CN109321576A

CN109321576A - 一种无腺体低棉酚棉花种质的创制方法

Info

Publication number: CN109321576A
Application number: CN201811271189.2A
Authority: CN
Inventors: 郭小平; 张军
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-10-29
Filing date: 2018-10-29
Publication date: 2019-02-12

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种无腺体低棉酚棉花种质的创制方法。本发明提供利用CRISPR‑Cas9系统创造无腺体低棉酚棉花材料的方法。选取特异针对控制棉花腺体发育形成GPGF基因的靶位点sgRNA1、sgRNA2，与Cas9蛋白在棉花内稳定表达，获得无腺体低棉酚棉花。转基因再生植株的无腺体表型可稳定遗传至下一代，且棉酚含量下降明显。该发明的优点在于克服了传统杂交方法创造低酚棉种质资源时间长和不稳定的缺陷，并且不限于棉花的受体品种。

Description

一种无腺体低棉酚棉花种质的创制方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种无腺体低棉酚棉花种质的创制方法。

背景技术

棉花腺体通常以褐色或黑褐色点状分布在茎秆、叶片、棉铃、种子等部位和器官(祝水金和季道藩 2001)。腺体中含量最多的代谢物是棉酚，可以达到35～50％，还有倍半萜、单萜等次生代谢物。自1978 年由湖南棉花选育我国第一个低酚棉品种无酚棉1号,至今已有种植区域包括西北内陆、长江流域、黄河流域等地区三十多个低酚棉品种通过审定(马丹2015)。大部分的无腺体低酚棉品种的腺体性状是由两对隐性基因gl₂gl₂gl₃gl₃控制的，在种植过程中容易发生天然异交，造成品种纯度下降，难以长期大面积推广。1999 年，樊云茜等利用显性无腺体基因Gl₂ ^e培育成特早熟显性无腺体棉花—汾显无1号(樊云茜et al1999)。显性无腺体的品种解决了双隐性无腺体品种异花授粉造成纯度下降的问题。2004年，祝水金等人将比克氏棉中的腺体延缓形成的性状转移到栽培种，种子萌发前子叶边缘含有少量腺体且棉酚含量较低，种子萌发后各个组织均含有腺体，棉酚含量正常。南京农业大学张天真团队(Ma et al.2016)利用TM-1和海1(具有 Gl₂ ^e基因)构建了F2群体，SSR分子标记精细定位到Gl₂ ^e基因，其在两个引物w5383和w7954之间的1.1cM 内。通过表达分析鉴定7个候选基因，筛选到ORF2的一个bHLH转录因子，命名为GoPGF(Gossypium Pigment GlandFormation gene)。病毒介导的基因沉默GoPGF基因后，植株无腺体，棉酚含量极低。隐性纯合无腺体植株的GoPGF_A12^m(gl2)、GoPGF_A12^m(gl2)两个基因因为分别有“T”、“A”单碱基插入突变导致提前终止转录。但是腺体是如何发育的，腺体与棉酚合成之间的关系尚未解析。

随着棉花分子生物学的发展，棉酚合成路径、腺体形成基因逐渐清晰，利用基因工程技术创造种子低酚植株高酚的材料更加容易。2006年Sunilkumar利用种子特异干涉技术降低种子中杜松烯合酶(CAD) 表达量，抑制棉酚合成，创造了种子低酚植株高酚的材料(Sunilkumar et al 2006)。CRISPR/Cas9技术使基因定点突变变得十分简单快捷、方便且具有较高的突变效率，使其成为了科研工作者首选的基因定点修饰的技术之一，越来越广泛地应用于动植物研究中。

本申请的发明人所在团队在已有的CRISPR基础上对GoPGF进行敲除，获得无腺体植株，对培育无腺体无棉酚新品种、研究腺体与棉酚的关系具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有杂交技术存在的缺陷，提供一种快速创制无腺体无棉酚棉花种质的方法。本发明基于pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体(Wang et al.2017)构建，针对GoPGF基因的基因编辑载体来转化棉花，创造无腺体无棉酚棉花种质材料。

本发明的技术方案如下所述：

一种无腺体低棉酚棉花种质的创制方法，包括下列步骤：

(1)在陆地棉GoPGF保守区域选择如序列表SEQ ID NO：1所示的Gh_A12G2172基因，序列表SEQ ID NO：2所示的Gh_D12G2351基因共有的靶位点sgRNA1、sgRNA2；所述的sgRNA1、sgRNA2的序列为：

sgRNA1：ATTTGGGGTTGGGAATCAT，

sgRNA2：TTTCTACGCACTTCGTTCCG；

(2)利用PCR将sgRNA1-guidRNA、sgRNA2-guidRNA串连，然后通过一步克隆法构建到CRISPR/Cas9 载体，得到高效转化载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ，该转化载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示；

