CN101900727A - 一种应用Rv3872新型融合蛋白制备的牛结核抗体鉴别检测试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物传染病基因工程技术领域。公开了一种利用RV3872、ESAT6和CFP10三基因融合蛋白制备的检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸条及制备方法与应用。以融合蛋白作为胶体金标记抗原和硝酸纤维素膜上检测区的捕获抗原建立胶体金免疫层析试纸条。本发明试剂条对牛结核抗体的检测具有特异性强和灵敏度高的突出优点，能同时鉴别检测卡介苗免疫和非结核分枝杆菌感染。本发明包括一种重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET28a-MPBrce，该菌株表达牛分枝杆菌RCE蛋白，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M208244。

Description

一种应用Rv3872新型融合蛋白制备的牛结核抗体鉴别检测试纸条 

技术领域

本发明涉及动物细菌学与动物传染病学技术领域。具体地说，是一种借助胶体金标记显色的免疫层析反应，快速、鉴别检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸条及其制备方法。 

背景技术

牛结核病是一种由牛分枝杆菌引起的慢性消耗性人兽共患病，被国际动物卫生组织(OIE)定的必须通报的疾病之一。2001年和2002年的部分统计结果表明我国个别省市奶牛结核病阳性率高达10％以上。牛结核病的防制措施是“检疫-扑杀”，即采用牛提纯结核菌素(PPD)变态反应进行检疫，对检出的阳性牛进行扑杀。皮内变态反应的基本过程是剃毛、量皮厚、注射结核菌素、72小时后再量皮厚。该方法具有较多缺陷，如牛结核菌素成分复杂，与环境分枝杆菌和卡介苗具有共同成份而使变态反应出现非特异性反应；感染后期的敏感性降低；结果判断主观性强；操作复杂，劳动强度大，需要时间长等，这些均使我国“检疫-扑杀”政策的实施效果大打折扣；此外，皮试反应只能进行活体现场检测，不能保存样品并进行回顾性分析。除牛外，其它动物的皮试反应未进行过标准化。野生动物因为难以捕捉，很难进行皮试反应。因此，临床上需要一种适合于不同动物、操作简便、能鉴别卡介苗免疫和环境分枝杆菌感染的灵敏特异的检测方法。胶体金试纸条就是一种被认为适合于“栏圈旁”检测的简易方法。该方法是20世纪80年代发展起来的一项新的免疫分析方法，是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。它具有简便，快速，特异性强，灵敏度高，费用低的优点。依据胶体金免疫层析技术，在国内外无论人医应用方面，还是兽医应用方面，都已经研制出了多种胶体金免疫层析快速检测试纸条。 

由于牛结核感染过程中抗体产生较晚，且不同时期出现针对不同蛋白的抗体，因此，针对单个蛋白设计的抗体检测方法虽然简便但灵敏度不高。各个科学家都在通过同时应用多种诊断抗原以提高灵敏度，这种方法被称为“鸡尾酒”法(Siguo Liu，Sheping Guo，Chunlai Wang，Meili Shao，Xiuhua Zhang，YangGuo and Qiang Gong.A novel fusion protein-based indirect enzyme-linked immunosorbent assay forthe detection of bovine tuberculosis.Tuberculosis，2006，3；C.Aagaard，M.Govaerts，V.Meikle，A.J.Vallecillo，J.A.Gutierrez-Pabello，F.Suarez-Güemes，[J].McNair，A.Cataldi，C.Espitia，P.Andersen，and J.M.Pollock，Optimizing Antigen Cocktails for Detection of Mycobacterium bovisin Herds with Different Prevalences of Bovine Tuberculosis：ESAT6-CFP10 Mixture Shows OptimalSensitivity and Specificity，[J].Clin Microbiol，2006，44(12)：4326-4335；Cockle PJ，GordonSV，Hewinson RG，Vordermeier HM.Field evaluation of a novel differential diagnostic reagentfor detection of Mycobacterium bovis in cattle[J].Clin Vaccine Immunol，2006，13(10)：1119-1124； Kanaujia GV，Garcia MA，Bouley DM，et al.Detection of early secretory antigenic target-6 antibodyfor diagnosis of tuberculosis in non-human primates[J].Comp Med 2003，53(6)：602-606)。本课题组前期研究中，进行了多种牛分枝杆菌特异性抗原蛋白的融合表达，最后发现，RV3872、CFP10、ESAT6的融合蛋白作用牛结核诊断抗原具有灵敏度高、特异性好、可区别卡介苗免疫与非结核分枝杆菌的干扰。 

