KR101481362B1

KR101481362B1 - 수두대상포진 바이러스의 당단백질e를 발현하는 인간 세포를 이용한 수두대상포진 바이러스에 대한 면역력 진단 방법

Info

Publication number: KR101481362B1
Application number: KR20140010842A
Authority: KR
Inventors: 박준수; 박송용; 박천일; 박호선; 박락현
Original assignee: 연세대학교 원주산학협력단
Priority date: 2014-01-28
Filing date: 2014-01-28
Publication date: 2015-01-15
Also published as: WO2015115767A1

Abstract

본 발명은 수두대상포진 바이러스의 당단백질E를 발현하며, FAMA (fluorescent antibody to membrane antigen)법에서 수두대상포진 바이러스에 감염된 세포를 대체하여 항-수두대상포진 바이러스 항체의 존재여부를 시료에서 검출하기 위해 이용되는 것을 특징으로 하는 분리된 인간 세포주 및 이를 이용한 수두대상포진 바이러스에 대한 면역력 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 수두대상포진 바이러스를 사용하지 않고, 수두대상포진 바이러스의 항체 유무를 용이하게 측정할 수 있으므로 수두대상포진 진단시 진단 관련 의료진들이 바이러스 감염으로부터 보호되어 안전하게 진단할 수 있고, 감염성 바이러스 처리를 위한 특별한 처리 및 시설을 필요치 않아서 경제적으로 매우 우수하다.

Description

수두대상포진 바이러스의 당단백질E를 발현하는 인간 세포를 이용한 수두대상포진 바이러스에 대한 면역력 진단 방법{Method for diagnosis of anti-VZV antibody in a human serum using human cell line expressing VZV glycoprotein E}

본 발명은 수두대상포진 바이러스의 당단백질E를 발현하는 인간 세포를 이용한 수두대상포진 바이러스에 대한 면역력 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 수두대상포진 바이러스의 당단백질E를 발현하며, FAMA (fluorescent antibody to membrane antigen)법에서 수두대상포진 바이러스에 감염된 세포를 대체하여 항-수두대상포진 바이러스 항체의 존재여부를 시료에서 검출하기 위해 이용되는 것을 특징으로 하는 분리된 인간 세포주 및 이를 이용한 수두대상포진 바이러스에 대한 면역력 진단 방법에 관한 것이다.

수두 및 대상포진 질환은 수두대상포진 바이러스(Varicella zoster virus, VZV)의 감염에 의해서 일어나는 바이러스 감염성 질환이다.

수두는 어린아이의 피부에 붉고 둥근 발진이 났다가 얼마 뒤에 작은 물집으로 변하는 바이러스성 전염병이다. 소아에게서 흔히 발생하며, 감염성이 매우 높은 질환으로 기침 등을 통해 공기중으로 감염되거나 수포와의 접촉을 통해서 감염된다. 수두는 가족내 환자가 있을 경우, 항체를 가지지 않은 가족 구성원에게 80~90%가 감염될 정도로 감염성이 높은 질환이다 (질병관리센터 보고서, 기현옥, 2011). 수두환자의 5%는 성인이며, 그 증세는 소아와 달리 심각하여 기간도 2주에 이르고 폐렴 등의 합병증도 생기며, 심각한 경우 사망에 이를 수 있다.

수두는 수포성대상포진바이러스(varicella-zoster virus)에 의해서 발생하는데, 이 바이러스는 대상포진을 일으키는 바이러스이기도 하다. 수두는 이 바이러스에 대한 첫 노출로 나타나는 임상반응이며, 환자가 임상적으로 회복한 뒤에 이 바이러스는 신경세포에 정주(定住)하고 있다가 몇 년 뒤에 다시 활동할 수도 있는데 이 때, 신경을 따라 피부에 이르러 대상포진(帶狀疱疹 herpes zoster)을 일으킨다.