(3)利用农杆菌介导的方法转化棉花(例如陆地棉品种豫668，实施本发明不限于该棉种和该品种)，得到无腺体低棉酚棉花植株；

(4)通过T0代单株测序、酶切、高通量测序验证GoPGF基因产生编辑并无脱靶现象；

(5)通过对T1代单株Southern Blot检测、测序鉴定本发明的基因编辑方法的可遗传性；

(6)通过液相色谱法测试鉴定棉花种质材料中的棉酚含量，筛选得到新的棉花种质材料。

本发明的高效转化载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ在棉花转基因中的应用。

本发明的有益效果：

(1)被发明克隆的sgRNA1、sgRNA2具有较高特异性核编辑效率。

(2)本发明高效获得无腺体表型植株，并且可遗传至后代。

(3)本发明的转化植株叶片中棉酚的含量下降98.8％。

附图说明

图1：是本发明的T0代植株Cas9阳性检测、GoPGF基因扩增、酶切检测的电泳图；附图标记说明：泳道1为5K的maker；泳道2、3为CK、WT对照；泳道4～15为不同上样单株，Cas9为Cas9阳性检测；GoPGF为GoPGF序列扩增；sgRNA1为第一个靶标sgRNA1位点侧翼序列，-表示没有酶切，+表示酶切； sgRNA2为第一个靶标sgRNA2位点侧翼序列，-表示没有酶切，+表示酶切。

图2：是本发明的T0代单株Southern Blot检测结果。附图标记说明：第1泳道为地高辛maker；第 2～12泳道为不同上样单株。

图3：是本发明的m4、m9单株GoPGF基因序列编辑展示。附图标记说明：WT野生型序列，PAM: 方框表示PAM区，下划线表示sgRNA序列；-表示碱基缺失，+表示碱基插入；图3中的A图显示m9单株sgRNA1的编辑情况，有6、29、50个碱基缺失，图3中的B图显示m9单株sgRNA2的编辑情况，有 1、24个碱基缺失，1个碱基插入；图3中的C图为m9单株sgRNA1的测序荧光峰图，可以清洗显示有 50个碱基缺失；图3中的D图显示m9单株sgRNA2的的测序荧光峰图，有24个碱基缺失；图3中的E 图显示m4单株sgRNA1的编辑情况，有3、59个碱基缺失，1个碱基插入；图3中的F图显示m4单株 sgRNA2的编辑情况，有1、4个碱基缺失，1个碱基插入；G为m4单株sgRNA1的测序荧光峰图，可以清洗显示有59个碱基缺失；H为m4单株sgRNA2的测序荧光峰图，可以清洗显示有1个碱基缺失。

图4：是本发明的GoPGF编辑后表型图。附图标记说明：图4中的A图、C图、E图、G图、I图和K图分别显示野生型单株的叶片、花蕾、茎、萼片、棉铃、种子具有黑色斑点的腺体结构；图4中的B 图、D图、F图、H图、J图和L图分别显示GoPGF突变单株的叶片、花蕾、茎、萼片、棉铃、种子没有黑色斑点的腺体结构。

图5：是本发明的T1代植株叶片棉酚含量检测，WT代表野生型单株，GoPGF为突变单株。

图6：是本发明的GoPGF编辑T1代阳性检测及拷贝数检测。附图标记说明：图6中的A图是Cas9 阳性检测；图6中的B图是GoPGF编辑T1代拷贝数的检测的胶图。第1泳道为Marker；第2、3泳道分别为阳性、阴性对照；第4～11泳道分别为m3产生的T1代单株。

图7：是本发明的m3T0、T1代基因编辑展示。附图标记说明：WT野生型序列，m3_A、m3_D分别代表At、Dt亚基因组，PAM:方框表示PAM区，下划线表示sgRNA序列；-表示碱基缺失，+表示碱基插入；图7中的A图是m3T0代sgRNA1基因编辑，大部分是碱基缺失，有一条序列碱基插入。图7中的 B图是m3T0代sgRNA2基因编辑.，大部分是碱基缺失，有四条序列碱基插入；图7中的C图、图7中的D图分别是m3T1代A/D亚组sgRNA1、sgRNA2基因编辑类型。

具体实施方式

对本发明中序列表的说明：

序列表SEQ ID NO：1是Gh_A12G2172的核苷酸序列。长度为1428bp

序列表SEQ ID NO：2是Gh_D12G2351的核苷酸序列。长度为1428bp

序列表SEQ ID NO：3是高效转化载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ的核苷酸序列。16241bp。