Rv3872和CFP10及ESAT6蛋白同属牛分枝杆菌的差异基因区(RD1区)，是ESAT6-CFP10复合体转运系统中的关键因子，敲除Rv3872会中止复合体的合成与分泌，可能参与了复合体的合成、分泌过程(Priscille Brodin，Laleh Majlessi，Laurent Marsollier，Marien I.de Jonge，Daria Bottai，Caroline Demangel，Jason Hinds，Olivier Neyrolles，Philip D.Butcher，Claude Leclerc，Stewart T.Cole，and Roland Brosch，Dissection of ESAT-6 System 1 of Mycobacterium tuberculosis and Impact on Immunogenicity and Virulence.Infection and Immunity，2006，74(1)：88-98)。有研究证明结核分枝杆菌的Rv3872能诱导结核病人产生显著的抗体反应(P.Mukherjee，M.Dutta，P.Datta，A.Dasgupta，R.Pradhan，M.Pradhan，M.Kundu，J.Basu andP.Chakrabarti，The RD1-encoded antigen Rv3872 of Mycobacterium tuberculosis as a potential candidate forserodiagnosis of tuberculosis.Clinical Microbiology and Infection，2007，13(2)：146-152)，鉴于牛分枝杆菌与结核分枝杆菌在基因组水平上有99.95％的同源性，提示该蛋白可能具有应用于牛结核血清学诊断的潜力。 

申请者的前期工作即授权专利(专利号ZL 2006101665510；发明名称：检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸条，授权公告日：2009年6月3日)也是一种牛结核抗体检测方法，但该方法不具备鉴别诊断功能，不能区分卡介苗和非结核分枝杆菌感染，而本发明是针对毒力型牛分枝杆菌的特异性早期分泌蛋白设计的免疫胶体金试纸条，除了具上已授权专利的灵敏度与特异性外，还具有鉴别诊断的新功能。 

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种一种应用Rv3872新型融合蛋白制备的牛结核抗体鉴别检测试纸条，该试纸条适合于早期鉴别诊断，具有特异性强、灵敏度高，操作简便，检测快速、准确的特点，专门用于检测牛结核病的抗体的免疫层次试纸条，为我国牛结核病防制提供一种新型试剂盒和新方法。 

鉴于以上三种牛分支杆菌特异性分泌蛋白的Rv3872、CFP10和ESAT6的特性，以及现阶段牛结核诊断方法研究现状，本发明以牛分支杆菌全基因组为模板克隆了Rv3872(基因登录号：NC 002945)、CFP10基因(基因登录：NC 002945)和ESAT6基因(基因登录号NC002945)，并构建了三种基因融合表达的原核表达载体，在大肠杆菌中表达。在所述的每种蛋白(Rv3872、CFP10和ESAT6)之间加入了连接序列以最大限度地保证融合蛋白中各个蛋白的空间构像和活性不受影响(见图8)。对纯化的Rv3872-CFP10-ESAT6融合蛋白活性进行了鉴定和ELISA初步验证(刘冬光，郭爱珍等，融合蛋白 Rv3872/CFP-10/ESAT-6的制备及在牛结核诊断中的初步应用，中国奶牛，2009(10)：7-11)，表明上述三蛋白融合抗原的牛结核抗体检出率显著高于由申请人所在的农业微生物学国家重点实验室自行克隆表达的CFP10-ESAT6二蛋白融合抗原(张桂荣、郭爱珍等，间接ELISA检测牛分枝杆菌抗体方法的建立及初步应用.中国预防兽医学报，2007，29(29)：555-560；张书环、郭爱珍等，牛分枝杆菌抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的融合表达及相关特性分析.中国人兽共患病学报，2007，23(12)：1238-1242)，因此，本发明应用新型融合蛋白制备成牛结核抗体鉴别诊断胶体金免疫层析试纸条，证实该产品具有简便、灵敏、特异等优点，为牛结核病的快速鉴别诊断提供了更加有效的工具。 

