CN114480456A - 用于检测多种融合基因的标准质粒及检测试剂盒 - Google Patents

用于检测多种融合基因的标准质粒及检测试剂盒 Download PDF

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CN114480456A CN202111570087.2A CN202111570087A CN114480456A CN 114480456 A CN114480456 A CN 114480456A CN 202111570087 A CN202111570087 A CN 202111570087A CN 114480456 A CN114480456 A CN 114480456A
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熊术道
胡林辉
丁晨
丁洋洋
张佳丽
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Abstract

本发明提供一种用于检测白血病相关多种融合基因的标准质粒及检测试剂盒，所述标准质粒的序列如SEQ ID NO:7所示。所述用于检测融合基因的试剂盒，包括所述标准质粒，同时还包括检测相关融合基因的引物和探针，所述引物和探针序列由SEQ ID NO:8‑SEQ ID NO:25组成；以上序列中，SEQ ID NO:8‑10用于检测BCR/ABL(P190型)，SEQ ID NO:11‑13用于检测BCR/ABL(P210型)，SEQ ID NO:14‑16用于检测AML/ETO，SEQ ID NO:17‑19用于检测CBFB/MYH11，SEQ ID NO:20‑22用于检测TEL/AML，SEQ ID NO:23‑25用于检测PML/RARA(L型)。

Description

用于检测多种融合基因的标准质粒及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种用于检测白血病相关多种融合基因的标准质粒及检测试剂盒。
背景技术
在恶性肿瘤所致死亡率中，白血病占男性第八位(2.07％)，女性第十位(2.57％)，而且男性发病率及死亡率近10年有上升趋势。此外，在儿童及39岁以下人群中，白血病发病率及死亡率占第二位，对人们身心健康及社会经济发展危害极大。
因此，如何进一步提高白血病的精准诊疗水平，对白血病诊断、治疗及预后意义重大。白血病融合基因(fusion gene)系染色体结构发生易位、倒位、缺失、重复等畸变，融合而成新的基因，进而编码融合蛋白，其是白血病发生发展的分子生物学基础及特异性分子标志物。鉴于白血病融合基因等相关基因在白血病发病机制中的作用，利用这些标志可以诊断不同类型的白血病，评估其预后，指导临床治疗，监测治疗效果，同时也补充细胞形态学、免疫学及细胞遗传学即MIC检查的不足。因此，白血病相关基因的检测，对白血病分型诊断、治疗、预后及机制研究意义重大。
目前临床上常使用染色体核型分析、荧光原位杂交以及PCR等三种技术检测融合基因，但染色体核型分析及荧光原位杂交技术周期较长，对临床治疗指导较为滞后。与之相比，PCR较为迅速，1-2个工作日便可获得结果，用于指导临床。PCR检测融合基因可根据实验方法分为普通PCR及实时荧光定量PCR，其中，普通PCR检测步骤较长，需要琼脂糖电泳来判读实验结果，冗余的实验步骤容易产生实验误差。相较于普通PCR，实时荧光定量PCR在PCR反应结束后，即可判读实验结果，且检测灵敏度较普通PCR高。然而，白血病融合基因种类繁多，不同的融合基因需要不同的引物来扩增，不同类型的融合基因在不同的反应管内进行，检测结果受不同反应体系和步骤繁多等因素干扰，造成系统误差，难以及时为临床诊断以及实时监控提供精确、可信、有效的数据和报告，进而难以精确指导白血病的诊断、治疗及预后评估，具有明显的局限性。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了可以检测多种融合基因的荧光PCR检测试剂盒，解决了现有技术中白血病检测结果受不同反应体系和步骤繁多等因素干扰，造成系统误差，难以及时为临床过程提供精确诊断的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一方面，本发明提供了一种用于检测融合基因的标准质粒，所述质粒的序列如SEQID NO:7所示。
另一方面，本发明提供了一种用于检测融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的标准质粒，所述质粒的序列如SEQ ID NO:7所示。
优选地，所述试剂盒还包括检测相关融合基因的引物和探针，所述融合基因包括BCR/ABL(P190型)，检测所述BCR/ABL(P190型)融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO:8所示，下游引物序列如SEQ ID NO:9所示，探针序列如SEQ ID NO:10所示。
优选地，所述试剂盒还包括检测相关融合基因的引物和探针，所述融合基因包括BCR/ABL(P210型)，检测所述BCR/ABL(P210型)融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO:11所示，下游引物序列如SEQ ID NO:12所示，探针序列如SEQ ID NO:13所示。
优选地，所述试剂盒还包括检测相关融合基因的引物和探针，所述融合基因包括AML/ETO，检测所述AML/ETO融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO:14所示，下游引物序列如SEQ ID NO:15所示，探针序列如SEQ ID NO:16所示。
优选地，所述试剂盒还包括检测相关融合基因的引物和探针，所述融合基因包括CBFB/MYH11，检测所述CBFB/MYH11融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO:17所示，下游引物序列如SEQ ID NO:18所示，探针序列如SEQ ID NO:19所示。