대상포진은 수두대상포진 바이러스가 잠복해 있다가 면역력 저하 등에 의해서 활성화될 때 나타나는 질환으로 피부 발진과 심한 통증을 유발하는 질환으로 최근 들어서 급격히 증가하는 추세이다. 대상포진에 대한 감수성은 혈청내에 수두대상포진 바이러스의 항체 유무에 따라서 판별할 수 있는데, 수두대상포진 바이러스에 대한 항체를 가지고 있을 경우, 바이러스 감염에 의해서 나타나는 질환에 대해서 면역력을 가지고 있다고 알려져 있다 (Breuer et al., 2008).

현재 수두대상포진 바이러스에 대한 면역력은 FAMA(Fluorescent Antibody to Membrane Antigen) 방법에 의해서 측정하는 것이 “Gold Standard"로 알려져 있으며, 1974년부터 사용되었다. FAMA 방법은 인간 섬유아세포주인 MRC5에 수두대상포진 바이러스를 감염시킨 후, 사람의 혈액에서 분리한 혈장 속의 항체가 MRC5 세포표면에 표출되는 수두대상포진 당바이러스 단백질과 결합하여 형광 염색되는 방법이다 (Zaia et al., 1977). 그러나 기존의 FAMA 방법으로 바이러스에 대한 항체 존재 여부를 측정할 경우 매번 세포주에 바이러스를 감염시켜 주어야 하는 단점이 있다.

아울러, 실험 중 수두대상포진 바이러스를 다루고, 이 바이러스가 공기중으로도 전파되고, 전염성이 매우 높기 때문에 바이러스에 감염되지 않았던 실험자에게 수두와 같은 질환을 일으킬 수 있고, 특히 면역력이 없는 성인에게 감염될 경우 심각한 문제를 일으킬 있기 때문에 FAMA 방법은 위험한 방법이며, 또한 감염성이 있는 바이러스를 가지고 실험하기 때문에 전처리 및 후처리에 비용이 추가적으로 들어가는 단점이 있다.

Breuer et al., Use and Limitations of Varicella-Zoster Virus-Specific Serological Testing to Evaluate Breakthrough Disease in Vaccinees and to Screen for Susceptibility to Varicella (2008) J. Infectious Diseases 1997:S147-151 Zaia et la., Antibody to Varicella-Zoster Virus-Induced Membrane Antigen: Immunofluorescence Assay Using Monodisperse Glutaraldehyde-Fixed Target Cells (1977) J. Infectious Diseases 136:519-530

이에 본 발명자들은 위험한 수두대상포진 바이러스를 사용하지 않고, 안전하게 수두대상포진 바이러스에 대한 항체를 측정하는 방법을 개발하기 위하여 연구하던 중, FAMA 법에서의 세포주에 수두대상포진 바이러스의 감염시키는 단계 대신에 바이러스의 항원 단백질인 당단백질 E를 세포에서 발현시키는 경우 수두대상포진 바이러스를 사용하지 않고, 안전하게 수두대상포진 바이러스에 대한 항체를 측정할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 수두대상포진 바이러스의 당단백질 E를 발현하며, FAMA (fluorescent antibody to membrane antigen)법에서 수두대상포진 바이러스에 감염된 세포를 대체하여 항-수두대상포진 바이러스 항체의 존재여부를 시료에서 검출하기 위해 이용되는 것을 특징으로 하는 분리된 인간 세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은

(a) 검사가 필요한 개체의 혈액에서 혈청을 분리하는 단계;

(b) 상기 혈청을 제1항의 세포주와 접촉시켜 상기 혈청 내의 항체와 상기 세포주 표면의 당단백질 E를 항원항체 반응에 의해 특이적으로 결합시키는 단계;

(c) 상기 결합된 항체와 특이적으로 결합하며, 형광 표지가 부착된 제2항체를 첨가하여 상기 항체와 상기 제2항체를 항원항체 반응에 의해 특이적으로 결합시키는 단계; 및