序列表SEQ ID NO：4是cas9的核苷酸序列。序列长度为999bp。

序列表SEQ ID NO：5是sgRNA1靶点的侧翼序列。长度为490bp。

序列表SEQ ID NO：6是sgRNA2靶点的侧翼序列。长度为489bp。

序列表SEQ ID NO：7是检测GoPGF编辑的核苷酸序列。长度为658bp。

实施例1：sgRNA的设计

1.GoPGF基因的sgRNA设计

在陆地棉GoPGF(Gh_A12G2172、Gh_D12G2351)保守区域选择Gh_A12G2172(序列如序列表SEQ ID NO：1所示)、Gh_D12G2351(序列如序列表SEQ ID NO：2所示)共有的靶位点sgRNA1(序列如表 1所示)、sgRNA2(序列如表1所示)，并且分别含有BfuAI、BtgI酶切位点，方便后续酶切验证。

表1 GoPGF基因的sgRNA序列

表1说明：：下划线处为酶切位点；斜体+方框处的碱基为PAM。

实施例2：CRISPR/Cas9载体构建

利用重叠延伸PCR将两个sgRNA与tRNA、gRNA进行串连，然后用一步克隆法构建到CRISPR/Cas9 载体上。

设计如下引物序列：

正向引物P1:AAGCATCAGATGGGCAAACAAAGCACCAGTGGTCTAG，

反向引物P2:ATGATTCCCAACCCCAAATCTGCACCAGCCGGGAAT；

正向引物P3:GATTTGGGGTTGGGAATCATGTTTTAGAGCTAGAAATA，

反向引物P4:CGGAACGAAGTGCGTAGAAATGCACCAGCCGGGAAT；

正向引物P5:AAGCATCAGATGGGCAAACAAA，

反向引物P6:TTCTAGCTCTAAAACCGGAACGAAGTGCGTAGAAA；

按如下步骤：

(1)第一次PCR扩增出两个小片段，其中第一个片段应用引物P1、P2连接tRNA、sgRNA1，第二个片段用引物P3、P4连接sgRNA1、gRNA、tRNA、sgRNA2，PCR反应体系如表2所示。

表2 PCR反应体系

PCR条件：95℃5min，95℃30sec，55℃30sec，72℃20sec，共3个循环；然后95℃30sec， 60℃30sec，72℃20sec，共27个循环，72℃5min，15℃，保存。

(2)利用重叠延伸PCR将片段1和2拼接，产生片段3PCR反应体系如表3所示。

表3 PCR反应体系

PCR条件：95℃5min，95℃30sec，59℃30sec，72℃20sec，共28个循环，72℃5min，15℃保存。

(3)载体酶切(BsaI购自北京NEB公司，货号：R3733L)，酶切体系如表4所示：

表4 酶切体系

37℃下孵育5h。

(4)连接(ClonExpress Entry One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司，货号： C114-01/02)连接体系如表5所示：

表5 连接体系

37℃孵育30min，冰上静置5min。

(5)热击至感受态，卡那霉素筛选，PCR阳性鉴定，U6-7F作正向引物测序(GCrich)。

U6-7 F:TGTGCCACTCCAAAGACATCAG

实施例3：利用CRISPR-Cas9系统转化棉花

将上述构建好的载体通过农杆菌介导的转化方法导入棉花宿主细胞。具体转化步骤如下：

(1)挑选饱满、健康的陆地棉豫668(由河南省农业科学院选育，惠赠，实施本发明不限于该品种) 种子，剥去种皮后，用0.1％的HgCl₂浸泡10min，再用无菌水洗涤3次，将灭菌后的棉种，接种于无菌苗萌发培养基上，在黑暗条件下，置于28℃恒温箱中培养4-6d；

(2)取无菌苗下胚轴，切成0.5-0.8cm小段接种于0.5OD值的用农杆菌活化培养基悬浮的农杆菌菌液中，侵染10mim后，用无菌滤纸吸干下胚轴表面的菌液；

(3)将下胚轴接种在含有共培养培养基的培养皿中，在21℃下共培养48h；将下胚轴放入含有头孢霉素500mg/L的无菌水中，冲洗3遍，吸干表面水份后，接种到选择培养基中，每1个月继代培养1次，直到获得胚性愈伤组织；将胚性愈伤组织转入分化培养基，获得大量胚状体；