优选地，所述试剂盒还包括检测相关融合基因的引物和探针，所述融合基因包括TEM/AML，检测所述TEM/AML融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO:20所示，下游引物序列如SEQ ID NO:21所示，探针序列如SEQ ID NO:22所示。
优选地，所述试剂盒还包括检测相关融合基因的引物和探针，所述融合基因包括PML/RARA(L型)，检测所述PML/RARA(L型)融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO:23所示，下游引物序列如SEQ ID NO:24所示，探针序列如SEQ ID NO:25所示。
优选地，所述试剂盒还包括one-step RT-PCR mix、酶、ddH2O。
(三)有益效果
本发明实施例提供了一种用于检测多种融合基因的标准质粒及检测试剂盒。具备以下有益效果：
本发明提供了一种用于检测多种融合基因的标准质粒及其制备方法，能够用于在定量检测人的骨髓或外周血标本中的白血病相关融合基因中BCR-ABL(P210及P190型)、AML-ETO、TEL/AML、CBFB/MYH11和PML/RARA融合基因标准曲线建立；本质粒包含了常见的融合基因片段，有效地提高了检测效率及精确度，降低人为操作失误，避免出现多质粒污染。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1PUC57质粒；
图2BCR/ABL-P190标准曲线；
图3BCR/ABL-P210标准曲线；
图4AML/ETO标准曲线；
图5CBFB/MYH11标准曲线；
图6TEL/AML标准曲线；
图7PML/RARA(L型)标准曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明合成并提供了一种包含多个融合基因片段的标准质粒，该质粒包含以下基因，BCR/ABL(P210型)，BCR/ABL(P190型)，TEM/AML，AML/ETO，CBFB/MYH11，PML/RARA(L型)，所述基因序列分别为SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6。SEQ ID NO:7为PUC57质粒序列。
所述用于检测融合基因的标准质粒的制备方法如下所述，包括：
(1)在NCBI查询以上融合基因序列，并合成基因片段；
(2)根据不同融合基因片段，分别设计引物和探针，引物及探针序列如表1所示：
表1
SEQID8 P190-F GCAGAACTCGCAACAGTCCT
SEQID9 P190-R GATGCTACTGGCCGCTGAA
SEQID10 P190探针 CTGCGTCTCCATGGAA
SEQID11 P210-F AGCATTCCGCTGACCATCAA
SEQID12 P210-R CCGCTGAAGGGCTTTTGAAC
SEQID13 P210探针 AAGATGATGAGTCTCC
SEQID14 AML/ETO-F AGGTTTGTCGGTCGAAGTGG
SEQID15 AML/ETO-R CCACAGGTGAGTCTGGCATT
SEQID16 AML/ETO探针 TGACCATCACTGTCTTC
SEQID17 CBF-F GGCTGGATTGATCTCCAAAGAC
SEQID18 CBF-R TCTTGTCTAGGTTCGCCTTGG
SEQID19 CBF探针 CTGGATGGTATGGGCTGT
SEQID20 TEL/AML-F AGGGAAGCCCATCAACCTCT
SEQID21 TEL/AML-R ATCGTGGACGTCTCTAGAAGGA
SEQID22 TEL/AML探针 TGGTCTCTGTCTCCC
SEQID23 PMLL-F ACGACAGCCCAGAAGAGGAA
SEQID24 PMLL-R CAAGGCTTGTAGATGCGGGG
SEQID25 PMLL探针 TGCAGCCAGACCC
(3)将步骤(1)中所述的基因片段插入PUC57质粒中，得到标准质粒，如图1所示；
(4)将上述制备得到的标准质粒加入到检测融合基因的试剂盒中，以便方便快捷的进行使用。
实施例2：
对实施例1制备得到的标准质粒进行BCR/ABL(P190型)融合基因进行线性验证和灵敏度验证。具体方法为：
1.对制备得到的标准质粒进行测定，得到标准质粒的浓度、吸光度和拷贝数，拷贝数的计算公式为50*A260吸光度*6.02*1014/((质粒序列长度+基因序列长度)*660)；其中使用nanodrop2000测定标准质粒的浓度、A260吸光度；
2.根据上述制备到的拷贝数，将标准质粒进行梯度稀释，以得到不同拷贝数的标准质粒(拷贝数从1*106递减为1*101个/ml)；
3.按照以下荧光定量PCR体系行PCR反应(12.5μl one-step RT-PCR mix、2μl逆转录酶及高保真性Taq DNA聚合酶混合物、6μl ddH2O、0.5μlP190-F、0.5μl P190-R、1μl P190探针、1μl梯度稀释后的标准质粒(拷贝数从1*106递减为1*101个/ml)行PCR反应；
4.PCR具体反应条件为：1.48℃10min，2.95℃10min，3.95℃15s，60℃45s循环40次(60℃采集荧光)。
5.验证结果如图2，公式为y＝-0.3324x+10.811，x为标本的CT值，y为拷贝数的对数。
实施例3：
对实施案例1制备得到的标准质粒进行BCR/ABL(P210型)融合基因进行线性验证和灵敏度验证。具体方法为：
1.对制备得到的标准质粒进行测定，得到标准质粒的浓度、吸光度和拷贝数，拷贝数的计算公式为50*A260吸光度*6.02*1014/((质粒序列长度+基因序列长度)*660)；其中使用nanodrop2000测定标准质粒的浓度、A260吸光度；
2.根据上述制备到的拷贝数，将标准质粒进行梯度稀释，以得到不同拷贝数的标准质粒(拷贝数从1*106递减为1*101个/ml)；
3.按照以下荧光定量PCR体系行PCR反应(12.5μl one-step RT-PCR mix、2μl逆转录酶及高保真性Taq DNA聚合酶混合物、6μl ddH2O、0.5μlP210-F、0.5μl P210-R、1μl P210探针、1μl梯度稀释后的标准质粒(拷贝数从1*106递减为1*101个/ml)进行PCR反应。
