CN113588945A

CN113588945A - 一种基于化学发光的新型冠状病毒中和抗体检测试剂及试剂盒

Info

Publication number: CN113588945A
Application number: CN202110810071.8A
Authority: CN
Inventors: 范春雷
Original assignee: Hangzhou Meierde Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Meierde Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-06-30
Filing date: 2021-07-18
Publication date: 2021-11-02

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于化学发光的新型冠状病毒中和抗体检测试剂及试剂盒。一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂，为带磁珠标记的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒。本发明公开了一种试剂盒，包括磁珠标记的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒、吖啶酯标记的重组人ACE2蛋白、超顺磁珠、化学发光启动液等相关材料。本发明通过磁微粒化学发光法定量分析新型冠状病毒感染后或接种疫苗后体内是否产生抗新冠病毒S蛋白的中和抗体，并计算出中和抗体的抑制率，从而对感染新型冠状病毒后或接种疫苗后体内是否产生保护抗体做出定量分析，为新型冠状病毒后期的血清学流行病普查及疫苗接种指导提供第一手资料。

Description

一种基于化学发光的新型冠状病毒中和抗体检测试剂及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于化学发光的新型冠状病毒中和抗体检测试剂及试剂盒。

背景技术

冠状病毒在系统分类上属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具外套膜(envelope)的正链单股RNA病毒，直径约80～120nm，其遗传物质是所有RNA病毒中最大的，感染宿主包括人、鼠、蝙蝠、猪、猫、穿山甲、犬、狼、鸡、牛、蛇类、禽类等脊椎动物。2019新型冠状病毒(SARS-CoV-19,曾用名2019-nCoV)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。研究表明，其中SARS-CoV-19、SARS-CoV和HCoV-NL63是通过病毒包膜spike glycoprotein(S-protein)介导病毒与宿主细胞膜上的ACE2受体相互作用来感染人的。人感染了新型冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。血清中抗病毒IgM抗体是病毒复制和早期感染的标志，随后会有IgG抗体升高，因而血清学IgM/IgG抗体通常作为病毒感染的检测指标，且可判断近期感染和既往感染。对于感染后产生的抗病毒IgG抗体通常有防止机体再次被感染的作用。另一方面，防治新冠肺炎最直接和有效的方法是接种疫苗，通过接种新型冠状病毒疫苗，诱发机体产生抗新型冠状病毒的抗体，从而保护机体免受新型冠状病毒侵染。但是，无论是感染病毒后产生的自然免疫，还是接种疫苗后的人工免疫，并非病毒或疫苗诱生的所有抗体都能起到保护作用，只有那些能够阻断病毒和人体细胞结合的抗体才能起到较好的保护作用，这种抗体通常被称为中和抗体。目前，对疫情中或疫情后流行病血清学调查主要是检测血清总抗体；但如果能同时检测出中和抗体的含量则对预后及再次感染的风险评估具有重要意义。同样，对于接种疫苗后如果能在检测总抗体的同时检测中和抗体的含量，则对评估疫苗的效果及是否需要和何时再次免疫具有重要意义。

那么，如何检测出中和抗体呢？新型冠状病毒入侵人体细胞的机制是新型冠状病毒通过其表面的棘突蛋白S(配体)与人细胞膜上的ACE2受体特异性结合入侵人体细胞。研究表明，新冠病毒的S蛋白与人ACE2受体有非常强的结合力，亲和力为15nM(平衡解离常数)，比SARS病毒强10-20倍。S蛋白与ACE2结合的区域称为受体结合结构域(ReceptorBinding Domain,RBD)。所谓中和抗体就是以RBD为靶点并起到能够阻断S蛋白配体与ACE2受体结合的抗体。因此，我们可以建立配体-受体竞争法化学发光检测系统特异地分析血清中新冠病毒中和抗体的含量。

发明内容

针对现有技术存在的上述技术问题，我们根据配体与受体特异性结合的原理，发明了一种基于化学发光的新型冠状病毒中和抗体检测试剂及其制备方法。

一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂，为带磁珠标记的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒。

