CN101538578B

CN101538578B - 三基因融合的重组牛结核特异性抗原蛋白及制备方法

Info

Publication number: CN101538578B
Application number: CN2009100609131A
Authority: CN
Inventors: 郭爱珍; 刘冬光; 曹莎; 陈颖钰; 廖娟红; 于清龙; 凌洁玉; 陈焕春
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2009-03-02
Filing date: 2009-03-02
Publication date: 2011-01-26
Anticipated expiration: 2029-03-02
Also published as: CN101538578A

Abstract

本发明属于微生物基因工程技术领域。具体涉及一种三基因融合的重组牛结核特异性抗原蛋白其及制备方法。该牛结核特异性融合抗原蛋白的基因，具有如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和氨基酸序列。公开了一株能够表达牛结核特异性融合抗原蛋白的重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET28a-RCE，其保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No：M208244。进一步本发明公开了这种三基因融合抗原蛋白的制备方法。

Description

三基因融合的重组牛结核特异性抗原蛋白及制备方法

技术领域

本发明涉及微生物基因工程技术领域。具体涉及一种三基因融合的重组牛结核特异性抗原蛋白及制备方法。

背景技术

牛结核病(Bovine Tuberculosis，bTB)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的一种慢性人兽共患传染病。我国将其列为二类动物疫病。国内外的人结核病原学调查均发现，牛分枝杆菌是人结核的重要病因之一。世界卫生组织专家委员会第七次会议报告指出：除非消灭牛结核，否则人类结核病的控制是不会成功的。由于目前为止尚未发现有效药物与疫苗用于牛结核病的防治，一些国家普遍采用的是“检疫-捕杀”政策，即检疫出的阳性牛一律捕杀来实现控制牛结核病。因此，准确而及时的诊断方法对于该病的防治显得尤为重要。

OIE唯一推荐的方法是牛型结核菌素皮内变态反应(Tuberculin skin test，TST)。但由于结核菌素可能包含有与其它分枝杆菌相同的非特异性抗原组份，检测时容易出现假阳性；结核菌素皮内变态反应对感染后期的开放性结核及全身性结核不敏感。此外，TST程序繁琐、耗时费力、结果判断主观性强，需专业人员操作，使“检疫-扑杀”政策的实施效果大打折扣，且其只能进行活体试验，而不能对保存的样品进行回顾性分析，更不适用于野生动物和边远山区的牛结核病普查。因此，人们致力于开发一种更加简便、快速、高特异性、高敏感性的新型诊断方法。

在关于牛结核病诊断的以往研究中，曾经报道过结核特异性抗原MPB70、MPB83、CFP10、ESAT6等的单独制备及应用，也有关于以上两种过多种抗原融合后的应用报道，发现单个抗原在牛结核的诊断过程中敏感性和特异性均不高，而采用“鸡尾酒”方法制备的融合抗原在应用中过的较好的效果(Siguo Liu，et al.，A novel fusion protein-based indirect enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of bovine tuberculosis.Tuberculosis，2006，3；C.Aagaard，et al.，Optimizing Antigen Cocktails for Detection of Mycobacterium bovisin Herds with Different Prevalences of Bovine Tuberculosis：ESAT6-CFP10 Mixture Shows Optimal Sensitivity andSpecificity，[J].Clin Microbiol，2006，44(12)：4326-4335；Cockle PJ，et al.，Field evaluation of a noveldifferential diagnostic reagent for detection of Mycobacterium bovis in cattle[J].Clin Vaccine Immunol，2006，13(10)：1119-1124；Kanaujia GV，et al.，Detection of early secretory antigenic target-6 antibody for diagnosisof tuberculosis in non-human primates[J].Comp Med 2003，53(6)：602-606)。

另一方面，过去乃至现在仍较流行的TST方法中所使用PPD所包含的抗原为致病性分枝杆菌、非结核分枝杆菌及卡介苗(BCG)共有，故不能区分PPD皮试阳性者是致病性分枝杆菌还是非结核分枝杆菌感染抑或是BCG免疫的结果(Oettinger T，Holm A，Haslov K，Characterization of the delayed typehypersensitivity-inducing epitope of MPT64 from Mycobacterium tuberculosis [J].Scand J Immunol，1997，45(5)：499-503)。为了排除由于以上原因导致的生产中会造成误诊、误杀的问题，国内外研究热点开始放在如何在牛结核的特异性诊断上。1998年结核分枝杆菌基因组破译成功，运用基因组杂交技术对结核分枝杆菌和卡介苗(BCG)的基因组序列进行比较，发现卡介苗(BCG)相比于结核分枝杆菌，有16个缺失的基因区域(Region of Deletion，RD)，包括RD1-16，其中的RD1区是仅存在于致病性分枝杆菌包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、非洲分枝杆菌及某些非典型分枝杆菌，而不存在于卡介苗(BCG)及其它非致病性分枝杆菌中(Lewis KN，Liao R，Guinn KM，et al.，Deletion of RD1 from Mycobacterium tuberculosis mimics bacilleCalmette-Guerin attenuation.[J].Infect Dis，2003，187(1)：117-123；Gordon S V，Brosch R，Billault A，et al.，Identification of variable regions in the genomes of tubercle bacilli using bacterial artifi cial chromosomearrays.[J].Mol Microbiol，1999，32(3)：643-655)。研究表明，RD1区的基因产物极有可能在最初的MTB侵袭细胞以及在细胞内生长过程中并不发挥作用，而在之后结核分支杆菌发挥毒性作用，即导致细胞的溶解这一步发挥关键的作用，代表了一种潜在的毒力因子，具有诊断价值并可作为疫苗的候选物。因此，国内外多家科研院所开始着眼于RD1区蛋白的表达及应用。