(d) 상기 형광 표지를 검출하는 단계를 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검출방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 세포주를 유효성분으로 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 세포주를 유효성분으로 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수두대상포진 바이러스의 당단백질E를 발현하며, FAMA (fluorescent antibody to membrane antigen)법에서 수두대상포진 바이러스에 감염된 세포를 대체하여 항-수두대상포진 바이러스 항체의 존재여부를 시료에서 검출하기 위해 이용되는 것을 특징으로 하는 분리된 인간 세포주를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 검사가 필요한 개체의 혈액에서 혈청을 분리하는 단계;

(d) 상기 형광 표지를 검출하는 단계를 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검출방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 세포주를 유효성분으로 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 세포주를 유효성분으로 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검출용 키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 수두대상포진 바이러스의 당단백질E를 발현하며, FAMA (fluorescent antibody to membrane antigen)법에서 수두대상포진 바이러스에 감염된 세포를 대체하여 항-수두대상포진 바이러스 항체의 존재여부를 시료에서 검출하기 위해 이용되는 것을 특징으로 하는 분리된 인간 세포주를 제공한다.

본 발명의 수두대상포진 바이러스 (varicella zoster virus, VZV)는 DNA 바이러스의 헤르페스 바이러스과에 속하는 바이러스의 일종으로, 학명은 HHV-3 (human herpesvirus 3)이다. 수두의 원인바이러스로 알려져 있는 바이러스이다.

수두대상포진 바이러스의 당단백질 E는 수두대상포진 바이러스의 ORF68에 의해서 발현되는 유전자로써 예전에는 gpI로 불렸으며, 수두대상포진 바이러스 감염시에 세포막에 발현되는 제1타입의 단백질(type 1 transmembrane protein)이다. 당단백질 E는 623개의 아미노산을 가지고 있으며 바이러스 감염된 세포에서 흔하게 발현된다.

본 발명에서 수두대상포진 바이러스의 당단백질 E는 형질전환 (또는 형질감염, 이하 같음)된 세포주의 세포막 표면에 표출된 것을 특징으로 하며, 세포막 표면의 당단백질 E가 시료내의 항체와 특이적으로 결합할 수 있게 된다.

바람직하게는 본 발명의 당단백질 E는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

당단백질 E의 발현을 위해서 세포주는 형질전환된 것이며, 바람직하게는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 (필요에 따라서는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 것일 수 있다. 상기에서 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지거나 서열번호 2의 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명에서 ‘프로모터’란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, ‘작동 가능하게 연결된다(operably linked)’는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있다.

본 발명의 세포로의 발현벡터의 형질전환은 당업계에 공지된 형질전환방법, 예를 들면, 인산칼슘법, 염화칼슘법, 염화루비듐법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션(electroporation), 입자 총 충격 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 자성나노입자 매개법(magnetic nanoparticle-mediated method) 등에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 세포주는 형질전환된 수두대상포진 바이러스의 당단백질 E가 발현되고 세포막으로 타겟팅되어 세포주의 표면으로 표출될 수 있는 세포내 발현 및 타겟팅 기작을 가진 것이라면 제한없이 이용될 수 있으나, 바람직하게는 인간의 세포주일 수 있으며, 더 바람직하게는 HEK293, HeLa, H1299 세포주가 이용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료" 또는 "시료"는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 조직, 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있으며, 바람직하게는 혈청일 수 있다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물로부터 수득될 수 있으며, 가장 바람직하게는 인간로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 균질화(homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 FAMA 방법에서 사람의 항체가 인식하는 항원으로 예상되는 수두대상포진바이러스의 당단백질(glycoprotein)들을 클로닝하여, 각각의 인간 섬유아 세포주인 HEK293세포에서 발현 후, 수두대상포진바이러스의 표준항체를 이용하여 염색하였다. 그 결과, 수두대상포진바이러스의 유전자 중 당단백질E(glycoprotein E, gE)를 코드하는 단백질이 FAMA 방법에서 가장 강한 신호를 나타낸다는 것을 발견하여 당단백질E를 발현하는 세포주가 FAMA 방법에서 바이러스의 감염 없이 사용될 수 있는 세포주임을 확인하였다. 본 방법은 바이러스를 사용하지 않는 안전한 수두대상포진 바이러스 진단을 위한 당단백질E를 발현하는 인간 세포주를 제공한다.