新型冠状病毒中和抗体检测试剂的制备方法，包括以下步骤：

1)将新型冠状病毒棘突蛋白的C末端依次接上人工设计的含跨膜序列的序列、蛋白定点生物素化序列，将其标记为nCoVS-TM-AVI；该人工设计序列经宿主细胞密码子优化后基因合成并亚克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的CMV启动子下，构建表达新型冠状病毒棘突蛋白S-定点生物素化序列融合蛋白的质粒，将其标记为pMLD-nCoVS；

2)将步骤1)构建好的质粒pMLD-nCoVS与pH1质粒、pH2质粒共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备nCoVS.copGFP慢病毒，并转染新的293V细胞，荧光显微镜下挑取高表达克隆，建立nCoVS.copGFP/293V稳转细胞系；

3)将步骤1)构建好的质粒pMLD-nCoVS与pH1质粒、pH2质粒共转染到步骤2)建立的nCoVS.copGFP/293V稳转细胞系，转染后48小时和72小时各收集培养上清液一次；合并两次收集的上清液，4℃,4000g离心10分钟，弃沉淀；取上清，4℃,20000g离心20分钟，弃沉淀；取上清，过0.45μm孔径滤膜后，4℃,85000g离心90分钟，弃上清；沉淀即为新型冠状病毒棘突蛋白假病毒，用pH7.4的PBS溶液重悬，制备含新型冠状病毒棘突蛋白S浓度≧1mg/ml的假病毒悬液；

4)用偶联抗新型冠状病毒棘突蛋白S蛋白抗体的磁珠纯化从步骤3)制备的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒重悬液，并制备成含新型冠状病毒棘突蛋白S浓度≧1mg/ml的假病毒PBS悬液；

5)将步骤4)制备的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒用生物素蛋白连接酶使其S蛋白C-末端定点生物素化，获得生物素化的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒，将其标记为nCoVSpsvirus-Biotin；

6)将链霉亲和素SA偶联于羧基磁珠，获得Mag-SA；将步骤5)获得的nCoVSpsvirus-Biotin与Mag-SA共孵育，获得牢固标记磁珠的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒，将其标记为Mag-nCoVSpsvirus。

优选的，

步骤1)中，所述新型冠状病毒棘突蛋白基因为GenBank:NC_045512.2中编码Spikeglycoprotein(GeneID:43740568)的基因序列；

所述人工设计的含跨膜序列的序列为TLTERLREKISRAFYNHGLLCASYPIPIILFTGFCILACCYPLLKLPL(ACCCTGACAGAGCGGCTGAGAGAGAAGATCAGCCGGGCCTTCTACAACCACGGCCTGCTGTGCGCCTCCTATCCCATCCCTATCATCCTGTTCACAGGCTTTTGTATCCTGGCCTGCTGTTACCCTCTGCTGAAGCTGCCACTG)，目的是使C末端的蛋白定点生物素化序列展示在病毒表面，便于生物素化以及标记；

所述蛋白定点生物素化序列为生物素蛋白连接酶BirA，其识别位点序列为GLNDIFEAQKIEWHE；

所述密码子优化的宿主为人；

其中，表达新型冠状病毒棘突蛋白和蛋白定点生物素化序列标签的人工设计序列经人宿主细胞密码子优化后的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，构建好的质粒所表达的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

新型冠状病毒中和抗体检测标志物用于制备检测新型冠状病毒中和抗体试剂盒的应用。

另外，本发明还提供了一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及其使用方法。

一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，包括带磁珠标记的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒。

优选的，还包括超顺磁珠标记的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒Mag-nCoVSpsvirus、吖啶酯标记的ACE2蛋白、阴性血清样本、洗涤缓冲液、化学发光启动液、多孔酶标板和酶标板磁架。

更优选的，所述阴性血清样本为来源于10个健康志愿者的血清混合标本；洗涤缓冲液为含0.5％-2％吐温80的0.01M PBS，pH7.2-7.4；化学发光启动液为稀碱H₂O₂、多孔酶标板为96孔酶标板。

