CN112941031B - 一种gE-HEK293细胞的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种gE‑HEK293细胞的构建方法及其应用，所述方法包括如下步骤：构建重组质粒，重组质粒转染，重组细胞株构建：将gE‑HEK293细胞和HEK293细胞加压筛选，获得初代gE‑HEK293细胞，在培养箱中培养后选取gE蛋白表达量最高的单克隆细胞进行传代培养，直至传代后的gE‑HEK293细胞能够稳定表达gE蛋白，形成最终能够表达gE蛋白的gE‑HEK293细胞。本发明构建的gE‑HEK293细胞能够稳定表达gE蛋白，并且可以用于FAMA实验、流式细胞术和细胞ELISA检测VZV gE的特异性抗体，检测过程中使用构建的gE‑HEK293细胞能够简化操作过程，快速获得检测结果。

Description

一种gE-HEK293细胞的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种gE-HEK293细胞的构建方法及其应用。
背景技术
水痘是由水痘带状疱疹病毒引起的一种疾病，主要见于儿童，在人群中具有极高的感染率。IgG是机体感染水痘后产生的两种主要中和抗体之一，检测血清中水痘IgG抗体在水痘血清流行病学研究、水痘疫苗的免疫效果评价、临床诊断等方面具有重要意义。Williams等首先在1974年报道了用FAMA(膜荧光抗体)法检测水痘病毒IgG抗体。因为该方法能区分水痘的易感者和免疫者，只要未检测出抗体就表明该个体是VZV(水痘-带状疱疹病毒)易感者，只要检测出抗体，就表明该个体具有免疫力，此外，FAMA法检测到血清抗体滴度转换，就表明周围有水痘发生。FAMA法敏感性高、特异性好、未发现与其他疱疹病毒产生交叉反应，被称为是水痘IgG抗体检测的“金标准”。
常规的FAMA实验，以VZV感染MRC-5细胞为抗原，荧光标记的抗血清抗体为二抗，检测血清中抗VZV的特异性IgG抗体，其形成的抗原抗体复合物主要位于感染细胞表面，荧光显微镜下观察可见膜性环状荧光。此方法的结果判断受主观因素影响较大，操作过程繁琐，需要提前使用病毒感染细胞，试验耗时长，不宜进行大批量检测。需要使用到病毒操作，涉及到生物安全，至少需要生物安全二级实验室才能开展。通常用于FAMA法的抗原细胞，用合适滴度的VZV病毒感染MRC-5细胞，待细胞病变达到++--+++，将病变细胞从细胞培养瓶中消化下来，吸附到载玻片上，经固定后再用于检测。抗原细胞制备复杂，对细胞病变判断需要一定经验，不利于实验重复性。
流式细胞术是一种在单个细胞水平上分析细胞特性的定量技术，现有技术中可利用流式细胞术分析腺病毒感染滴度。但采用MRC-5细胞感染水痘病毒后，细胞聚集严重，无法进行水痘病毒的滴度检测。
因此需要一种能够方便检测IgG抗体并能够定量检测水痘病毒的细胞。
发明内容
针对上述问题，本发明涉及一种gE-HEK293细胞的构建方法及其应用。
一种gE-HEK293细胞的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
构建重组质粒：将水痘带状疱疹病毒糖蛋白gE基因序列片段按HEK293细胞表达系统进行密码子优化形成目的基因，并将目的基因连接至表达载体上，形成重组质粒；
重组质粒转染：将重组质粒用限制性内切酶在30±2℃下反应3-5h，利用乙醇沉淀回收法获得线性化质粒，采用脂质体转染法将线性化质粒转染至HEK293细胞，将能够表达gE蛋白的HEK293细胞作为初代gE-HEK293细胞；
重组细胞株构建：将初代gE-HEK293细胞和HEK293细胞用Hygromycin B加压筛选；
待HEK293细胞全部死亡后，将初代gE-HEK293细胞计数并按照1个细胞/孔的密度铺板，在培养箱中培养后选取gE蛋白表达量最高的单克隆细胞进行传代培养，传代后的gE-HEK293细胞能够稳定表达gE蛋白，形成最终能够表达gE蛋白的HEK293细胞。
进一步地，所述gE基因序列片段通过在水痘带状疱疹病毒糖蛋白gE基因序列的上下游添加Hind III和Xho I酶切位点，再通过序列合成的方式获得gE基因序列片段。
进一步地，所述培养箱的培养条件为：转染细胞在37℃、5％CO2下培养12-14天。
进一步地，所述选取gE蛋白表达量最高的单克隆细胞进行传代培养包括：在初代gE-HEK293细胞培养结束后，选择有单克隆生成的细胞孔，加药筛选培养，通过ELISA检测筛选表达量最高的单克隆细胞进行扩大培养，重复加压筛选以及挑选表达量最高的单克隆细胞的步骤，直至HEK293细胞能够稳定表达gE蛋白完成传代培养。
利用上述的gE-HEK293细胞进行FAMA检测的方法，所述方法包括：
胰酶消化gE-HEK293细胞，将细胞稀释固定在载玻片上；
将稀释后的VZV抗体血清加入到含有gE-HEK293细胞的载玻片中，4℃静置16-18h；