아울러, 본 발명은

(a) 검사가 필요한 개체의 혈액에서 혈청을 분리하는 단계;

(b) 상기 혈청을 제1항의 세포주와 접촉시켜 상기 혈청 내의 항체와 상기 세포주 표면의 당단백질 E를 항원항체 반응에 의해 특이적으로 결합시키는 단계; 및

본 발명의 수두대상포진 바이러스 검출방법을 이하에서 보다 상세히 설명한다.

(a) 단계는 검사가 필요한 개체의 혈액에서 혈청을 분리하는 단계이다.

(a) 단계에서의 혈액 또는 혈청의 분리는 당업계에서 통상적으로 사용되는 채혈법 및 원심분리에 의한 혈청의 분리 방법이 이용될 수 있다. 바람직하게는 정맥혈에서 혈액을 채취하여 혈액을 분리하고, 혈액을 실온에 20~30분 세워 놓아 혈액 응고 과정이 끝난 후에, 1,500rpm에서 10분간 원심분리하여 용기의 상층에 모아진 혈청을 회수할 수 있다.

(b) 단계는 상기 혈청을 본 발명의 세포주와 접촉시켜 상기 혈청 내의 항체와 상기 세포주 표면의 당단백질 E를 항원항체 반응에 의해 특이적으로 결합시키는 단계이다. 바람직하게는 혈청은 버퍼에 희석되어 사용될 수 있으며, 상기 버퍼는 당업계에서 혈청 희석에 사용되는 통상의 버퍼일 수 있으나, 바람직하게는 PBS (phosphate buffered saline)일 수 있다.

(c) 단계는 상기 결합된 항체와 특이적으로 결합하며, 형광 표지가 부착된 제2항체(사람의 항체를 인지하는 항-사람 혈청에 FITC등의 형광물질이 결합된 항체)를 첨가하여 상기 항체와 상기 제2항체를 항원항체 반응에 의해 특이적으로 결합시키는 단계이다.

(d) 단계는 상기 형광 표지를 검출하는 단계이다.

형광 표지의 검출은 표지에 따른 공지된 검출방법을 이용할 수 있다. 형광 표지로는 형광단백질, 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 그 중 형광단백질로는 당 업계에 공지된 것을 사용할 수 있으며 예를 들어, GFP(Green Fluorescent Protein); EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein); RFP(Red Fluorescent Protein); mRFP(Monomeric Red Fluorescent Protein); DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein); CFP(Cyan Fluorescent Protein); CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein); YFP(Yellow Fluorescent Protein); AzG(Azami Green), HcR(HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein), BFP(Blue Fluorescent Protein) 등이 있다.

본 발명의 검출방법을 통해 개체의 수두대상포진 바이러스에 대한 항체 존부가 검출된다. 따라서, 본 발명의 검출방법은 개체의 수두대상포진 바이러스에 대한 면역력 측정에 이용될 수 있으며, 수두대상포진 바이러스에 대한 항체가 검출되는 경우 면역력을 가지고 있는 것으로, 항체가 검출되지 않는 경우 면역력을 가지고 있지 않는 것으로 판별할 수 있다. 형광의 세기를 정량적으로 측정하여 면역력의 양을 정량적으로 산출하는 것도 가능하다.

한편, 본 발명은 본 발명의 세포주를 유효성분으로 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검출용 조성물을 제공한다. 아울러, 본 발명은 본 발명의 세포주를 유효성분으로 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 본 발명의 세포주이외에 FAMA 방법의 수행에 사용되는 당 업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 필요에 따라 각 성분들을 혼합하는데 사용될 튜브, 웰 플레이트, 사용방법을 기재한 지시자료 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 FAMA 방법들에서 이용될 수 있는 실험과정, 시약 및 반응 조건은 수두 대상포진 바이러스의 세포주 감염 과정을 제외한 종래 당업계에서 통상적으로 알려져 있는 것들을 모두 이용할 수 있으며, 이는 당업자에게 자명한 일이다.

