CN104237509A

CN104237509A - 一种结核分枝杆菌的检测试剂盒及应用

Info

Publication number: CN104237509A
Application number: CN201310244468.0A
Authority: CN
Inventors: 何正国; 张曙光
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2013-06-19
Filing date: 2013-06-19
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2033-06-19
Also published as: CN104237509B

Abstract

本发明公开了一种结核分枝杆菌的检测试剂盒及应用，一种结核分支杆菌的检测试剂盒，包括包被液；洗涤液；封闭液；终止液；抗原Rv3872；抗原Rv2309A。本发明所述试剂盒具有操作简便、成本低、精确度高、操作者友好、设备简便等优点，本发明利用混合抗原进行包被，克服了单一抗原在进行诊断时，存在很大的个体差异性的问题，并且，混合抗原的检测效果在灵敏度，精确性和特异性方面都要优于单独抗原。与目前市售的同类试剂盒相比，无论是在特异性、假阳性率或是检出率上，优势更明显，本发明所述的试剂盒在检测结核分枝杆菌上具备广阔的应用前景。

Description

一种结核分枝杆菌的检测试剂盒及应用

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌的检测试剂盒，同时还涉及试剂盒试剂盒在制备检测结核分枝杆菌试剂中的应用。

背景技术

结核病是一种严重的传染性疾病，是当今世界面临的主要公共健康问题之一，曾在世界范围内出现过大流行。它的病原体是结核分枝杆菌，属分支杆菌属。随着比较有效的抗结核药物的出现，结核病的发展在全球得到过充分的抑制，但是近些年来由于结核分枝杆菌多重耐药菌株的出现，使结核病的发病率又再度回升，全球结核病形势出现了恶化趋势。据WHO统计，全球约有1/3的人口（约20亿）被结核分支杆菌感染。据我国在2000年的第四次全国结核病流行病学的抽样调查结果估算，我国约有450万活动性肺结核病人，每年有13万人死于肺结核，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数为世界第二。

早期的诊断治疗对于结核病的预防和治疗有着非常重要的作用，现阶段的诊断包括痰涂片法、痰结核菌培养、X线检查和血清学检测等方法。其中，血清学检测由于其操作简便、成本低、精确度高、操作者友好、设备简便等优点，在对结核病的检测方面应用前景非常广阔，但是现在所使用的抗原存在着特异性差、假阳性率高的缺点，并且现在的一些商业试剂盒检出率低、假阳性率高，因此急需研发出更为有效的特异性抗原来提高血清学检测的效果。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种结核分枝杆菌的检测试剂盒，本试剂盒由一对混合抗原组成，为Rv2309A和Rv3872，其序列分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。单一抗原在进行诊断时，会存在很大的个体差异性，而混合抗原的出现可以克服这一缺点。并且，混合抗原的检测效果在灵敏度，精确性和特异性方面都要优于单独抗原。

本发明的另一个目的是在于提供了一种结核分枝杆菌试剂盒在制备检测结核分枝杆菌试剂中的应用，本试剂盒与商业试剂盒TB-DOT相比，其灵敏度，精确性和特异性都要优于TB-DOT。和商业试剂盒TB-CHECK-1相比，在灵敏度和精确度方面都要优于TB-CHECK-1。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

本发明通过基因工程手段，将结核分枝杆菌Rv2309A和Rv3872蛋白在体外表达、纯化，并将Rv2309A和Rv3872蛋白混合制备混合抗原及抗原诊断试剂盒，这两个试剂盒能特异性的检测结核分枝杆菌的抗体，能区分经卡介苗免疫的健康人群和被结核分枝杆菌感染的患结核病的人群。可用于结核病的临床血清学检测。

一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，它包括以下组份：

包被液：0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液；

洗涤液：含0.05%(v/v)吐温-20的PBS溶液；

封闭液：含5%（w/v）脱脂牛奶的洗涤液；

终止液：2M H₂SO₄；

抗原Rv2309A，其序列为SEQ ID NO.2所示；

抗原Rv3872，其序列为SEQ ID NO.3所示。

一种结核分枝杆菌基因表达载体组氨酸标签融合表达载体pETXba的构建方法，其步骤如下:

（1）将商业购买的载体pET28a上的Xba Ⅰ酶切位点消除，获得一个中间载体pET28a-ΔX；

（2）将步骤（1）获得的载体pET28a-ΔX用限制性内切酶Nde Ⅰ和Xho Ⅰ进行消化；

（3）利用极端嗜热古菌S.solfataricus的cdc62基因作为第一个媒介基因，通过PCR的方法从极端嗜热古菌S.solfataricus基因组中扩增获得末端含有Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点的cdc62媒介基因；

（4）将步骤（3）获得的媒介基因cdc62用限制性内切酶Nde Ⅰ和Xho Ⅰ进行消化；

（5）将步骤（2）获得的载体和步骤（4）获得.的媒介基因在16℃连接过夜，得到第二个中间载体pET28a-62；

（6）将步骤（5）获得的载体pET28a-62用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ进行消化；

（7）利用极端嗜热古菌S.solfataricus的微型染色体维持基因MCM作为第二个媒介基因，通过PCR方法获得末端含有EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ限制性酶切位点的MCM媒介基因；

（8）将步骤（7）获得的MCM媒介基因用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ限制性内切酶消化；

（9）将步骤（6）获得的载体pET28a-26和步骤（8）获得的媒介基因MCM在16℃连接过夜。

通过以上方式获得的表达载体pETXba，其大小为6526bp，该载体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，它还包括一个适用于克隆结核分枝杆菌所编码基因的多克隆位点。

上述步骤（3）中的cdc62基因扩增所用引物对的序列如下：

正向引物：GCGCGGCATATGAGAATTCATGAGTGATATAATTGATGAG，

反向引物：ATATGACTCGAGTACTCCAGAGATCAGCAAACCT；

上述步骤（7）中MCM基因扩增所需的引物对的序列如下：

正向引物：GAGCGAATTCGTTGGAAATTCCTAGTAAAC，

反向引物：GGATGGCTCGAGTCTAGACTTTTTTGTAACAT。

Rv2309A和Rv3872抗原表达载体的构建方法，其步骤是：

(1)根据GeneBank提供的结核分枝杆菌H37Rv基因组序列，查出Rv2309A和Rv3872的序列并设计引物，通过PCR得到上述两个基因。PCR结果见图1。

(2)将PCR产物分别酶切，用同样的方法酶切表达载体pETXba，之后将Rv2309A和Rv3872分别和酶切过的pET表达载体连接，分别转化大肠杆菌DH5α，制备质粒，质粒电泳结果见图2。

一种结核分枝杆菌蛋白质在大肠杆菌中的外源表达和蛋白质的纯化，其步骤是：

将得到的pET-Rv2309A和pET-Rv3872转化BL21（DE3）菌株，从转化的培养皿上挑取单菌落分别进行诱导表达，蛋白质纯化。蛋白质试表达结果见图3，蛋白质纯化结果见图4。最终得到Rv2309A和Rv3872抗原，其序列分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

一种结核分枝杆菌试剂盒在制备检测结核病试剂中的应用，其步骤是：

包被液：0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲液（Na₂CO₃：1.59g;NaHCO₃：2.93g;加蒸馏水定容至1L）；

洗涤液：含0.05%(v/v)吐温-20的PBS溶液（PBS配方参见《分子克隆技术操作指南》）；

封闭液：含5%（w/v）脱脂牛奶的洗涤液；

终止液：2M H₂SO₄；

具体实施步骤：

(1)包被：在每孔中加入100μl包被液，每孔中含有Rv3872121μmol，含有Rv2309A:28μmol，4℃过夜；

(2)洗涤：次日从4℃取出步骤（1）的ELISA板，甩干内容物，向孔内加入洗涤液，每孔200μl，静置3分钟，甩干，再加洗涤液，如此泡洗三次，最后一次甩干后，将ELISA板朝下放在滤纸上反复拍打干净；