目前，RD1区基因研究较多的当属CFP10和ESAT6。培养滤液蛋白10(Culture Filtrate Protein 10，CFP10)和早期分泌性抗原靶(Early Secretory Antigenic Target 6，ESAT6)是由结核杆菌基因组RD1区操纵子编码的两个低分子量蛋白，从结核分枝杆菌短期培养滤液中分离得到。Brusasca等(2001)用ESAT6抗原检测结核患者血清中的特异性抗体，阳性率为25％，而健康对照组没有检出相应抗体。Dillon等(2003)以重组CFP10作为诊断抗原，用ELISA法检测活动性结核患者和非结核对照者血清中的特异性抗体，在痰涂片阳性结核患者中阳性率为28％，在痰涂片阴性患者中阳性率为25％。从国内外看到单独表达该两种蛋白的数据均表明，单独使用任何一种蛋白用于检测诊断，其敏感性一直很低(姚卫，李红霞，陈建平，曾林子.重组融合蛋白CFP10-ESAT6在结核病血清学诊断中的初步应用.西部医学，2008，20(4)：854-856)。而当两种蛋白经过基因克隆的方法，组装成融合表达抗原后，其检测敏感性的到提高。姚卫等使用CFP10-ESAT6融合蛋白进行ELISA检测结果敏感性提高到45％。Pinxteren等将CFP10和ESAT6联合使用作为新型的诊断抗原时，发现其敏感度为73％(Laurens A.H.van Pinxteren，et al.，Diagnosis ofTuberculosis Based on the Two Specific Antigens ESAT-6 and CFP10.Clin Diagn Lab Immunol，2000，7：155-160)。

Rv3872基因所编码的Rv3872蛋白(PE35)为PE蛋白家族成员之一，与CFP10与ESAT6蛋白同属RD1区，是ESAT6-CFP10复合体转运系统中的关键因子，敲除Rv3872会中止复合体的合成与分泌，可能参与了复合体的合成、分泌过程(Priscille Brodin，et al.，Dissection of ESAT-6 System 1 of Mycobacteriumtuberculosis and Impact on Immunogenicity and Virulence.Infection and Immunity，2006，74(1)：88-98)。又有研究表明，Rv3872作为抗原较前两种蛋白更具有应用到血清学诊断的潜力(P.Mukherjee，etal.，TheRD1-encoded antigen Rv3872of Mycobacterium tuberculosis as a potential candidate forserodiagnosis of tuberculosis.Clinical Microbiology and Infection，2007，13(2)：146-152)。

鉴于以上三种结核分支杆菌特异性分泌蛋白的Rv3872、CFP10和ESAT6的特性，以及现阶段牛结核诊断方法研究现状，本发明以牛结核分支杆菌全基因组为模板克隆了Rv3872、CFP10和ESAT6基因，并构建了三种基因融合表达的原核表达载体，在大肠杆菌中表达。在每种蛋白之间加入了连接序列以最大限度地保证融合蛋白中各个蛋白的空间构像和活性不受影响。对纯化的Rv3872-CFP10-ESAT6融合蛋白活性进行鉴定，ELISA初步验证，三蛋白融合抗原的牛结核抗体检出率显著高于由申请人所在的农业微生物学国家重点实验室自行克隆表达的CFP10-ESAT6二蛋白融合抗原(张桂荣、郭爱珍等，间接ELISA检测牛分枝杆菌抗体方法的建立及初步应用.[J].中国预防兽医学报，2007，29(29)：555-560；张书环、郭爱珍等，牛分枝杆菌抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的融合表达及相关特性分析.[J].中国人兽共患病学报，2007，23(12)：1238-1242)，因此，该新型融合蛋白在牛结核血清学诊断与鉴别诊断方面具有广阔的应用前景，可望利用这个新型融合蛋白开发更为灵敏、特异的ELISA检测方法和制备成胶体金免疫层析试纸条，为牛结核病的快速诊断提供更加有效的确工具。

