KR20190086833A - 지카 바이러스의 외막 단백질에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

지카 바이러스의 외막 단백질에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 57의 아미노산 서열로 이루어진, 지카 바이러스에 특이적으로 결합하는 펩티드, 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 지카 바이러스 검출용 조성물 및 상기 지카 바이러스 검출용 조성물을 유효성분으로 포함하는 지카 바이러스 검출용 키트에 관한 것으로, 본 발명의 펩티드는 신속한 지카 바이러스 특이적 감염 진단에 활용될 수 있을 것이다.

Description

지카 바이러스의 외막 단백질에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 이의 용도{Peptide specifically binding to envelope protein of zika virus and uses thereof}
본 발명은 지카 바이러스의 외막 단백질에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다.
지카 바이러스는 1947년 우간다 옆 빅토리아 호수 근방에 위치한 지카 숲의 붉은털원숭이(rhesus monkey)에서 최초로 발견되었고, 숲모기속(Ades)의 모기에 의해 다른 종으로 전염될 수 있음이 알려졌다. 1953년 우간다 및 탄자니아에서 지카 바이러스에 감염된 인간이 처음 보고되긴 하였으나, 바이러스에 감염된 사람들이 별다른 증상을 보이지 않아 큰 관심을 받지 못하였다. 그 후, 2007년 서태평양 미크로네시아 연방에 위치한 야프 섬(Yap island)에서 다수의 지카 바이러스 감염자가 발생하는 사건이 보고되었고, 이 후, 아프리카, 아시아, 아메리카 등 많은 열대지역에서 지카 바이러스의 발병이 보고되었다. 그러다, 2015년 3월 브라질 동부의 바이아(Bahia) 주를 중심으로 뎅기열과 유사해 보이는 열성 질환이 보고되기 시작했고, 같은 해 5월 브라질 연구진은 질병의 원인이 지카 바이러스임을 밝혔다. 브라질 보건 당국은 2016년 4월까지 총 150만명의 의심 환자가 발생했다고 보고하였으며, 2015년 10월에는 콜롬비아에서도 발병 보고가 있었고, 2016년 3월까지 총 51,473명의 의심 환자가 발생했다. 그리고 2016년 3월에는 중남미 거의 대부분의 국가에서 지카 바이러스 유행이 보고되었다.
지카 바이러스의 인체 감염이 처음으로 밝혀진 이래로, 지카 바이러스는 대체로 심각한 위협으로 간주되지 않았었다. 하지만 2015년 9월, 브라질의 역학 연구에서 지카 바이러스 유행 지역에서 소두증(microcephaly), 즉 두부 및 뇌가 정상보다 작은 선천성 기형을 가지고 태어나는 신생아가 늘어났다는 보고가 있었고, 추가 연구들을 통해 지카 바이러스가 심각한 신경계 질환을 유발할 가능성이 있다는 결과가 제기되어, 지카 바이러스의 감염은 전세계를 위협하는 질병이 되었다.
지카 바이러스는 플라비비리대(Flaviviridae), 플라비바이러스 속의 모기-매개 계통형(clade)에 속한다. 지카 바이러스는 또한, 바이러스 다단백질에서 약 43%의 아미노산 서열 유사성으로 스폰드웨니 바이러스(Spondweni virus) 그룹에 속하고, 뎅기 바이러스의 4가지 혈청형과 매우 유사한 특징이 있다. 지카 바이러스는 약 10.7kb의 (+) 센스 RNA 게놈을 가진 20면체(icosahedral)의 외피성 바이러스이다. 지카 바이러스의 게놈은 단일 다단백질을 코딩하는데, 상기 다단백질은 캡시드(Capsid, C), 당단백질인 pre-membrane(prM) 및 외막(envelope, E) 단백질을 포함하는 세 개의 구조 단백질과, 바이러스의 전사, 복제 및 숙주의 항바이러스 반응 지연을 조절하는 NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5를 포함하는 비구조적 단백질(nonstructural protein)로 나눠진다. 캡시드 단백질은 ~120개의 아미노산으로 이루어져 있으며 바이러스의 게놈에 결합하여 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 코어를 형성한다. prM 단백질은 ~ 165개의 아미노산으로 이루어져 있으며 숙주세포의 막과 미성숙 융합을 저해하는 역할을 하며, 외막 단백질은 ~495개의 아미노산으로 이루어져 있으며 숙주세포에 부착, 도입 및 융합을 매개하는데 중요한 역할을 수행하는 융합 단백질과 세포의 수용체-결합 자리를 포함하고 있다.
지카 바이러스의 외막 단백질의 이합체(dimer) 구조는 β-barrel 모양의 도메인 I, 핑거(finger)-유사 도메인 Ⅱ 및 면역글로불린-유사 도메인 Ⅲ의 세포외 도메인에 의해 형성되는데, 도메인 Ⅱ가 지카 바이러스의 외막 이합체 형성에 중요한 역할을 한다. 도메인 I 및 Ⅱ는 융합 루프에 의해 다른 외막 단백질 모노머와 연결된다. 다른 모기-매개 바이러스와 비교하였을 때, 지카 바이러스의 외막 도메인 I과 Ⅱ는 아미노산 서열에 있어서 낮은 유사성을 보여준다. 따라서, 지카 바이러스의 외막 도메인 I과 Ⅱ는 지카 바이러스 생검을 위한 단클론항체의 효과적인 후보 표적으로 사용되고 있다.
신속 진단 시스템은 높은 민감도, 짧은 검출 시간 및 저렴한 비용이 요구된다. 지카 바이러스 진단 시스템의 개발을 위한 인기있는 소재로 주로 항체가 사용되어 왔지만, 항체는 높은 생산 단가, 낮은 안정성 및 극도의 환경에서 낮은 기능성 등의 문제점을 가지고 있다. 본 발명에서는 지카 바이러스를 검출하기 위한 면역분석 시스템에서 항체를 대체할 수 있는, 지카 바이러스의 외막 단백질에 결합할 수 있는 펩티드를 개발하였다.