用PBS洗涤含血清的载玻片，并加入稀释的FITC标记的羊抗鼠二抗，37℃避光孵育1h；
PBS洗涤孵育后的载玻片，置于荧光显微镜下观察，所述gE-HEK293细胞表面能够形成边界清晰膜性荧光环。
进一步地，所述细胞稀释固定在载玻片上包括：将消化后的细胞稀释至6×105个/ml密度，取10μl细胞加至12孔载玻片，置于37℃晾干；
所述细胞稀释后固定在载玻片上所用的固定液为80％冷丙酮，固定时间为5min。
进一步地，所述FITC标记的羊抗鼠二抗为含1％伊文思蓝的FITC标记的羊抗鼠二抗，稀释比例为1:100。
利用上述的gE-HEK293细胞进行流式细胞术检测的方法，其特征在于，所述方法包括：
稀释gE-HEK293细胞至所需浓度，取100μl稀释后的gE-HEK293细胞；
将稀释后的VZV抗体血清加入100μl的gE-HEK293细胞中，37℃孵育1h；
加入标记抗体，37℃孵育1h；
重悬加入标记抗体后的gE-HEK293细胞，进行流式细胞仪上样，收集检测数据。
进一步地，所述标记抗体为1:100稀释的FITC标记的羊抗鼠二抗，所用标记抗体体积为100μl。
进一步地，所述重悬加入标记抗体后的gE-HEK293细胞包括：首先用PBS重悬加入标记抗体后的gE-HEK293细胞，1000rpm离心5min，重复2次，用PBS重悬离心后的gE-HEK293细胞，流式细胞仪上样。
本发明构建的gE-HEK293细胞能够稳定表达gE蛋白，并且可以用于FAMA实验、流式细胞术和细胞ELISA检测VZV gE的特异性抗体中，检测过程中使用构建的gE-HEK293细胞能够简化操作过程，快速获得检测结果。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了根据本发明实施例的gE-HEK293细胞和HEK293细胞经80％冷丙酮固定5min后FAMA检测荧光图；
图2示出了根据本发明实施例的gE-HEK293细胞和HEK293细胞经100％冷丙酮固定15min后FAMA检测荧光图；
图3示出了根据本发明实施例的gE-HEK293细胞和HEK293细胞经50％冷丙酮固定10min后FAMA检测荧光图；
图4示出了根据本发明实施例的0号血清使用gE-HEK293细胞和HEK293细胞FAMA检测结果；
图5示出了根据本发明实施例1号血清使用gE-HEK293细胞和HEK293细胞FAMA检测结果；
图6示出了根据本发明实施例3号血清使用gE-HEK293细胞和HEK293细胞FAMA检测结果；
图7示出了根据本发明实施例4号血清使用gE-HEK293细胞和HEK293细胞FAMA检测结果；
图8示出了根据本发明实施例5号血清使用gE-HEK293细胞和HEK293细胞FAMA检测结果；
图9示出了根据本发明实施例6号血清使用gE-HEK293细胞和HEK293细胞FAMA检测结果；
图10示出了根据本发明实施例gE-HEK293细胞系FAMA实验结果图；
图11示出了根据本发明实施例pCEP4-gE瞬时转染HEK293细胞FAMA实验结果图；
图12示出了根据本发明实施例HEK293空白细胞的FAMA实验结果图；
图13示出了根据本发明实施例VZV感染MRC-5细胞FAMA实验结果图；
图14示出了根据本发明实施例MRC-5细胞的荧光染色结果图；
图15示出了根据本发明实施例gE-HEK293细胞荧光染色结果图；
图16示出了根据本发明实施例gE-HEK293流式细胞术检测结果图；
图17示出了根据本发明实施例目的基因gE序列图；
图18示出了根据本发明实施例重组质粒pCEP4-gE使用XhoI和HindIII双酶切电泳鉴定结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
VZV(水痘-带状疱疹病毒)至少表达8种糖蛋白，在水痘和带状疱疹患者的恢复期血清中VZV抗体主要是针对gE、gB和gH三种病毒糖蛋白，其中尤以gE为主。在早期的gE抗原表位研究中，分别采用一些不同的gE单克隆抗体做gE的表位分析，证明gE分子至少含有3个不同的抗原表位，分别位于氨基酸109～123、160-316以及另一个存在重叠的抗原表位。后来，用酵母菌表达的各个gE蛋白片段作为抗原，经免疫印迹实验证实gE的主要B细胞抗原表位位于氨基酸第1～161位的片段中。gE蛋白为跨膜蛋白，全长623个氨基酸，在538-560氨基酸处有跨膜区。使用该跨膜蛋白作为VZV抗体结合抗原，其抗原抗体结合物附着于细胞膜表面形成膜性环状荧光。
本发明采用现有VZV gE蛋白全长序列及跨膜区截短序列的HEK293细胞，构建能够稳定表达gE蛋白的HEK293细胞。
一种gE-HEK293细胞的构建方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一构建重组质粒：将水痘带状疱疹病毒糖蛋白的gE基因序列片段按HEK293细胞表达系统进行密码子优化形成目的基因，并将目的基因连接至表达载体上，形成重组质粒。
