CN104450733A - 棉花腺体形成基因GoPGF的克隆及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了棉花腺体形成基因GoPGF的克隆及利用。棉花腺体形成基因GhPGF_A12在陆地棉遗传标准系TM-1的基因组A亚组序列为：SEQ ID NO.1；GhPGF_D12在陆地棉遗传标准系TM-1的基因组D亚组序列为：SEQ ID NO.2。GbPGF_A12在海1基因组A亚组中核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示GbPGF_D12在海1基因组D亚组中核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。通过病毒介导的基因沉默技术，证明GoPGF是一个控制腺体形成的关键性基因。该基因为研究棉花腺体形成、腺体与棉酚的关系，低酚棉、高酚棉等新种质的创制奠定重要的研究基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术应用领域，涉及棉花腺体形成基因GoPGF的克隆及应用。
技术背景
棉花除了为人类提供天然纤维之外，它还是一种重要的油料作物。轧去纤维后剩下的棉籽中，种仁占50％左右。棉花种仁中蛋白质含量高达40％左右，是小麦面粉蛋白含量的5倍，是稻米蛋白含量的7倍，可与大豆、花生相媲美，完全能够满足人们对蛋白质的需求。种仁中含油量高达35％以上，能与花生和油菜相媲美，且棉子油中的不饱和脂肪酸含量较高，特别油酸和亚油酸的含量高达71.7％，是一种优质的植物油资源。除棉子蛋白和棉子油外，棉仁中还含有一定量的维生素B和E等营养成分，具有很高的营养价值(刘毓湘等，1995)。然而，棉花种仁中一般含棉酚及其衍生物，含量为0.15％～0.20％就会引起人和非反刍动物产生严重的中毒现象。因此，棉子油需要进行脱毒精炼后才能食用，榨油后的棉仁饼也只能用作肥料。但是，对棉株本身棉酚却是重要的抗性物质，是防御病虫危害的重要组成部分，缺少棉酚会导致棉花病虫的危害而使产量大幅下降。作为棉酚的主要存储结构，腺体的多少与棉酚含量关系密切。因此，有关腺体的形成和遗传机制以及棉酚的代谢研究一直是科学家研究的热点，其目的在于搞清棉花色素腺体的分布规律、分布模式、形态建构和遗传规律，以及腺体形成与棉酚积累关系，进而有目的地进行育种，特别是培育植株有腺体种子无腺体的新型棉花品种(潘家驹等，1998)，从根本上解决棉籽综合利用的问题。
(一)腺体与棉酚含量的关系研究
棉酚是一种倍半萜烯类化合物。棉酚主要以两种形式存在于棉花植株器官：不能用70％的丙酮溶液抽提出来的结合棉酚和可用70％的丙酮抽提出来以游离的形式存在的有生物学活性游离棉酚。一般认为，棉酚及其衍生物由根部合成，而后向上运输，主要存储在棉属植物一种特有的结构——腺体中。腺体在棉株中除花粉、种皮和木质部外均有分布。腺体分布数量和密度在棉株个体间存在差异，常因不同品种、不同植株、不同器官、不同组织、不同生长环境和发育时期而有所不同。国内外研究表明，棉属植物棉酚的有无及含量与不同的腺体类型密切相关，通常色素腺体数目与棉酚含量呈高度正相关关系。Pominski(1951)分析，四个栽培种中色素腺体数目与棉酚含量呈直线相关。Singh(1972)经过试验证明棉仁和棉株叶片花蕾上色素腺体数量和棉酚含量之间的高度正相关性。Wilson等人(1976)也报道了出现在棉籽、叶片以及花蕾等部位的色素腺体的数目与棉酚的含量有着正比的关系。祝水金等(1997)对棉属栽培种和野生种种子与植株主要器官的棉酚含量和色素腺体进行了相关性分析，发现种仁和花瓣的色素腺体与棉酚含量存在着极显著的相关性。因此，在传统低酚棉育种中，叶片、棉籽的腺体数目常常作为判断棉酚含量的重要指标。