4.PCR具体反应条件为：1.48℃10min，2.95℃10min，3.95℃15s，60℃45s循环40次(60℃采集荧光)。
5.验证结果如图3，公式为y＝-0.313x+10.51，x为标本的CT值，y为拷贝数的对数。
实施例4：
对实施案例1制备得到的标准质粒进行AML/ETO融合基因进行线性验证和灵敏度验证。具体方法为：
1.对制备得到的标准质粒进行测定，得到标准质粒的浓度、吸光度和拷贝数，拷贝数的计算公式为50*A260吸光度*6.02*1014/((质粒序列长度+基因序列长度)*660)；其中使用nanodrop2000测定标准质粒的浓度、A260吸光度；
2.根据上述制备到的拷贝数，将标准质粒进行梯度稀释，以得到不同拷贝数的标准质粒(拷贝数从1*106递减为1*101个/ml)；
3.按照以下荧光定量PCR体系行PCR反应(12.5μl one-step RT-PCR mix、2μl逆转录酶及高保真性Taq DNA聚合酶混合物、6μl ddH2O、0.5μlAML/ETO-F、0.5μlAML/ETO-R、1μlAML/ETO探针、1μl梯度稀释后的标准质粒(拷贝数从1*106递减为1*101个/ml)行PCR反应；
4.PCR具体反应条件为：1.48℃10min，2.95℃10min，3.95℃15s，60℃45s循环40次(60℃采集荧光)。
5.验证结果如图4，公式为y＝-0.3009x+10.224，x为标本的CT值，y为拷贝数的对数。
实施例5：
对实施案例1制备得到的标准质粒进行CBF/MYH11进行线性验证和灵敏度验证。具体方法为：
1.对制备得到的标准质粒进行测定，得到标准质粒的浓度、吸光度和拷贝数，拷贝数的计算公式为50*A260吸光度*6.02*1014/((质粒序列长度+基因序列长度)*660)；其中使用nanodrop2000测定标准质粒的浓度、A260吸光度；
2.根据上述制备到的拷贝数，将标准质粒进行梯度稀释，以得到不同拷贝数的标准质粒(拷贝数从1*106递减为1*101个/ml)；
3.按照以下荧光定量PCR体系行PCR反应(12.5μl one-step RT-PCR mix、2μl逆转录酶及高保真性Taq DNA聚合酶混合物、6μl ddH2O、0.5μlCBF-F、0.5μl CBF-R、1μl CBF探针、1μl梯度稀释后的标准质粒(拷贝数从1*106递减为1*101个/ml)行PCR反应；
4.PCR具体反应条件为：1.48℃10min，2.95℃10min，3.95℃15s，60℃45s循环40次(60℃采集荧光)。
5.验证结果如图5，公式为y＝-0.3241x+10.825，x为标本的CT值，y为拷贝数的对数。
实施例6：
对实施案例1制备得到的标准质粒进行TEL/AML融合基因进行线性验证和灵敏度验证。
1.对制备得到的标准质粒进行测定，得到标准质粒的浓度、吸光度和拷贝数，拷贝数的计算公式为50*A260吸光度*6.02*1014/((质粒序列长度+基因序列长度)*660)；其中使用nanodrop2000测定标准质粒的浓度、A260吸光度；
2.根据上述制备到的拷贝数，将标准质粒进行梯度稀释，以得到不同拷贝数的标准质粒(拷贝数从1*106递减为1*101个/ml)；
3.按照以下荧光定量PCR体系行PCR反应(12.5μl one-step RT-PCR mix、2μl逆转录酶及高保真性Taq DNA聚合酶混合物、6μl ddH2O、0.5μlTEL/AML-F、0.5μl TEL/AML-R、1μl TEL/AML探针、1μl梯度稀释后的标准质粒(拷贝数从1*106递减为1*101个/ml)行PCR反应；
4.PCR具体反应条件为：1.48℃10min，2.95℃10min，3.95℃15s，60℃45s循环40次(60℃采集荧光)。
5.验证结果如图6，公式为y＝-0.3055x+10.311，x为标本的CT值，y为拷贝数的对数。
实施例7：
对实施案例1制备得到的标准质粒进行PML/RARA融合基因进行线性验证和灵敏度验证。
1.对制备得到的标准质粒进行测定，得到标准质粒的浓度、吸光度和拷贝数，拷贝数的计算公式为50*A260吸光度*6.02*1014/((质粒序列长度+基因序列长度)*660)；其中使用nanodrop2000测定标准质粒的浓度、A260吸光度；
2.根据上述制备到的拷贝数，将标准质粒进行梯度稀释，以得到不同拷贝数的标准质粒(拷贝数从1*106递减为1*101个/ml)；
3.按照以下荧光定量PCR体系行PCR反应(12.5μl one-step RT-PCR mix、2μl逆转录酶及高保真Taq DNA聚合酶混合物、6μl ddH2O、0.5μlPMLL-F、0.5μl PMLL-R、1μl PMLL探针、1μl梯度稀释后的标准质粒(拷贝数从1*106递减为1*101个/ml)行PCR反应；
4.PCR具体反应条件为：1.48℃10min，2.95℃10min，3.95℃15s，60℃45s循环40次(60℃采集荧光)。
5.验证结果如图7，公式为y＝-0.301x+11.046，x为标本的CT值，y为拷贝数的对数。
本发明提供了一种用于检测多种融合基因的标准质粒及其制备方法：
1.首先在于针对现有技术中的不足，合成了一种包含多种融合基因序列(BCR/ABL(P210型)，BCR/ABL(P190型)，TEM/AML，AML/ETO,CBFB/MYH11，PML/RARA(L型)，)的融合质粒(具体序列见SEQ ID NO:1-7)，并制备成标准品。
2.针对以上融合基因，新设计合成了引物和探针序列，其序列由SEQ ID NO:8-SEQID NO:25组成；以上序列中，SEQ IDNO:8-10用于检测BCR/ABL(P190型)，SEQ IDNO:11-13用于检测BCR/ABL(P210型)，SEQ ID NO:14-16用于检测AML/ETO，SEQ ID NO:17-19用于检测CBFB/MYH11，SEQ ID NO:20-22用于检测TEL/AML，SEQ ID NO:23-25用于检测PML/RARA(L型)；以上序列中SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:25均为探针序列，荧光基因均为BHQ基团。