发明内容

本发明的目的是获得具有很好免疫原性的三基因融合的重组牛结核特异性抗原蛋白，通过对编码该基因的序列的克隆、表达，进一步验证其功能，并获得一种能快速检测牛结核病的抗原成分。

本发明将构建的重组融合载体质粒pET-28a-RCE转移到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，通过IPTG诱导表达获得一种检测牛结核特异性抗体的三基因融合抗原蛋白RCE。包含该重组的三基因融合抗原蛋白基因的大肠杆菌(Escherichia coli BL21/pET-28a-RCE)已于2008年12月4日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M208244。

申请人将获得的由保藏编号为：CCTCC NO：M208244的大肠杆菌表达的融合抗原蛋白命名为“RCE”，将构建过程中获得的中间载体质粒pET-28a-CFP10-ESAT6命名为“CE”。

申请人通过分离和克隆，获得一种融合的基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

一种牛结核特异性三基因融合抗原蛋白的制备方法，其步骤如下：

(1)以牛结核分支杆菌H37Rv标准株基因组为模板，扩增牛结核分支杆菌基因组RD1区的三个基因Rv3872、CFP10和ESAT6，分别得到321bp，348bp和341bp的目的片段，在基因Rv3872和CFP10的末端分别带有15bp和45bp的连接序列；

(2)采用重叠延伸剪切(SOE)方法，得到CFP10-ESAT6的融合基因，通过酶切连接，构建得到中间载体质粒pET-28a-CFP10-ESAT6；

(3)进一步利用酶切连接方法，获得重组的三基因融合载体质粒pET-28a-Rv3872-CFP10-ESAT6，将该重组的三基因融合载体质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导，得到所述的三基因融合抗原蛋白RCE。

本发明的以下部分将详细描述本发明关于融合基因的克隆、表达，蛋白的纯化以及生物学试验。本发明构建的融合蛋白对检测牛结核抗体有较好的敏感性和特异性，对于实际应用有较大意义。

更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是编码牛结核分枝杆菌特异性抗原蛋白(RCE)的核苷酸序列和对应的氨基酸序列。

图1：是本发明使用的原始pET-28a(+)载体质粒图谱。

图2：是本发明PCR扩增Rv3872电泳图谱；图中：M为DL2000；1为阴性对照；2为扩增后得到的321bp的Rv3872片段，其中包括酶切位点和连接序列(Linker)长度。

图3为PCR扩增CFP10和ESAT6电泳图谱。图中：M为DL2000；1，3为阴性对照；2为348bp的CFP10目的片段，其中包括酶切位点和连接序列(Linker)长度；4为341bp的ESAT6目的片段，其中包括酶切位点和连接序列(Linker)长度。

图4：是本发明三基因融合重组原核表达载体pET-28a-Rv3872-CFP10-ESAT6(即pET-28a-RCE)构建流程图。

图5：是本发明所构建包含CFP10-ESAT6融合基因的中间质粒pET-28a-CFP10-ESAT6(即pET-28a-CE)的图谱。

图6：是本发明所构建包含Rv3872-CFP10-ESAT6三基因的重组表达载体质粒pET-28a-Rv3872-CFP10-ESAT6(即pET-28a-RCE)的图谱。

图7：是本发明重组中间融合基因CFP10-ESAT6PCR扩增后的电泳图谱。图中：M为DL2000；1为扩增后643bp的CFP10-ESAT6融合基因片段(包括连接序列和两端酶切位点)；2为阴性空白对照。

图8：是重组中间融合质粒pET-28a-CFP10-ESAT6构建后酶切鉴定电泳图谱。图中：M1为DL2000；M2为DL15000；1为HindIII和NotI双酶切pET-28a-CFP10-ESAT6质粒后出现5363bp和636bp左右的两个片段；2，3为NotI和HindIII分别单酶切pET-28a-CFP10-ESAT6质粒出现5999bp左右的片段。

图9：是本发明重组融合表达载体质粒pET-28a-RCE构建后酶切鉴定电泳图谱。图中：M1为DL15000；M2为DL2000；1为EcoRI和NotI双酶切pET-28a-RCE质粒后得到一条5355bp左右的片段和一条959bp左右的片段；2为EcoRI单酶切pET-28a-RCE质粒得到6314bp左右的片段。

图10：是本发明制备的RCE蛋白表达纯化流程图。

图11：是本发明制备的RCE蛋白表达形式鉴定图谱。图中：M为蛋白分子量标准；1为IPTG诱导的空载体对照；2为菌液经IPTG诱导后的情况；3为超声波破碎菌体离心后上清取样；4为超声波破碎菌体离心后沉淀取样。