(4)将获得的胚状体转移到胚萌发及成苗培养基，直到获得转基因植株幼苗。

转化用的培养基成分及配制方法：

无菌苗萌发培养基：1/2MS大量元素，15g/L葡萄糖，2.5g/L的Phytagel；pH＝6.1-6.2。

愈伤组织诱导培养基：MSB，24-D 0.1mg/L，KT 0.1mg/L，3％Glucose，0.3％Phytagel；pH＝5.85-5.95。

农杆菌活化培养基：胰化蛋白胨5g/L，NaCl ₅g/L，MgSO₄.7H₂O 0.1g/L，KH₂PO₄，0.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸1.0g/L；pH＝5.85-5.95。

共培养培养基：MSB+2，4-D 0.1mg/l，KT 0.1mg/l，50mg/l AS，3％Glucose，0.25％Phytagel，pH＝5.8。

选择培养基：MSB，2，4-D 0.1mg/L，KT 0.1mg/L，3％Glucose，0.3％Phytagel，卡那霉素50mg/L，头孢霉素400mg/L；pH:5.85-5.95。

分化培养基：在MSB培养基中去掉NH₄NO₃,将KNO₃用量加倍，Gln 1.0g/L，Asn 0.5g/L，IBA 0.5 mg/L，KT 0.15mg/L，3％Glucose，0.25％Phytagel；pH＝6.1-6.2。

生根培养基：1/2MS无机盐+B5有机物，15g/L葡萄糖，2.5g/L的Phytagel；pH＝5.90-5.95；

MSB：MS培养基+B5维生素。

实施例4：检测CRISPR-Cas9对GoPGF基因的编辑效果

(1)再生苗阳性检测及拷贝数鉴定

利用T-DNA上的序列进行转基因植株的阳性鉴定，扩增得到999bp的目标片段(序列如序列表SEQ ID NO：4所示)。

引物序列：正向引物Cas9 F GCTTGTGCGTTTCGATTTGA，反向引物Cas9 RCCGCTCGTGCTTCTTATCCT；

表6 PCR反应体系:

PCR条件：95℃5min；95℃30sec；58℃30sec；72℃60sec；共32个循环；72℃5min；15℃保存。

利用GoPGF基因PGF S、PGF AS引物进行扩增基因序列，检测是否存在大片段基因缺失。PCR体系和PCR条件同上。

引物：正向引物PGF S ATGTCTTCCTCTTCTTCGTCTTCTC，反向引物PGF ASCTAATTCAACGTGCATCTCTGAAGG；

利用Cas9引物(同上)鉴定转基因再生植株是否为阳性植株，本发明共获得再生苗12株，其中阳性植株10株，阳性率为83.3％(图1)。10个阳性植株均无腺体表型，表型率为100％。通过PCR扩增GoPGF 基因的全长，发现其中编号为m4的单株(红箭头标示)具有两条带，说明在该单株在体内编辑过程中，产生了大片段的缺失，经测序鉴定，发现该植株的基因组有大片段的缺失序列(缺失59个碱基)。

利用Southern杂交对CRISPR/Cas9转基因材料进行拷贝数鉴定。发现在陆地棉豫668背景下，m1、 m2、m4、m5、m11单株为单拷贝，其他单株为多拷贝。其中m1、m2单株是一个转化事件，m7、m8、 m9、m10单株为一个转化事件(图2)。

(2)GoPGF基因的酶切鉴定

设计引物扩增sgRNA的侧翼序列，进行限制性酶切，sgRNA1侧翼序列全长490bp(序列如序列表SEQ ID NO：5所示)，酶切后分别得到301bp和189bp两个片段；gRNA2侧翼序列全长489bp(序列如序列表 SEQ ID NO：6所示)。，酶切后分别得到191bp和298b两个片段。扩增用的相关引物序列如下所示：正向引物PGFS1 F CTATACCGTATCCATGACCCGATCA，反向引物PGFS1 R GGCATTGAACTCGGTGTCTGCAGAGG；正向引物PGFS2 F ACAGGTTTAGGCCGTTCGTCATCGG，反向引物PGFS2 R TGCAGCTGGATGATCGATATCTGGA；

sgRNA1和sgRNA2序列上的酶切位点分别为BfuAI、BtgI酶(均购自NEB(北京)有限公司)。

用PCR扩增含有sgRNA的片段进行酶切鉴定。酶切后sgRNA1的片段与CK、WT相比，m1、m3、 m4、m7、m8、m9、m10、m11单株没有切开小片段，说明存在较高效率的编辑。尽管BfuAI识别位点在上游，但阴性植株m6、m12带型与对照一致，说明本发明的酶切验证是可靠的。利用限制性内切酶BtgI 对sgRNA2的片段进行酶切验证，与CK、WT相比，m1、m2、m3、m8、m9、m10、m11单株具有明显的大片段，说明本发明具有较高编辑效率(图1)。