gE基因序列片段的获得通过：
在水痘带状疱疹病毒糖蛋白gE基因序列的上下游添加Hind III和Xho I酶切位点，获得初始片段，按照初始片段的序列采用基因合成的方式获得gE基因序列片段。
在本发明实施例中，将gE基因序列初始片段委托商业公司进行序列合成，目的基因按HEK293细胞表达系统进行密码子优化，其交付产物为pUC57-gE质粒。再通过酶切回收目的基因gE，目的基因gE序列如序列表所示(图17中的序列与序列表所示的序列相同)，并将gE基因连接至pCEP4表达载体，形成重组质粒pCEP4-gE。
重组质粒pCEP4-gE使用XhoI和HindIII双酶切电泳鉴定，鉴定结果如图18所示，得到10186bp和1893bp两条目的条带，说明重组质粒pCEP4-gE制备成功。
步骤二重组质粒转染：将pCEP4-gE质粒用XhoI限制性内切酶在30±2℃下反应3-5h，利用乙醇沉淀回收法获得线性化质粒，采用脂质体转染法将线性化质粒转染至HEK293细胞，转染48h后获得能够表达gE蛋白的HEK293细胞，该细胞作为初代gE-HEK293细胞。
对初代gE-HEK293细胞进行检测：通过NP40裂解液裂解后，用Western blot检测gE蛋白的表达，确定初代gE-HEK293细胞构建成功。
步骤三重组细胞株构建：确定HEK293细胞能够表达gE蛋白后，将初代gE-HEK293细胞作为转染组，原始HEK293细胞作为对照组，将转染组与对照组用Hygromycin B(终浓度200μg/ml)加压筛选。
待对照组细胞全部死亡后，将转染组细胞计数并按照1个细胞/孔的密度铺板，在培养箱中培养后选取gE蛋白表达量最高的单克隆细胞进行传代培养，直至HEK293细胞能够稳定表达gE蛋白，形成gE-HEK293细胞。
所用培养箱的培养条件为：转染细胞在37℃、5％CO2下培养12-14天。
所获得的gE-HEK293细胞能够实现gE蛋白胞外与跨膜区域的稳定表达。
若将所述目的基因设置为胞外+跨膜+部分胞内区域基因序列，则通过上述构建方法所获得的gE-HEK293细胞能够稳定表达gE蛋白胞外+跨膜+部分胞内区域；
若将所述目的基因设置为胞外蛋白表达的序列，则通过上述构建方法所获得的gE-HEK293细胞能够稳定表达胞外gE蛋白全长。
选取gE蛋白表达量最高的单克隆细胞进行传代培养包括：在初代转染细胞培养结束后，选择有单克隆细胞生成的细胞孔，加药筛选培养(所用药物为：含终浓度为200μg/ml的Hygromycin B及10％胎牛血清的DEME培养基)，通过ELISA检测筛选表达量最高的单克隆细胞进行扩大培养。将扩大培养后的细胞与原始HEK293细胞共同加压筛选，选择有单克隆细胞生成的细胞孔，加药筛选培养，继续筛选表达量最高的单克隆细胞进行扩大培养。不断重复筛选以及挑选表达量最高的单克隆细胞的过程，完成传代培养。
本发明还涉及利用上述gE-HEK293细胞进行FAMA检测方法，包括如下步骤：
步骤一：胰酶消化表达gE蛋白的gE-HEK293细胞，将细胞稀释固定在载玻片上。
细胞稀释固定在载玻片上包括：将消化后的细胞稀释至6×105个/ml密度，取10μl细胞加至细胞12孔载玻片，置于37℃晾干；
晾干后用80％冷丙酮浸泡载玻片5min，固定细胞，取出后自然晾干载玻片。
步骤二：将含有PBS稀释小鼠VZV抗体血清加入到含有gE-HEK293细胞的载玻片中，4℃静置16-18h。
将VZV免疫的小鼠血清从1:8倍倍比稀释至1:256倍后加入载玻片中。
步骤三：PBS洗涤含血清的载玻片，并加入稀释的FITC标记的羊抗鼠二抗，37℃避光孵育1h；
PBS洗涤含血清的载玻片具体为：采用PBS溶液洗涤3次，5min/次。
所用FITC标记的羊抗鼠二抗为含1％伊文思蓝的FITC标记的羊抗鼠二抗，稀释比例为1:100。
步骤四：PBS洗涤孵育后的载玻片，置于荧光显微镜下观察，gE-HEK293细胞表面形成边界清晰膜性荧光环。
PBS洗涤孵育后的载玻片具体为：采用PBS溶液洗涤3次，5min/次。
本发明还涉及利用上述gE-HEK293细胞进行流式细胞术检测血清特异性抗体的方法，包括如下步骤：
稀释gE-HEK293细胞，取100μl稀释后的gE-HEK293细胞；
用PBS按倍比稀释VZV小鼠血清至所需浓度，将稀释后的血清加入gE-HEK293细胞中，加入1:100稀释的FITC标记的羊抗鼠二抗100μl，37℃孵育1h；
用1.5ml PBS重悬细胞，1000rpm离心5min，重复2次。用500μl PBS重悬细胞，流式细胞仪上样，收集检测数据。
本发明gE-HEK293细胞能够用于FAMA检测或者流式细胞术检测VZV或者VZV gE的抗体，实验操作更加快速，结果更加准确、稳定。实施例1稳定表达gE蛋白HEK293细胞系建立