所述检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：检测时，在96孔酶标板各孔中加入1μg/ml的吖啶酯标记的ACE2蛋白,50μl/孔；各孔分别加入阴性血清样本和待测样本，100μl/孔；混匀后各孔分别再加入0.1％的Mag-nCoVSpsvirus,50μl/孔；100rpm摇床，37℃孵育15分钟；酶标板置磁架上，弃上清；用洗涤缓冲液洗3遍；加入化学发光启动液，采用化学发光分析仪定量分析；

提供中和抗体的阴/阳性、抑制率指标；中和抗体的抑制率根据公式1来计算；检测样本中SARS-CoV-2中和抗体的阴/阳性判断可根据抑制率来设定，具体检测限可在10％-100％的抑制率范围内设定；

公式1:

所述检测试剂盒用于检测抗新型冠状病毒棘突蛋白中和抗体的用途。

本发明公开了一种基于化学发光的新型冠状病毒中和抗体检测方法及试剂盒制备，试剂盒包括磁珠标记的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒、吖啶酯标记的重组人ACE2蛋白、超顺磁珠、化学发光启动液等相关材料。本发明通过磁微粒化学发光法定量分析新型冠状病毒感染后或接种疫苗后体内是否产生抗新冠病毒S蛋白的中和抗体，并计算出中和抗体的抑制率，从而对感染新型冠状病毒后或接种疫苗后体内是否产生保护抗体做出定量分析，为新型冠状病毒后期的血清学流行病普查及疫苗接种指导提供第一手资料。

本发明的优势在于采用配体与受体相互作用的原理，可将样本中的抗新型冠状病毒棘突蛋白中和抗体检测出来，结合高灵敏度的磁粒化学发光法可精确定量分析样本中的抗新型冠状病毒棘突蛋白中和抗体。

本发明的另一个优势在于采用了新型冠状病毒棘突蛋白假病毒进行检测，更能反映抗体对病毒作用的真实情况。本发明可对感染新冠病毒后是否产生的自然免疫，以及接种疫苗后的人工免疫效果进行快速筛查和评估。

中和抗体的抑制率可作为新冠肺炎患者康复后和疫苗接种者血清保护抗体的评估。中和抗体的抑制率越高表明中和阻断抗体越多，保护作用越强。

附图说明

图1为pMLD-nCoVS质粒图谱。

图2为基于化学发光的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及检测原理示意图。

图3SEQ ID NO：1。

图4SEQ ID NO:2。

图5SEQ ID NO:2序列跨膜节段分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例1pMLD-nCoVS质粒构建

基因设计nCoVS-TM-AVI融合蛋白的核酸序列，经宿主(人)密码子优化后序列如SEQ ID NO：1所示(图3)，两端分别设计EcoR I和Not I限制性内切酶，表达后氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示(图4)；该氨基酸序列经蛋白分析软件分析TMHMM Server v.2.0(http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)确保S1功能区及C-末端的生物素化区均展示在膜外(图5)；基因合成序列后，通过连接酶切位点EcoR I和Not I，克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的CMV启动子下，构建真核表达质粒pMLD-nCoVS(如图1所示)。

实施例2建立nCoVS-TM-AVI.copGFP/293稳转细胞系

将pMLD-nCoVS质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备nCoVS-TM-AVI.copGFP慢病毒，并转染HEK293细胞，荧光显微镜下挑取克隆建立nCoVS-TM-AVI.copGFP/293稳转细胞系。具体步骤如下：

1)实验前一天对5个15cm dish进行细胞铺板，保证在转染之前，细胞均达70％-80％汇合度。

2)转染前1～2h，更换dish内培养基为无血清无抗生素的DMEM培养基。

3)准备一支15mL离心管，加入5mL 1×HBS，再依次加入100μg的pMLD-nCoVS质粒、100μg PH1/PH2混合质粒(PH1:PH2＝3:1)，轻轻混匀。