(3)封闭；向步骤（2）的ELISA板中加入封闭液，每孔200μl，37℃温育30min；

(4)洗涤：同步骤（2）的方法；

(5)加入一抗反应：向步骤（4）的ELISA板中加入结核病人血清（湖北省武汉市结核病防治所）稀释液，稀释400倍，每孔100μl，37℃温育30min；

(6)洗涤：同步骤（2）的方法；

(7)加入二抗反应：向步骤（6）的ELISA板中加入二抗（购自武汉意德生物技术有限公司）稀释液，稀释5000倍，每孔100μl，37℃温育30min；

(8)洗涤：同步骤（2）的方法；

(9)显色：向步骤（8）的ELISA板中加入TMB底物（购自武汉意德生物技术有限公司）显色，每孔100μl，避光30min；

(10)终止反应：向步骤（9）的ELISA板中加入终止液终止显色反应；

(11)结果读取：利用酶标仪读取OD₄₅₀的值。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.单一抗原在进行诊断时，会存在很大的个体差异性，本发明利用混合抗原进行包被，的出现可以克服这一缺点。并且，混合抗原的检测效果在灵敏度，精确性和特异性方面都要优于单独抗原。

2.本发明的试剂盒操作简便，成本低廉，高通量，能提高结核病检测的灵敏度和精确性。

附图说明

图1为Rv2309A和Rv3872PCR示意图。

从左至右第一泳道为marker，第二泳道为Rv2309A，第三泳道为Rv3872。

图2为pET-Rv2309A和pET-Rv3872质粒电泳示意图。

图3为Rv2309A和Rv3872蛋白质试表达结果，

从左至右第一泳道为marker，第二泳道为Rv2309A诱导前的菌体，第三泳道为Rv2309A诱导后的蛋白表达情况，第四泳道为Rv3872诱导前的菌体，第五泳道为Rv3872诱导后的蛋白表达情况。

图4为Rv2309A和Rv3872蛋白质纯化结果。

第一泳道为marker，第二泳道为Rv2309A蛋白质，第三泳道为Rv3872蛋白质。

图5为一种TB-DOT试剂盒示意图

图6为一种TB-CHECK-1试剂盒示意图

具体实施方式

实施例1：

一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，它包括以下组份：

包被液：0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液（Na₂CO₃：1.59g;NaHCO₃：2.93g;加蒸馏水定容至1L）；

洗涤液：含0.05%(v/v)吐温-20的PBS溶液；

封闭液：含5%（w/v）脱脂牛奶的洗涤液；

终止液：2M H₂SO₄；

抗原Rv2309A，其序列为SEQ ID NO.2所示；

抗原Rv3872，其序列为SEQ ID NO.3所示。

实施例2：

结核分枝杆菌基因Rv2309A和Rv3872的PCR扩增：

以结核分枝杆菌（来自武汉市医疗救治中心）H37Rv的总基因组（登录号为NC000962）的DNA为模版:，根据Rv2309A（gene bank no：3205076）和Rv3872（gene bank no：886191）设计的引物进行PCR，扩增出所需基因。

其中，引物设计方法为：应用BioEdit软件，根据编码基因内部的酶切位点，选择基因内部没有的酶切位点组合来设计引物，三个基因都选取EcoRⅠ和XbaⅠ的组合，引物具体如下：

Rv2309A f:ATAT GAATTC AT TTGGCCACCAGTAGCGACGA

Rv2309A r:TATATA TCTAGA TCATGGGCCGACAGGAAGCT

Rv3872f:AGCGAGC GAATTC GC ATGGAAAAAATGTCACATGA

Rv3872r:ATAT TCTAGA ATATA CTATTCGGCGAAGACGCCGG

表1PCR体系

表2PCR反应条件

实施例3：

表达载体pETEXba的改造

(1)通过末端补齐修饰的方法（具体参见Takara公司T4DNA Polymerase使用方法）将商用的pET28a（购自Novagen公司）载体上的XbaⅠ酶切位点消除，获得一个中间载体，命名为pET28a-ΔX；