따라서, 본 발명의 세포주 또는 이를 이용하는 수두 대상포진 바이러스 검출방법에 의하면, 수두대상포진 바이러스를 사용하지 않고, 수두대상포진 바이러스의 항체 유무를 용이하게 측정할 수 있으므로 수두대상포진 진단시 진단 관련 의료진들이 바이러스 감염으로부터 보호되어 안전하게 진단할 수 있고, 감염성 바이러스 처리를 위한 특별한 처리 및 시설을 필요치 않아서 경제적으로 매우 우수하다.

도 1은 VZV 혈청을 이용하여 VZV 감염 세포와 VZV glycoprotein E를 발현시킨 세포를 웨스턴 블롯으로 비교한 것이다. 4번이 glycoprotein E를 293T에서 발현시킨 것으로 VZV에 감염된 세포에서 나오는 가장 진한 밴드와 일치한다.
도 2는 VZV에 감염된 HEK293세포를 International standard VZV WHO 항체로 측정한 것 (상부 패널)이며, HEK293세포에 당단백질 E를 발현시키고, 형광 염색약으로 염색한 것 (하부 패널)이다. 당단백질E의 발현만으로도 수두 대상포진 바이러스 전체를 사용하는 FAMA와 비슷한 결과를 얻음을 알 수 있다.
도 3은 당단백질E를 발현시킨 세포를 이용하여 FAMA assay를 한 것이다. VZV에 대한 항체가 거의 없는 혈장과 항체가 많은 혈장을 이용하여 당단백질E로 염색한 결과이다. 염색된 패턴이 다르고 염색 강도가 크게 차이나는 것을 알 수 있다.
도 4는 환자의 혈장을 분리하여 본 발명의 방법에 따라서 FAMA를 수행한 사진, 앞의 세사람은 기존 진단 방법으로 “음성”으로 알려진 사람들이고, 나머지는 양성인 사람들로 결과가 일치함을 알 수 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

당단백질의 클로닝 및 형질전환 세포주의 제조

<1-1> 수두대상포진 바이러스의 당단백질의 클로닝

수두대상포진 바이러스가 감염된 세포에서 바이러스 게놈을 Hirt Extraction Method로 분리하여 5' 프라이머로 ATGGGGACAGTTAATAAACC (서열번호 3)를 사용하고 3' 프라이머로 TCACCGGGTCTTATCTATATAC (서열번호 4)를 사용하여 PCR중합방법을 이용하여 증폭하였고, 이를 pcDNA4HisMax vector (invitrogen)에 클로닝하였다.

<1-2> 형질전환 293T 세포주의 제조

상기 실시예 <1-1>에서 클로닝한 각각의 당단백질 유전자를 리포좀을 이용하는 DNA 도입(transfection)방법에 의해서 293T세포에 도입하였다. 37℃ 5% CO₂의 조건에서 48시간 배양하여 각각의 당단백질이 발현되어 세포막에 표출되도록 하였다.

상기 세포주의 단백질을 분리하여 웨스턴 블럿으로 단백질 발현을 확인하였다. 대조군으로 수두대상포진 바이러스에 감염된 세포를 사용하였다(VZV infected cell).

그 결과, 도 1에서 보듯이, 수두대상포진 바이러스가 감염된 세포에서 강하게 발현되는 유전자와 거의 같은 크기에서 당단백질E가 발현되어서 당단백질E가 수두대상포진 바이러스에 감염시에 가장 강하게 발현되어서 FAMA방법에 적합할 것으로 예상되었다. 따라서, 이후의 실험에서 대상 항원으로 당단백질 E를 사용하도록 하였다.

<1-3> 형질전환 HEK293 세포주의 제조

HEK293세포에 상기 실시예 1-1에서 제조한 당단백질E를 발현하는 플라스미드를 리포좀을 이용하는 방법으로 도입하여 발현되도록 하였다.