本发明总体技术路线如附图1所示。 

本发明通过以下技术方案实现： 

一种牛结核抗体的检测试纸条，其包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬。在PVC背衬(7)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)；所述的结合垫(2)上包被有保藏号为CCTCC NO：M208244的重组大肠杆菌所表达的Rv3872-CFP10-ESAT6蛋白与胶体金的标记物；所述的硝酸纤维素膜(3)上分别包被有Rv3872-CFP10-ESAT6蛋白的检测线(5)、抗Rv3872-CFP10-ESAT6蛋白IgG构成的质控线(6)； 

其中，Rv3872-CFP10-ESAT6蛋白是以牛分支杆菌全基因组为模板克隆Rv3872、CFP10和ESAT6基因，并构建三种基因融合表达的原核表达载体，并在大肠杆菌中表达得到。 

一种适用于检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸条的制备方法，其步骤包括： 

1)克隆牛分枝杆菌特异性分泌蛋白RCE基因并在重组大肠杆菌中表达，表达牛分枝杆菌RCE蛋白的重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET-28a-RCE，该重组大肠杆菌已于2008年12月4日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC NO：M208244。 

2)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金； 

3)将RCE蛋白加入步骤2)制备的胶体金中，得到RCE蛋白-胶体金标记物； 

4)将得到RCE蛋白-胶体金标记物包被在结合垫(3)上； 

5)将步骤1)表达纯化RCE蛋白包被在硝酸纤维素膜(4)上构成检测线(5)；并将纯化RCE蛋白的IgG包被在硝酸纤维素膜(3)上构成质控线(6)； 

6)在所述的PVC背衬(7)上按顺序依次粘附所述的样品垫(1)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(7)，得到所述的检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸条、将试纸条装到专门的透明外壳(9)中、血清稀释液(8)专指用于该检测试纸条血清样本稀释的溶液。 

本发明选用牛分枝杆菌特异性分泌蛋白RCE作为检测线，牛分枝杆菌特异性分泌蛋白RCE作为胶体金标记物，利用间接法来检测待测血清样品中是否含有RCE抗体。当待检样品中为牛结核抗体阳性时，血清RCE抗体与RCE蛋白-胶体金标记物结合之后，在检测线处遇到RCE抗原就会出现颜色深浅不同的红色条 带，质控线处出现红色条带，表示阳性反应(二条带)。否则只有质控线处出现红色条带(一条带)，表示阴性反应。 

本检测试纸条(如附图2所示结构图)由样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(7)按图示的顺序依次粘附在PVC背衬(1)上组装而成的。结合垫上包被有本发明制备的RCE蛋白-胶体金标记物，硝酸纤维素膜上包被有检测线(5)和质控线(6)，其中检测线为本发明制备的牛分枝杆菌特异抗原蛋白RCE，质控线为本发明制备的提纯抗RCE蛋白IgG。所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC背衬均购自Millipore公司。 