(2)将步骤（1）获得的中间载体pET28a-ΔX用限制性内切酶Nde Ⅰ和Xho Ⅰ进行消化；

(3)利用极端嗜热古菌S.solfataricus的cdc62基因（GeneBank ID：1455035）(Bender A,Pringle JR.Multicopy suppression of the cdc24budding defect in yeast by CDC42and three newly identified genes including the ras-related gene RSR1[J].Proceedings ofthe National Academy of Sciences,1989,86(24):9976-9980.)作为改造载体的第一个媒介基因。通过PCR的方法在极端嗜热古菌S.solfataricus基因组中扩增（正向引物14bEcoR-f：GCGCGGCATATGAGAATTCATGAGTGATATAATTGATGAG，反向引物14bEcoR-r：ATATGACTCGAGTACTCCAGAGATCAGCAAACCT，下划线为酶切位点，PCR体系见表1，PCR条件见表3）从获得末端含有Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点的cdc62基因片段；

4)将步骤（3）获得的媒介基因片段cdc62用限制性内切酶Nde Ⅰ和Xho Ⅰ进行消化；

5)将通过步骤（2）和步骤（4）获得的载体和媒介基因在16℃进行连接过夜，得到中间载体，命名为pET8a-62；

6)将步骤（5）获得的中间载体pET28a-62用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ进行消化；

7)利用极端嗜热古菌S.solfataricus的微型染色体维持基因（mini-chromosome maintenance-like gene,MCM,Genebank ID:1455038）作为改造载体的原始媒介基因。通过PCR（正向引物Trgada-f:GAGCGAATTCGTTGGAAATTCCTAGTAAAC,反向引物Adaptor-r:GGATGGCTCGAGTCTAGACTAGACTTTTTTGTAACAT,下划线为酶切位点）的方法从极嗜热古菌S.solfataricus的基因组中扩增得2.0kb的MCM基因。由于在MCM内部存在两个BamHⅠ限制性内切酶识别位点，将该片段经BamHⅠ充分酶切形成缺失844个碱基的片段。随后将该片段经末端补齐修饰方法（具体方法参见Takara公司T4DNA Polymerase使用方法）处理形成末端含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，大小为1.2kb的MCM媒介基因；

8)利用极端嗜热古菌S.solfataricus的微型染色体维持基因（mini-chromosome maintenance-like gene,MCM,Genebank ID:1455038）作为改造载体的第二个媒介基因。通过PCR的方法（正向引物TrgXcm-f:GAGCGAATTCGTTGGAAATTCCTAGTAAAC，反向引物Xcm-r:GGATGGCTCGAGTCTAGACTAGACTTTTTTGTAACAT，下划线为酶切位点，)以在步骤（7）中获得的MCM媒介基因为模版扩增获得末端含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的MCM媒介基因；

9)将步骤（8）获得的MCM媒介基因用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ进行消化；

10)将通过步骤（6）和步骤（9）获得的载体和媒介基因在16℃进行连接过夜，得到改造成功的表达载体，命名为pETEXba，其大小为6526bp，其序列为SEQ ID NO.1所示。

表3PCR反应条件

实施例4：

将结核分枝杆菌编码基因的PCR产物克隆至pETEXba载体

(1)将通过PCR得到的基因片段Rv2309A和Rv3872分别用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ消化；

(2)将通过实施例2得到的pETXba载体用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ消化；

(3)将步骤（1）获得的基因片段和步骤（2）获得的载体分别在16℃连接过夜；转化大肠杆菌，挑取阳性克隆测序正确后获得质粒pET-Rv2309A和pET-Rv3872。

实施例5：

蛋白质的诱导表达

本实施例中使用的通用LB培养基和附加的卡那霉素（见具体步骤所示）配方参见J.萨姆布鲁克，EF.佛里奇，T.曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南（第三版），科学出版社，2002年。