4)加入4mL PEI工作液(10μM)，轻轻混匀，置37℃孵育20min。

5)将转染复合液等分5份，均匀加入5个待转染的15cm dish内，轻轻晃动使复合物分布均匀。

6)转染6h后换液，更换为DMEM完全培养基(+10％FBS+1％青霉素/链霉素双抗)。

7)转染48h收集上清，于8000g离心15min后，冻于-80℃冰箱。

8)转染72h收集上清，于8000g离心15min后，合并转染48h所收集上清，过0.45μm滤膜，再以85000g离心2h。

9)弃上清，沉淀以1mL完全培养基(+10％FBS+1％双抗)重悬，感染HEK293细胞(6孔板1个孔，细胞60％-70％汇合度)。

10)感染的HEK293细胞培养2天后传代分至2个6孔板共12个孔；待分散的单个细胞形成克隆细胞团(约1周)，在荧光显微镜下挑取高表达绿色荧光蛋白的单克隆细胞团进行扩增培养建立nCoVS-TM-AVI.copGFP/293稳转细胞系。

实施例3 nCoVSpsvirus假病毒制备

1)将pMLD-nCoVS质粒与pH1质粒共转染到将建立的nCoVS-TM-AVI.copGFP/293V稳转细胞系，转染后48小时和72小时各收集培养上清液一次；合并两次收集的上清液，4℃,4000g离心10分钟，弃沉淀；取上清，4℃,20000g离心20分钟，弃沉淀；取上清，过0.45μm孔径滤膜后，4℃,85000g离心90分钟，弃上清；沉淀即为新型冠状病毒棘突蛋白假病毒，用pH7.4的PBS溶液重悬，制备含新型冠状病毒棘突蛋白S浓度≧1mg/ml的假病毒悬液。

2)用偶联抗新型冠状病毒棘突蛋白抗体的磁珠纯化制备新型冠状病毒棘突蛋白假病毒重悬液；洗脱后的nCoVS假病毒悬液，4℃,85000g离心90分钟，弃上清；沉淀用生物素蛋白连接酶(BirA酶)连接缓冲液(10mM ATP,10mM MgOAc,50μM D-Biotin)重悬，制备成含新型冠状病毒棘突蛋白S浓度≧1mg/ml的假病毒悬液。按产品说明书用BirA酶使nCoVS假病毒定点生物素化，即将生物素连在GLNDIFEAQKIEWHE序列中赖氨酸(K)上，获得生物素化nCoVS假病毒，将其标记为nCoVSpsvirus-Biotin；

实施例4 Mag-nCoVSpsvirus的制备

将链霉亲和素(SA)偶联于羧基磁珠，nCoVSpsvirus-Biotin即可通过SA-Biotin系统牢固地标记上磁珠。具体步骤如下：

1)按产品说明书的方法将链霉亲和素(SA)偶联于羧基磁珠，获得Mag-SA；

2)在pH7.4的PBS缓冲液中将Mag-SA和nCoVSpsvirus-Biotin以1:4的摩尔比混合(Mag-SA以标记的SA计)，37℃、150rpm振荡孵育1小时，获得Mag-nCoVSpsvirus；

3)8000g、4℃离心30分钟，去上清，沉淀用PB缓冲液(pH7.0、1％BSA、8％蔗糖、0.05％NaN₃)重悬。

实施例5基于化学发光的新型冠状病毒中和抗体检测方法及试剂盒的应用

基于本发明技术方案研发的基于化学发光的新型冠状病毒中和抗体快速检测试剂盒可应用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染后，以及新型冠状病毒疫苗接种后血清学中和抗体的快速检测评估，检测样本包括全血、血浆、血清。

试剂盒检测结果应用化学发光分析仪进行定量分析，并提供中和抗体的阴/阳性、抑制率等指标。

中和抗体的抑制率根据公式1来计算；检测样本中SARS-CoV-2中和抗体的阴/阳性判断可根据抑制率来设定，具体检测限可在10％-100％的抑制率范围内设定，如见表1。

表1检测样本中SARS-CoV-2中和抗体的阴/阳性判断

取45份无新冠病史、没有接种新冠疫苖的健康志愿者血清和45份新冠疫苖接种二次后7天以上的志愿者血清，用本发明技术方案研发的试剂盒进行检测，具体步骤如下：

1)取一块96孔酶标板，按每孔50μl Mag-nCoVSpsvirus+50μl，1μg/ml吖啶酯标记的ACE2蛋白+100μl样本血清。其中设6个孔为重复阴性对照标准品血清，其6个孔光量值的平均值做为阴性对照的光量值。

