０に記載のペプチド及び／又は請求項５１に記載のワクチン。
  53. 対象におけるがんの、場合によっては黒色腫の、予防又は治療に使用するための、請求項５２に記載の核酸、ベクター、ペプチド及び／又はワクチン。
  54. 対象における感染症の、場合によってはCOVID-19感染の、予防又は治療に使用するための、請求項５２に記載の核酸、ベクター、ペプチド及び／又はワクチン。
  55. ２種以上の異なる、請求項１～４０のいずれか一項に記載の核酸、請求項４１～４９のいずれか一項に記載のベクター、請求項５０に記載のペプチド又は請求項５１に記載のワクチンが、前記対象に投与される、請求項５３若しくは５４に記載の核酸、ベクター、ペプチド及び／又はワクチン。
  56. 請求項３３に記載の核酸及び請求項３４に記載の核酸の両者が、前記対象に投与される、請求項５４を引用する請求項５５に記載の核酸、ベクター、ペプチド及び／又はワクチン。
  57. 前記核酸、ベクター、ペプチド及び／又はワクチンが、前記対象に無針注射によって投与される、請求項５２～５６のいずれか一項に記載の核酸、ベクター、ペプチド及び／又はワクチン。
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