(1)将通过实施例3获得的质粒pET-2309A和pET-3872分别转化BL21(DE3)菌株（购自上海超研生物科技有限公司）。

(2)从步骤（1）转化到的平板上挑取单菌落接入2.5ml含有卡那霉素（30μg/ml）的LB培养基中，于37℃摇床培养过夜；

(3)把步骤（2）获得的过夜培养物取2ml转接至200ml含有卡那霉素（30μg/ml）的LB培养基中，于37℃扩大培养至OD₆₀₀=1.0。剩余培养物作为菌种保存至-20℃；

(4)向步骤（3）获得的200ml菌液中加入IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，终浓度1.0mM）的LB培养基，于37℃摇床继续培养4个小时；

(5)将步骤（4）获得的菌液收集至100ml离心管，8000转/分钟离心2分钟，倒掉上清，菌体于-20℃保存。

实施例6：

蛋白质的变性纯化

本实施例中使用的缓冲液B、C和E配方参见下表3

表4实施例5中使用的缓冲液B、C和E的组分及其配比

(1)向在实施例4中收集的菌体加入约30ml Buffer B重悬，37℃摇床过夜，使菌体充分裂解；

(2)将步骤(1)裂解后的菌体于4℃，9000转/分钟离心30分钟，将上清取出备用；

(3)将步骤(2)得到的上清流过含有加镍之后的镍亲和层析胶珠(购自GE公司)的蛋白质纯化柱；

(4)向步骤(3)的蛋白质纯化柱中加入30ml Buffer C冲洗；

(5)向步骤(4)的蛋白质纯化柱中加入5ml Buffer E冲洗，接好冲洗过柱的样品备用，经过SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）检测纯化的结果，Rv2309A浓度：280μmol/ml，其序列为SEQ ID NO.2所示，Rv3872浓度：1210μmol/ml，其序列为SEQ ID NO.3所示。

实施例7：

一种结核分枝杆菌试剂盒在制备检测结核分枝杆菌试剂中的应用，其步骤是：

本实施例中使用的缓冲液配方如下：

包被液：0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲液（Na₂CO₃：1.59g;NaHCO₃：2.93g;加蒸馏水定容至1L）;

封闭液：含5%（w/v）脱脂牛奶的洗涤液；

终止液：2M H₂SO₄；

具体实施步骤：

（1）包被：在每孔中加入100μl包被液，每孔中含有Rv3872121μmol，含有Rv2309A:28μmol，4℃过夜；

（2）洗涤：次日从4℃取出步骤（1）的ELISA板，甩干内容物，向孔内加入洗涤液，每孔200μl，静置3分钟，甩干，再加洗涤液，如此泡洗三次，最后一次甩干后，将ELISA板朝下放在滤纸上反复拍打干净；