1、实验材料及来源
细胞、病毒和质粒：HEK293细胞购自ATCC；表达载体pCEP4购自英潍捷基(上海)贸易有限公司；gE基因序列由南京金斯瑞有限公司合成基因序列由商业公司合成。
主要试剂：酵母提取物和胰酪大豆胨购自英国OXOID公司；质粒抽提试剂盒购自英潍捷基(上海)贸易有限公司；胶回收试剂盒购自宝日医生物技术有限公司；限制性内切酶XhoI和Hind III购自宝日医生物技术有限公司；HPR标记的羊抗鼠购自艾比玛特生物医药(上海)有限公司；增强型HRP-DAB底物显色试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；鼠源的gE单克隆抗体购自英国abcam公司；DMEM培养基购自美国Gbico公司；Hygromycin B购自thermo fisher公司；FITC标记的羊抗鼠荧光二抗购自武汉博士德公司。
2、实验方法
重组质粒的构建：水痘带状疱疹病毒糖蛋白gE基因序列委托商业公司合成，上下游添加Hind III和Xho I酶切位点，目的基因按HEK293细胞表达系统进行密码子优化。合成的目的基因连接至pUC57载体，利用酶切回收，将目的基因连接至pCEP4表达载体。将重组质粒用XhoI和HindIII双酶切电泳鉴定,得到10186bp和1893bp目的条带。
重组质粒乙醇沉淀：将pCEP4-gE质粒(200μg)用Xho I限制性内切酶在30℃下反应3-5h。向酶切体系中加入2.5倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M的醋酸钠(pH值为5.2)，-20℃静置过夜。12000rpm离心30min，加入1ml的70％乙醇重悬。12000rpm离心15min。超净台内挥发乙醇20min，加入100μl无菌水溶解白色沉淀即为线性化pCEP4-gE质粒。
重组质粒的转染：将线性化pCEP4-gE质粒利用lip2000脂质体转染至293细胞(参照lip2000脂质体转染说明书)。转染48h后，取细胞用NP40裂解液裂解后用Western blot检测gE蛋白的表达。
重组细胞株构建：取样检测表达后，将转染组细胞在37℃、5％CO2培养箱培养12-14天，选择有单克隆生成的细胞孔，加药筛选培养。通过ELISA检测筛选表达量最高的单克隆细胞进行扩大培养。将单克隆细胞持续传代，按照1个细胞/孔的密度铺板，在37℃、5％CO2培养箱培养12-14天，选择有单克隆生成的细胞孔，通过ELISA检测筛选表达量最高的单克隆细胞进行扩大培养。在第15-20代收集细胞检测蛋白表达量，判断构建的细胞是否稳定。
3、gE-HEK293细胞系构建成功
1)通过二轮有限稀释法筛选gE蛋白表达细胞系，通过ELISA检测选择最高表达的克隆细胞为1号克隆。
克隆编号 1号 6号 7号 14号 15号 18号 阴性
OD值 1.3428 1.0047 1.0651 1.1686 1.2576 1.0659 0.0036
2)gE-HEK293细胞系稳定传代检测
选择1号克隆传代，在第15-20代每代收集细胞，用ELISA检测gE蛋白表达量。分析各代次之间的蛋白表达量RSD值为11.8％，说明细胞系表达稳定。
细胞代次 P15 P16 P17 P18 P19 P20 RSD
浓度IU/ml 2.88 2.85 2.46 2.37 3.24 3 11.8％
实施例2gE-HEK293细胞进行FAMA检测的可行性
1、实验材料及来源
主要试剂FITC标记的羊抗鼠荧光二抗购自武汉博士德公司。
2、实验方法
1)抗原细胞制备
表达gE蛋白的HEK293细胞可作FAMA实验用细胞；胰酶消化表达gE蛋白的HEK293细胞和HEK293细胞(阴性组)，将细胞稀释至6×105个/ml密度，取10μl细胞加至12孔载玻片，置于37℃晾干，80％冷丙酮固定5min或100％冷丙酮固定15min或用50％冷丙酮固定10min，自然晾干，备用。
2)用PBS稀释小鼠VZV抗体血清，从1:8倍比稀释至1:256；每孔加入10μl，4℃静置16-18h。
3)PBS洗涤12孔载玻片，5min/次，洗涤3次。
4)加入含1％伊文思蓝的FITC标记的羊抗鼠二抗，抗体稀释比例为1：100，37℃避光孵育1h。
5)PBS洗涤12孔载玻片，5min/次，洗涤3次。
6)置于荧光显微镜下观察。
3、实验结果
3.1、实验结果如图1-3所示：
图1a示出了gE-HEK293细胞经80％冷丙酮固定5min后FAMA检测荧光图，而图1b为对照组HEK293细胞经80％冷丙酮固定5min后FAMA检测荧光图。
在图1a中细胞贴壁牢固，洗涤过程中损失小，荧光观察过程中细胞边界清晰，图1b说明HEK293细胞无法与VZV血清抗体结合。
图2a示出了gE-HEK293细胞经100％冷丙酮固定15min后FAMA检测荧光图，图2b示出了HEK293细胞经100％冷丙酮固定15min后FAMA检测荧光图