图12：是本发明制备的RCE蛋白最佳表达条件。在图12A中：M为蛋白分子量标准；1为0.8mmol/L IPTG(分子克隆实验指南建议浓度)诱导空载体对照；2为IPTG终浓度为0.4mmol/L诱导；3为IPTG终浓度为0.6mmol/L诱导；4为IPTG终浓度为0.8mmol/L诱导；5为IPTG终浓度为1.0mmol/L诱导。在图12B中：M为蛋白分子量标准；1为0.4mmol/L IPTG诱导空载体；2为：0.4mmol/L IPTG诱导2h；3为0.4mmol/LIPTG诱导3h；4为0.4mmol/L IPTG诱导5h；5为0.4mmol/L IPTG诱导6h。

图13：是本发明制备的RCE蛋白最佳纯化条件。在图13A中：M为蛋白分子量标准；1为Wash Buffer∶Binding Buffer＝1∶6；2为Wash Buffer∶Binding Buffer＝1∶4；3为Wash Buffer∶Binding Buffer＝1∶2；4为Wash Buffer∶Binding Buffer＝1∶1；5为原浓度的Wash Buffer。在图13B中：M为蛋白分子量标准；1为Elute Buffer∶Binding Buffer＝1∶6；2为Elute Buffer∶Binding Buffer＝1∶4；3为EluteBuffer∶Binding Buffer＝1∶2；4为Elute Buffer∶Binding Buffer＝1∶1；5为未稀释的Elute Buffer；

图14：是本发明制备的RCE蛋白Western-Blot图。图中：M为蛋白分子量标准；1为牛结核阳性血清；2为正常牛血清。

图15：是本发明制备的RCE蛋白浓度测定标准曲线图。图15A和图15B为蛋白标准品做两次重复分别所得标准曲线及公式。

具体实施方式

实施例1：目的基因CFP10、ESAT6和Rv3872的克隆

1、质粒与宿主菌来源

本发明和实施例所用的原始质粒载体pET-28a(+)购自于Novagen公司，其物理图谱见图1所示。大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞购自湖北省武汉生命技术有限公司。

2、引物设计与合成

根据牛分枝杆菌AF2122/97发表的序列(GenBank登录号：NC002945)设计针对CFP10、ESAT6和Rv3872等全长基因的特异性引物。引物由上海生工生物技术有限公司合成。所述引物对的DNA序列如下：

CFP10上游引物(HindIII)：5′-TCTGAAGCTTGCAGAGATGAAGACCGAT-3′

CFP10下游引物(Linker)：

5′-AGATCCGCCTCCACCTGAACCGCCACCTCCGAAGCCCATTTGCGAGGACAGCGCCT-3′

ESAT6上游引物(Linker)：

5′-GGAGGTGGCGGTTCAGGTGGAGGCGGATCTATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGG-3′

ESAT6下游引物(NotI)：5′-AGCAGCGGCCGCCTATGCGAACATCCC-3′

Rv3872上游引物(EcoRI)：5′-TTACGAATTCGAAAAAATGTCACATG-3′

Rv3872下游引物(HindIII)：

5′-GTACAAGCTTTCCACCACCACCACCTTCGGCGAAGACGCC-3′

3、目的基因的PCR扩增

以牛型分枝杆菌临床标准分离株(H37Rv，Mycobacterium bovis AF2122/97，由湖北出入境检验检疫局郭明星兽医师惠赠，其基因组序列登录号见Genbank登录号为：NC002945)细菌培养物(将该菌破碎后做模板用)加少量双蒸水煮沸10min裂解菌体，离心后取上清液作为PCR模板。用Probest DNA聚合酶(购自宝生物工程(大连)有限公司)PCR分别扩增CFP10、ESAT6和Rv3872。PCR扩增反应体系为：10×Taq Buffer5.0μL，25mmol/L MgCl₂ 1.0μl，2mmol/L dNTPs 1.5μL，20μmol/L上、下游引物各1.0μL，Taq DNA聚合酶1.0μL，模板3μL，无菌双蒸水加至50μL。扩增的循环参数：95℃预变性5min；然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测(见图2和图3)，检测结果表明，扩增产物正确，然后用胶回收试剂盒(购自上海生工生物工程技术有限公司，参照该试剂盒说明书)纯化PCR产物。

4、PCR产物回收：

采用上海生工生物技术有限公司生产的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收DNA片段，按照该UNIQ-10柱式离心式DNA凝胶回收试剂盒的说明书的提供步骤进行，具体操作如下：

用0.8％的琼脂糖胶电泳，使目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，在长波紫外灯下，用在酒精灯火焰上烧过的手术刀片切下含有目的DNA片段的琼脂块，放入1.5mL灭菌离心管中。