(3)GoPGF基因的测序

由于一代测序读长的限制，本发明通过设计引物扩增基因，得到658p的核苷酸序列(序列如序列表 SEQ ID NO：7示)，以便一个反应可以覆盖两个sgRNA的靶序列。

引物序列如下所示：正向引物PGFCX F CATATTTGGTTGGGTGGAGA，反向引物PGFCX RCAGATTGTACTAGGAGTTGAGCCT；

将包含sgRNA的序列进行扩增测序，并通过GoPGF_A12^m、GoPGF_D12^m之间的SNP进行区分At、Dt的测序结果。本测试的10株转基因阳性苗均具有无腺体表型，完全突变效率为80％(8/10)，sgRNA1的位点编辑率为100％(10/10)，同源序列纯合率为50％(5/10),sgRNA2的位点编辑率为100％(10/10)，同源序列纯合率为30％(3/10)。具体数据见表7

表7 T0代转基因植株sgRNA编辑效率及表型率统计

对表7说明：“-”、“+”以及“n”分别代表碱基缺失、插入和无编辑。

“a”、“d”代表At、Dt序列被编辑。

“Y”、“N”分别代表阳性检测为阳性植株、阴性植株。

本发明通过tRNA将两个sgRNA串联同时对GoPGF_A12、GoPGF_D12进行敲除，所以在一条序列上具有两个编辑位点，大大提高了突变率。如m9测序图谱和碱基序列显示两个sgRNA可以敲除74个碱基；而单株m4的sgRNA1可以敲除59个碱基(图3)。

(4)利用sgRNA潜在脱靶位点的预测及深度测序检测

利用sgRNAcas9_3.0.5.pl和extract_targetSeq.pl程序对sgRNA1、sgRNA2进行全基因组潜在脱靶位点预测及位点侧翼序列的提取，针对序列利用在线网站batchprimer3(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)进行批量设计引物，从基因组中扩增目标序列并等量混合建库，然后利用Illumina Hiseq 3000测序仪对目标序列进行150bp双端测序，最后对测序结果比对统计(见表8)。

表8 潜在脱靶序列预测

(5)CRISPR/Cas9阳性植株叶片棉酚的检测

(1)将冻干样品组织在液氮中研磨成细粉，取适量的样品细粉(种子干重20-50mg，叶片干重100mg) 于2mL离心管中，向离心管中加入1.5mL棉酚提取液(乙腈：水：磷酸V/V/V＝85:15:0.2)，4℃下振荡15 分钟；

(2)，每隔5分钟上下颠倒；4℃，12000r/min离心15分钟，取上清于新离心管中；

(3)用0.22μm滤膜过滤上清，取200μL于棕色瓶内插管中，4℃下保存；

(4)在液相色谱仪上进行测试分析。液相色谱条件：流动相(甲醇：水：磷酸V/V/V＝85:15:0.2)，进样量50μL，流速0.6mL/min，柱温50℃，DAD检测波长272nm。

取T1代转基因棉株和野生型(非转基因)棉株的倒二叶，进行棉酚测定。野生型和突变体棉酚含量分别为0.4832mg/g、0.0056mg/g。突变体降低了98.8％。敲除腺体后，棉酚含量极低，说明腺体结构不仅影响了棉酚的贮藏，还影响了棉酚的合成(图5)。

实施例5：表型及突变遗传验证

与野生型(非转基因)棉株相比，GoPGF基因被敲除后，在叶片、茎、萼片、棉铃、种子等部位无明显黑褐色腺体斑点(图4)。叶片、茎部位的表型与马丹等(Ma et al 2016)VIGS报道的结果的一致。在体式显微镜下，突变体T0代种子比野生型种子表面无明显黑斑点，更加光滑。棉铃表面除了无黑色斑点外，显得更加平整。分子水平以及表型观察证明腺体敲除是成功的。

对m3收获的T1材料进行阳性鉴定，发现其中4株m3-1、m3-3、m3-5、m3-6为makerfree材料(图 6中的A图)，Southern杂交结果与PCR鉴定结果一致，且阳性植株其余四株与m3带型一致(图6中的B 图)。

设计特异引物扩增T1代8株苗子中包含sgRNA1、sgRNA2两个位点的基因序列进行测序。对T0代 m3单株测序，通过基因771bp(T/C)、841bp(A/G)区分At、Dt，结果显示At、Dt基因两个sgRNA具有多种基因编辑类型，其中sgRNA2处都有野生型序列，为后代产生新的编辑类型创造了条件(图7中的 A图)。