然而，伴随着新棉种的发现，人们发现腺体与棉酚含量之间也并非是绝对的正相关关系。据研究发现，二倍体的比克氏棉(G1)、澳洲棉(C3)、南岱华棉(C1-n)、斯特提氏棉(C1)、纳尔逊氏棉(C9)均是种仁无腺体、无棉酚而植株有腺体且有棉酚的特异种质；阿拉伯棉(E1)和索马里棉(E2)种仁内有腺体，却难以测到棉酚。说明棉酚和腺体之间联系密切又复杂。棉酚如何合成和运输？没有腺体的棉种种，棉酚又是以何种形式在棉花体内？这些问题都尚腺体的发生与棉酚的积累关系值得深入的研究。
(二)腺体的形成过程研究
成熟的色素腺体为1～3层扁平的上皮细胞围绕一个含有分泌物质的腔隙组成。直径为100～400微米，子叶或叶片的腺体发生在栅栏组织下面，新生茎秆的腺体发生在皮层的下皮层；老的茎秆和根中的腺体分布遍及皮层的韧皮部。从外表观察，腺体呈褐色或黑褐色，但显微镜下观察腺体在叶片中呈桔红、棕红或紫红色，在种仁中呈棕黄色，花瓣上腺体为淡黄色，常与花瓣色无明显差异，必须迎着光线才能看出。棉花色素腺体的发育过程，即关于基本的分生组织如何形成空腔，长期以来一直存在争议。一种观点认为，色素腺体腔隙是通过分泌细胞团相互分离的裂生方式发育而来，分泌物很早就出现在分泌细胞间(Tschirch，1906)。但是，多数学者认为腺体是通过细胞溶解的方式发育而来，也就是典型的溶生型发育。周亚福等(2011)利用细胞化学、光学显微镜、扫描和透射电子显微镜技术研究了陆地棉叶色素腺体的发生，发现棉花叶片腺体起源于表皮下方一团细胞质浓密的基本分生组织细胞，色素腺体原始细胞分化为中央细胞和鞘细胞后，色素腺体的中央细胞及部分鞘细胞在发育过程中降解成熟的色素腺体，由一层扁平的上皮细胞和1～3层鞘细胞围绕着中央大的腔隙组成，最外1～2层鞘细胞的细胞壁在发育后期明显加厚。同时发现“溶生型”棉花色素腺体的发育是一个细胞程序化死亡的过程。
(三)腺体形成相关基因的研究
到目前为止，已发现控制棉花腺体有无的基因有六对(gl1～gl6)(McMichael等，1954，1959，1960；Miravalle等，1962；Lee等，1965；Murray等，1965)。在这六个基因位点中，gl2和gl3起主要作用，其它的基因仅起修饰作用。李祥凤和徐自平(1993)根据棉酚腺体在棉株上的分布及其在不同时期的表达，将棉酚腺体在棉株上的分布与基因型对应起来，有四种表现型：第一种是A型，其下胚轴、子叶、托叶等部位均有腺体，随机分布，对应的基因型是具有显性Gl2或Gl3两种或两种以上的基因型，有6种基因型：Gl2Gl2Gl3Gl3、Gl2Gl2gl3gl3、Gl2Gl2Gl3gl3、gl2gl2Gl3Gl3、Gl2gl2Gl3Gl3、Gl2gl2Gl3gl3；第二种是B型，其腺体分布在子叶边缘及沿中脉附近，托叶上有少量腺体，下胚轴上有零星腺体存在，用镜检可以发现，基因型为Gl2gl2gl3gl3；第三种是C型，仅在子叶边缘、托叶上有少量腺体分布，用镜检同样可见下胚轴上有零星腺体，基因型为gl2gl2Gl3gl3；第四种是D型，植株各部分均无腺体，具有纯合隐性gl2gl2gl3gl3基因型。也就是说当gl2和gl3两对隐性基因纯合时，棉花植株和棉籽均表现为无腺体。
控制棉花腺体的基因，除了上述的gl1-gl6六个基因外，还相应存在它们的各个复等位基因。McMichael(1970)在美国亚利桑那州发现一株茎秆无腺体的陆地棉突变体，进一步遗传分析证明该突变性状是受一个与gl1等位的简单隐性基因控制，确定基因符号为gl1 y，从而形成Gl1、gl1、gl1 y三个复等位基因。Lee(1965)在验证“等位基因替代”假说的试验中，证明了A组亚洲棉的腺体是由一个与gl2等位的基因所控制的，确定为gl2 arb，而D组的腺体是由一个与gl3相同的位点所控制的，雷蒙德氏棉D5具有等位基因gl3 rai，瑟伯氏棉D1具有等位基因gl3 thur，戴维逊氏棉D3具有等位基因gl3 dav，海岛棉AD亚组分别具有等位基因gl2 b和gl3 b。