（3）封闭；向步骤（2）的ELISA板中加入封闭液，每孔200μl，37℃温育30min；

（4）洗涤：同步骤（2）的方法；

（5）加入一抗反应：向步骤（4）的ELISA板中加入结核病人血清（湖北省武汉市结核病防治所）稀释液，稀释400倍，每孔100μl，37℃温育30min；

（6）洗涤：同步骤（2）的方法；

（7）加入二抗反应：向步骤（6）的ELISA板中加入二抗（购自武汉意德生物技术有限公司）稀释液，稀释5000倍，每孔100μl，37℃温育30min；

（8）洗涤：同步骤（2）的方法；

（9）显色：向步骤（8）的ELISA板中加入TMB底物（购自武汉意德生物技术有限公司）显色，每孔100μl，避光30min；

（10）终止反应：向步骤（9）的ELISA板中加入终止液终止显色反应；

（11）结果读取：利用酶标仪读取OD₄₅₀的值。

表5血清排列方式

备注：P代表病人血清，H代表健康人血清。

实施例8：

用商业试剂盒TB-DOT（购自上海奥普生物醫藥有限公司）和TB-CHECK-1（购自上海宏泰生物工程有限公司）检测血清，和ELISA方法对比。

详细检测方法参见产品说明书。

表6TB-DOT检测结果：

注：1表示检测结果显阳性，0表示检测结果显阴性

表7TB-CHECK-1检测结果：

注：1表示检测结果显阳性，0表示检测结果显阴性

表8Rv2309A和Rv3872的ELISA检测结果

数据处理方法

1、试剂盒数据处理方法。

真阴性：在健康人中检测结果显阴性

真阳性：在病人中检测结果显阳性

假阴性：在病人中检测结果显阴性

假阳性：在健康人中检测结果显阳性

灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性)×100%

特异性=真阴性/(假阳性+真阴性)×100%

精确度=(真阳性+真阴性)/样本总数×100%

2、ELISA数据处理方法

Cut off value=临床阴性血清OD₄₅₀平均值+2×临床阴性血清OD₄₅₀标准差

真阴性：在健康人中检测结果＜Cut off value

真阳性：在病人中检测结果＞Cut off value

假阴性：在病人中检测结果＜Cut off value

假阳性：在健康人中检测结果＞Cut off value

灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性)×100%

特异性=真阴性/(假阳性+真阴性)×100%

精确度=(真阳性+真阴性)/样本总数×100%

表9ELISA与试剂盒结果

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种结核分枝杆菌的检测试剂盒及应用

<130> 一种结核分枝杆菌的检测试剂盒及应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 6526

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtctagac tagacttttt 180

tgtaacattc tggttttgct tcatatatta taccactctt tctcatatct gtaagtaatt 240

tttctatatt acttttttca atgcctactt gttgagcttc ttttagtatg tccttaactt 300

ttgcgcactc agaacttaca gctaaactat ctattatttc tattattttc atcattttct 360

ctctagcgct tttaggttta ccagtcatta ttgtatctat atctattttt ccactttcca 420

tatcaactcc tacactctct aggaaaagtc tcatgatatt tattgctctt tctgcatctt 480

ctctagtgac ttcagcctta agagccatct tggcataggc ttctgaaatt cttattaaag 540

cctctaattg tcttggagtt atcaatattg ggctatcagg tgtttctgag cttttcttcc 600

tcatttctac gaagaaatct gtaatcagat tcttagcctc actagtaatt tttggtgtaa 660

cgtatttcct tgcatatgct atatattttc ttaatgtatc tatatctata atattttttg 720

tggattttcc tgaatgtaca tctaatatgt aattcgcaag ttctctatct tgttcacctg 780

gttgatcctt tagtataaat attaggtcaa atcttgacaa gattgttgga ggtaggttga 840

tattatcaga cactggtctt tcacttatgt atctcccgaa tttcggattc cctgcagcta 900

taactgcagc cctagcgttt aatttagcta ctattccagc ttttgctatt gagactgtct 960

gttgttccat tgcctcatga atggctactc tatcttcatc cctcatcttg tctatttcat 1020

caataactgc tattccacca tcagcaagta ctaacgcacc agcttctaag taatactctc 1080

cagttccctt ttctcttact acagcagctg ttaaacctgc agctgtggat ccaattgcaa 1140

gatatgatca tacaatgcac cttccagaat tggtagaata attttggtat tatttattat 1200

ctcataagcc aaattttcat tgaacgaaag tacatcagaa aattctatta taagactttt 1260

tttcctatac gctactagct cgtttatcct ctcgatatat ttgttttgat tattgttacc 1320

cttgaaagtt gtcagaaact ctataaatac gtctctatag tcaatctgtt tactaggaat 1380

ttccaagaat tctcatatgg ctgccgcgcg gcaccaggcc gctgctgtga tgatgatgat 1440

gatggctgct gcccatggta tatctccttc ttaaagttaa acaaaattat ttctagaggg 1500

gaattgttat ccgctcacaa ttcccctata gtgagtcgta ttaatttcgc gggatcgaga 1560

tctcgatcct ctacgccgga cgcatcgtgg ccggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg 1620