3.本申请提供的质粒能够用于在定量检测人的骨髓或外周血标本中的白血病相关融合基因中BCR-ABL(P210及P190型)、AML-ETO、TEL/AML、CBFB/MYH11和PML/RARA融合基因标准曲线建立；有效地提高了检测效率及精确度，降低人为操作失误，避免出现多质粒污染；标准质粒的最低检出拷贝数为1*101个/ml；操作简单，不易污染，检测范围大，能够有效降低检测成本。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽医科大学第二附属医院
<120> 用于检测多种融合基因的标准质粒及检测试剂盒
<160> 25
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 464
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
gaagtgtttc agaagcttct ccctgacatc cgtggagctg cagatgctga ccaactcgtg 60
tgtgaaactc cagactgtcc acagcattcc gctgaccatc aataaggaag atgatgagtc 120
tccggggctc tatgggtttc tgaatgtcat cgtccactca gccactggat ttaagcagag 180
ttcaaaagcc cttcagcggc cagtagcatc tgactttgag cctcagggtc tgagtgaagc 240
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<211> 568
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
cgcaccagga gaacaaccac caggagtcct accctctgtc agtgtctccc atggagaata 60
atcactgccc agcgtcctcc gagtcccacc cgaagccatc cagcccccgg caggagagca 120
cacgcgtgat ccagctgatg cccagcccca tcatgcaccc tctgatcctg aacccccggc 180
actccgtgga tttcaaacag tccaggctct ccgaggacgg gctgcatagg gaagggaagc 240
ccatcaacct ctctcatcgg gaagacctgg cttacatgaa ccacatcatg gtctctgtct 300
ccccgcctga agagcacgcc atgcccattg ggagaatagc agaatgcata cttggaatga 360
atccttctag agacgtccac gatgccagca cgagccgccg cttcacgccg ccttccaccg 420
cgctgagccc aggcaagatg agcgaggcgt t 451
<210> 4
<211> 443
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
gatggctggc aatgatgaaa actactcggc tgagctgaga aatgctaccg cagccatgaa 60
gaaccaggtt gcaagattta atgacctcag gtttgtcggt cgaagtggaa gagggaaaag 120
cttcactctg accatcactg tcttcacaaa cccaccgcaa gtcgccacct accacagagc 180
catcaaaatc acagtggatg ggccccgaga acctcgaaat cgtactgaga agcactccac 240
aatgccagac tcacctgtgg atgtgaagac gcaatctagg ctgactcctc caacaatgcc 300
acctccccca actactcaag gagctccaag aaccagttca tttacaccga caacgttaac 360
taatggcacg agccattctc ctacagcctt gaatggcgcc ccctcaccac ccaatggctt 420
cagcaatggg ccttcctctt ctt 443
<210> 5
<211> 1047
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
ctgctggagg ctgtggacgc gcggtaccag cgcgactacg aggagatggc cagtcggctg 60
ggccgcctgg atgctgtgct gcagcgcatc cgcacgggca gcgcgctggt gcagaggatg 120
aagtgctacg cctcggacca ggaggtgctg gacatgcacg gtttcctgcg ccaggcgctc 180
tgccgcctgc gccaggagga gccccagagc ctgcaagctg ccgtgcgcac cgatggcttc 240
gacgagttca aggtgcgcct gcaggacctc agctcttgca tcacccaggg gaaagatgca 300
gctgtatcca agaaagccag cccagaggct gccagcactc ccagggaccc tattgacgtt 360
gacctgcccg aggaggcaga gagagtgaag gcccaggttc aggccctggg gctggctgaa 420
gcccagccta tggctgtggt acagtcagtg cccggggcac accccgtgcc agtgtacgcc 480
ttctccatca aaggcccttc ctatggagag gatgtctcca atacaacgac agcccagaag 540