대조구 세포로 MRC5 세포에 수두대상포진 바이러스를 감염시키는 일반적인 방법으로 각각 당단백질E를 발현시키는 방법으로 수두대상포진 바이러스에 감염된 세포주를 제조하였다.

< 실시예 2>

본 발명의 형질전환 세포주를 이용한 FAMA 방법 수행

<2-1> 종래의 FAMA 방법과의 비교

상기 실시예 1에서 제조된 당단백질을 발현하는 HEK293세포주가 FAMA 방법에 의해서 수두대상포진 바이러스에 대한 항체 검출이 용이하게 이루어지는지 확인하기 위하여 종래의 FAMA 방법과 본 발명의 세포주를 이용하는 것으로 개량한 FAMA 방법으로 나누어 각각 수행하였다. HEK293세포에 상기 실시예 1-1의 당단백질E를 발현하는 플라스미드를 리포좀을 이용하여 DNA를 도입한 후, 24시간 후에 FAMA 방법으로 염색하였다.

그 결과 도 2에서 보듯이, VZV에 감염된 HEK293세포를 International standard VZV WHO 항체로 측정한 것 (상부 패널)과 대비하여 본 발명의 방법에 의한 것 (하부 패널)이 당단백질E의 발현만으로도 수두 대상포진 바이러스 전체를 사용하는 FAMA와 비슷한 결과를 얻어 본 발명의 세포주를 이용하는 경우 FAMA 방법을 개량하여 수행할 수 있음을 알 수 있었다.

<2-2> 항체 유무에 따른 구분가능여부 확인

FAMA 방법이 미지의 시료에서의 수두대상포진 바이러스에 대한 항체의 존재여부를 확인하는 것이므로 본 발명의 세포주를 이용하는 경우에도 항체 유무에 따른 구분이 가능한지를 확인하였다. HEK293세포에 당단백질E를 발현하는 플라스미드를 리포좀을 이용하여 DNA를 도입한 후, 24시간 후에 FAMA 방법으로 염색하였다. 염색시에는 기존의 방법으로 수두대상포진 바이러스에 대한 항체가 없는 것으로 알려진 사람의 항체(제1열)와 수두대상포진 바이러스에 대한 항체가 높은 것으로 알려진 사람의 항체(제2열, 제3열)를 이용하여 테스트를 하였다.

그 결과, 도 3에서 보듯이, VZV에 대한 항체가 거의 없는 혈장에서는 항체 결합을 반영하는 염색이 그다지 나타나지 않은데에 비해서, 항체가 많은 혈장을 이용하여 당단백질E로 염색한 것은 염색 강도가 매우 크게 나타남을 확인하여 염색 결과에 따라 혈장에서의 항체 여부를 확인할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

환자 시료에서의 본 발명의 방법에 따른 항체의 검출

16 명의 환자의 시료에서 각각 혈액을 채취한 다음, 혈장만을 수득하였다. 각각의 혈장 시료에 대해서 상기 실시예 2-1에 기재된 본 발명의 방법에 따라서 수두대상포진 바이러스의 항체를 검출하였다.

