CN102604896A - 一种h1r高表达的重组hek293细胞的构建方法 - Google Patents

Abstract

一种H1R高表达的重组HEK293细胞的构建方法，利用真核表达载体pEGFP-N1构建全长H1R基因真核表达载体pEGFP-N1-H1R，进而以其转染HEK293细胞，利用G418筛选得到高表达全长H1R的基因的工程细胞系HEK293-H1R，并证实该细胞系可将全长H1R的表达提高2.58倍，H1R高表达的HEK293-H1R重组细胞应用于抗过敏药物筛选。

Description

一种H1R高表达的重组HEK293细胞的构建方法

技术领域

本发明属于重组细胞技术领域，涉及一种H1R高表达的重组HEK293细胞的构建方法。

背景技术

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)，又称为七次α螺旋跨膜蛋白受体(seven α-helices transmembrane segmentreceptors，7TM receptors)，是体内最大的蛋白质超家族。在结构上面它包括七个跨膜区段，它们与配体结合G蛋白分子开关后，通过与受体偶联的G蛋白的介导，使第二信使物质增多或减少，转而改变膜上的离子通道，引起膜电位发生变化。其作用比离子通道型受体缓慢，这类受体与G蛋白之间的偶联关系也颇为复杂；一种受体可以和多种G蛋白偶联，激活多种效应系统；也可同时和几种受体偶联或几种G蛋白与一种效应系统联系而使来自不同受体的信息集中于同一效应系统。

组胺是一种小分子胺类物质。它是由组氨酸脱羧酶作用于L-组氨酸而合成，组氨酸脱羧酶在整个机体细胞内均有表达，包括中枢神经系统神经元、胃黏膜壁细胞、肥大细胞及嗜碱粒细胞。组胺通过组胺受体(Histamine receptor，H1R)调节机体功能，包括睡眠与觉醒周期，能量及内分泌稳定，识别及记忆，抗惊厥作用。

组胺受体属G蛋白偶联受体(GPCR)家族成员，与其他单胺GPCR具有共同的保守序列。但序列同源性很低，在与组胺的亲和力上存在很大差异，通过偶联激活特异的G蛋白进行信号转导。H1R在多种细胞中表达，包括内皮细胞、平滑肌细胞，调节血管舒张和支气管收缩。研究表明，组胺在过敏性炎症中起关键性作用，长期以来人们认为组胺释放引起的炎性反应是由H1R介导的。H1R通过改变细胞内钙离子的浓度而将细胞外信号传递给第二信使传导系统并升高环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)浓度而影响细胞生理功能。

过敏是指由免疫机制诱导的高敏反应。过敏是体液(抗体)或者是细胞免疫机制介导的。在大多数情况下，可产生过敏反应的抗体属于IgE类，这些个体可以归类于患有IgE-介导的过敏反应。然而，并非所有的“特异反应性”(atopy)个体都会发生与IgE相关的“过敏反应”。在非-IgE-介导的过敏反应中，抗体也可以属于IgG一类。H1R拮抗剂也称为抗组胺药，可用于因组胺释放所致的荨麻疹、变应性鼻炎，以及对过敏所致的瘙痒、水肿都有很好的抑制作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种H1R高表达的重组HEK293细胞的构建方法，采用以H1R为靶标，筛选H1R阻断剂，为发现H1R阻断剂建立细胞模型。

为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现：

一种H1R高表达的重组HEK293细胞的构建方法，H1R高表达的重组HEK293细胞是以HEK293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体的是包含H1R全长基因的表达载体。

所述的H1R全长基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

所述的包含H1R全长基因的表达载体是pEGFP-N1，该表达载体是通过HindIII，Xho I酶切位点将H1全长基因克隆入真核表达载体pEGFP-N1。

所述的表达载体pEGFP-N1带有GFP绿色荧光，应用于H1R高表达细胞的筛选。

所述的H1R高表达的HEK293-H1R重组细胞应用于抗过敏药物的筛选。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明构建了组胺受体H1的真核表达载体pEGFP-N1，经过克隆测序证实序列同NCBI数据库中的人H1R序列一致；经过脂质体法转染HEK293细胞，G418抗性筛选获得能够稳定生长、存活的细胞株，经过Western blot，免疫荧光检测，筛选出稳定、高表达H1R的重组HEK293/H1R细胞株；