按每100mg琼脂糖胶加入400μL Binding Buffer，置50-60℃水浴中10min，使琼脂糖凝胶彻底融化(加热溶胶时，每2min混匀一次)。

将UNIQ-10柱放入收集管中，将融化的胶溶液转移到UNIQ-10柱中，室温静置2min，室温8000r/min离心1min。

取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500μL WashSolution，室温8000r/min离心1min。

重复步骤4，取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，室温12000r/min离心15sec。

将UNIQ-10柱放入一个灭菌的1.5mL离心管中，根据PCR产物量的相对多少，在柱子底部的膜中央加10-20μL Elution Buffer或ddH₂O，室温或37℃放置2min室温12000r/min离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。

实施例2、融合基因Rv3872-linker-CFP10-linker-ESAT6的构建(见图4)

1、中间质粒pET-28a-CFP10-ESAT6的构建

采用重叠延伸剪切技术(即SOE，Nikolai Avchuk，Construction of long DNA molecules using longPCR-based fusion of several fragments simultaneously.Nucleic Acids Research，2004，32(2)：e19)获得CFP10和ESAT6的融合基因CFP10-ESAT6。以上述纯化的PCR产物CFP10和ESAT6为模板，以cfp10上游(HindIII)和esat6下游(NotI)为引物，用Probest DNA聚合酶进行PCR。反应体系(50μL)：上下游引物各300nmol/L，CFP10和ESAT6PCR产物各0.5μL，Probest DNA聚合酶1.25U。退火温度为63℃(1min)，其它条件同上。

回收CFP10-ESAT6的PCR产物(见图7)，将pET-28a空载体和回收得到的PCR产物用HindIII和NotI(购自宝生物工程(大连)有限公司)双酶切，酶切产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收试剂盒纯化酶切产物。将纯化的酶切产物用T4DNA Ligase(购自Fermentas公司)进行粘末端连接，16℃水浴连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

2、连接产物的转化

取感受态细胞DH5α100μL加入到灭菌1.5mL EP管中，将连接后的中间质粒pET-28a-CFP10-ESAT6各10μL加入并混匀。置冰上30min后，42℃热激90sec，冰浴3-5min。加入400μL LB液体培养基(每升培养基含酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，用10mol/L NaOH调pH至7.5，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。在每100毫升LB液体培养基中加入1.5g琼脂粉即为固体LB培养基，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用)，于37℃恒温摇床200r/min振荡培养45min使其复苏。复苏后的重组大肠杆菌悬液于4℃5000r/min离心10min，弃去400μL上清，用剩余的100μL重悬沉淀涂布于含有25μg/mL卡那霉素(购自Invitrogen公司)的LB琼脂平板。37℃增殖1h，再将平板翻过来，倒置37℃培养14-16h至菌落出现。

3、质粒的提取

使用碱裂解法(参照萨姆布鲁克.J，弗里奇.E.F，曼尼阿蒂斯.T主编，分子克隆实验指南，黄培唐等译，第三版，科学出版社，北京，2002版的方法)进行，具体操作如下：

用灭菌牙签在LB平板上随机挑取数个单菌落，分别接种于3mL 25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃恒温摇床200r/min振荡培养过夜。

将菌液转入1.5mL离心管内，于4℃8000r/min离心3min，弃上清，再将剩余的1.5mL菌液重复离心，倒立离心管于吸水纸上，使液体流尽。

加入100μL冰预冷的溶液I(0.05mol/L葡萄糖，0.025mol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.01mol/L EDTA)，涡旋使菌体充分悬浮，再加入200μL新配制的溶液II(0.2mol/L NaOH，1％十二烷基磺酸钠，即SDS，现配现用)，反复颠倒离心管数次，冰浴5min，最后加入150μL冰预冷的溶液III(5mol/L乙酸钠60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5mL，pH5.0)，温和颠倒离心管数次，冰浴10min。

于4℃以12000r/min离心10min，吸取上清至另一支1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混和均匀，室温静置5min。

室温12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用75％冷乙醇漂洗后，真空干燥或自然干燥。

沉淀用200μL含20μL Rnase(20μg/mL)的TE(pH8.0)溶解，56℃水浴30min或37℃水浴1h以除去RNA。

加7.5mol/L NH4Ac 100μL，室温静置5min，再于室温12000r/min离心5min。

吸取上清到另一1.5mL的EP管中，加入2倍体积的冷无水乙醇，冰浴置10min。

于4℃12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用75％冷乙醇漂洗后，真空干燥后溶于20μL ddH₂O或TE(1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-Cl，pH8.0)，置-20℃冰箱保存备用。