与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点： 

1、与专利号ZL 2006101665510的授权专利比较，本发明具有鉴别和检测双重功能，可区分卡介苗和非结核分枝杆菌，同时具有早期检测功能。 

2、本发明具有特异性强，灵敏度高，检测时间短(5-10分钟)的特点。 

3、本发明的检测试纸条不需要任何特殊仪器、设备，检测成本低。 

4、本发明的检测试纸条操作简便，不需由专业人员操作。 

5、本发明的检测试纸条储存方便，对温度要求不高，在2～8℃下有效保存期可达两年。 

附图说明

SEQ ID NO：1是牛分枝杆菌特异性融合抗原蛋白的核苷酸序列表 

图1：本发明的总体技术路线图 

图2：本发明检测试纸条的组装示意图 

图中：1为PVC背衬，2为样品垫，3为结合垫，4为硝酸纤维素膜，5为检测线，6为质控线，7吸收垫 

图3：本发明检测试纸条结果判定示意图 

图中：A：为阳性标准品结果，B：为阳性样品结果，C：为阴性样品结果，D、E：为试纸条失效。图4：本发明检测试纸条结果判定图 

图中：A：为阳性结果，D：为阴性样品结果，B和C：为试纸条失效。 

图5：pET-28a(+)原始质粒载体物理图谱。 

图6：是本发明PCR扩增Rv3872电泳图谱；图中：M为DL2000；1为阴性对照；2为扩增后得到的321bp的Rv3872片段，其中包括酶切位点和连接序列(Linker)长度。 

图7：为PCR扩增CFP10和ESAT6电泳图谱。图中：M为DL2000；1，3为阴性对照；2为348bp的CFP10目的片段，其中包括酶切位点和连接序列(Linker)长度；4为341bp的ESAT6目的片段，其中包括酶切位点和连接序列(Linker)长度。 

图8：是本发明中三基因融合重组原核表达载体pET-28a-Rv3872-CFP10-ESAT6(即pET-28a-RCE)构建流 程图。 

图9：是本发明中所构建包含CFP10-ESAT6融合基因的中间质粒pET-28a-CFP10-ESAT6(即pET-28a-CE)的图谱。 

图10：是本发明中所构建包含Rv3872-CFP10-ESAT6三基因的重组表达载体质粒pET-28a-Rv3872-CFP10-ESAT6(即pET-28a-RCE)的图谱。 

图11：是本发明中重组中间融合基因CFP10-ESAT6PCR扩增后的电泳图谱。图中：M为DL2000；1为扩增后643bp的CFP10-ESAT6融合基因片段(包括连接序列和两端酶切位点)；2为阴性空白对照。 

图12：是重组中间融合质粒pET-28a-CFP10-ESAT6构建后酶切鉴定电泳图谱。图中：M1为DL2000；M2为DL15000；1为HindIII和NotI双酶切pET-28a-CFP10-ESAT6质粒后出现5363bp和636bp左右的两个片段；2，3为NotI和HindIII分别单酶切pET-28a-CFP10-ESAT6质粒出现5999bp左右的片段。 

图13：是本发明中制备的RCE蛋白表达形式鉴定图谱。图中：M为蛋白分子量标准；1为IPTG诱导的空载体对照；2为菌液经IPTG诱导后的情况；3为超声波破碎菌体离心后上清取样；4为超声波破碎菌体离心后沉淀取样。 

图14：是本发明中制备的RCE蛋白最佳表达条件。在图12A中：M为蛋白分子量标准；1为0.8mmol/L IPTG(分子克隆实验指南建议浓度)诱导空载体对照；2为IPTG终浓度为0.4mmol/L诱导；3为IPTG终浓度为0.6mmol/L诱导；4为IPTG终浓度为0.8mmol/L诱导；5为IPTG终浓度为1.0mmol/L诱导。在图12B中：M为蛋白分子量标准；1为0.4mmol/L IPTG诱导空载体；2为：0.4mmol/L IPTG诱导2h；3为0.4mmol/L IPTG诱导3h；4为0.4mmol/L IPTG诱导5h；5为0.4mmol/L IPTG诱导6h。 