Barrow和Davis(1974)用有腺体材料XG-15与无腺体的爱字棉B6532杂交发现了一个Gl2的次级等位基因，确定基因符号为Gl2 s。当Gl2 s为纯合体时，子叶上有较少的腺体；而当Gl2为纯合体时，子叶上有大量腺体。张天真等(2001)对湘X9628种子低酚、植株有酚特性的遗传分析表明：湘X9628植株有腺体、种子低棉酚特性由两对重叠隐性基因控制。等位性测验表明，其中一对基因是gl2的等位基因，另一对是gl3的复等位基因，它对gl3表现为隐性，并定名为gl3 n。祝水金等(2004)育成具有子叶色素腺体延缓形成特性的陆地棉种质系“ABH-0318”，遗传分析结果表明，该种质的子叶色素腺体延缓形成性状受位于Gl2和Gl3位点的两对基因互作控制，其中位于Gl2位点的基因来源于比克氏棉，对已知的陆地棉色素腺体等位基因(Gl2和gl2)为显性，但对Gl3则表现为隐性上位，暂定其基因符号为Gl2 b。
1965年，埃及一个Bahtim试验站的Afifi等人在海岛棉中发现了一个无腺体单节显性突变体，它是所发现的控制棉酚腺体性状的基因中的第一个无腺体基因。他用P32溶液处理海岛棉品种吉扎45种子，获得一个显性无腺体突变体，从而育成无腺体品种巴蒂姆110(Bahtim110)。美国学者Kohel(1984)用Bahtim110为背景材料与标准系TM-1杂交，经过多次回交将Bahtim110的显性无腺体基因转移到TM-1中，得到无腺体突变体“等位基因系”，遗传分析表明，该性状受到一对显性主基因(Gl2 e)控制，可以显性抑制棉酚腺体的表现，与纯合隐性的gl2gl2gl3gl3基因型效应相似，为棉花低酚育种提供揭开了新的篇章。中国农业科学院棉花研究所1986年发放了海岛棉无腺体突变品系海1，靖深蓉等(1991)采用有腺体陆地棉与海1杂交，再与陆地棉回交和人工选择的方法，把海岛棉中的显性无腺体基因转育到陆地棉中，经过3次回交和2次自交及人工选择，选育出具有陆地棉遗传背景的显性无腺体近似等位基因群体，且对陆地棉的主要经济性状无不良影响。唐灿明等(1994；1996)对海1的遗传机制进行了进一步研究，结果表明其无腺体性状是由位于Gl2位点上的一对不完全显性基因Gl2 e控制。他发现海1除含显性无腺体Gl2 e基因外，还含有腺体基因Gl3和Gl1，Gl2 e对它们有显性上位作用。Gl2 e基因为目前发现的唯一一个控制腺体有无的显性单基因。该基因克服了隐性无腺体基因易于发生天然杂交、导致食用不安全的问题，并且在转育到陆地棉品种中后对被转育品种的主要农艺性状无不良影响，使培育抗天然杂交的无腺体低酚棉品种成为可能。由Gl2 e基因控制的无腺体性状还可作为一个优良的指示性状，应用于棉花杂种优势的研究(袁有禄等，1997)。因此，许多研究工作集中于克隆Gl2 e基因。2003年蔡应繁采用抑制性消减杂交方法(SSH)克隆了显性无腺体海岛棉与有腺体陆地棉的衍生后代突变体“湘棉18”的特殊腺体发育相关的基因，获得24个差异表达的cDNA克隆。2008年谢永芳等选用川2802(种子、植株都有腺体)，湘棉18(种子无腺体，植株有腺体，种子萌发过程中腺体逐渐增多)，无腺体棉－显无N5(种子、植株都无腺体)为材料，通过棉花基因芯片，对腺体形成时期的基因进行高通量筛选，筛选表达变化的基因。获得腺体形成时期相关的基因311条。Yu等2000年以陆地棉的标准系“TM-1”以及它的近等基因系材料ESP作为杂交亲本构建F2群体，用了集团分离的方法获得了一个距Gl2 e基因为1.9cM的SSR标记。蒋小燕等在2002年，同样的也采用近等基因系的分析方法筛选到了380个随机引物，通过实验，最终获得了一个与Gl2 e紧密连锁RAPD标记且已经把这个RAPD标记转换成了比较稳定的SCAR标记，该标记与显性无腺体基因Gl2 e的遗传距离为6.4cM。2007年，董承光等用“TM-1”和海1为杂交亲本，构建了一个F2群体，通过SSR的方法对Gl2 e基因进行了更为精细定位，最终将目标基因定位在了CIR362和NAU2251之间，其遗传距离分别约为9.27cM和0.96cM。