4、中间载体质粒pET-28a-CFP10-ESAT6的酶切鉴定

利用HindIII和NotI分别进行单酶切和双酶切中间载体质粒pET-28a-CFP10-ESAT6(见图6)，酶切后出现预期大小的外源片段和载体片断，将包含该中间载体质粒的大肠杆菌DH5α菌液送上海生工生物工程技术有限公司测序，测序结果与Genbank(登录号：NC 002945)中公布的CFP10和ESAT6的序列进行比对，结果完全符合，中间连接序列也正确，说明本发明中构建的中间载体质粒构建成功，可以用于下一步三联体(三基因融合)重组表达载体质粒的构建。

5、三联体(三基因融合)重组表达载体质粒的构建

取纯化的Rv3872PCR产物和中间载体质粒pET-28a-CFP10-ESAT6分别使用HindIII和EcoRI(购自宝生物工程(大连)有限公司)进行双酶切，酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶纯化，纯化后的酶切产物经T4DNALignase于16℃水浴连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。参照上述的《分子克隆实验指南》的方法提取质粒，并使用NotI和EcoRI进行单酶切和双酶切，鉴定重组融合表达载体。申请人将获得的该重组表达载体质粒命名为pET-28a-RCE(见图7)，将包含该载体质粒的BL21(DE3)菌液经IPTG诱导后表达的抗原蛋白简称为“RCE”。

经酶切鉴定，所构建重组表达载体质粒酶切后条带与预期一致。将酶切鉴定后的重组表达载体pET-28a-RCE送上海生工生物工程技术有限公司测序。测序后的序列与Genbank中公布的Rv3872的标准序列(登录号：NC 002945)经Blast比对发现重组表达载体pET-28a-RCE的插入片段序列与理论序列完全符合，表明该融合基因构建成功。其完整的阅读框(编码区)的核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：1所示，序列全长为1053bp，编码350个氨基酸。将该重组表达载体质粒pET-28a-RCE转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达。

具体步骤如下：取感受态细胞BL21(DE3)100μL加入到1.5mL EP管中，将重组表达载体质粒pET-28a-RCE 2μL加入并混匀。置冰上30min后，42℃热激90sec，冰浴3-5min。将其涂布于含有25μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板。37℃正置1h，再将平板翻过来，倒置37℃培养14-16h至菌落出现。

实施例3、目的融合基因在大肠杆菌中的表达及纯化

1、目的基因的诱导表达

将包含有重组表达载体的大肠杆菌菌株DH5α接种于含有25μg/mL卡那霉素的3mL LB液体培养基，于37℃摇床培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8。从培养好的大肠杆菌菌液中取100μL菌液接种于10mL含有25μg/mL卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，于37℃振荡培养约3h，至OD₆₀₀达到0.6-0.8，加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG，购自Invitrogen公司)至终浓度为0.8mmol/L，继续培养3h后收集菌体(图8)。

2、表达产物的SDS-PAGE电泳分析

SDS-PAGE电泳样品的制备

将诱导后的重组大肠杆菌8000r/min离心15min。沉淀用1/10体积的50mM Tris-HCl(pH8.0)重悬，冰浴30min。冰浴条件下进行超声碎破，直至菌液不再粘稠，10000r/min，离心30min。分别取少量裂解后的上清和沉淀，加入2×蛋白电泳上样缓冲液(100mmol/L Tris-HCl(pH6.8)，200mmol/L二硫苏糖醇(DTT，购自Amresco公司)，4％SDS(电泳级)，0.2％溴酚蓝，20％甘油)125μL，振荡混匀，100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，取上清进行SDS-PAGE电泳分析。

SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制及电泳

12％分离胶配制：纯化水1.6mL，30％丙烯酰胺溶液2.0mL，1.5mol/L Tris-Base溶液(pH8.8)1.3mL，10％SDS 0.05mL，10％过硫酸铵0.05mL，TEMED 0.003mL；各成分加入后迅速混合，加入制胶板中，上面加异丁醇。

5％浓缩胶配制：纯化水2.1mL，30％丙烯酰胺溶液0.5mL，1.0mol/L Tris-Base溶液(pH6.8)0.38mL，10％SDS 0.03mL，10％过硫酸铵0.03mL，TEMED 0.003mL；各成分加入后迅速混合，加入制胶板的分离胶的上面，灌满后插入加样梳。待积层胶凝固后，取下梳子；将凝胶固定于电泳装置上，加入足够量的Tris-甘氨酸电泳缓冲液，在加样孔中分别加入各样品；电泳电压80V，待溴酚蓝至分离胶界面时，电压改为120V，至溴酚蓝泳出胶底面，终止电泳。

聚丙烯酰胺凝胶染色与脱色

卸下凝胶，用考马斯亮蓝R250染色液(45％甲醇，45％纯化水，10％冰乙酸，0.25％的考马斯亮蓝R250)染色4h以上，再用脱色液(45％甲醇，45％纯化水，10％冰乙酸)进行脱色至背景色完全脱去，观察结果。确定目的蛋白是可溶性表达还是以包涵体的形式表达。