한편, 한국등록특허 제1692436호에는 '지카 바이러스 진단을 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 지카 바이러스 진단용 키트 및 이를 이용한 지카 바이러스 진단방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2017-0125484호에는 '지카 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 지카 바이러스의 외막 단백질에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 지카 바이러스의 외막 단백질에 결합 가능한 펩티드들을 다양한 프로그램들을 이용하여 예측하였고, 후보 펩티드 중 지카 외막 단백질에 대한 결합력이 우수한(결합에너지가 낮은) 1종(Z_10)을 선별하였으며, 상기 선별된 펩티드의 지카 바이러스에 대한 결합력을 더욱 증가시키기 위해 아미노산 서열을 일부 치환하여 결합에너지가 더욱 낮은 것으로 예측된 펩티드(Z_10.8)를 선발하였다. 상기 Z_10.8 펩티드를 제조하여 지카 바이러스와의 결합력을 FLISA(fluorescence-linked immunosorbent assay) 방법으로 확인한 결과, Z_10.8 펩티드가 지카 바이러스와 유사한 특성을 가지는 뎅기 바이러스에는 결합하지 않으며 지카 바이러스에만 특이적인 결합력을 보여주는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 57의 아미노산 서열로 이루어진, 지카 바이러스에 특이적으로 결합하는 펩티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 지카 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 검출용 조성물을 유효성분으로 포함하는 지카 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 지카 바이러스의 감염이 의심되는 동물로부터 분리된 시료로부터 상기 지카 바이러스 검출용 키트를 이용하여 지카 바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 지카 바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 지카 바이러스에 특이적으로 결합하는 펩티드는 항체에 비해 크기가 작고, 단시간에 적은 비용으로 생산이 가능한 장점이 있다. 또한, 본 발명의 펩티드는 지카 바이러스의 외막 단백질에 특이적으로 결합하는 특성이 있어, 지카 바이러스 특이적 감염 진단에 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 지카 바이러스와 다른 관련 바이러스간의 외막 단백질 도메인 I-Ⅱ의 아미노산 서열 비교 결과(A)와 지카 바이러스의 항원을 제조하기 위한 재조합 벡터의 모식도(B)이다.
도 2는 재조합 지카 바이러스 항원을 확인한 겔 염색 사진과 웨스턴 블롯 결과이다. 1: BSA 10㎍, 2: 정제한 재조합 단백질(표적 항원) 10㎍.
도 3은 Zika EI-Ⅱ 항원에 대한 단클론항체의 동정 과정을 보여주는 것으로, A는 11개 후보 항체의 간접 ELISA 결과이고, B는 6개 후보 항체의 SDS-PAGE 결과이고, C는 지카 바이러스를 이용한 간접 ELISA의 결과이다.
도 4는 단클론항체 1A5 및 1G8를 이용한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 5는 지카 외막 단백질(항원)과 펩티드간의 상호작용 도킹 모델을 보여주는 결과로, 좌측은 Z_10.8 펩티드(양성 상호작용 펩티드; 노란색), 우측은 P3 펩티드(음성 상호작용 펩티드; 주황색)와 항원과의 상호결합 모습을 나타낸다.
도 6은 Z_10.8 펩티드의 지카 바이러스 특이성을 검증한 FLISA 결과이다.
도 7은 Z_10.8 펩티드의 타겟을 검증하기 위해 재조합 지카 외막 단백질에 대한 FLISA 결과(A) 및 지카 또는 뎅기 바이러스에 대한 Z_10.8 펩티드(B) 및 P3 펩티드(C)의 결합력 분석 결과이다.
도 8은 Z_10.8 펩티드의 검출 한계를 확인한 FLISA 결과이다.
도 9는 혈청(sera) 또는 소변(urine) 내에 존재하는 지카 바이러스에 대한 Z_10.8 펩티드의 검출능을 확인한 FLISA 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 57의 아미노산 서열로 이루어진, 지카 바이러스에 특이적으로 결합하는 펩티드를 제공한다.
용어 '펩티드(peptide)'는 펩티드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.
본 발명에 따른 지카 바이러스에 특이적으로 결합하는 펩티드는 지카 바이러스의 외막 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 지카 바이러스에 특이적으로 결합하는 펩티드의 범위는 서열번호 57로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 및 상기 펩티드의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 57로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 57로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 펩티드과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩티드를 말한다.
본 발명은 또한, 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 지카 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 지카 바이러스 검출용 조성물의 유효성분인 펩티드는 전술한 바와 같으며, 본 발명에 따른 지카 바이러스 검출용 조성물에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 57의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드의 아미노 말달에 형광물질이 결합된 펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 형광물질은 유로피움(Europium) 형광체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 지카 바이러스 검출용 조성물을 유효성분으로 포함하는 지카 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 지카 바이러스 검출용 키트는 본 발명의 펩티드와 형광물질이 결합된 결합체를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 검출용 키트는 서열번호 57의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드가 기판에 흡착된 상태로 제공되거나, 지카 바이러스에 결합할 수 있는 특이적 항체가 기판에 흡착된 상태로 제공되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 기판으로는 PVDF 막, 플레이트 및 슬라이드가 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 검출용 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
본 발명의 지카 바이러스 검출용 키트는 본 발명의 펩티드와 형광물질이 결합된 결합체를 포함하여 목적하는 항원을 면역검출할 수 있는 형광면역측정법을 사용하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 결합체를 포함하는 FLISA(Fluorescence-linked immunosorbent assay) 키트 또는 FICT(fluorescent immunochromatographic test kit)일 수 있고, 보다 바람직하게는 샌드위치 FLISA 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어 'FLISA(fluorescence-linked immunosorbant assay)'는, 플레이트를 이용한 면역측정방법으로, ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay)와 동일한 원리를 가지며, 널리 이용되고 있는 방법 중 하나이다. FLISA의 경우, ELISA와 마찬가지로 형광 측정기를 이용하여 짧은 시간의 분석시간이면 진단하고자 하는 물질을 다량으로 측정할 수 있다. 또한, FLISA는 일반적으로 ELISA에 비하여 감도(sensitivity)와 특이도(specificity)가 모두 우수하다고 알려져 있다.