本发明构建的包含H1R基因全长的重组HEK293/H1R细胞株能够稳定表达H1R，具有完整的分子结构。

2、作为宿主细胞的HEK293细胞为原代人胚肾细胞转染V型腺病毒(Ad5)DNA的永生化细胞，该细胞本身还有的各种受体表达量相对较低，而重组后的HEK293/H1R细胞表达的H1R的相对表达量较HEK293空载明显升高，相对于其他细胞表面分子占据优势表达量，处于与特异配体结合的优势地位，这样就大大提高了以H1R为药物筛选靶标的特异性及灵敏性。

3、重组后的HEK293/H1R细胞表达的H1R利用GFP融合蛋白，活体观察H1R蛋白表达定位，显示H1R蛋白主要表达于细胞膜上。

4、通过Western blot及免疫荧光检测技术，证明H1R表达量相比HEK293明显升高，且其在细胞膜上的表达较HEK293细胞表达量明显提高，体现H1R的分子活性。

附图说明

图1是扩增H1R基因及线性化载体电泳检测图谱。

图2是pEGFP-N1/H1R重组载体转染大肠杆菌DH5后，提取质粒菌液PCR鉴定结果。

图3是经G418抗性筛选后，通过GFP荧光蛋白，活体观察的阳性细胞培养图。

图4-a是Western blot分析阳性细胞H1R表达量；图4-b是对Western blot结果灰度分析柱状图。

图5是免疫荧光分析H1R在pEGFP-N1/H1R细胞表达定位。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做详细描述。

本发明在构建H1R全长基因的真核表达载体pEGFP-N1/H1R的基础上，转染HEK293细胞，获得稳定、高表达H1R的重组HEK293/H1R细胞株，下面是对本发明实施例的解释而不是限定。

本实施例以pEGFP-N1为基础载体，具体选择HindIII和XhoI酶切位点作为连接外源基因的多克隆位点。

一种H1R高表达的重组HEK293细胞的构建方法，包括以下步骤：

1)H1R基因克隆

选择包含H1R基因全长cDNA序列pBluescriptR/H1质粒作为模板进行克隆，采用Primer Premier5.0软件设计相应的特异性引物，并在两端分别加入HindIII/XhoI酶切位点：H1R-HindIII：5’-GATAAGCTTGGAGCGAATATGCAGAATTCT-3’；H1R-XhoI：5’-GTACTCGAGATGAGCCTCCCCAATTCCTCC-3’；

采用Takara公司LA Taq进行扩增：PCR反应体系为：上游引物4μL、下游引物4μL、10×M buffer：5μL、dNTP：8μL、DNA：1μL、BSA：2μL、Taq酶：0.4μL、补加ddH₂O至50μL；首次95℃变性5min，再经过30个循环作用(95℃变性45s，60℃复性40s，72℃延伸2min)，最后72℃延伸10min，得到大量目的片段，对产物采用商品化PCR纯化试剂盒将扩增产物纯化，H1cDNA扩增结果检测如图1所示，M为marker，结果表明扩增获得预期的基因；

2)重组表达载体构建

利用HindIII/XhoI双酶切真核表达载体pEGFP-N1和H1基因纯化产物：酶切体系为：HindIII：1μL、Xho I：1.5μL、DNA/质粒：2μL、10×M buffer 2μL、补加ddH₂O至20μL；37℃反应4h，对pEGFP-N1载体酶切产物采用商品化PCR产物纯化试剂盒将扩增产物纯化，pEGFP-N1载体酶切产物电泳结果如图1所示，M为Marker；

将线性化载体同酶切后的H1扩增片段4℃条件下，T4DNA ligase作用下过夜连接，反应体系为：酶切后的线性pEGFP-N13.7μL、酶切后的H1片段5μL、T4DNAligase 0.3μL、10×buffer 1μL，得到重组pEGFP-N1/H1表达载体；

按照《分子克隆实验指南》制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，将10μL重组pEGFP-N1/H1质粒加入200μL感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，加入10mL无卡拉霉素抗性LB液体培养基，37℃振摇1h，3000rpm离心3min，将菌体沉淀吹打均匀，加入30mL含有卡拉霉素抗性(100mg/mL)LB固体培养基中，37℃过夜培养，挑取单克隆在含有卡拉霉素抗性(100mg/mL)LB液体培养基中扩大培养，采用商品化试剂盒提取获得高纯度质粒，菌液PCR初步鉴定阳性克隆(结果如图2所示)，并送金斯瑞生物科技公司进行测序，验证序列碱基，DNAstar Seqman进行序列拼接，得到的测序结果如SEQ.ID.NO.1所示，测序结果与基因库(NCBI)中比对，序列一致性为100％，含有正确序列即为pEGFP-N1/H1重组表达载体；