重组蛋白的纯化

将收集的重组蛋白表达菌使用结合缓冲液Binding buffer(20mM Tris-HCl pH7.9，5mM Imidazole，0.5M NaCl)重悬，超声波破碎，4℃12000g离心15min取上清上样。使用Ni-NTA His·Band层析柱(购自Novagen公司)纯化目的蛋白。分别使用结合Binding buffer和洗涤缓冲液Washing buffer(20mMTris-HCl pH7.9，15mM Imidazole，0.5M NaCl)洗柱直至OD值达到基线附近，换用洗脱缓冲液Elute buffer(20mM Tris-HCl pH7.9，40mM Imidazole，0.5M NaCl)洗脱结合的重组蛋白，收集波峰部分蛋白作为纯化的重组蛋白用于进一步分析。

3、目的蛋白表达最佳条件的确定

根据上述步骤2(即表达产物的SDS-PAGE电泳分析)的步骤，检测表明本发明制备的重组融合蛋白(RCE)为可溶性表达(图11)。重新复苏保存的转化有pET-28a-RCE的大肠杆菌BL21(DE3)菌液，37℃摇床培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8时，按照IPTG浓度分别为0.4mM、0.6mM、0.8mM和1.0mM，和分别于诱导前和诱导后2h、3h、5h、6h取样，SDS-PAGE分析。

确定RCE蛋白的最佳表达条件为IPTG 0.4mmol/L，37℃诱导3h表达量最高(图12)。

4、重组蛋白纯化最佳条件的确定

为摸索Wash Buffer和Elute Buffer中最佳的咪唑浓度，将Wash Buffer和Elute Buffer分别与Binding Buffer按体积比1∶6、1∶4、1∶2、1∶1、1∶0(此浓度为原浓度的Wash Buffer或EluteBuffer)五个浓度梯度稀释，将细菌破碎后离心得到的上清上柱后、加Binding Buffer后、依次加五个浓度Wash Buffer、依次加五个浓度Elute Buffer后分别接收样品，SDS-PAGE分析。

确定RCE蛋白纯化的最佳Wash Buffer和Elute Buffer体积比为1∶4和1∶0(图13)。

实施例4：重组蛋白RCE的特性分析

1.Western-blot分析重组蛋白的抗原性

将上述纯化的重组融合蛋白RCE进行SDS-PAGE电泳。

转移：切出6张Whatman 3M滤纸和1′张硝酸纤维膜(NC膜)，滤纸和膜的大小要和凝胶的大小完全相等或略小于凝胶，用铅笔在滤膜一角作标记，确保转印后膜与凝胶的相对方向；将硝酸纤维膜在纯化水中浸泡5min；在另一浅托盘中加入少量转移缓冲液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris碱，0.037％SDS(电泳级)，20％甲醇)，将6张Whatman 3M滤纸浸泡于其中。然后按照如下方法安装转移电泳槽：平放石墨电极的底座(负极)，依次放3层3M滤纸、聚丙烯酰胺凝胶、硝酸纤维膜和3层3M滤纸。彻底排除各层间的气泡；将转移电泳槽的上盖扣到石墨电极-转移膜胶复合体上；连接电源，根据凝胶板面积按照0.65-1.0mA/cm2的参数接通电流，电泳转移0.5-2h。

将NC膜置于含1％BSA和5％的脱脂奶粉的1×TBST(10mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，0.05％Tween-20，pH8.0)中，室温封闭过夜或至少30min；

洗膜：弃封闭液，用1×TBST洗涤NC膜3遍，每次5min；

一抗孵育：将NC膜放入用1×TBST稀释的阳性血清(体积比为1∶100)，37℃孵育0.5-1h；

洗膜：取出NC膜，用1×TBST洗膜3次，每次10min；

二抗孵育：将膜转入1×TBST稀释的HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗牛IgG(购自Sigma公司)抗体(体积比为1∶10000)，37℃孵育0.5-1h；

洗膜：取出NC膜，用1×TBST洗膜3次，每次10min；

显色：将NC膜置于新配置的DAB显色液中，置暗处显色，待蛋白带的颜色深度达到要求后，用1×TBST冲洗以终止反应。

结果如图14所示，阳性血清组RCE蛋白表现出很高的免疫原性，而阴性血清对照组没有出现反应。

2.重组蛋白浓度的测定(Bradford法)

将蛋白标准品(BCA蛋白浓度测定试剂盒，购白北京赛驰生物科技有限公司)牛血清白蛋白用1×PBS缓冲液(NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.24g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.628g，溶于800mL蒸馏水中，用盐酸调pH值为7.4，蒸馏水定容至1000mL，灭菌)溶解，然后进行倍比稀释。分别取每个浓度的蛋白标准液100μL，加入到5mL的染料液中，反应45min后，在波长595nm处测吸光度，根据测得的OD值与相应浓度的关系，绘制标准曲线，并推导出换算公式。