일반적으로 형광체의 경우 여기(excitation) 파장과 방출(emission) 파장대가 높을수록, 즉, 낮은 에너지로 여기가 가능할수록 보다 저렴한 형태의 광원을 선택할 수 있어 측정 장비들을 경제적으로 제작할 수 있게 된다. 또한, 면역 물질과 형광체와의 축합(conjugation) 반응 결합체는 형광변역측정법을 이용하기 위해 필수적인 요소이므로 사용 전(ready-to-use) 형태의 형광체의 개발은 매우 중요하다.
본 발명은 또한, 상기 지카 바이러스 검출용 키트에, 목적하는 항원의 존재여부가 확인되지 않은 분리된 시료를 가하여 반응시키는 단계를 포함하는, 지카 바이러스의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은 (a) 지카 바이러스의 감염이 의심되는 동물로부터 분리된 시료를 수득하는 단계; 및 (b) 본 발명의 상기 키트를 이용하여 상기 수득한 시료로부터 지카 바이러스를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 동물은 지카 바이러스에 감염 가능성이 있는 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다.
본 명세서에서 용어 '시료'는 검출 대상체로 샘플 또는 검체와 동일한 의미로 사용되었으며, 상기 시료는 예컨대, 혈액, 림프, 골수액, 타액, 유즙, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌추출 액, 척수액, 관절액, 복수, 양막액 또는 세포조직액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 시약
nTaq PCR 구성요소는 Takara(일본)와 Clontech(미국)에서 구입하여 사용하였으며, pET21b(+) 플라스미드는 Novagen(영국)에서 구입하였다. 본 발명에 사용된 펩티드는 펩트론(한국)에서 합성하여 사용하였으며, P(S/V-COOH) 유로피움 나노파티클(Europium nanoparticle, Eu-NP) 비드(0.1㎛)는 Bangs Laboratories Inc.(미국)에서 구입하였으며, EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride) 및 Sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt)는 Thermo Scientific(미국)에서 구입하여 사용하였다.
2. 지카 바이러스 항원 발현
지카 바이러스-MR 799를 0.01 MOI(multiplicity of infection)로 베로(Vero) 세포에 감염시켰다. 바이러스 감염 4~6일 후, RNA 추출 키트(Macherey Nagel, 독일)를 사용하여 베로 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 지카 바이러스 외막 단백질의 전장(full length, Zika E)과 외막 단백질의 도메인 I-Ⅱ(Zika EI-Ⅱ)을 PCR을 사용하여 증폭시켰다. PCR에 사용된 프라이머의 정보는 하기 표 1과 같다.
PCR에 사용된 프라이머 정보
프라이머 명칭 서열정보 (5'→3')
ZE 정방향 AAG CTT ATC AGG TGC ATT GGA GTC AGC A (서열번호 1)
ZE 역방향 CTC GAG AGC AGA AAC AGC CGT GGA GAG (서열번호 2)
ZEI-Ⅱ 정방향 GGA TCC AAT CAG GTG CAT AGG AGT CAG CAA TAG AC (서열번호 3)
ZEI-Ⅱ 역방향 CTC GAG ACC AGA ACC AGC CTC TAG AG CTC CAG CGA GA (서열번호 4)
PCR 반응은 CFX96 TouchTM real-time PCR 시스템(Bio-RAD, #1845096, 미국)을 사용하였고, PCR 산물은 1% 아가로스 겔에 로딩하여 확인하였다. 겔에 로딩한 PCR 산물은 겔-추출 키트(Quiagen, 미국)를 사용하여 분리하였고, 분리한 PCR 산물(Zika E 및 Zika EI-Ⅱ 단편)은 pGEM-T easy 플라스미드(Promega, 미국)로 클로닝하였다. 상기 벡터를 대장균 DH5α에 형질전환한 후, 무작위로 형질전환 콜로니를 선발하고, 소규모로 밤샘 배양하여 플라스미드를 추출한 후, 서열분석을 통해 삽입 표적의 크기 및 방향을 분석하였다.
pGEM-T 벡터로부터 추출한 Zika E 및 Zika EI-Ⅱ 단편을 박테리아 발현 벡터인 pET21b(+)로 클로닝한 후, 상기 재조합 플라스미드를 발현 숙주세포인 BL21 DE3 균주로 형질전환한 후, 100㎍/㎖의 암피실린을 포함하고 있는 LB 고체 배지에서 37℃의 온도로 밤샘 배양하였다. 상기에서 선발된 콜로니를 암피실린을 포함하고 있는 250㎖ LB 액체 배지에 접종하고 37℃에서 흡광도가 0.5~0.6이 될때까지 교반하며 배양하였다. 그 후, 0.5mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 37℃에서 3~4시간 배양하며 단백질의 발현을 유도하였다. 단백질 발현을 유도한 세포는 4℃, 8,000rpm의 조건으로 10분동안 원심분리하여 회수하였고, 버퍼 A(10mM Tris pH 7.5, 100mM NaCl, 10mM EDTA)로 세척하였다. 그 후, 세포 펠릿을 1mM PMSF(Phenylmethylsulfonyl fluoride) 및 8M 요소(urea)가 포함된 버퍼 A를 사용하여 재현탁시키고, 상온에서 2시간 동안 교반시켰다. 응집체 펠릿은 10㎖ 가용화 완충용액(100mM Tris pH 7.5, 8M Urea, 0.2mM EDTA)으로 재현탁시키고 2시간 동안 상온에서 교반시켰다. 가용화된 Zika E 및 Zika EI-Ⅱ의 응집체는 100㎖ 재접힘 버퍼(100mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5M L-Arginine, 0.2mM EDTA)을 넣어준 후, 10℃에서 48시간 동안 천천히 재접힘을 유도하였다. 재접힘 시료를 20mM 인산염 버퍼(pH 7.5), 300mM 염화나트륨, 10mM 이미다졸 및 100mM 요소로 이루어진 버퍼에서 4℃, 48시간 동안 반응시키며 투석하였다. 투석 반응 동안 매 12시간 마다 새 버퍼로 교체해주었다. 투석 분리물을 4℃의 조건에서 Ni-NTA 친화성 컬럼에 2시간 동안 반응시키고, 세척 버퍼(20mM phosphate buffer pH 7.5, 300mM NaCl, 10mM imidazole)로 수 회 세척하였다. 재조합 Zika E 및 Zika EI-Ⅱ 단백질은 용출 버퍼(20mM phosphate buffer pH 7.5, 300mM NaCl, 250mM imidazole)를 사용하여 용출시켜 회수하였으며, 단백질 순도는 SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