在图2a中细胞贴壁牢固，洗涤过程中损失小，但在荧光观察过程中，细胞皱缩比例增加，细胞膜荧光抗体成环不明显。
图3a示出了gE-HEK293细胞经50％冷丙酮固定10min后FAMA检测荧光图，图3b示出了HEK293细胞经50％冷丙酮固定10min后FAMA检测荧光图。
在图3a中细胞贴壁不牢固，洗涤过程中细胞损失大，基本观察不到细胞。
由此可知，gE-HEK293细胞用于FAMA检测时，固定液最佳浓度及最佳时间为：使用80％冷丙酮固定5min。
3.2实验结论
将gE-HEK293细胞胰酶消化收集细胞作为FAMA抗原细胞，用VZV免疫小鼠血清进行FAMA实验，结果表明表达gE-HEK293细胞表面可形成膜性荧光环，表明gE-HEK293细胞可进行FAMA实验。
实施例3gE-HEK293细胞用于FAMA检测血清特异性抗体
1、实验材料及来源
FAMA实验用材料同实施例2(细胞固定用80％冷丙酮固定5min)。
Balb/c小鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，雌性。
小鼠血清制备
取纯化VZV或者VZV-gE蛋白免疫Balb/c小鼠，末次免疫后14天眼眶采血，分离血清，分装后保存于-20℃待测。
2、实验方法
选取6个小鼠血清参照实施例2的步骤进行FAMA实验。
ELISA法检测血清抗体
将血清稀释合适倍数，以双抗夹心ELISA法检测gE蛋白含量，ELSIA检测结果以抗体稀释度表现。ELISA步骤如下：
使用纯化的gE蛋白包被酶标板，经过PBS冲洗后去除未结合蛋白，再使用含VZV抗体小鼠免疫血清结合gE蛋白，加入HRP酶标羊抗鼠二抗显色后，检测450nm波长下的吸收值。
1)酶标板的制备：取gE蛋白稀释至6μg/ml，加入100μl/孔，分别加入酶标板条中，，2-8℃过夜。
2)用洗涤液洗板3次，拍干，加入300μl/孔的5％牛奶37℃封闭2小时；洗涤液洗板3次，拍干待用；
3)分别将小鼠抗VZV血清从1:200开始2倍倍比稀释，按照梯度稀释，100μl/孔加入酶标板中，37℃孵育1h。
4)PBST洗涤液洗板3次，拍干，加入HRP酶标记二抗，37℃孵育1h；
5)PBST洗涤液洗板3次，拍干，在波长450nm处读取OD值。
3、实验结果
将FAMA法和ELISA法检测VZV血清特异性结果进行比较
3.1、ELSIA实验结果
ELSIA实验是检测IgG抗体的传统方法，其利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性与定量检测，结果可靠。对本实施例中#0、#1、#3、#4、#5和#6血清进行ELSIA检测，检测结果如下表所示，以血清#0作为阴性对照，测得血清#6的抗体阳性稀释度最高，即6号血清的抗体效价最高。
Figure GDA0004187355130000121
Figure GDA0004187355130000131
3.2、FAMA实验结果
FAMA实验检测结果如图4-9所示，图4示出了0号血清使用gE-HEK293细胞和HEK293细胞FAMA检测结果；图5示出了1号血清使用gE-HEK293细胞和HEK293细胞FAMA检测结果；图6示出了3号血清使用gE-HEK293细胞和HEK293细胞FAMA检测结果；图7示出了4号血清使用gE-HEK293细胞和HEK293细胞FAMA检测结果；图8示出了5号血清使用gE-HEK293细胞和HEK293细胞FAMA检测结果；图9示出了6号血清使用gE-HEK293细胞和HEK293细胞FAMA检测结果。在图4-9中所有左侧附图为gE-HEK293细胞检测结果，右侧附图为HEK293细胞。
FAMA测定水痘病毒的抗体效价的判定标准是FAMA<1:4即抗体效价判定为阴性；FAMA≥1:4即抗体效价判定为阳性。通过图4-9可知gE-HEK293细胞的FAMA实验结果表明血清#1、血清#3和血清#6均为阳性，且血清#6抗体效价最高，与ELISA测得抗体效价趋势一致。
FAMA滴度检测结果
血清 #0 #1 #3 #4 #5 #6
FAMA检测结果 <1:8 1:8 1:8 <1:8 <1:8 1:32
4、实验结论
FAMA滴度检测结果与ELSIA实验结果趋势基本一致，表明HEK293-gE细胞系可作为特异性抗原用于FAMA检测。
实施例4FAMA实验用细胞比较
1、实验材料及来源
FAMA实验用材料同实施例2；
MRC-5细胞和水痘病毒为本实验室保存；
2、实验方法
稳定表达gE蛋白的HEK293细胞即gE-HEK293细胞系，pCEP4-gE瞬时转染HEK293细胞，水痘病毒感染的MRC-5细胞，以及空白HEK293细胞分别作为FAMA实验用细胞；以实施例2中的#6血清作为检测血清，血清进行倍比稀释后按照实施例2的方法进行FAMA操作。
3、实验结果