图15：是本发明中制备的RCE蛋白Western-Blot图。图中：M为蛋白分子量标准；1为牛结核阳性血清；2为正常牛血清。 

图16：是本发明中制备的RCE蛋白浓度测定标准曲线图。图16A和图16B为蛋白标准品做两次重复分别所得标准曲线及公式。 

图17：制备好的胶体金电镜照片。 

图18：牛结核RCE抗体快速检测试纸条。 

具体实施方式

实施例1(制备实施例) 

(一)牛分枝杆菌特异性分泌蛋白RCE基因的克隆及在重组大肠杆菌中表达并纯化的方法参见(专利申请号：200910060913.1；公开号CN101538578，公告日：2009年9月23日)报道的方法。 

(二)提纯RCE蛋白的IgG抗体 

将含有RCE抗体的血清4000r/min离心10分钟取上清用于提纯：取10ml上清于4℃，12000r/min离心10分钟，弃杂质，然后加入40ml 0.06M pH4.5的醋酸盐缓冲液，再在室温(25℃)下缓慢加入330μl辛酸， 边滴加边搅拌。缓慢加入饱和硫酸铵至终浓度为45％，用0.01M PBS(pH7.4)溶解后透析过夜。SDS-PAGE电泳分析(如附图11所示)显示有两条带，一条为IgG重链，一条为IgG轻链。用紫外分光光度计测定纯化多抗在280nm和260nm波长时的光吸收值(OD)，按公式1.45×OD280-0.74×OD260计算多抗浓度。调整溶液体积，使其终浓度为2.5mg/ml。利用该抗体作为质控线。 

实施例2(制备实施例) 

牛分枝杆菌特异性分泌蛋白RCE抗体诊断试纸条组装及制备方法 

1、RCE试纸条包括： 

样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(7)和PVC背衬(1)为商购，其具体结构是：在PVC背衬(1)上按顺序依次粘附有样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(7)；所述的结合垫(3)上包被有MPBrce蛋白-胶体金标记物；所述的硝酸纤维素膜(4)上分别包被有纯化的RCE蛋白的检测线(5)、纯化RCE蛋白IgG构成的质控线(6)。 

2胶体金的制备： 

用超纯水将1％氯金酸稀释成0.01％，置磁力加热搅拌器上搅拌煮沸，按每100ml 0.01％氯金酸加入2.0ml 1％柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈橙红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期一年，胶体金电镜照片如附图17。 

3RCE蛋白-胶体金标记物制备： 

磁力搅拌下，用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至8.0，按每ml胶体金加入2.3μL 1.0mg/mL MPBrce蛋白，继续搅拌混匀60min，加入10％PEG20000至终浓度为1％，继续搅拌混匀30min。3500rpm、4℃离心30min，弃沉淀，上清7500rpm、4℃离心30min，弃上清，沉淀用0.02M pH8.0的硼酸盐缓冲液(配方：硼酸0.1237g，PEG-200001g，用超纯水定容至1000ml，调pH至8.0)洗涤两次，用二十分之一初始胶体金体积的0.02M pH8.0的硼酸盐缓冲液(配方：硼酸0.1237g，聚乙二醇(PEG)-200001g，用超纯水定容至1000ml，调pH至8.0)将沉淀重悬，置4℃备用，有效期60天。 

4结合垫的包被 

将结合垫浸泡于0.01M pH 7.4磷酸缓冲液(配方及制备：20g牛血清白蛋白(BSA)，25g蔗糖，3g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-10，0.2gNaN3 NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH₂PO₄0.2g，用超纯水定容至1000ml)中30min后，于37℃烘干。然后用Biodot点膜仪将制备好的RCE蛋白-胶体金标记物均匀包被在结合垫上，每厘米结合垫包被9μlMPBrce蛋白-胶体金标记物，冷冻真空干燥，真空封装，置4℃备用。 