3. 마우스 면역화 및 단클론항체 제조
재조합 Zika EI-Ⅱ 단백질(50㎍/100㎖)을 프로인드완전보강제(Freund's complete adjuvant, Sigma, 미국)와 1:1의 비율로 혼합하고, 7주령 암컷 BALB/c 마우스(대한바이오링크, 한국)의 복강내(intraperitoneally)로 주사하였다. 매 2주마다 프로인드완전보강제와 1:1의 비율로 혼합된 재조합 Zika EI-Ⅱ 단백질(25㎍/100㎖)로 부스팅시켰다. 3번의 주사가 완료된 후, 재조합 Zika EI-Ⅱ 단백질(5㎍/100㎖)을 정맥주사하였다. 공지된 세포 융합 기술을 따라 단클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 생산하였다. 마우스 비장세포를 50% PEG(polyethylene glycol, Sigma)를 사용하여 골수종세포(F/o cell line)와 융합시켰다. 하이브리도마 세포는 HAT(hypoxanthine-aminopterin-thymidine) 및 HT(hypoxanthine-thymidine) 배지에서 서브배양하여 선별하였고, 항체의 생산은 ELISA를 통해 동정하였다. 한계희석을 통한 서브 클로닝 후에, 선발된 하이브리도마 콜로니를 10주령의 암컷 BALB/c 마우스의 복강내로 주사하여, 대량의 단클론항체 생산을 유도하였다. 상기 마우스의 복수로부터 획득된 단클론항체는 단백질 A 아가로스 컬럼(Amersham Biosciences, 스웨덴)을 사용하여 정제하였다.
4. 웨스턴 블롯
정제된 재조합 Zika E 및 Zika EI-Ⅱ 단백질을 12% SDS-PAGE 겔에 로딩하여(10㎍/레인) 전개시킨 후, PVDF 멤브레인으로 트랜스퍼시키고, 5%(w/v) 탈지유를 함유한 PBS-T(phosphate-Buffered saline with 0.1% Tween 20)로 2시간 동안 블록킹한 후, PBS-T로 3회 세척하였다. 그 후, 항-히스티딘 태그 항체(Thermo fisher scientific)를 1차 항체로 하여 상온에서 1시간 동안 반응시키고, 멤브레인을 세척한 후, HRP-결합된 항-마우스 IgG 항체를 2차 항체로 하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 결과 이미지는 ChemiDoc XRS+ 이미징 시스템(Bio-RAD)을 사용하여 확인하였다.
또한, 하이브리도마로부터 생산되는 지카 바이러스에 대한 단클론항체의 재조합 Zika E 및 Zika EI-Ⅱ 단백질에 대한 결합 친화도를 웨스턴 블롯을 이용하여 측정하였다. BSA(bovine serum albumin), Zika EI-Ⅱ 단백질(50㎍/레인) 및 바이러스 배양액(106 TCID50/㎖) 등의 항원을 SDS-PAGE에 로딩하고 전개시킨 후, PVDF 멤브레인에 트랜시퍼시켰다. 상기 멤브레인을 1㎎/㎖ 농도의 1A5 또는 1G8 단클론항체를 100배 희석하여 4℃에서 밤샘 배양시켰다. 그 후, HRP-결합된 항-마우스 IgG 항체를 2차 항체로 하여 반응시킨 후, ChemiDoc XRS+ 이미징 시스템을 사용하여 결과를 확인하였다.
5. Zika EI-Ⅱ에 특이적인 항체 동정을 위한 간접(indirect) ELISA
배양한 지카 바이러스(104 TCID50/㎖)를 이용하여 간접 ELISA를 수행하였다. 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Vom Plastic Corp., 한국)의 각 웰에 지카 바이러스 배양액을 100㎕ 씩 넣어주고, 4℃에서 밤샘 반응시켰다. 그 후, 200㎕의 PBS-T를 사용하여 2분간 약하게 교반하며 3회 세척하고, 4%(w/v) BSA/PBS-T로 37℃에서 1시간 동안 블록킹시켰다. 그 후, 1차 항체로 1G8 또는 1A5를 웰 당 5㎍씩 넣어주고, 37℃에서 1시간 반동안 반응시킨 후, PBS-T로 세척하고, HRP가 결합된 항-마우스 IgG 항체(Abcam, 영국)를 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 비색 반응은 TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) 기질(Thermo Fisher Scientific)을 사용하였고, 0.18M 황산으로 반응을 종료시켰다. 흡광도는 Infinite F200 마이크로플레이트 리더기(Tecan, 스위스)를 사용하여 450nm에서 측정하였다.
6. 펩티드 디자인 및 도킹(docking) 분석
지카 바이러스의 외막 단백질에 대한 펩티드의 디자인은 ABC pred(J Mol Recognit. 2008, 21(4):243-55), BCPreds(http://www.sdsc.edu/pb/edu/pharm201/11/c35.pdf/), Bepipred(Sci Rep. 2016, 6:37313) 등의 에피토프 예측 프로그램을 사용하였다. 지카 바이러스 외막 단백질과 에피토프의 3D 구조는 I-TASSER (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)를 사용하여 확인하였으며, 에피토프의 결합력은 PyRx-virtual Screening Tool(https://sourceforge.net/projects/pyrx/)을 사용하여 분석하였다. 도킹 결과는 펩티드들의 방향이 표적하는 활성자리에서 유연하고 차등있는 세트가 선호됨에도 불구하고, 고정된 분자로서 수용체 결합 자리를 도입한 지카 바이러스 외막 단백질을 사용하였다. -6.5 kcal/mol 보다 낮은 결합에너지 값을 가진 펩티드를 선택한 후, 지카 바이러스의 외막-거대분자에 특이성이 증가할 수 있도록 아미노산 서열을 변형시켰다.