2)37℃、100rpm振荡孵育30min。

3)用磁架吸住磁珠，弃上清。

4)每孔加入0.01M PBS(pH7.4)200μl，100rpm振荡洗涤半分钟。

5)重复3)、4)两次；每孔加入发光启动液100μl，化学发光分析仪检测。

6)按抑制率公式计算各待测样本抗新冠病毒中和抗体的抑制率，结果见表2。

表2志愿者待测样本血清抗新冠病毒中和抗体的抑制率

序列表

<110> 杭州迈尔德生物科技有限公司

<120> 一种基于化学发光的新型冠状病毒中和抗体检测试剂及试剂盒

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4103

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaattcatgt tcgtgttcct ggtgctgctg cctctggtgt cctcccagtg tgtgaacctg 60

accaccagaa cccagctgcc tcctgcctac accaatagct tcaccagagg cgtgtactac 120

cccgataagg tgtttaggtc cagcgtgctg cactccaccc aggacctgtt tctgcctttc 180

tttagcaatg tgacctggtt ccacgccatc cacgtgagcg gcaccaacgg caccaagagg 240

tttgacaacc ctgtgctgcc cttcaatgat ggcgtgtact ttgcctccac cgagaagtcc 300

aacatcatca ggggctggat ctttggcacc accctggact ccaagaccca gagcctgctg 360

atcgtgaata acgccaccaa tgtggtcatt aaggtgtgcg agtttcagtt ctgcaatgac 420

cctttcctgg gcgtgtacta tcacaagaac aacaagagct ggatggagag cgagtttaga 480

gtgtacagct ccgccaacaa ttgtaccttt gagtacgtgt cccagccctt cctgatggat 540

ctggagggca agcagggcaa ctttaagaat ctgagagagt ttgtgttcaa gaatatcgac 600

ggctacttca agatctacag caagcacacc cccatcaacc tggtgaggga cctgcctcag 660

ggcttttccg ccctggagcc tctggtggac ctgcccatcg gcatcaacat caccagattc 720

cagaccctgc tggccctgca cagaagctac ctgacccccg gcgattcctc cagcggctgg 780

accgctggcg ccgctgctta ctacgtgggc tacctgcagc ccaggacctt tctgctgaag 840

tacaacgaga acggcaccat caccgacgcc gtggattgcg ccctggaccc tctgtccgag 900

acaaagtgca ccctgaagtc cttcaccgtg gagaagggca tctaccagac cagcaatttc 960

agggtgcagc ccaccgagag catcgtgagg tttcctaata tcaccaacct gtgccctttt 1020

ggcgaggtgt tcaatgccac cagattcgcc agcgtgtacg cctggaatag gaagaggatc 1080

tccaactgcg tggccgacta ctccgtgctg tacaactccg cctcctttag caccttcaag 1140

tgttacggcg tgagccctac caagctgaac gatctgtgct tcaccaacgt gtacgccgac 1200

agctttgtga tcaggggcga cgaggtgaga cagatcgccc ctggccagac cggcaagatc 1260

gccgattaca attacaagct gcctgacgat ttcaccggct gcgtgatcgc ctggaatagc 1320

aacaacctgg atagcaaggt gggcggcaat tacaattacc tgtacaggct gttcagaaag 1380

tccaacctga agcccttcga gagggacatc agcaccgaga tctaccaggc cggcagcacc 1440

ccttgtaatg gcgtggaggg cttcaattgc tacttccccc tgcagagcta cggcttccag 1500

cctaccaatg gcgtgggcta ccagccctac agagtggtgg tgctgagctt cgagctgctg 1560

cacgcccccg ccaccgtgtg tggacctaag aagagcacca acctggtgaa gaataagtgt 1620

gtgaacttca attttaacgg cctgaccggc accggcgtgc tgaccgagtc caataagaag 1680

tttctgcctt tccagcagtt tggcagggac atcgccgaca ccaccgatgc cgtgagggac 1740

ccccagaccc tggagatcct ggacatcacc ccctgcagct ttggcggcgt gagcgtgatc 1800

acccctggca ccaacaccag caatcaggtg gccgtgctgt accaggacgt gaattgcacc 1860

gaggtgcccg tggccatcca cgccgatcag ctgaccccca cctggagggt gtacagcacc 1920

ggcagcaatg tgtttcagac cagggccggc tgcctgatcg gcgctgagca cgtgaataat 1980

tcctacgagt gtgacatccc tatcggcgcc ggcatctgcg cctcctacca gacccagacc 2040

aattccccca gaagagccag atccgtggcc agccagagca tcatcgccta caccatgtcc 2100

ctgggcgccg agaacagcgt ggcctacagc aataatagca tcgccatccc caccaatttt 2160

accatcagcg tgaccaccga gatcctgcct gtgtccatga ccaagaccag cgtggattgc 2220

accatgtaca tctgcggcga ttccaccgag tgcagcaatc tgctgctgca gtacggcagc 2280

ttctgcaccc agctgaacag ggccctgacc ggcatcgccg tggagcagga caagaacacc 2340