表9 T1代植株sgRNA编辑效率及表型率统计

表9的说明：“-”、“+”以及“n”分别代表碱基缺失、插入、无编辑。

“a”、“d”代表At、Dt序列被编辑。“

Y”、“N”分别代表阳性检测为阳性植株、阴性植株。

T1代测序统计结果显示，T1代单株编辑类型相比T0单株少很多，并且大部分编辑类型来源于m3。值得关注的是，m3-3、m3-7单株为基因型纯合。特别是m3-3既是maker-free，同时基因型也已经纯合，后代不会发生分离(图7中的B图、表9)。PCR鉴定、Southern Blot测序三个结果可以证明无腺体表型及突变序列是可以遗传的。

主要参考文献：

1.Ma,D.,Y.Hu,C.Yang,B.Liu,L.Fang,Q.Wan,W.Liang,G.Mei,L.Wang,H.Wang,L.Ding,C.Dong,M. Pan,J.Chen,S.Wang,S.Chen,C.Cai,X.Zhu,X.Guan,B.Zhou,S.Zhu,J.Wang,W.Guo,X.Chen& T.Zhang(2016)Genetic basis for glandular trichomeformation in cotton.Nat Commun,7,10456；

2.Wang,P.,J.Zhang,L.Sun,Y.Ma,J.Xu,S.Liang,J.Deng,J.Tan,Q.Zhang,L.Tu,H.Daniell,S.Jin&X. Zhang (2017)High efficient multi-sites genome editing inallotetraploid cotton(Gossypium hirsutum)using CRISPR/Cas9 system.PlantBiotechnology Journal,16,137-150。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种无腺体低棉酚棉花种质的创制方法

<141> 2018-10-24

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1428

<212> DNA

<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1428)

<400> 1

atgtcttcct cttcttcgtc ttctcttatt accttaggtc aagatgcctc acctactttg 60

caacaacgcc tccatttcat cgtccaaagt aggcctgaat ggtgggtata ctccattttc 120

tggcaagctt caagggatgt tgatggtcgc gttgttttgt catggggcga tggctatttt 180

cgagggaccc gagatggtac gggaaaatcc atcaataggc tgagcccttc caaattgggg 240

tccagtttcg agaggaaaag gtcgggaaaa gatcaggtgc aagcttattt taatgaagtg 300

atggacgtgg accgtatggt agatggcgat gtgactgatt atgagtggta ctataccgta 360

tccatgaccc gatcattcgc tgtaggtgat gggattcttg ggaaggcttt cggatcaggc 420

tcccatattt ggttgggtgg agaccatgaa ctccaattgt accagtgtga gcgtgttaga 480

gaagctcgaa tgcgagggat tcaaacatta gtttgtcttc ctacatcctt cggggttgtc 540

gaattgggat cttctgatat catcatggaa gactggggca cccttcaact cactaaatcg 600

atattcagtt ctgggatcaa caacagcctg ggttcaaatc aacctgccca tgattcccaa 660

ccccaaatct caaccccaag tattcctttt gttgattttg gaatggtttc aggtgatcaa 720

aaggagcgga ttcttgaaga caaacaacaa gtcgagccca agaaagaaac tacaggttta 780

ggccgttcgt catcggaatc tgatggggat ttcgcctctg cagacaccga gttcaatgcc 840

agcggccggt cgaaaaagag aggtagaaaa ccagggaatg ggaaagaatc ccctataaac 900

cacgttgaag cagaaaggca acgacgtgag agactgaacc atcgtttcta cgcacttcgt 960

tccgtggttc caaacgtatc caagatggac aaagcctcat tactttcaga tgcagtagcc 1020

tacatcaagg aactaagatc aaaaatcgat aaactagagg ctcaactcct agtacaatct 1080

gaaaaatcca agttgaaccc catcaatgtt ttcgaaaacc aaactaccaa atccgcattc 1140

gacaatacca tgaaacaatc ctctacttat tggccaaaga cagtggaagt tgatgtgaag 1200

atagtaggat ccgaagctat gattcgggtt cgaagtccag atatcgatca tccagctgca 1260

cgattgatgg atgcacttcg agacctagag ctaccagttc accatgccag tgtatcaaac 1320

gtcaatgatc ttatgctaca ggatgttgtt gtcagagtcc ctactggaat attcataacc 1380

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atgtcttcct cttcttcgtc ttctcttatt accttaggtc aagatgcctc acctactttg 60

caacaacgcc tccatttcat cgtccaaagt aggcctgaat ggtgggtata ctccattttc 120

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atggacgtgg accgaatggt agatggcgat gtgactgatt atgagtggta ctataccgta 360