그 결과, 도 4에서 보듯이, 음성대조군으로 기존의 방법을 통해 항체가 거의 없다고 알려진 환자들 (#41, #43, #61)에서는 음성의 결과를 얻었고, 기존의 방법으로 항체가 있다고 알려진 환자에게서는 양성의 결과를 얻어서, 새로운 방법이 기존의 방법과 동일한 결과를 얻을 수 있으며, 바이러스를 직접 사용하지 않는 안전한 방법으로 쉽게 진단을 할 수 있음을 알게 되었다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 세포주 또는 이를 이용하는 수두 대상포진 바이러스 검출방법에 의하면, 수두대상포진 바이러스를 사용하지 않고, 수두대상포진 바이러스의 항체 유무를 용이하게 측정할 수 있으므로 수두대상포진 진단시 진단 관련 의료진들이 바이러스 감염으로부터 보호되어 안전하게 진단할 수 있고, 감염성 바이러스 처리를 위한 특별한 처리 및 시설을 필요치 않아서 경제적으로 매우 우수하다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Method for diagnosis of anti-VZV antibody in a human serum using human cell line expressing VZV glycoprotein E <130> NP13-0099 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 623 <212> PRT <213> Varicella zoster virus <400> 1 Met Gly Thr Val Asn Lys Pro Val Val Gly Val Leu Met Gly Phe Gly 1 5 10 15 Ile Ile Thr Gly Thr Leu Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Ala Ser Val 20 25 30 Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn 35 40 45 Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp 50 55 60 Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro 65 70 75 80 Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His 85 90 95 Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu 100 105 110 Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp 115 120 125 Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His 130 135 140 Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly 145 150 155 160 Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val 165 170 175 Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg Ile Tyr 180 185 190 Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu Thr Cys 195 200 205 Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys His Thr 210 215 220 Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu Asn Thr 225 230 235 240 Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly Lys Lys 245 250 255 Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu Phe Asp 260 265 270 Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu Lys Val 275 280 285 Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn Met Arg 290 295 300 Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr Trp Lys 305 310 315 320 Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro Gln Pro 325 330 335 Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val Phe Ser 340 345 350 Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln Tyr Lys Ile His 355 360 365 Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro Ile Asp 370 375 380 Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr His Pro 385 390 395 400 Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr Phe Thr 405 410 415 Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln Asn Cys 420 425 430 Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser His Met 435 440 445 Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr Leu Lys 450 455 460 Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe Val Val 465 470 475 480 Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val Ser Thr 485 490 495 Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro Pro Thr 500 505 510 Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr Pro Val 515 520 525 Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Ile Arg Tyr Ala Ala Trp Thr Gly Gly 530 535 540 Leu Ala Ala Val Val Leu Leu Cys Leu Val Ile Phe Leu Ile Cys Thr 545 550 555 560 Ala Lys Arg Met Arg Val Lys Ala Tyr Arg Val Asp Lys Ser Pro Tyr 565 570 575 Asn Gln Ser Met Tyr Tyr Ala Gly Leu Pro Val Asp Asp Phe Glu Asp 580 585 590 Ser Glu Ser Thr Asp Thr Glu Glu Glu Phe Gly Asn Ala Ile Gly Gly 595 600 605 Ser His Gly Gly Ser Ser Tyr Thr Val Tyr Ile Asp Lys Thr Arg 610 615 620 <210> 2 <211> 1872 <212> DNA <213> Varicella zoster virus <400> 2 atggggacag ttaataaacc tgtggtgggg gtattgatgg ggttcggaat tatcacggga 60 acgttgcgta taacgaatcc ggtcagagca tccgtcttgc gatacgatga ttttcacatc 120 gatgaagaca aactggatac aaactccgta tatgagcctt actaccattc agatcatgcg 180 gagtcttcat gggtaaatcg gggagagtct tcgcgaaaag cgtacgatca taactcacct 240 tatatatggc cacgtaatga ttatgatgga tttttagaga acgcacacga acaccatggg 300 gtgtataatc agggccgtgg tatcgatagc ggggaacggt taatgcaacc cacacaaatg 360 tctgcacagg aggatcttgg ggacgatacg ggcatccacg ttatccctac gttaaacggc 420 gatgacagac ataaaattgt aaatgtggac caacgtcaat acggtgacgt gtttaaagga 480 gatcttaatc caaaacccca aggccaaaga ctcattgagg tgtcagtgga agaaaatcac 540 ccgtttactt tacgcgcacc gattcagcgg atttatggag tccggtacac cgagacttgg 600 agctttttgc cgtcattaac ctgtacggga gacgcagcgc ccgccatcca gcatatatgc 660 ttaaaacata caacatgctt tcaagacgtg gtggtggatg tggattgcgc ggaaaatact 720 aaagaggatc agttggccga aatcagttac cgttttcaag gtaagaagga agcggaccaa 780 ccgtggattg ttgtaaacac gagcacactg tttgatgaac tcgaattaga cccccccgag 840 attgaaccgg gtgtcttgaa agtacttcgg acagaaaaac aatacttggg tgtgtacatt 900 tggaacatgc gcggctccga tggtacgtct acctacgcca cgtttttggt cacctggaaa 960 ggggatgaaa aaacaagaaa ccctacgccc gcagtaactc ctcaaccaag aggggctgag 1020 tttcatatgt ggaattacca ctcgcatgta ttttcagttg gtgatacgtt tagcttggca 1080 atgcatcttc agtataagat acatgaagcg ccatttgatt tgctgttaga gtggttgtat 1140 gtccccatcg atcctacatg tcaaccaatg cggttatatt ctacgtgttt gtatcatccc 1200 aacgcacccc aatgcctctc tcatatgaat tccggttgta catttacctc gccacattta 1260 gcccagcgtg ttgcaagcac agtgtatcaa aattgtgaac atgcagataa ctacaccgca 1320 tattgtctgg gaatatctca tatggagcct agctttggtc taatcttaca cgacgggggc 1380 accacgttaa agtttgtaga tacacccgag agtttgtcgg gattatacgt ttttgtggtg 1440 tattttaacg ggcatgttga agccgtagca tacactgttg tatccacagt agatcatttt 1500 gtaaacgcaa ttgaagagcg tggatttccg ccaacggccg gtcagccacc ggcgactact 1560 aaacccaagg aaattacccc cgtaaacccc ggaacgtcac cacttatacg atatgccgca 1620 tggaccggag ggcttgcagc agtagtactt ttatgtctcg taatattttt aatctgtacg 1680 gctaaacgaa tgagggttaa agcctatagg gtagacaagt ccccgtataa ccaaagcatg 1740 tattacgctg gccttccagt ggacgatttc gaggactcgg aatctacgga tacggaagaa 1800 gagtttggta acgcgattgg agggagtcac gggggttcga gttacacggt gtatatagat 1860 aagacccggt ga 1872 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forword primer for cloning glycoprotein E <400> 3 atggggacag ttaataaacc 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for cloning glycoprotein E <400> 4 tcaccgggtc ttatctatat ac 22