aggaagtgca gccagaccca gtgccccagg aaggtcatca agatggagtc tgaggagggg 600
aaggaggcaa ggttggctcg gagctccccg gagcagccca ggcccagcac ctccaaggca 660
gtctcaccac cccacctgga tggaccgcct agccccagga gccccgtcat aggaagtgag 720
gtcttcctgc ccaacagcaa ccacgtggcc agtggcgccg gggaggcagc cattgagacc 780
cagagcagca gttctgaaga gatagtgccc agccctccct cgccaccccc tctaccccgc 840
atctacaagc cttgctttgt ctgtcaggac aagtcctcag gctaccacta tggggtcagc 900
gcctgtgagg gctgcaaggg cttcttccgc cgcagcatcc agaagaacat ggtgtacacg 960
tgtcaccggg acaagaactg catcatcaac aaggtgaccc ggaaccgctg ccagtactgc 1020
cgactgcaga agtgctttga agtgggc 1047
<210> 6
<211> 1399
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
cagggagaac agcgacaaac acctagccga gagtatgtcg acttagaaag agaagcaggc 60
aaggtatatt tgaaggctcc catgattctg aatggagtct gtgttatctg gaaaggctgg 120
attgatctcc aaagactgga tggtatgggc tgtctggagt ttgatgagga gcgagcccag 180
caggaggatg cattagcaca acaggccttt gaagaggctc ggagaaggac acgcgaattt 240
gaagatagag acaggtctca tcgggaggaa atggaggcca aggcgaacct agacaagaat 300
aagcagacgc tggagaaaga gaacgcagac ctggccgggg agctgcgggt cctgggccag 360
gccaagcagg aggtggaaca taagaagaag aagctggagg cgcaggtgca ggagctgcag 420
tccaagtgca gcgatgggga gcgggcccgg gcggagctca atgacaaagt ccacaagctg 480
cagaatgaag ttgagagcgt cacagggatg cttaacgagg ccgaggggaa ggccattaag 540
ctggccaagg acgtggcgtc cctcagttcc cagctccagg acacccagga gttgcttcaa 600
gaagaaaccc ggcagaagct caacgtgtct acgaagctgc gccagctgga ggaggagcgg 660
aacagcctgc aagaccagct ggacgaggag atggaggcca agcagaacct ggagcgccac 720
atctccactc tcaacatcca gctctccgac tcgaagaaga agctgcagga ctttgccagc 780
accgtggaag ctctggaaga ggggaagaag aggttccaga aggagatcga gaacctcacc 840
cagcagtacg aggagaaggc ggccgcttat gataaactgg aaaagaccaa gaacaggctt 900
cagcaggagc tggacgacct ggttgttgat ttggacaacc agcggcaact cgtgtccaac 960
ctggaaaaga agcagaggaa atttgatcag ttgttagccg aggagaaaaa catctcttcc 1020
aaatacgcgg atgagaggga cagagctgag gcagaagcca gggagaagga aaccaaggcc 1080
ctgtccctgg ctcgggccct tgaagaggcc ttggaagcca aagaggaact cgagcggacc 1140
aacaaaatgc tcaaagccga aatggaagac ctggtcagct ccaaggatga cgtgggcaag 1200
aacgtccatg agctggagaa gtccaagcgg gccctggaga cccagatgga ggagatgaag 1260
acgcagctgg aagagctgga ggacgagctg caagcctcgg aggacgccaa actgcggctg 1320
gaagtcaaca tgcaggcgct caagggccag ttcgaaaggg atctccaagc ccgggacgag 1380
cagaatgagg agaagagga 1399
<210> 7
<211> 2626
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 7
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagactgtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtatt gggatatccc 420
aatggcgcgc cgagcttggc tcgagcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat 480
ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc 540
taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga 600
aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 660
attgggcgct gttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 720
cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 780
gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 840
ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 900
agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 960
tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 1020
ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 1080
gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 1140
ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 1200
gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 1260
aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg 1320
aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 1380
ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 1440
gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 1500
gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa 1560
tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttagaaaaac 1620
tcatcgagca tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat accatatttt 1680
tgaaaaagcc gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga ggcagttcca taggatggca 1740
agatcctggt atcggtctgc gattccgact cgtccaacat caatacaacc tattaatttc 1800
ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac tgaatccggt 1860
gagaatggca aaagtttatg catttctttc cagacttgtt caacaggcca gccattacgc 1920
tcgtcatcaa aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca ttcgtgattg cgcctgagcg 1980
aaacgaaata cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa caggaatcga atgcaaccgg 2040
cgcaggaaca ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg aatcaggata ttcttctaat 2100
acctggaatg ctgttttccc agggatcgca gtggtgagta accatgcatc atcaggagta 2160
cggataaaat gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt tagtctgacc 2220
atctcatctg taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat gtttcagaaa caactctggc 2280
gcatcgggct tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg attgcccgac attatcgcga 2340
gcccatttat acccatataa atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg cctagagcaa 2400
gacgtttccc gttgaatatg gctcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 2460
cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 2520
ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc 2580
atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct tttgtc 2626
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 8
gcagaactcg caacagtcct 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 9
gatgctactg gccgctgaa 19
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 10
ctgcgtctcc atggaa 16