caggaggtgt tcgcccaggt gaagcagatc tacaagaccc ctcccatcaa ggatttcggc 2400

ggcttcaact tcagccagat cctgcctgat cctagcaagc ccagcaagag atcctttatc 2460

gaggatctgc tgttcaataa ggtgaccctg gccgacgccg gcttcatcaa gcagtacggc 2520

gactgtctgg gcgacatcgc cgccagggat ctgatctgcg cccagaagtt caacggcctg 2580

accgtgctgc cccccctgct gacagacgag atgatcgccc agtacaccag cgccctgctg 2640

gccggaacca tcacctccgg ctggaccttc ggcgccggag ctgctctgca gatccccttt 2700

gccatgcaga tggcctacag gtttaacggc atcggcgtga cccagaacgt gctgtacgag 2760

aatcagaagc tgatcgccaa ccagttcaat agcgccatcg gcaagatcca ggactccctg 2820

tccagcaccg cctccgccct gggaaagctg caggacgtgg tgaatcagaa cgcccaggcc 2880

ctgaataccc tggtgaagca gctgtcctcc aattttggcg ccatctccag cgtgctgaat 2940

gatatcctga gcagactgga taaggtggag gccgaggtgc agatcgacag gctgatcacc 3000

ggcagactgc agagcctgca gacctacgtg acccagcagc tgatcagggc cgccgagatc 3060

agagccagcg ccaacctggc cgccaccaag atgtccgagt gtgtgctggg ccagtccaag 3120

agagtggact tttgcggcaa gggctaccac ctgatgagct tccctcagag cgccccccac 3180

ggcgtggtgt ttctgcacgt gacctacgtg cctgcccagg agaagaactt taccaccgcc 3240

cctgccatct gtcacgatgg caaggcccac ttccctaggg agggcgtgtt tgtgagcaac 3300

ggcacccact ggttcgtgac ccagagaaac ttttacgagc cccagatcat caccaccgac 3360

aacacctttg tgtccggcaa ttgcgacgtg gtcattggca tcgtgaataa caccgtgtac 3420

gaccccctgc agcctgagct ggatagcttc aaggaggagc tggacaagta ctttaagaat 3480

cacacctccc ctgatgtgga cctgggcgat atctccggca tcaatgccag cgtggtgaac 3540

atccagaagg agatcgacag actgaatgag gtggccaaga atctgaatga gagcctgatc 3600

gacctgcagg agctgggcaa gtacgagcag tacatcaagt ggccctggta catctggctg 3660

ggctttatcg ccggcctgat cgccatcgtg atggtgacca tcatgctgtg ttgtatgacc 3720

agctgttgca gctgcctgaa gggctgttgc agctgtggct cctgttgtaa gtttgatgag 3780

gatgattccg agcccgtgct gaagggcgtg aagctgcact acaccggctc cggcggctcc 3840

ggaggaagcg ctggaggagg actgaacgat atctttgagg cccagaagat cgagtgggga 3900

tccaccctga cagagcggct gagagagaag atcagccggg ccttctacaa ccacggcctg 3960

ctgtgcgcct cctatcccat ccctatcatc ctgttcacag gcttttgtat cctggcctgc 4020

tgttaccctc tgctgaagct gccactggga ctgaacgata tcttcgaggc ccagaagatc 4080

gagtggcacg agtaggcggc cgc 4103

<210> 2

<211> 1363

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala

675 680 685

Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser

690 695 700

Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile

705 710 715 720

Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val

725 730 735

Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu

740 745 750

Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr

755 760 765

Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln

770 775 780

Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe

785 790 795 800

Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser

805 810 815

Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

820 825 830

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

835 840 845

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

850 855 860

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

865 870 875 880

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

885 890 895

Pro Phe Ala Met Met Ala Gly Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val