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gaattgggat cttctgatat catcatggaa gactggggca cccttcaact cactaaatcg 600

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ccccaaatct caaccccaag tattcctttt gttgattttg gaatggtttc aggtgatcaa 720

aaggagcgga ttcttgaaga caaacaacaa gtcgagccca agaaagaaac cacaggttta 780

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gacaatacca tgaaacaatc ctctacttat tggccaaaga cagtggaagt tgatgtgaag 1200

atagtaggat ccgaagccat gattcgggtt cgaagtccag atatcgatca tccagctgca 1260

cgattgatgg atgcacttcg agacctagag ctaccagttc accatgccag tgtatcaaac 1320

gtcaatgatc ttatgctaca agatgttgtt gtcagagtcc ctactggaat attcataacc 1380

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cttgtacaaa gtggttgata acagcgacta caaggatgac gatgacaagg cttagagctc 60

gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc 120

cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa 180

catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata 240

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ggtgtcatct atgttactag atcgggaatt cactggccgt cgttttacac tggccgtcgt 360

tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca 420

tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 480

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aggcgggtca ggcaagacga ccatcgcaac ccatctagcc cgcgccctgc aactcgccgg 1980

ggccgatgtt ctgttagtcg attccgatcc ccagggcagt gcccgcgatt gggcggccgt 2040

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cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 4740

gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 4800

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ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 4980

atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 5040

aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 5100

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tggccccaaa gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc gacaagaagt 12060

acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt 12120

acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga 12180

agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga 12240

agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga 12300

tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct 12360

tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg 12420

aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca 12480

gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc 12540

ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt 12600

tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg 12660

gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc 12720

tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga 12780

gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc 12840

agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc 12900

agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca 12960

tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat 13020

acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg 13080

agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacattgacg 13140

gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg 13200

gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct 13260

tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc 13320

ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga 13380

ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga 13440

tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg 13500

gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg 13560

agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat aacgagctga 13620

ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga 13680

aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga 13740

aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag 13800

atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg 13860

acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac 13920

tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg 13980

acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga 14040

agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt 14100

ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta 14160

aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg 14220

ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg 14280

acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca 14340

gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg 14400

aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc 14460

agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg 14520

accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga 14580

gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac aagaaccggg 14640

gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc 14700

agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga 14760

gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc 14820

ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg 14880

agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg 14940

atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc 15000

acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg 15060

aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga 15120

gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact 15180

ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga 15240

caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga 15300

aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct 15360

tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg 15420

actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg 15480

tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg 15540

ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt ctggaagcca 15600

agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg 15660

agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg 15720

aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc 15780

tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaagcact 15840

acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg 15900

ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc atcagagagc 15960

aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca 16020

agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg 16080

ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc 16140

tgggaggcga caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa aagaaaaagt 16200

aagaattcgc ggccgcactc gagatatcta gacccagctt t 16241

<210> 4

<211> 999

<212> DNA

<213> 酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(999)

<400> 4

gcttgtgcgt ttcgatttga tttcatatgt tcacagatta gataatgatg aactctttta 60

attaattgtc aatggtaaat aggaagtctt gtcgctatat ctgtcataat gatctcatgt 120

tactatctgc cagtaattta tgctaagaac tatattagaa tatcatgtta caatctgtag 180

taatatcatg ttacaatctg tagttcatct atataatcta ttgtggtaat ttctttttac 240

tatctgtgtg aagattattg ccactagttc attctactta tttctgaagt tcaggatacg 300

tgtgctgtta ctacctatct gaatacatgt gtgatgtgcc tgttactatc tttttgaata 360

catgtatgtt ctgttggaat atgtttgctg tttgatccgt tgttgtgtcc ttaatcttgt 420

gctagttctt accctatctg tttggtgatt atttcttgca gatagttatc aacaagtttg 480

tacaaaaaag caggcttcga aggagataga accaattctc taaggaaata cttaaccatg 540

gactataagg accacgacgg agactacaag gatcatgata ttgattacaa agacgatgac 600

gataagatgg ccccaaagaa gaagcggaag gtcggtatcc acggagtccc agcagccgac 660

aagaagtaca gcatcggcct ggacatcggc accaactctg tgggctgggc cgtgatcacc 720

gacgagtaca aggtgcccag caagaaattc aaggtgctgg gcaacaccga ccggcacagc 780

atcaagaaga acctgatcgg agccctgctg ttcgacagcg gcgaaacagc cgaggccacc 840

cggctgaaga gaaccgccag aagaagatac accagacgga agaaccggat ctgctatctg 900

caagagatct tcagcaacga gatggccaag gtggacgaca gcttcttcca cagactggaa 960

gagtccttcc tggtggaaga ggataagaag cacgagcgg 999

<210> 5

<211> 490

<212> DNA

<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(490)