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 11
agcattccgc tgaccatcaa 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 12
ccgctgaagg gcttttgaac 20
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 13
aagatgatga gtctcc 16
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 14
aggtttgtcg gtcgaagtgg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 15
ccacaggtga gtctggcatt 20
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 16
tgaccatcac tgtcttc 17
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 17
ggctggattg atctccaaag ac 22
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 18
tcttgtctag gttcgccttg g 21
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 19
ctggatggta tgggctgt 18
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 20
agggaagccc atcaacctct 20
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 21
atcgtggacg tctctagaag ga 22
<210> 22
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 22
tggtctctgt ctccc 15
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 23
acgacagccc agaagaggaa 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 24
caaggcttgt agatgcgggg 20
<210> 25
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 25
tgcagccaga ccc 13

Claims (9)

1.一种用于检测融合基因的标准质粒，其特征在于，所述质粒的序列如SEQ ID NO:7所示。
2.一种用于检测融合基因的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的标准质粒。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测相关融合基因的引物和探针，所述融合基因包括BCR/ABL(P190型)，检测所述BCR/ABL(P190型)融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO:8所示，下游引物序列如SEQ ID NO:9所示，探针序列如SEQ IDNO:10所示。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测相关融合基因的引物和探针，所述融合基因包括BCR/ABL(P210型)，检测所述BCR/ABL(P210型)融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO:11所示，下游引物序列如SEQ ID NO:12所示，探针序列如SEQ IDNO:13所示。
5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测相关融合基因的引物和探针，所述融合基因包括AML/ETO，检测所述AML/ETO融合基因的上游引物序列如SEQID NO:14所示，下游引物序列如SEQ ID NO:15所示，探针序列如SEQ ID NO:16所示。
6.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测相关融合基因的引物和探针，所述融合基因包括CBFB/MYH11，检测所述CBFB/MYH11融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO:17所示，下游引物序列如SEQ ID NO:18所示，探针序列如SEQ ID NO:19所示。
7.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测相关融合基因的引物和探针，所述融合基因包括TEM/AML，检测所述TEM/AML融合基因的上游引物序列如SEQID NO:20所示，下游引物序列如SEQ ID NO:21所示，探针序列如SEQ ID NO:22所示。
8.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测相关融合基因的引物和探针，所述融合基因包括PML/RARA(L型)，检测所述PML/RARA(L型)融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO:23所示，下游引物序列如SEQ ID NO:24所示，探针序列如SEQ ID NO:25所示。
9.如权利要求2-8任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括one-step RT-PCR mix、逆转录酶及高保真性Taq DNA聚合酶混合物、ddH2O。
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