900 905 910

Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe

915 920 925

Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser

930 935 940

Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu

945 950 955 960

Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser

965 970 975

Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val

980 985 990

Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr

995 1000 1005

Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn

1010 1015 1020

Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg

1025 1030 1035 1040

Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser

1045 1050 1055

Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln

1060 1065 1070

Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala

1075 1080 1085

His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe

1090 1095 1100

Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn

1105 1110 1115 1120

Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn

1125 1130 1135

Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu

1140 1145 1150

Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly

1155 1160 1165

Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile

1170 1175 1180

Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp

1185 1190 1195 1200

Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr

1205 1210 1215

Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr

1220 1225 1230

Ile Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys

1235 1240 1245

Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro

1250 1255 1260

Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr Gly Ser Gly Gly Ser Gly

1265 1270 1275 1280

Gly Ser Ala Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile

1285 1290 1295

Glu Trp Gly Ser Thr Leu Thr Glu Arg Leu Arg Glu Lys Ile Ser Arg

1300 1305 1310

Ala Phe Tyr Asn His Gly Leu Leu Cys Ala Ser Tyr Pro Ile Pro Ile

1315 1320 1325

Ile Leu Phe Thr Gly Phe Cys Ile Leu Ala Cys Cys Tyr Pro Leu Leu

1330 1335 1340

Lys Leu Pro Leu Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu

1345 1350 1355 1360

Trp His Glu

Claims

1.一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂，为带磁珠标记的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒Mag-nCoVSpsvirus。

2.权利要求1所述新型冠状病毒中和抗体检测试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述新型冠状病毒中和抗体检测试剂的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述新型冠状病毒棘突蛋白基因为GenBank:NC_045512.2中编码Spikeglycoprotein(GeneID:43740568)的基因序列；

所述人工设计的含跨膜序列的序列为TLTERLREKISRAFYNHGLLCASYPIPIILFTGFCILACCYPLLKLPL(ACCCTGACAGAGCGGCTGAGAGAGAAGATCAGCCGGGCCTTCTACAACCACGGCCTGCTGTGCGCCTCCTATCCCATCCCTATCATCCTGTTCACAGGCTTTTGTATCCTGGCCTGCTGTTACCCTCTGCTGAAGCTGCCACTG)；

所述密码子优化的宿主为人；

4.权利要求1所述新型冠状病毒中和抗体检测试剂用于制备检测新型冠状病毒中和抗体试剂盒的应用。

5.一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，包括权利要求1所述新型冠状病毒中和抗体检测试剂。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于：还包括超顺磁珠标记的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒Mag-nCoVSpsvirus、吖啶酯标记的ACE2蛋白、阴性血清样本、洗涤缓冲液、化学发光启动液、多孔酶标板和酶标板磁架。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于：所述阴性血清样本为来源于10个健康志愿者的血清混合标本；洗涤缓冲液为含0.5％-2％吐温80的0.01M PBS，pH7.2-7.4；化学发光启动液为稀碱H₂O₂、多孔酶标板为96孔酶标板。

8.权利要求6或7所述检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：检测时，在96孔酶标板各孔中加入1μg/ml的吖啶酯标记的ACE2蛋白,50μl/孔；各孔分别加入阴性血清样本和待测样本，100μl/孔；混匀后各孔分别再加入0.1％的Mag-nCoVSpsvirus,50μl/孔；100rpm摇床，37℃孵育15分钟；酶标板置磁架上，弃上清；用洗涤缓冲液洗3遍；加入化学发光启动液，采用化学发光分析仪定量分析；

公式1:

9.权利要求6或7所述检测试剂盒用于检测抗新型冠状病毒棘突蛋白中和抗体的用途。