ctggcgccta tatcgccgac atcaccgatg gggaagatcg ggctcgccac ttcgggctca 1680

tgagcgcttg tttcggcgtg ggtatggtgg caggccccgt ggccggggga ctgttgggcg 1740

ccatctcctt gcatgcacca ttccttgcgg cggcggtgct caacggcctc aacctactac 1800

tgggctgctt cctaatgcag gagtcgcata agggagagcg tcgagatccc ggacaccatc 1860

gaatggcgca aaacctttcg cggtatggca tgatagcgcc cggaagagag tcaattcagg 1920

gtggtgaatg tgaaaccagt aacgttatac gatgtcgcag agtatgccgg tgtctcttat 1980

cagaccgttt cccgcgtggt gaaccaggcc agccacgttt ctgcgaaaac gcgggaaaaa 2040

gtggaagcgg cgatggcgga gctgaattac attcccaacc gcgtggcaca acaactggcg 2100

ggcaaacagt cgttgctgat tggcgttgcc acctccagtc tggccctgca cgcgccgtcg 2160

caaattgtcg cggcgattaa atctcgcgcc gatcaactgg gtgccagcgt ggtggtgtcg 2220

atggtagaac gaagcggcgt cgaagcctgt aaagcggcgg tgcacaatct tctcgcgcaa 2280

cgcgtcagtg ggctgatcat taactatccg ctggatgacc aggatgccat tgctgtggaa 2340

gctgcctgca ctaatgttcc ggcgttattt cttgatgtct ctgaccagac acccatcaac 2400

agtattattt tctcccatga agacggtacg cgactgggcg tggagcatct ggtcgcattg 2460

ggtcaccagc aaatcgcgct gttagcgggc ccattaagtt ctgtctcggc gcgtctgcgt 2520

ctggctggct ggcataaata tctcactcgc aatcaaattc agccgatagc ggaacgggaa 2580

ggcgactgga gtgccatgtc cggttttcaa caaaccatgc aaatgctgaa tgagggcatc 2640

gttcccactg cgatgctggt tgccaacgat cagatggcgc tgggcgcaat gcgcgccatt 2700

accgagtccg ggctgcgcgt tggtgcggat atctcggtag tgggatacga cgataccgaa 2760

gacagctcat gttatatccc gccgttaacc accatcaaac aggattttcg cctgctgggg 2820

caaaccagcg tggaccgctt gctgcaactc tctcagggcc aggcggtgaa gggcaatcag 2880

ctgttgcccg tctcactggt gaaaagaaaa accaccctgg cgcccaatac gcaaaccgcc 2940

tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa 3000

agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt aagttagctc actcattagg caccgggatc 3060

tcgaccgatg cccttgagag ccttcaaccc agtcagctcc ttccggtggg cgcggggcat 3120

gactatcgtc gccgcactta tgactgtctt ctttatcatg caactcgtag gacaggtgcc 3180

ggcagcgctc tgggtcattt tcggcgagga ccgctttcgc tggagcgcga cgatgatcgg 3240

cctgtcgctt gcggtattcg gaatcttgca cgccctcgct caagccttcg tcactggtcc 3300

cgccaccaaa cgtttcggcg agaagcaggc cattatcgcc ggcatggcgg ccccacgggt 3360

gcgcatgatc gtgctcctgt cgttgaggac ccggctaggc tggcggggtt gccttactgg 3420

ttagcagaat gaatcaccga tacgcgagcg aacgtgaagc gactgctgct gcaaaacgtc 3480

tgcgacctga gcaacaacat gaatggtctt cggtttccgt gtttcgtaaa gtctggaaac 3540

gcggaagtca gcgccctgca ccattatgtt ccggatctgc atcgcaggat gctgctggct 3600

accctgtgga acacctacat ctgtattaac gaagcgctgg cattgaccct gagtgatttt 3660

tctctggtcc cgccgcatcc ataccgccag ttgtttaccc tcacaacgtt ccagtaaccg 3720

ggcatgttca tcatcagtaa cccgtatcgt gagcatcctc tctcgtttca tcggtatcat 3780

tacccccatg aacagaaatc ccccttacac ggaggcatca gtgaccaaac aggaaaaaac 3840

cgcccttaac atggcccgct ttatcagaag ccagacatta acgcttctgg agaaactcaa 3900

cgagctggac gcggatgaac aggcagacat ctgtgaatcg cttcacgacc acgctgatga 3960

gctttaccgc agctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca 4020

gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca 4080

gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga 4140

tagcggagtg tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac 4200

catatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct 4260

cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 4320

cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 4380

acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 4440

ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 4500

ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 4560

gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 4620

gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 4680

ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 4740

actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 4800

gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 4860

ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 4920

ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 4980

gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 5040

tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 5100

tcatgaacaa taaaactgtc tgcttacata aacagtaata caaggggtgt tatgagccat 5160

attcaacggg aaacgtcttg ctctaggccg cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta 5220