3)高表达H1重组HEK293细胞构建

①使用Invitrogen公司脂质体转染试剂LipofectAMINE 2000进行转染：常规培养HEK293细胞，在6孔板中接种3×10⁵个细胞/孔，加入2mL完全培养基，置CO₂孵箱中37℃培养过夜，待细胞长至50～80％时进行转染；在无菌离心管中配制如下溶液：

溶液A：将5μg待转染的超纯DNA稀释到200μL无血清培养基中；

溶液B：将8μL LipofectAMINE 2000稀释到200μL无血清培养基中；

混合溶液A和B，轻轻混匀，室温放置15～45min；用2mL无血清培养基轻轻洗涤细胞，加入0.8mL无血清培养基/孔，将脂质体复合物滴加到孔中，轻轻摇晃混匀，置CO₂孵箱中37℃孵育6h；用完全培养基替换转染液，继续培养；HEK293细胞的筛选浓度为800μg/mL；转染72小时后按1∶10的比例将转染细胞在6孔板中传代，换为含G418的选择培养基；在6孔板内可见单个细胞，继续培养14天左右，可见单个细胞分裂增殖形成单个抗性集落，如图3所示；

②有限稀释法：抗性集落细胞消化下来后做连续的10倍稀释(10^-2～10^-10)，将每一稀释度的细胞滴加到96孔板中培养，15天左右细胞长满整个孔，胰酶消化，传代至大瓶培养，反复冻存、培养细胞两次；

4)高表达H1R重组HEK293细胞鉴定

①Western blot：4℃条件下，将转染H1、转染pEGFP-N1的HEK293细胞，按1.5×10⁶个细胞加入200μL细胞裂解液(加入蛋白酶抑制剂PMSF)的比例裂解细胞，加入50μL loading buffer，沸水浴10min，提取细胞总蛋白进行SDS-PAGE电泳，用PVDF膜完成全湿电转印，后用含5％(m/v)脱脂奶粉的TBST室温封闭转移后的PVDF膜，经TBST洗涤，加5％(m/v)BSA的TBST稀释的特异性一抗与靶蛋白4℃过夜孵育，TBST洗涤3次后，再加5％(m/v)BSA的TBST稀释的辣根过氧化物酶偶联的二抗，用ECL化学发光检测蛋白表达，检测HEK293/H1R细胞H1蛋白表达。经检测，如图4-a所示，H1-1、H1-3、H1-4、H1-7、H1-8、H1-9为筛选的转染了HEK293/H1R的细胞克隆，pcDNA为转染空载的重组HEK293细胞，克隆H1-4、H1-7、H1-8、H1-9的H1R表达量较克隆HEK293-pcDNA的表达量均有提高，而以克隆H1-8的H1R表达量最高。对Western blot的灰度分析结果表明，阳性克隆表达量均有升高，且H1-8较阴性细胞HEK293的H1R的表达高2.58倍；如图4-b所示；

②免疫荧光分析H1R表达定位：取对数生长期的HEK293空载细胞和pEGFP-N1/H1R细胞，0.25％(m/v)胰蛋白酶消化，按1×10⁵个细胞/孔左右接种于放有多聚赖氨酸预处理的无菌盖玻片的6孔板中，培养24h细胞贴壁后，弃去培养基，用PBS轻轻洗涤爬有细胞的盖玻片三次；4％(m/v)多聚甲醛(pH 7.4PBS溶解)1mL固定细胞15min，后弃去；PBS轻柔洗涤细胞2次，加入1mL含1％(m/v)牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的PBST孵育细胞1h；用含1％(m/v)BSA的PBST以1∶100稀释兔抗人H1R多克隆抗体，加到盖玻片上，室温孵育2h；PBS轻轻洗涤三次，每次5min；用含1％(m/v)BSA的PBST以1∶200稀释FITC标记山羊抗兔IgG二抗，滴加到爬片上，室温避光孵育1h；于暗处，PBS洗涤三次，每次5min；在载玻片上滴加90％(m/v)甘油封片，注意不要产生气泡。用荧光显微镜观察并拍照，结果如图5所示，图5-a、图5-d为DAPI分别染H1R和HEK293细胞核，蓝色荧光。图5-b、图5-e为cy-3分别染H1R和HEK293细胞膜，红色荧光。图5-c、图5-f别为H1R和HEK293细胞核和细胞膜荧光叠加后的图谱。与HEK293空载细胞相比，H1R细胞膜上有H1R的表达。