두 번째 펩티드 동정은 최종 펩티드 산물을 모으기 위해 수행하였으며, 음성 대조구 펩티드는 가장 높은 결합에너지 값을 가지는 펩티드를 사용하였다. 단백질-단백질 상호작용은 PyMOL(https://pymol.org/2/) 프로그램을 사용하여 측정하였다.
7. 유로피움(Europium)과 항체/펩티드 결합체 제조
유로피움 결합체는 여 등(Sci Rep. 2017, 7:7933)의 문헌을 참고하였다. 카복실레이트 아민(carboxylate amine) 응집법에 기반하여, 1G8 항체, Z_10.8 및 P3 펩티드를 10㎕ 유로피움(0.1㎛, 1% w/t, Bangs lab.)과 500㎕의 0.05M MES 버퍼(pH 6.1)를 사용하여 결합시켰다. 그 후, EDC/HNS 시약을 첨가하여 유로피움-나노파티클(이하, Eu-NP) 표면에 교차결합을 만들었다. 25℃에서 1시간 반응시킨 후, 17,000rpm에서 5분간 원심분리하여 반응하지 않은 성분들은 제거하였다. 활성화된 Eu-NP는 45㎕의 1G8 단클론항체(1㎎/㎖) 또는 다양한 농도의 펩티드 30㎕과 반응시켰다. 상기 반응은 470㎕의 0.1M 인산나트륨(pH 8.0)에서 25℃, 2시간 동안 수행되었다. 1% BSA와 0.2% 붕사(Borax, pH 9.0)를 함유한 저장 버퍼로 반응물을 세척한 후, 200㎕의 저장 버퍼를 넣고 4℃에서 보관하였다.
8. 펩티드 기능성 분석
후보 펩티드의 기능성은 직접 FLISA(Fluorescent-linked immunosorbent assay)를 통해 확인하였다. 간단하게, 지카 펩티드 및 음성 펩티드(P3)를 각각 유로피움(0.1㎛)과 결합시켰다. 지카 바이러스에 대한 단클론항체 1G8을 후보 펩티드들의 지카 바이러스에 대한 결합력 확인을 위한 양성 대조구로 사용하였다.
96-블랙 웰 마이크로플레이트를 지카 바이러스(105 TCID50/㎖)로 코팅한 후, 지카 바이러스의 외막 단백질 항원(10㎍/㎖)을 웰에 첨가하고 4℃에서 밤샘 배양하였다. 5% 탈지유로 블록킹한 후, 20배 희석한 펩티드 또는 1G8과 결합된 Eu-NP를 넣어 반응시켰다. 형광분석은 Infinite F200 마이크로플레이트 리더기로 분석하였고, 여기파장(Ex), 방출파장(Em)은 각각 322, 612nm이다.
9. Sandwich FLISA
10μM 및 20μM 사이의 다양한 농도의 지카 펩티드 및 P3 펩티드를 96-블랙 웰 마이크로플레이트에 코팅하였다. 0.1㎍/웰 농도의 단클론항체 1A5를 코팅하여 양성 대조구로 사용하였다. 상기 펩티드 또는 항체를 4℃에서 밤샘 배양시킨 후, PBS-T(pH 7.4)로 세척하고, 5% 탈지유로 37℃에서 2시간 동안 블록킹시켰다. PBS-T로 3회 세척 후, 재조합 지카 바이러스 항원, 지카 바이러스 또는 바이러스 배양액을 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 배양시켰다.
결합하지 않은 펩티드 또는 항체를 제거하기 위해 플레이트를 3회 세척한 후, 펩티드 또는 1G8 항체가 결합된 Eu-NP의 계대 희석액을 첨가한 후, 37℃에서 2시간 반응시켰다. PBS-T로 5회 세척 후, PBS 100㎕를 각 웰에 넣어주었다. 형광분석은 Infinite F200 마이크로플레이트 리더기로 분석하였고, 여기파장(Ex), 방출파장(Em)은 각각 322, 612nm이다.
실시예 1. 대장균에서 지카 바이러스 외막 항원의 발현
1,502개의 염기로 이루어진 지카 바이러스의 외막 단백질(이하 Zika E) 코딩 서열과, 1,128개의 염기로 이루어진 외막 단백질 도메인 I-Ⅱ(이하 Zika EI-Ⅱ) 코딩 서열을 포함하는 pET21b 벡터를 제작하고, 상기 벡터를 대장균 BL21-DE3에서 발현시켰다. 지카 바이러스의 외막 단백질 도메인 I-Ⅱ는 다른 관련된 바이러스와 비교하였을 때 치쿤구니아(Chikungunya) 바이러스와는 25%, 뎅기 바이러스와는 약 60%로 확인되어 아미노산 서열 유사성이 높지 않은 것으로 확인되었다(표 2, 도 1A).
지카 바이러스 항원의 관련 바이러스와의 서열 유사성 비교
항원
바이러스 Envelope domain I-Ⅱ prM NS3 NS5
Zika_MR766 100 100 100 100
DENV1_10667 61 42 65 65
DENV2_16681 59 40 64 66
DENV3_16562 60 42 66 66
DENV4_1036 57 46 67 67
WNV_NY99 42 42 65 69
YFV_17D 37 36 51 60
CHIKUN_MRS1 25 31 43 47
(DENV: 뎅기바이러스(숫자: 혈청형), WNV: 웨스트닐 바이러스, YFV: 황열병 바이러스, CHIKUN: 치쿤구니아 바이러스.)