2012年黄娟用“中棉所12号(中12)”及其近等基因系材料“中棉所12号显性无腺体(中12显无)”为亲本构建了包含2,302个单株的F2群体，定位Gl2 e基因，锁定在物理距离大概为340kb的范围内。在进一步的实验中，进一步缩小在物理距离大约为7.5kb的范围内，但未能进行功能验证。但是，控制腺体形成的Gl2 e基因到底是什么，目前尚未见报道。相对于拟南芥135Mb、水稻372Mb、大豆975Mb的基因组大小来说，棉花2.5Gb的大小无异是巨人，因棉花为异源四倍体，重复序列高达70％以上，全基因组测序较困难，二倍体雷蒙德氏棉的序列也是近期才公布，而作为锦葵科的棉花与其他已测序作物水稻、大豆、谷子进化关系较远，所以借助其他作物基因组序列信息来图位克隆棉花基因很难实现，故到目前为止并未有任何一个基因在棉花中图位克隆成功。
概括以上所述腺体遗传研究的现状，现将有关腺体基因的资料做一归纳总结(见表1)。
表1 控制棉花色素腺体形成的基因
(四)控制腺体形成基因在低酚棉育种中的利用
低酚棉棉籽中棉酚的平均含量0.02％，低于0.045％的国际食用安全标准，是非常重要的食用蛋白质和植物油资源，但是如果植株完全没有棉酚，棉花对各种病虫害的抵抗能力就会显著下降。为了避免棉酚对人畜的毒害，同时又不降低棉株对病虫害的抵抗能力，棉花育种专家致力于培育植株高酚而种子低酚的棉花新品种。1954年McMichael首次从霍皮棉(陆地棉尖斑棉变种)中育成由隐性基因控制的无色素腺体棉，取名23-B，其特点是种子和植株均为无腺体，种子可以直接利用。以后23-B成为无腺体棉的主要基因源。随后，美国在棉花的低酚育种规模以及其种植面积的面积上都在日渐增大，相继又选育出了很多个棉酚含量很低的棉品系：Gl16、Greg25v、Waaton、35W、爱字棉63-67、兰布莱特Gl-4(Lanbarat Gl-4)、兰布莱特Gl-5(LanbaratGl-5)、佩马斯特464(Paymaster 464)、佩马斯特465(Paymaster 465)、赖曼71(Lyman 71)(季道藩，1980)。法国热带棉花研究所育成的无色素腺体品种F280，在乍得几个地区大面积推广种植，且产量品质都较好(黄滋康等，2003)。此外，还有印度的Badnawar、Indorawar和埃及的Bahtim 110等低酚棉品种。在中国，从二十世纪七十年代，由辽宁省农科院经作所首先从非洲马里引进低酚棉种质资源。此后，我国农业考察团等又从美国、法国等引进兰布莱特GL5等低酚棉品种(黄滋康等，2003)开始了低酚棉育种工作。1978年，由湖南棉花所选育成的“无酚棉1号”成为了我国的第一个具有低酚性状的品种。经过多年的努力，已有20多个低酚棉品种通过省级以上审定并命名，其中有适合长江流域棉区种植的浙棉9号、10号、湘棉11号、13号、16号和皖棉5号，适合黄河流域棉区种植的中棉所13号、18号、22号、豫棉2号、6号和冀棉19号，适合北部特早熟棉区种植的辽棉11号、辽无2152、中棉所20号以及适合西北内陆棉区种植的新陆早1号、3号和新陆中2号等(邱新棉，2000)。1995年，湖南棉花所在对陆地棉进行的种间杂交后代的调查中发现了一个种子无腺体而植株表现为有腺性状的突变体，该突变体被定名为“湘X9628”，该突变体不但不存在杂种间的不亲不育问题。樊云茜等(1999)将存在于海1的无腺体基因Gl2 e转育到了特早熟普通有腺体棉品种上，选育出携带有单节显性无腺体基因的特早熟陆地棉型无腺体棉花新种质系“汾显无1号”。但是，低酚棉品种由于植株没有棉酚，其抗性很差，易受害虫、鼠、兔的危害，导致产量大幅度下降，而且容易发生天然异交而导致生物学混杂，致使品种纯度下降，棉种中棉酚含量升高，导致低酚棉品种难以大面积长期推广种植。
发明内容
本发明的目的是提供一种棉花的腺体形成基因GoPGF在陆地棉TM-1，和海岛棉显性无腺体海1基因组中的序列。