Claims (6)

1.一种H1R高表达的重组HEK293细胞的构建方法，其特征在于：H1R高表达的重组HEK293细胞是以HEK293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体的是包含H1R全长基因的表达载体。

2.根据权利要求1所述的一种H1R高表达的重组HEK293细胞的构建方法，其特征在于：所述的H1R全长基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示：

核苷酸序列表

<110>西安交通大学

<120>一种H1R高表达的重组HEK293细胞的构建方法

<160>1

<210>1

<211>1464

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

atgagcctccccaattcctcctgcctcttagaagacaagatgtgtgagggcaacaagaccactat

ggccagcccccagctgatgcccctggtggtggtcctgagcactatctgcttggtcacagtaggg

ctcaacctgctggtgctgtatgccgtacggagtgagcggaagctccacactgtggggaacctgt

acatcgtcagcctctcggtggcggacttgatcgtgggtgccgtcgtcatgcctatgaacatcctct

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gccagcacagcgtccattttcagtgtcttcatcctgtgcattgatcgctaccgctctgtccagcagc

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ctctcttttctgtgggttattcccattctaggctggaatcacttcatgcagcagacctcggtgcgccg

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atcaactccacactgaaccccctcatctaccccttgtgcaatgagaacttcaagaagacattcaag

agaattctgcatattcgctcc。

3.根据权利要求1所述的一种H1R高表达的重组HEK293细胞的构建方法，其特征在于：所述的包含H1R全长基因的表达载体是pEGFP-N1，该表达载体是通过Hind III，XhoI酶切位点将H1R全长基因克隆入真核表达载体pEGFP-N1。

4.根据权利要求3所述的一种H1R高表达的重组HEK293细胞的构建方法，其特征在于：所述的达载体pEGFP-N1带有GFP绿色荧光，应用于H1R高表达细胞的筛选。

5.根据权利要求1所述的一种H1R高表达的重组HEK293细胞 的构建方法，其特征在于：所述的H1R高表达的HEK293-H1R重组细胞应用于抗过敏药物筛选。

6.根据权利要求1至5任一权利要求所述的一种H1R高表达的重组HEK293细胞的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)H1R基因克隆

选择包含H1R基因全长cDNA序列pBluescriptR/H1R质粒作为模板进行克隆，采用Primer Premier5.0软件设计相应的特异性引物，并在两端分别加入HindIII/XhoI酶切位点：H1R-HindIII：5’-GATAAGCTTGGAGCGAATATGCAGAATTCT-3’；H1R-XhoI：5’-GTACTCGAGATGAGCCTCCCCAATTCCTCC-3’；

采用Takara公司LA Taq进行扩增：PCR反应体系为：上游引物4μL、下游引物4μL、10×M buffer：5μL、dNTP：8μL、DNA：1μL、BSA：2μL、Taq酶：0.4μL、补加ddH₂O至50μL；首次95℃变性5 min，再经过30个循环作用(95℃变性45s，60℃复性40s，72℃延伸2min)，最后72℃延伸10min，得到大量目的片段，对产物采用商品化PCR纯化试剂盒将扩增产物纯化；

2)重组表达载体构建

利用HindIII/XhoI双酶切真核表达载体pEGFP-N1和H1基因纯化产物：酶切体系为：HindIII：1μL、Xho I：1.5μL、DNA/质粒：2μL、10×M buffer 2μL、补加ddH₂O至20μL；37℃反应4h，对pEGFP-N1载体酶切产物采用商品化PCR产物纯化试剂盒将扩增产物纯化；

将线性化载体同酶切后的H1扩增片段4℃条件下，T4 DNA ligase作用下过夜连接，反应体系为，酶切后的线性pEGFP-N1 3.7μL、酶切后的H1片段5μL、T4 DNA ligase 0.3μL、10×buffer 1μL，得到重 组pEGFP-N1/H1表达载体；