5样品垫的处理 

将样品垫浸泡于0.01M pH 7.4磷酸缓冲液(配方及制备：20g BSA，25g蔗糖，3gPVP-10，0.2gNaN₃ NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KH₂PO₄0.2g，用超纯水定容至1000ml)中30min后，于37℃烘干，真空封装，置4℃备用。 

6硝酸纤维素膜的包被 

用Biodot点膜仪将纯化的牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白RCE(浓度为2mg/mL)包被于硝酸纤维素膜作为检测线，包被量为0.6μl/cm，检测线靠近结合垫端，距结合垫垫端约8mm；用Biodot点膜仪将纯化的猪IgG抗体(浓度2mg/ml)包被于硝酸纤维素膜作为质控线，包被量为0.8μl/cm，质控线靠近吸水垫，距吸收垫约8mm，两线距离5～8mm。室温干燥，封装备用。 

7试纸条的组装 

将样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(7)按图2所示的顺序依次粘附在PVC背衬(1)上，切成3mm宽的小条，装到塑料通明外壳(9)中真空封装。2～8℃保存，有效期2年；常温保存，有效期12个月。 

实施例3(应用实施例) 

牛结核抗体的免疫胶体金试纸条使用方法 

1、血清样品的预处理 

血清样品经4000rpm/min离心10min去掉血细胞，-20℃长期保存，4℃短期保存。 

2、检测步骤 

用吸管吸取40μl待检血清与40μl血清稀释液混合均匀后缓慢滴加在胶体金试纸条的样品垫上，20分钟后观察结果。 

3、结果判定 

如图3所示，若待测样品试纸条检测线颜色明显深于阳性标准品试纸条检测线颜色，同时质控线上出现红色条带则判断为阳性样品，即待测样品中有牛结核分枝杆菌特异性分泌蛋白RCE的抗体，说明该牛为结核病牛；若待测样品试纸条检测线无颜色出现，同时质控线上出现红色条带则判断为阴性样品，即待测样品中没有牛结核分枝杆菌特异性分泌蛋白RCE的抗体，说明该牛为结核阴性牛；若待测样品试纸条检测线颜色介于阳性标准品和阴性标准品试纸条检测线颜色之间，同时质控线上出现红色条带则判断为可疑样品，说明该牛疑似结核病；如果质控线上没有红色条带出现，则该试纸条无效。 

实施例4(应用实施例) 

本发明的应用效果举例(如附图18) 

本例中所指的检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸检测方法参照实施例3所述的操作步骤，其检测结果如表1、表2和表3。 

1、特异性试验 

按实施例3所述方法进行试验，检测牛结核阳性阳性血清，牛结核阴性血清(按照常规的PPD皮试、 ELISA和病理学和细菌学检验方法操作)、副结核病牛血清、布病牛血清、弓形虫病牛血清和口蹄疫牛血清(均购自中国兽药监察所)。试验结果表明(见表1)，副结核病牛血清、布病牛血清、弓形虫病牛血清和口蹄疫牛血清样品检测线无颜色出现，同时质控线上出现红色条带。本发明试纸条与牛的其他疾病无交叉反应，显示本发明试纸条具有好的特异性。 

表1特异性试验 

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。 

2、敏感性试验 

按实施例3所述方法进行试验，将200份临床牛血清样品用牛结核病抗体检测试纸条检测，并且与TST检测做比较。牛结核病抗体检测试纸条与TST的比较(结果见表2)。TST阳性牛100头，其中试纸条检测判断85头为阳性，阳性符合率为68％。TST阴性牛100头，其中试纸条检测判断115头为阴性，阴性符合率为83％。总符合率为75.5％。 

表2牛结核RCE抗体检测试纸条与TST的比较 

用牛分枝杆菌RCE抗体检测胶体金试纸条与韩国进口的牛结核抗体检测胶体金试纸条同时检测了240份临床牛血清样品，结果显示：本发明的试纸条检测62为阳性，韩国试纸条阳性牛61头，共同检出60份，其中阳性符合率为97％(59/61)。韩国试纸条阴性牛179头，其中本研究试纸条检测判断为阴性的有176头，阴性符合率为98％(176/179)。总符合率为98％(59+176/240)。说明本发明的试纸条与韩国试纸条具有很高的符合率(表2)。 