대장균 세포 펠릿으로부터 획득한 지카 바이러스 항원은 변성 조선에서 정제하였고, SDS-PAGE에서 단백질의 순도를 확인하였다. 그 결과, Zika E는 54kDa, Zika EI-Ⅱ는 34kDa 크기에서 확인되었다(도 2).
실시예 2. 단클론항체의 제조, 동정 및 기능 분석
Zika EI-Ⅱ 재조합 단백질을 단클론항체 제조를 위한 표적 항원으로 사용하였다. 최종 한계 희석 수행에서, 11개의 후보 항체가 간접 ELISA에서 450nm 흡광도가 1 이상으로 확인되었고(도 3A), 이 중 6개의 정제된 단클론항체가 SDS-PAGE 상에서 뚜렷한 중쇄 및 경쇄의 밴드를 보여주었다(도 3B). 또한, 지카 바이러스를 이용한 간접 ELISA 실험에서, 단클론항체 1A5 및 1G8가 다른 항체 후보들에 비해 2배 이상 높은, 0.8 정도의 흡광도를 보여주었다(도 3C). 더욱이, 상기 1A5 및 1G8 항체는 BSA 및 치쿤구니아 바이러스에 대해서는 비특이적 반응이 낮은 것을 보여주었다.
상기 단클론항체 1A5 및 1G8의 지카 바이러스 결합능을 확인하기 위해서, Zika E 재조합 단백질을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 그 결과, Zika EI-Ⅱ 항원에 대한 항체 1A5 및 1G8가 지카 바이러스 외막 단백질을 검출할 수 있음을 알 수 있었다(도 4).
실시예 3. 펩티드 디자인 및 도킹 연구
B 세포 에피토프는 펩티드 백신 및 펩티드 진단 시스템 개발에 있어서 중요한 역할을 한다. 이 예측 방법은 75%의 실험적 정확성이 있다고 보고된 바 있다. 본 발명에서는, 지카 연속적 에피토프 펩티드를 다양한 도구(프로그램)들을 사용하여 디자인하였다.
단일 아미노산 경향 규모에 사용되는 ABCpred 알고리즘은 0.60 값의 ROC(receiver operating characteristic) 곡선 조건에서 위치를 알려준다. 상기 알고리즘을 통해, 0.7 한계치에서 지카 바이러스의 외막에 속하는 각각 10개의 잔기를 가지는, 21개의 연속적인 에피토프가 디자인되었다(표 3).
ABCpred에 의한 지카 외막 단백질로부터 예측된 B 세포 에피토프
번호 시작 위치 서열정보 (서열번호) 점수
1 258 LGSQEGAVHT (5) 0.78
2 90 YVCKRTLVDR (6) 0.77
3 22 DVVLEHGGCV (7) 0.77
4 143 VHGSQHSGMI (8) 0.77
5 51 SNMAEVRSYC (9) 0.76
6 213 VHKEWFHDIP (10) 0.76
7 125 MTGKSIQPEN (11) 0.76
8 138 RIMLSVHGSQ (12) 0.75
9 100 GWGNGCGLFG (13) 0.75
10 80 AYLDKQSDTQ (14) 0.74
11 208 NKHWLVHKEW (15) 0.74
12 45 LVTTTVSNMA (16) 0.73
13 117 AKFTCSKKMT (17) 0.73
14 76 TQGEAYLDKQ (18) 0.72
15 244 EFKDAHAKRQ (19) 0.72
16 236 WNNKEALVEF (20) 0.72
17 110 KGSLVTCAKF (21) 0.72
18 69 ASDSRCPTQG (22) 0.71
19 298 LRLKGVSYSL (23) 0.71
20 251 KRQTVVVLGS (24) 0.71
21 172 NSPRAEATLG (25) 0.70
BCPreds 프로그램은 선형의 B 세포 에피토프 예측을 위한 새로운 방법으로서, 서브시퀀스 커널(subsequence kernel)을 사용한다. BCPreds 서버 1.0을 사용하여, 75%의 특정치를 가지는 16개의 에피토프 후보가 디자인되었다(표 4).
BCPreds에 의한 지카 외막 단백질로부터 예측된 B 세포 에피토프
번호 시작 위치 서열정보 (서열번호) 점수
1 98 DRGWGNGCGLFG (26) 0.999
2 332 YAGTDGPCKIPV (27) 0.996
3 177 EATLGGFGSLGL (28) 0.984
4 227 AGADTGTPHWNN (29) 0.974
5 74 CPTQGEAYLDKQ (30) 0.968
6 348 DMQTLTPVGRLI (31) 0.948
7 164 RAKVEVTPNSPR (32) 0.944
8 373 KMMLELDPPFGD (33) 0.882
9 393 DKKITHHWHRSG (34) 0.770
10 120 TCSKKMTGKSIQ (35) 0.758
11 25 LEHGGCVTVMAQ (36) 0.758
12 476 GLNTKNGSISLT (37) 0.701
13 425 GDTAWDFGSVGG (38) 0.664
14 300 LKGVSYSLCTAA (39) 0.549
15 202 YYLTMNNKHWLV (40) 0.443
16 255 VVVLGSQEGAVH (41) 0.386
BepiPred 방법은 히든 마코프 모델(Hidden Markov Model)과 Parker's hydrophilicity scale 및 Levitt's secondary structure scale의 조합에 기반하여 만들어진 것으로, 본 발명에서는 BepiPred-IEDB server의 값을 0.5로 세팅하였다. 이 방법을 통해 504개 아미노산으로 이루어진 지카 외막 단백질에서 8개의 선형의 에피토프가 예측되었다(표 5).