标准曲线如图15。

由标准曲线求得RCE蛋白的浓度为2.15mg/mL。

3.重组融合蛋白RCE间接ELISA最佳条件的确定

将已知浓度的重组融合蛋白RCE在96孔板上，按照表1所示将重组融合蛋白RCE和牛血清做倍比稀释，二抗按照上述推荐的浓度使用。于4℃过夜包被酶标板，次日取出后洗涤液(含0.05％Tween-20的1×PBS)洗涤3次，用洗涤液稀释的5％脱脂奶粉37℃封闭1h，洗涤液洗板3次后取阳性和阴性标准血清按表1中所示倍比稀释，37℃反应30min。洗板3次后加入为1∶10000(体积比)稀释的羊抗牛IgG，37℃反应30min。洗板5次后加入100μL底物液(含1mg/mL四甲基联苯胺TMB和0.03％H₂O₂)，避光显色10min后加入0.25％HF终止反应，于OD₆₃₀读数。

表1RCE蛋白间接ELISA最佳工作条件确定

确定RCE蛋白工作最佳包被浓度为25ng/孔，血清最佳稀释度为1∶100(体积比)。

4.重组融合蛋白RCE对牛结核特异性抗体敏感性和特异性检测

为了比较本发明中三基因融合表达的抗原RCE与本发明申请人所在的农业微生物学国家重点实验室自行构建表达的二基因融合表达的抗原CFP10-ESAT6(即CE)在其生物学活性上的差异，将本发明申请人所在的农业微生物学国家重点实验室自行构建表达的二蛋白融合蛋白CFP10-ESAT6(张桂荣等，间接ELISA检测牛分枝杆菌抗体方法的建立及初步应用.[J].中国预防兽医学报，2007，29(29)：555-560)为对照组，按照以上确定本发明中的三基因融合抗原RCE最佳工作条件的方法确定CE蛋白的最佳包被浓度为4μg/mL，血清稀释度为1∶100(体积比)，二抗工作浓度为1∶10000(体积比)。

取26份牛结核阳性血清，18份牛结核阴性血清，分别在RCE和CE的最佳工作浓度下，进行间接ELISA试验检测血清中的抗体。方法如下：使用牛结核特异性抗原于4℃过夜包被酶标板，洗涤液洗涤3次，用洗涤液稀释的5％脱脂奶粉37℃封闭1h，洗涤液洗板3次后加入1∶100(体积比)倍稀释血清，100μL/孔，每孔重复3次，37℃反应30min。洗板3次后加入体积比为1∶10000(体积比)稀释的羊抗牛IgG，37℃反应30min。洗板5次后加入100μL底物液(含1mg/mL TMB和0.03％H₂O₂)，避光显色10min后加入0.25％HF终止反应，于OD₆₃₀读数。

RCE蛋白间接ELISA对牛结核特异性抗体检测的敏感性为69.23％(18/26)，特异性为94.44％(17/18)。CE蛋白间接ELISA对牛结核特异性抗体检测的敏感性为15.38％(4/26)，特异性为94.44％(17/18)。由此看出，RCE蛋白和CE蛋白相比，在对牛结核抗体检测特异性没有降低的情况下，敏感性获得了显著提高(提高了53.85％)，因而该新型融合蛋白在牛结核病的临床检测中具有广泛的应用前景(表2，3)。

表2 26份牛结核阳性血清的检测结果

表3 18份PPD阳性的检测结果

<110>华中农业大学

<120>三基因融合的重组牛结核特异性抗原蛋白及制备方法

<130>

<141>2009-02-27

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1053

<212>DNA

<213>牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1053)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1053)

<223>

<400>1

atg ggc agc agc cat cat cat cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg 48

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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Gly Thr Gln Val Ser Asp Asn Ala Leu His Gly Val Thr Ala Gly Ser

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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Leu Ala Ser Asn Ala Ser Ala Gln Asp Gln Leu His Arg Ala Gly Glu

100 105 110

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115 120 125

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Ala Gly Val Phe Ala Glu Gly Gly Gly Gly Gly Lys Leu Ala Glu Met

130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys Gln Lys Gln Glu

195 200 205

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Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly Val Gln Tyr Ser

210 215 220

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Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser Gln Met Gly Phe

225 230 235 240

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met

245 250 255

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260 265 270

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Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys

275 280 285

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Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu

290 295 300

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Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu

305 310 315 320

aac aac gcg ctg cag aac ctg gcg cgg acg atc agc gaa gcc ggt cag 1008

Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln

325 330 335

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Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala

340 345 350

<210>2

<211>350

<212>PRT