按照《分子克隆实验指南》制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，将10μL重组pEGFP-N1/H1质粒加入200μL感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，加入10mL无卡拉霉素抗性LB液体培养基，37℃振摇1h，3000rpm离心3min，将菌体沉淀吹打均匀，加入30mL含有卡拉霉素抗性(100mg/mL)LB固体培养基中，37℃过夜培养，挑取单克隆在含有卡拉霉素抗性(100mg/mL)LB液体培养基中扩大培养，采用商品化试剂盒获得高纯度质粒，菌液PCR初步鉴定阳性克隆，并送金斯瑞生物科技公司进行测序，验证序列碱基，DNAstar Seqman进行序列拼接，得到的测序结果如SEQ.ID.NO.1所示，测序结果与基因库(NCBI)中比对，序列一致性为100％，含有正确序列即为pEGFP-N1/H1重组表达载体；

3)高表达H1重组HEK293细胞构建

①使用Invitrogen公司脂质体转染试剂LipofectAMINE 2000进行转染：常规培养HEK293细胞，在6孔板中接种3×10⁵个细胞/孔，加入2mL完全培养基，置CO₂孵箱中37℃培养过夜，待细胞长至50～80％时进行转染；在无菌离心管中配制如下溶液：

溶液A：将5μg待转染的超纯DNA稀释到200μL无血清培养基中；

溶液B：将8μL LipofectAMINE 2000稀释到200μL无血清培养基中；

混合溶液A和B，轻轻混匀，室温放置15～45min；用2mL无血清培养基轻轻洗涤细胞，加入0.8mL无血清培养基/孔，将脂质体复合物滴加到孔中，轻轻摇晃混匀，置CO₂孵箱中37℃孵育6h；用完 全培养基替换转染液，继续培养；HEK293细胞的筛选浓度为800μg/mL；转染72小时后按1∶10的比例将转染细胞在6孔板中传代，换为含G418的选择培养基；在6孔板内可见单个细胞，继续培养14天左右，可见单个细胞分裂增殖形成单个抗性集落；

②有限稀释法：抗性集落细胞消化下来后做连续的10倍稀释(10^-2～10^-10)，将每一稀释度的细胞滴加到96孔板中培养，15天左右细胞长满整个孔，胰酶消化，传代至大瓶培养，反复冻存、培养细胞两次；

4)高表达H1R重组HEK293鉴定

①Western blot：4℃条件下，将转染H1R、转染pEGFP-N1的HEK293细胞，按1.5×10⁶个细胞加入200μL细胞裂解液(加入蛋白酶抑制剂PMSF)的比例裂解细胞，加入50μL loading buffer，沸水浴10min，提取细胞总蛋白进行SDS-PAGE电泳，用PVDF膜完成全湿电转印，后用含5％(m/v)脱脂奶粉的TBST室温封闭转移后的PVDF膜，经TBST洗涤，加％(m/v)BSA的TBST稀释的特异性一抗与靶蛋白4℃过夜孵育，TBST洗涤3次后，再加5％(m/v)BSA的TBST稀释的辣根过氧化物酶偶联的二抗，用ECL化学发光检测蛋白表达，检测HEK293/H1细胞H1蛋白表达；经检测，H1-1、H1-3、H1-4、H1-7、H1-8、H1-9为筛选的转染了HEK293/H1R的细胞克隆，pcDNA为转染空载的重组HEK293细胞，克隆H1-4、H1-7、H1-8、H1-9的H1R表达量较克隆HEK293-pcDNA的表达量均有提高，而以克隆H1-8的H1R表达量最高；对Western blot的灰度分析结果表明，阳性克隆表达量均有升高，且H1-8较阴性细胞HEK293的H1R的表达高2.58倍； 

②免疫荧光分析H1R表达定位：取对数生长期的HEK293空载细胞和pEGFP-N1/H1R细胞，0.25％(m/v)胰蛋白酶消化，按1×10⁵个细胞/孔左右接种于放有多聚赖氨酸预处理的无菌盖玻片的6孔板中，培养24h细胞贴壁后，弃去培养基，用PBS轻轻洗涤爬有细胞的盖玻片三次；4％(m/v)多聚甲醛(pH 7.4 PBS溶解)1mL固定细胞15min后弃去；PBS轻柔洗涤细胞2次，加入1mL含1％(m/v)牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的PBST孵育细胞1h；用含1％(m/v)BSA的PBST以1∶100稀释兔抗人H1多克隆抗体，加到盖玻片上，室温孵育2h；PBS轻轻洗涤三次，每次5min；用含1％(m/v)BSA的PBST以1∶200稀释FITC标记山羊抗兔IgG二抗，滴加到爬片上，室温避光孵育1h；于暗处，PBS洗涤三次，每次5min；在载玻片上滴加90％(m/v)甘油封片，注意不要产生气泡。 

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