BepiPred에 의한 지카 외막 단백질로부터 예측된 B 세포 에피토프
번호 시작 위치 서열정보 (서열번호) 길이
1 36 QDKPTV (42) 6
2 67 DMASDSRCPTQGEAVLDKQSDTQ (43) 23
3 125 MTGKSIQPE (44) 9
4 156 TGYETDENRAKVEVTPNSPRAEAT (45) 24
5 226 HAGADTGTPHWNN (46) 13
6 275 AEMDGA (47) 6
7 332 YAGTDGPCK (48) 9
8 364 VITESTEN (49) 8
PyPX 9.0은 펩티드 스크리닝 프로그램이다. 상기에서 예측된 결과에서 반복되는 아미노산 서열(표 3 내지 5의 굵은 글씨)을 포함하는 에피토프를 선발하여, 지카 바이러스 외막 단백질과의 도킹 분석에 사용하였다. 18개의 선별된 에피토프 중 Z_10 (KRQTVVVLGS; 서열번호 24) 펩티드가 다른 펩티드에 비해 낮은 결합에너지(-6.9 kcal/mol) 및 낮은 평균 제곱근 편차(Root Mean Square Deviation, RMSD)를 보여주었다.
리간드-펩티드 복합체의 결합력을 증진시키기 위해서, Z_10 펩티드 서열을 변형시켰다. 다른 14개의 변형된 펩티드에 비해 Z_10.8 (KRAVVSCAEA; 서열번호 57) 펩티드가 가장 낮은 결합에너지(-7.2 kcal/mol)를 보여주었다(표 6 내지 10).
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
Z_10.8 펩티드의 도킹 분석에서, 단백질-리간드 복합체의 대부분이 2Å보다 낮은 평균제곱근 편차 하계(RMSD l.b.)값을 보여준 반면, 세 번째 복합체에서는 높은 RMSD 값을 나타내어 고리(loop) 지역과 리간드의 복합체로 관찰되었다(표 11 및 도 5). Zika-E_P3 펩티드(표 10 참고)를 음성 대조군으로 사용하였다.
Figure pat00006
실시예 4. 펩티드 기능 확인
Z_10.8 펩티드의 지카 바이러스 특이성을 FLISA를 통해 확인하였다. Z_10.8 펩티드 또는 1A5 단클론항체를 코팅시킨 후, 105 TCID50/㎖의 치쿤구니아(CHIKV), 뎅기(DENV) 또는 지카 바이러스(ZIKV)로 반응시킨 다음, 유로피움과 결합시킨 Z_10.8 펩티드 또는 1G8 단클론항체를 첨가하여 1시간동안 반응시킨 후, 형광신호를 측정하였다.
그 결과, 도 6에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 Z_10.8 펩티드가 지카 바이러스에만 특이적으로 반응하며, 치쿤구니아 및 뎅기 바이러스에는 반응하지 않음을 확인할 수 있었다. 또한, 1A5 단클론항체를 코팅한 조건에 비해 Z_10.8 펩티드를 코팅한 조건에서 지카 바이러스에 대한 단클론항체 및 펩티드 검출의 형광값이 현저히 높은 것을 알 수 있었다(도 6B 및 6C).
또한, Z_10.8 펩티드의 타켓을 검증하기 위해, 재조합 지카 외막 단백질을 이용하여 FLISA를 수행하였다. 지카 바이러스에 대한 결합에너지가 높은(즉, 결합력이 낮은) 펩티드인 P3를 음성 대조구로 사용하였으며, 재조합 지카 외막 단백질은 0.31, 0.63, 1.25 및 2.50㎍/㎖ 농도를 실험하였다. 그 결과, Z_10.8 펩티드가 재조합 지카 외막 단백질을 인식하는 것으로 확인되었으며, 재조합 단백질의 농도 의존적으로 형광량이 증가되는 것이 관찰되었다(도 7A). 또한, 다양한 농도의 Z_10.8 펩티드 또는 P3 펩티드를 104 TCID50/㎖의 지카 또는 뎅기 바이러스와 결합시킨 결과, Z_10.8 펩티드가 지카 바이러스에 대해 141.2nM의 Kd 값을 나타내는 것을 알 수 있었으며(도 7B), 뎅기 바이러스에 대해서는 항원 무처리 대조구와 유사하게 결합반응이 거의 일어나지 않음을 알 수 있었다. 또한, P3 펩티드는 지카 및 뎅기 바이러스 모두에 대해 반응이 거의 일어나지 않아 Kd 값을 측정할 수 없었다(도 7C). 이상의 결과를 통해 본 발명의 Z_10.8 펩티드가 지카 바이러스에 대해 특이성이 있음을 알 수 있었다.
실시예 5. Z_10.8 펩티드의 지카 바이러스 검출능 분석
지카 바이러스에 대한 특이성이 확인된 Z_10.8 펩티드의 바이러스 검출 한계를 측정하기 위해, Z_10.8 펩티드를 capture 및 detector로 하고, 다양한 농도의 지카 바이러스 시료를 이용하여 FLISA를 수행하였다. 그 결과, Z_10.8 펩티드의 지카 바이러스 검출 한계는 5 x 104 TCID50/㎖인 것으로 확인되었다(도 8).
또한, 임상 시료에 존재하는 지카 바이러스에 대한 Z_10.8 펩티드의 검출능을 검증하기 위해, 1:400으로 희석시킨 사람 혈청 및 소변 원액에 지카 바이러스를 희석시킨 시료를 이용하여 FLISA를 수행하였다. 그 결과, 혈청 또는 소변 내에 존재하는 지카 바이러스에 대해서도 Z_10.8 펩티드가 5 x 104 TCID50/㎖ 농도까지 검출가능함을 확인하였다(도 9).