<400> 5

ctataccgta tccatgaccc gatcattcgc tgtaggtgat gggattcttg ggaaggcttt 60

cggatcaggc tcccatattt ggttgggtgg agaccatgaa ctccaattgt accagtgtga 120

gcgtgttaga gaagctcgaa tgcgagggat tcaaacatta gtttgtcttc ctacatcctt 180

cggggttgtc gaattgggat cttctgatat catcatggaa gactggggca cccttcaact 240

cactaaatcg atattcagtt ctgggatcaa caacagcctg ggttcaaatc aacctgccca 300

tgattcccaa ccccaaatct caaccccaag tattcctttt gttgattttg gaatggtttc 360

aggtgatcaa aaggagcgga ttcttgaaga caaacaacaa gtcgagccca agaaagaaac 420

tacaggttta ggccgttcgt catcggaatc tgatggggat ttcgcctctg cagacaccga 480

gttcaatgcc 490

<210> 6

<211> 489

<212> DNA

<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(489)

<400> 6

acaggtttag gccgttcgtc atcggaatct gatggggatt tcgcctctgc agacaccgag 60

ttcaatgcca gcggccggtc gaaaaagaga ggtagaaaac cagggaatgg gaaagaatcc 120

cctataaacc acgttgaagc agaaaggcaa cgacgtgaga gactgaacca tcgtttctac 180

gcacttcgtt ccgtggttcc aaacgtatcc aagatggaca aagcctcatt actttcagat 240

gcagtagcct acatcaagga actaagatca aaaatcgata aactagaggc tcaactccta 300

gtacaatctg aaaaatccaa gttgaacccc atcaatgttt tcgaaaacca aactaccaaa 360

tccgcattcg acaataccat gaaacaatcc tctacttatt ggccaaagac agtggaagtt 420

gatgtgaaga tagtaggatc cgaagctatg attcgggttc gaagtccaga tatcgatcat 480

ccagctgca 489

<210> 7

<211> 658

<212> DNA

<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(658)

<400> 7

catatttggt tgggtggaga ccatgaactc caattgtacc agtgtgagcg tgttagagaa 60

gctcgaatgc gagggattca aacattagtt tgtcttccta catccttcgg ggttgtcgaa 120

ttgggatctt ctgatatcat catggaagac tggggcaccc ttcaactcac taaatcgata 180

ttcagttctg ggatcaacaa cagcctgggt tcaaatcaac ctgcccatga ttcccaaccc 240

caaatctcaa ccccaagtat tccttttgtt gattttggaa tggtttcagg tgatcaaaag 300

gagcggattc ttgaagacaa acaacaagtc gagcccaaga aagaaactac aggtttaggc 360

cgttcgtcat cggaatctga tggggatttc gcctctgcag acaccgagtt caatgccagc 420

ggccggtcga aaaagagagg tagaaaacca gggaatggga aagaatcccc tataaaccac 480

gttgaagcag aaaggcaacg acgtgagaga ctgaaccatc gtttctacgc acttcgttcc 540

gtggttccaa acgtatccaa gatggacaaa gcctcattac tttcagatgc agtagcctac 600

atcaaggaac taagatcaaa aatcgataaa ctagaggctc aactcctagt acaatctg 658

Claims

1.一种无腺体低棉酚棉花种质的创制方法，其特征包括下列步骤：

sgRNA1：ATTTGGGGTTGGGAATCAT，

sgRNA2：TTTCTACGCACTTCGTTCCG；

(2)利用PCR将sgRNA1-guidRNA、sgRNA2-guidRNA串连，然后通过一步克隆法构建到CRISPR/Cas9载体，得到高效转化载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ，该转化载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示；

(3)利用农杆菌介导的方法转化棉花，得到无腺体低棉酚棉花植株。

2.根据权利要求1所述的一种无腺体低棉酚棉花种质的创制方法，其特征在于，步骤(3)中所述的棉花为陆地棉。

3.一种高效转化载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。

4.权利要求3所述的一种高效转化载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ在棉花转基因中的应用。