表3本发明的试纸条与同类韩国试纸条的比较 

3、临床样品的检测 

按实施例3所述方法进行试验，对湖北省黄冈地区11个牛场的1003份血清进行检测，结果见表4。检测样品阳性率为7.00％-65.00％(见表4)，由此可见牛结核病分布较广。临床应用证明该试剂盒准确性、重复性、敏感性、特异性良好，适合临床大量血清抗体检测和疾病诊断，在清除牛结核病传染源和控制牛结核病的临床实践中具有重要的意义。 

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明的保护范围内。 

表4本发明的牛结核病抗体检测试纸条的临床应用情况 

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种应用Rv3872新型融合蛋白制备的牛结核抗体鉴别检测试纸条

<130>

<141>2010-04-28

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1053

<212>DNA

<213>牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1053)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1053)

<223>

<400>1

atg ggc agc agc cat cat cat cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg     48

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1               5                   10                  15

cgc ggc agc cat atg gct agc atg act ggt gga cag caa atg ggt cgc     96

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

            20                  25                  30

gga tcc gaa ttc gaa aaa atg tca cat gat ccg atc gct gcc gac att    144

Gly Ser Glu Phe Glu Lys Met Ser His Asp Pro Ile Ala Ala Asp Ile

        35                  40                  45

ggc acg caa gtg agc gac aac gct ctg cac ggc gtg acg gcc ggc tcg    192

Gly Thr Gln Val Ser Asp Asn Ala Leu His Gly Val Thr Ala Gly Ser

    50                  55                  60

acg gcg ctg acg tcg gtg acc ggg ctg gtt ccc gcg ggg gcc gat gag    240

Thr Ala Leu Thr Ser Val Thr Gly Leu Val Pro Ala Gly Ala Asp Glu

65                  70                  75                  80

gtc tcc gcc caa gcg gcg acg gcg ttc aca tcg gag ggc atc caa ttg    288

Val Ser Ala Gln Ala Ala Thr Ala Phe Thr Ser Glu Gly Ile Gln Leu

                85                  90                  95

ctg gct tcc aat gca tcg gcc caa gac cag ctc cac cgt gcg ggc gaa    336

Leu Ala Ser Asn Ala Ser Ala Gln Asp Gln Leu His Arg Ala Gly Glu

            100                 105                 110

gcg gtc cag gac gtc gcc cgc acc tat tcg caa atc gac gac ggc gcc    384

Ala Val Gln Asp Val Ala Arg Thr Tyr Ser Gln Ile Asp Asp Gly Ala

        115                 120                 125

gcc ggc gtc ttc gcc gaa ggt ggt ggt ggt gga aag ctt gca gag atg    432

Ala Gly Val Phe Ala Glu Gly Gly Gly Gly Gly Lys Leu Ala Glu Met

    130                 135                 140

aag acc gat gcc gct acc ctc gcg cag gag gca ggt aat ttc gag cgg    480

Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala Gly Asn Phe Glu Arg

145                 150                 155                 160

atc tcc ggc gac ctg aaa acc cag atc gac cag gtg gag tcg acg gca    528

Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln Val Glu Ser Thr Ala

                165                 170                 175

ggt tcg ttg cag ggc cag tgg cgc ggc gcg gcg ggg acg gcc gcc cag    576

Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala Gly Thr Ala Ala Gln

            180                 185                 190

gcc gcg gtg gtg cgc ttc caa gaa gca gcc aat aag cag aag cag gaa    624

Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys Gln Lys Gln Glu

        195                 200                 205

ctc gac gag atc tcg acg aat att cgt cag gcc ggc gtc caa tac tcg    672

Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly Val Gln Tyr Ser

    210                 215                 220

agg gcc gac gag gag cag cag cag gcg ctg tcc tcg caa atg ggc ttc    720

Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser Gln Met Gly Phe

225                 230                 235                 240

ggt ggc ggt gga agc ggc ggt ggc gga agc ggc ggt ggc ggc agc atg    768

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met

                245                 250                 255

aca gag cag cag tgg aat ttc gcg ggt atc gag gcc gcg gca agc gca    816

Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala

            260                 265                 270

atc cag gga aat gtc acg tcc att cat tcc ctc ctt gac gag ggg aag    864

Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys

        275                 280                 285