如图10-13所示，图10示出了gE-HEK293细胞系FAMA实验结果图；图11示出了pCEP4-gE瞬时转染HEK293细胞FAMA实验结果图；图12示出了HEK293细胞FAMA实验结果图；图13示出了VZV感染MRC-5细胞FAMA实验结果图。
各细胞FAMA检测结果如下：
Figure GDA0004187355130000141
由检测结果可知，稳定表达gE蛋白的HEK293细胞系比gE瞬时转染的HEK293细胞作为FAMA检测抗原的灵敏度高；稳定表达gE蛋白的HEK293细胞系与水痘病毒感染的MRC-5细胞检测结果相似。
实施例5gE-HEK293用于流式细胞术检测血清特异性抗体
1、实验材料及来源
FITC标记的羊抗鼠荧光二抗购自武汉博士德公司；MRC-5细胞和水痘病毒为本实验室保存。
小鼠血清制备同实施例3所述。
2、实验方法
感染水痘病毒MRC-5细胞及gE-HEK293细胞流式样品制备。
以本实验室保存的水痘病毒感染MRC-5细胞，感染3d后，胰酶消化收集MRC-5细胞，将其密度稀释为3×106个/ml，取100μl为1个检测样，将小鼠血清按1:8稀释加入100μl样品中。将样品在37℃孵育1h；用1.5mlPBS重悬细胞，1000rpm离心5min，重复2次。加入1:100稀释的FITC标记的羊抗鼠二抗100μl，37℃孵育1h；用1.5mlPBS重悬细胞，1000rpm离心5min，重复2次。用500μlPBS重悬细胞。取部分细胞于荧光显微镜下观察细胞形态及荧光。
收获HEK293-gE细胞，将其稀释为3×106个/ml，取100μl为1个检测样，将小鼠血清加入100μl样品中，HEK293-gE组小鼠血清最终稀释比例为1:5、1:8、1:16、1:32；设HEK293-gE不加血清孵育组为阴性对照。用1.5mlPBS重悬细胞，1000rpm离心5min，重复2次。加入1:100稀释的FITC标记的羊抗鼠二抗100μl，37℃孵育1h；用1.5mlPBS重悬细胞，1000rpm离心5min，重复2次。用500μlPBS重悬细胞，流式细胞仪上样，收集并分析数据。
3、实验结果
使用荧光染色观察水痘病毒感染后的MRC-5细胞和gE-HEK293细胞，检测结果如图14和15所示，图14示出了MRC-5细胞的荧光染色结果图，图15示出了gE-HEK293细胞荧光染色结果图。
由图可知，MRC-5细胞在感染水痘病毒后，感染后第三天，取细胞荧光染色观察；结果表明MRC-5细胞感染病后细胞易聚团，且细胞碎片较多无法使用流式细胞仪检测。gE-HEK293细胞荧光抗体孵育处理后，细胞分散，且细胞边缘清晰，可使用流式细胞仪检测。
gE-HEK293流式细胞术检测结果
以孵育#0血清的gE-HEK293细胞为阴性对照，在阴性组设门，使阴性组细胞荧光强度峰值全部位于门内，分析样品组阳性细胞率。结果表明随着血清抗体稀释的降低，流式检测FITC标记的阳性细胞比例逐渐减少，结果如图16所示。
由图16可知，gE-HEK293细胞能够完全适用于流式细胞术检测，并且检测结果清晰准确。
实施例6gE-HEK293细胞用于细胞ELISA检测血清特异性抗体1、实验材料及来源
增强型HRP-DAB底物显色试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；Balb/c小鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，雌性，小鼠血清制备取本实验室制备纯化的VZV-gE蛋白肌肉注射小鼠，分别于0天和14天进行2次免疫，2免后14天眼眶采血，分离血清，分装后保存于-20℃。
2、实验方法
2.1、gE-HEK293细胞悬浮分散后，按1×106个/ml的密度接种96孔板，每孔100μl，37℃培养过夜。
2.2、弃上清，用80％冷丙酮固定细胞5min；弃去固定液，用PBST轻轻洗涤细胞3次。
2.3、每孔加入100μl的5％脱脂奶粉，37℃封闭1h。
2.4、用PBST按10倍倍比稀释小鼠抗VZV血清，分别为1:10、1:100和1:1000；阴性组用对照组血清进行1:10稀释，每个稀释度加入100μl，做复孔，在37℃孵育2h。
2.5、弃血清抗体，用PBST轻轻洗涤细胞3次。
2.6、用PBST按1：1000稀释HRP标记的羊抗鼠二抗，每孔100μl，37℃孵育1h。
2.7、弃去二抗，用PBST轻轻洗涤细胞3次。
2.8、用TMB显色，每孔加入50μl显色液和50μl终止液，在波长450nm处读取OD值，根据OD值判定抗体效价。
3、实验结果
细胞ELISA结果显示，gE-HEK293细胞可进行细胞ELSIA实验。
血清稀释度 1:10 1:100 1:1000 阴性血清(1:10)
OD值 1.325 0.832 0.442 0.434
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 安徽智飞龙科马生物制药有限公司