tatgggtata aatgggctcg cgataatgtc gggcaatcag gtgcgacaat ctatcgattg 5280

tatgggaagc ccgatgcgcc agagttgttt ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat 5340

gatgttacag atgagatggt cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc 5400

atcaagcatt ttatccgtac tcctgatgat gcatggttac tcaccactgc gatccccggg 5460

aaaacagcat tccaggtatt agaagaatat cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg 5520

ctggcagtgt tcctgcgccg gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc 5580

gatcgcgtat ttcgtctcgc tcaggcgcaa tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg 5640

agtgattttg atgacgagcg taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat 5700

aaacttttgc cattctcacc ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc acttgataac 5760

cttatttttg acgaggggaa attaataggt tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca 5820

gaccgatacc aggatcttgc catcctatgg aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta 5880

cagaaacggc tttttcaaaa atatggtatt gataatcctg atatgaataa attgcagttt 5940

catttgatgc tcgatgagtt tttctaagaa ttaattcatg agcggataca tatttgaatg 6000

tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga 6060

aattgtaaac gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt 6120

ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat 6180

agggttgagt gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa 6240

cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac catcacccta 6300

atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta aagggagccc 6360

ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc 6420

gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac 6480

acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcccat tcgcca 6526

<210> 2

<211> 95

<212> PRT

<213> 结核分枝杆菌

<400> 2

Met Ala Thr Ser Ser Asp Asp Ile Thr Ile Asn Arg His Pro Pro Leu

1 5 10 15

Asn Cys Ala Val Asn Arg His Asp Glu Ser Arg Arg Ser Pro Leu Arg

20 25 30

Arg Gly Leu Leu Ala Asn Gly Leu Arg Glu Arg Gln Ala Gly Ala Leu

35 40 45

Phe Glu Arg Tyr Glu Ser Gln Phe Asp Ser Phe Gly Tyr Ile Glu Lys

50 55 60

Val Arg Tyr Arg Gly Ser Gly Tyr Arg Val Glu Asp Val Tyr Ala Arg

65 70 75 80

Ala Asp Ser Gly Pro Ser Ala Gly Ala Glu Leu Pro Val Gly Pro

85 90 95

<210> 3

<211> 99

<212> PRT

<213> 结核分枝杆菌

<400> 3

Met Glu Lys Met Ser His Asp Pro Ile Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gln

1 5 10 15

Val Ser Asp Asn Ala Leu His Gly Val Thr Ala Gly Ser Thr Ala Leu

20 25 30

Thr Ser Val Thr Gly Leu Val Pro Ala Gly Ala Asp Glu Val Ser Ala

35 40 45

Gln Ala Ala Thr Ala Phe Thr Ser Glu Gly Ile Gln Leu Leu Ala Ser

50 55 60

Asn Ala Ser Ala Gln Asp Gln Leu His Arg Ala Gly Glu Ala Val Gln

65 70 75 80

Asp Val Ala Arg Thr Tyr Ser Gln Ile Asp Asp Gly Ala Ala Gly Val

85 90 95

Phe Ala Glu

Claims

1.一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，包括以下组份：

包被液：0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液；

洗涤液：含0.05% v/v吐温-20的PBS溶液；

封闭液：含5% w/v 脱脂牛奶的洗涤液；

终止液：2M H₂SO₄；

抗原Rv2309A，其序列为SEQ ID NO.2所示；

抗原Rv3872，其序列为SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述试剂盒在制备检测结核分枝杆菌试剂中的应用。