cag tcc ctg acc aag ctc gca gcg gcc tgg ggc ggt agc ggt tcg gag    912

Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu

    290                 295                 300

gcg tac cag ggt gtc cag caa aaa tgg gac gcc acg gct acc gag ctg    960

Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu

305                 310                 315                 320

aac aac gcg ctg cag aac ctg gcg cgg acg atc agc gaa gcc ggt cag   1008

Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln

                325                 330                 335

gca atg gct tcg acc gaa ggc aac gtc act ggg atg ttc gca tag       1053

Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala

          340                 345                 350

<210>2

<211>350

<212>PRT

<213>牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)

<400>2

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1               5                   10                  15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

            20                  25                  30

Gly Ser Glu Phe Glu Lys Met Ser His Asp Pro Ile Ala Ala Asp Ile

        35                  40                  45

Gly Thr Gln Val Ser Asp Asn Ala Leu His Gly Val Thr Ala Gly Ser

    50                  55                  60

Thr Ala Leu Thr Ser Val Thr Gly Leu Val Pro Ala Gly Ala Asp Glu

65                  70                  75                  80

Val Ser Ala Gln Ala Ala Thr Ala Phe Thr Ser Glu Gly Ile Gln Leu

                85                  90                  95

Leu Ala Ser Asn Ala Ser Ala Gln Asp Gln Leu His Arg Ala Gly Glu

            100                 105                 110

Ala Val Gln Asp Val Ala Arg Thr Tyr Ser Gln Ile Asp Asp Gly Ala

        115                 120                 125

Ala Gly Val Phe Ala Glu Gly Gly Gly Gly Gly Lys Leu Ala Glu Met

    130                 135                 140

Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala Gly Asn Phe Glu Arg

145                 150                 155                 160

Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln Val Glu Ser Thr Ala

                165                 170                 175

Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala Gly Thr Ala Ala Gln

            180                 185                 190

Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys Gln Lys Gln Glu

        195                 200                 205

Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly Val Gln Tyr Ser

    210                 215                 220

Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser Gln Met Gly Phe

225                 230                 235                 240

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met

                245                 250                 255

Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala

            260                 265                 270

Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys

        275                 280                 285

Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu

    290                 295                 300

Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu

305                 310                 315                 320

Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln

                325                 330                 335

Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala

            340                 345                 350

Claims (3)

1.一种牛结核抗体的检测试纸条，其包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬，其特征在于，在PVC背衬(7)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)；所述的结合垫(2)上包被有保藏号为CCTCC NO：M208244的重组大肠杆菌所表达的Rv3872-CFP10-ESAT6蛋白与胶体金的标记物；所述的硝酸纤维素膜(3)上分别包被有Rv3872-CFP10-ESAT6蛋白的检测线(5)、抗Rv3872-CFP10-ESAT6蛋白IgG构成的质控线(6)；

其中，Rv3872-CFP10-ESAT6蛋白是以牛分支杆菌全基因组为模板克隆Rv3872、CFP10和ESAT6基因，构建三种基因融合表达的原核表达载体，并在大肠杆菌中表达得到。

2.一种表达Rv3872-CFP10-ESAT6蛋白的重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET28a-RCE，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M208244。

3.权利要求2所述的的重组大肠杆菌在制备牛结核抗体检测试纸条上的应用。

Images