重庆智飞生物制品股份有限公司
北京智飞绿竹生物制药有限公司
<120> 一种gE-HEK293细胞的构建方法及其应用
<140> 2021101944481
<141> 2021-02-21
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1875
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggacatgg gcacagtgaa taagcctgtg gtgggcgtgc tgatgggctt cggcatcatc 60
accggcacac tgcgcatcac caacccagtg agggccagcg tgctgcgcta cgacgatttt 120
cacatcgacg aggataagct ggacacaaat tccgtgtatg agccctacta tcactctgat 180
cacgcagaga gctcctgggt gaacagggga gagtctagca gaaaggccta cgaccacaac 240
tccccctata tctggcctcg gaatgactac gatggcttcc tggagaacgc ccacgagcac 300
cacggcgtgt ataatcaggg cagaggcatc gactctggcg agaggctgat gcagcccacc 360
cagatgagcg cccaggagga tctgggcgac gatacaggca tccacgtgat ccctaccctg 420
aatggcgacg atcgccacaa gatcgtgaac gtggatcagc ggcagtacgg cgacgtgttt 480
aagggcgatc tgaatcccaa gcctcagggc cagagactga tcgaggtgag cgtggaggag 540
aaccacccat tcaccctgag ggcaccaatc cagaggatct acggcgtgcg gtataccgag 600
acatggtcct ttctgccttc tctgacctgc acaggcgacg cagcaccagc aatccagcac 660
atctgcctga agcacaccac atgtttccag gacgtggtgg tggacgtgga ttgtgccgag 720
aataccaagg aggatcagct ggccgagatc tcctacaggt tccagggcaa gaaggaggcc 780
gatcagccct ggatcgtggt gaacacctct acactgtttg acgagctgga gctggatccc 840
cctgagatcg agcctggcgt gctgaaggtg ctgcgcaccg agaagcagta cctgggcgtg 900
tatatctgga acatgagggg aagcgacggc acctccacat acgccacctt cctggtgaca 960
tggaagggcg atgagaagac cagaaatcca acaccagcag tgacccctca gccaaggggc 1020
gcagagtttc acatgtggaa ctatcactct cacgtgttca gcgtgggcga cacctttagc 1080
ctggccatgc acctgcagta caagatccac gaggcccctt tcgacctgct gctggagtgg 1140
ctgtatgtgc ccatcgatcc tacatgccag ccaatgcgcc tgtactccac ctgtctgtat 1200
cacccaaatg ccccccagtg cctgtcccac atgaactctg gctgtacctt tacaagccca 1260
cacctggcac agagggtggc atccacagtg taccagaact gcgagcacgc cgacaattac 1320
accgcctatt gtctgggcat cagccacatg gagccatcct tcggcctgat cctgcacgac 1380
ggaggaacca cactgaagtt tgtggatacc cccgagagcc tgtccggcct gtacgtgttc 1440
gtggtgtact tcaacggcca cgtggaggcc gtggcctaca cagtggtgtc taccgtggat 1500
cacttcgtga acgccatcga ggagagaggc tttccaccaa cagcaggaca gcctccagca 1560