Claims

수두대상포진 바이러스의 당단백질E를 발현하며, FAMA (fluorescent antibody to membrane antigen)법에서 수두대상포진 바이러스에 감염된 세포를 대체하여 항-수두대상포진 바이러스 항체의 존재 여부를 시료에서 검출하기 위해 이용되는 인간 세포주이며, 상기 당단백질 E가 상기 세포주의 세포막 표면에 표출되고, 상기 세포주가 수두대상포진 바이러스에 의한 감염 없이 당단백질 E가 발현되도록 형질 전환된 것임을 특징으로 하는 분리된 인간 세포주.
삭제
제1항에 있어서, 상기 당단백질 E는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것임을 특징으로 하는 분리된 인간 세포주.
제1항에 있어서, 상기 시료는 인간의 혈청인 것을 특징으로 하는 분리된 인간 세포주.
제1항에 있어서, 상기 세포주는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 의해서 형질전환된 것을 특징으로 하는 분리된 인간 세포주.
제5항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 분리된 인간 세포주.
(a) 검사가 필요한 개체의 혈액에서 혈청을 분리하는 단계;
(b) 상기 혈청을 제1항의 세포주와 접촉시켜 상기 혈청 내의 항체와 상기 세포주 표면의 당단백질 E를 항원항체 반응에 의해 특이적으로 결합시키는 단계; 및
(c) 상기 결합된 항체와 특이적으로 결합하며, 형광 표지가 부착된 제2항체를 첨가하여 상기 항체와 상기 제2항체를 항원항체 반응에 의해 특이적으로 결합시키는 단계; 및
(d) 상기 형광 표지를 검출하는 단계를 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검출방법.
제7항에 있어서, 상기 검출방법은 개체의 수두대상포진 바이러스에 대한 면역력 측정을 위한 것임을 특징으로 하는 수두 대상포진 바이러스 검출방법.
제1항의 세포주를 유효성분으로 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검출용 조성물.
제1항의 세포주를 유효성분으로 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검출용 키트.