이상의 결과를 통해, 본 발명의 Z_10.8 펩티드가 지카 바이러스에 대한 면역분석 시스템 개발에 있어서 항체 대안 요소로 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
<110> Wonkwang University Center for Industry-Academy Cooperation <120> Peptide specifically binding to envelope protein of zika virus and uses thereof <130> PN17523 <160> 63 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 aagcttatca ggtgcattgg agtcagca 28 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctcgagagca gaaacagccg tggagag 27 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggatccaatc aggtgcatag gagtcagcaa tagac 35 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctcgagacca gaaccagcct ctagagctcc agcgaga 37 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 5 Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Val His Thr 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 6 Tyr Val Cys Lys Arg Thr Leu Val Asp Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial 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Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 14 Ala Tyr Leu Asp Lys Gln Ser Asp Thr Gln 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 15 Asn Lys His Trp Leu Val His Lys Glu Trp 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 16 Leu Val Thr Thr Thr Val Ser Asn Met Ala 1 5 10 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 17 Ala Lys Phe Thr Cys Ser Lys Lys Met Thr 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 18 Thr Gln Gly Glu Ala Tyr Leu Asp Lys Gln 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 19 Glu Phe Lys Asp Ala His Ala Lys Arg Gln 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 20 Trp Asn Asn Lys Glu Ala Leu Val Glu Phe 1 5 10 <210> 21 <211> 10 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Pro Val 1 5 10 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 28 Glu Ala Thr Leu Gly Gly Phe Gly Ser Leu Gly Leu 1 5 10 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 29 Ala Gly Ala Asp Thr Gly Thr Pro His Trp Asn Asn 1 5 10 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 30 Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala Tyr Leu Asp Lys Gln 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 31 Asp Met Gln Thr Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile 1 5 10 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 32 Arg Ala Lys Val Glu Val Thr Pro Asn Ser Pro Arg 1 5 10 <210> 33 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 33 Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe Gly Asp 1 5 10 <210> 34 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 34 Asp Lys Lys Ile Thr His His Trp His Arg Ser Gly 1 5 10 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 35 Thr Cys Ser Lys Lys Met Thr Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 <210> 36 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 36 Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr Val Met Ala Gln 1 5 10 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 37 Gly Leu Asn Thr Lys Asn Gly Ser Ile Ser Leu Thr 1 5 10 <210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 38 Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly 1 5 10 <210> 39 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 39 Leu Lys Gly Val Ser Tyr Ser Leu Cys Thr Ala Ala 1 5 10 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 40 Tyr Tyr Leu Thr Met Asn Asn Lys His Trp Leu Val 1 5 10 <210> 41 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 41 Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Val His 1 5 10 <210> 42 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 42 Gln Asp Lys Pro Thr Val 1 5 <210> 43 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 43 Asp Met Ala Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala Val Leu 1 5 10 15 Asp Lys Gln Ser Asp Thr Gln 20 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 44 Met Thr Gly Lys Ser Ile Gln Pro Glu 1 5 <210> 45 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 45 Thr Gly Tyr Glu Thr Asp Glu Asn Arg Ala Lys Val Glu Val Thr Pro 1 5 10 15 Asn Ser Pro Arg Ala Glu Ala Thr 20 <210> 46 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 46 His Ala Gly Ala Asp Thr Gly Thr Pro His Trp Asn Asn 1 5 10 <210> 47 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 47 Ala Glu Met Asp Gly Ala 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 48 Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys 1 5 <210> 49 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 49 Val Ile Thr Glu Ser Thr Glu Asn 1 5 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 50 Lys Arg Gln Val Val Ser Cys Ala Trp Ala 1 5 10 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 51 Lys Arg Gln Thr Val Val Ser Cys Ala Glu Ala 1 5 10 <210> 52 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 52 Lys Arg Trp Gln Val Val Ser Cys Ala Glu 1 5 10 <210> 53 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 53 Lys Gln Asn Ala Val Val Lys Val Ala Glu Ala 1 5 10 <210> 54 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 54 Lys Arg Ala Thr Val Val Val Leu Gly Ser 1 5 10 <210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 55 Lys Asp Tyr Ala Val Leu Gly Asp Asn Phe 1 5 10 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 56 Lys Arg Ala Val Val Leu Pro Cys Ala Glu Ala 1 5 10 <210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 57 Lys Arg Ala Val Val Ser Cys Ala Glu Ala 1 5 10 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 58 Lys Phe Ala Val Val Ser Cys Ala Glu Ala 1 5 10 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 59 Lys Arg Met Ala Val Thr Gly Ser Glu Ala 1 5 10 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 60 Lys Pro Met Asp Ala Ile Glu Thr Cys Phe 1 5 10 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 61 Lys Pro Asn Asp Ala Ile Glu Thr Cys Phe 1 5 10 <210> 62 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 62 Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn Asp Ala Ile Asn Phe 1 5 10 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zika E_binding peptide <400> 63 Lys Asp Ala Val Val Ser Cys Ala Glu Ala 1 5 10

Claims (6)

  1. 서열번호 57의 아미노산 서열로 이루어진, 지카 바이러스에 특이적으로 결합하는 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 지카 바이러스의 외막 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 지카 바이러스 검출용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 펩티드는 형광물질과 결합된 펩티드인 것을 특징으로 하는 지카 바이러스 검출용 조성물.
  5. 제3항 또는 제4항의 지카 바이러스 검출용 조성물을 유효성분으로 포함하는 지카 바이러스 검출용 키트.
  6. 지카 바이러스의 감염이 의심되는 동물로부터 분리된 시료로부터 제5항의 지카 바이러스 검출용 키트를 이용하여 지카 바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 지카 바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101481362B1 (ko) * 2014-01-28 2015-01-15 연세대학교 원주산학협력단 수두대상포진 바이러스의 당단백질e를 발현하는 인간 세포를 이용한 수두대상포진 바이러스에 대한 면역력 진단 방법
KR20160117608A (ko) * 2014-02-11 2016-10-10 비스테라, 인크. 뎅기열 바이러스에 대한 항체 분자 및 그의 용도

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101481362B1 (ko) * 2014-01-28 2015-01-15 연세대학교 원주산학협력단 수두대상포진 바이러스의 당단백질e를 발현하는 인간 세포를 이용한 수두대상포진 바이러스에 대한 면역력 진단 방법
KR20160117608A (ko) * 2014-02-11 2016-10-10 비스테라, 인크. 뎅기열 바이러스에 대한 항체 분자 및 그의 용도

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Bioanal. Biomed., Vol. 9, No. 4, pp. 177-185(2017.07.04.) *
The Journal of Clinical Investigation, Vol. 127, No. 1, pp. 183-198(2017.01.) *

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