accacaaagc caaaggagat cacacctgtg aacccaggca cctccccact gctgagatat 1620
gcagcatgga caggaggact ggcagcagtg gtgctgctgt gcctggtcat cttcctgatc 1680
tgtaccgcca agcggatgag agtgaaggcc tacagagtgg acaagtctcc ctataatcag 1740
agcatgtact atgccggcct gcctgtggac gatttcgagg actctgagag caccgataca 1800
gaggaggagt ttggaaacgc aatcggagga agccacggag gctcctctta cacagtgtat 1860
atcgataaga ccagg 1875

Claims (9)

1.一种gE-HEK293细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
构建重组质粒：将水痘带状疱疹病毒糖蛋白gE基因序列片段按HEK293细胞表达系统进行密码子优化形成目的基因，并将目的基因连接至表达载体上，形成重组质粒；密码子优化后的目的基因序列如序列表所示；
重组质粒转染：将重组质粒用限制性内切酶在30±2℃下反应3-5h，利用乙醇沉淀回收法获得线性化质粒，采用脂质体转染法将线性化质粒转染至HEK293细胞，将能够表达gE蛋白的HEK293细胞作为初代gE-HEK293细胞；
重组细胞株构建：将初代gE-HEK293细胞和HEK293细胞用Hygromycin B加压筛选；
待HEK293细胞全部死亡后，将初代gE-HEK293细胞计数并按照1个细胞/孔的密度铺板，在培养箱中培养后选取gE蛋白表达量最高的单克隆细胞进行传代培养，所述选取gE蛋白表达量最高的单克隆细胞进行传代培养包括：在初代gE-HEK293细胞培养结束后，选择有单克隆生成的细胞孔，加药筛选培养，通过ELISA检测筛选表达量最高的单克隆细胞进行扩大培养，重复加压筛选以及挑选表达量最高的单克隆细胞的步骤，直至HEK293细胞能够稳定表达gE蛋白完成传代培养。
2.根据权利要求1所述的gE-HEK293细胞的构建方法，其特征在于，所述gE基因序列片段通过在水痘带状疱疹病毒糖蛋白gE基因序列的上下游添加Hind III和Xho I酶切位点，再通过序列合成的方式获得gE基因序列片段。
3.根据权利要求1所述的gE-HEK293细胞的构建方法，其特征在于，所述培养箱的培养条件为：转染细胞在37℃、5％CO2下培养12-14天。
4.利用权利要求1-3任意一项所述的gE-HEK293细胞进行非诊断目的的FAMA检测的方法，其特征在于，所述方法包括：
胰酶消化gE-HEK293细胞，将细胞稀释固定在载玻片上；
将稀释后的VZV抗体血清加入到含有gE-HEK293细胞的载玻片中，4℃静置16-18h；
用PBS洗涤含血清的载玻片，并加入稀释的FITC标记的羊抗鼠二抗，37℃避光孵育1h；
PBS洗涤孵育后的载玻片，置于荧光显微镜下观察，所述gE-HEK293细胞表面能够形成边界清晰膜性荧光环。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述细胞稀释固定在载玻片上包括：将消化后的细胞稀释至6×105个/ml密度，取10μl细胞加至12孔载玻片，置于37℃晾干；所述细胞稀释后固定在载玻片上所用的固定液为80％冷丙酮，固定时间为5min。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述FITC标记的羊抗鼠二抗为含1％伊文思蓝的FITC标记的羊抗鼠二抗，稀释比例为1:100。
7.利用权利要求1-3任意一项所述的gE-HEK293细胞进行非诊断目的的流式细胞术检测的方法，其特征在于，所述方法包括：
稀释gE-HEK293细胞至所需浓度，取100μl稀释后的gE-HEK293细胞；
将稀释后的VZV抗体血清加入100μl的gE-HEK293细胞中，37℃孵育1h；
加入标记抗体，37℃孵育1h；
重悬加入标记抗体后的gE-HEK293细胞，进行流式细胞仪上样，收集检测数据。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述标记抗体为1:100稀释的FITC标记的羊抗鼠二抗，所用标记抗体体积为100μl。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述重悬加入标记抗体后的gE-HEK293细胞包括：首先用PBS重悬加入标记抗体后的gE-HEK293细胞，1000rpm离心5min，重复2次，用500μl PBS重悬离心后的gE-HEK293细胞，流式细胞仪上样。
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