本发明的另一目的是证明GoPGF可控制棉花腺体的形成和发育。以便用于低酚棉、高酚棉创制中。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一个棉花腺体形成基因GhPGF_A12，在陆地棉遗传标准系TM-1的基因组A亚组中核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。一个棉花腺体形成基因GhPGF_D12，在陆地棉遗传标准系TM-1的基因组D亚组中核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。一个棉花腺体形成基因GbPGF_A12，在海1基因组A亚组中核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。一个棉花腺体形成基因GbPGF_D12，在海1基因组D亚组中核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。GhPGF_A12和GhPGF_D12为TM-1中扩增得到的一对部分同源基因；GbPGF_A12和GbPGF_D12为海1中扩增得到的一对部分同源基因。在转录水平表达上，定量PCR研究发现GhPGF_A12表达量显著高于GbPGF_A12。
腺体形成基因GhPGF_A12的VIGS干扰载体。
所述的VIGS干扰载体优选以陆地棉遗传标准系TM-1的cDNA作为模板，选择GhPGF_A12基因3’端作为候选区段，在该基因904～1428bp处设计特异性引物进行PCR扩增，将扩增产物插入VIGS载体pTRV2的BamHI/Xba I位点间得到腺体形成基因GhPGF_A12的VIGS干扰载体；其中特异性引物序列为：正向引物：5’AAGGTTACCGAATTCTCTAGATTTGATACACTGGCATGGTGA3’(SEQ ID NO.5)和反向引物：5’CGTGAGCTCGGTACCGGATCCTTGAAGCAGAAAGGCAACGAC3’(SEQ ID NO.6)。
腺体形成基因GoPGF(GhPGF_A12、GhPGF_D12、GbPGF_A12、GbPGF_D12)的植物表达载体。
所述的植物表达载体优选以陆地棉TM-1和海岛棉海1的cDNA作为模板，在该基因起始位点ATG到终止密码子之前设计特异性引物进行PCR扩增，将扩增产物插入载体PBI121的Xba I/Sma I位点间得到腺体形成基因GoPGF的植物表达载体；其中特异性引物序列为：正向引物：5’CTCTAGAATGTCTTCCTCTTCTTCGTCTTCT3’(SEQ ID NO.7)和反向引物：5’CCCCGGGTGATTCAACGTGCATCTCTGAAGG3’(SEQ ID NO.8)。
腺体形成基因GoPGF(GhPGF_A12、GhPGF_D12、GbPGF_A12、GbPGF_D12)在控制棉花腺体形成，进行低酚棉、高酚棉创制中的应用。
所述的应用，优选利用显性无腺体基因GoPGF设计分子标记，筛选低酚性状，培育符合需要的低酚棉花新品种；或者利用基因工程手段使棉酚腺体基因在有腺体棉的种子中不表达，在植株其他组织中正常表达或高表达，培育既具有抗性又可作为蛋白质和植物油资源的棉花新品种。
有益效果
本发明的优点表现在：
自从1986年剑桥大学的Alan coulson提出图位克隆(Map-based cloning)，1992年人们首次应用图位克隆技术在拟南芥中成功分离出ABI3基因和FAD3基因(Giraudat et al,1992；Arondelet al,1992)以来，已经从拟南芥、水稻、大麦、玉米和番茄等30多个植物中成功克隆出130多个基因。如，拟南芥的对植物生长素不敏感基因AXR1，抗霜霉病RPP5基因，(Leyser et al,1993)，番茄Pot基因(Martin et al,1993)，水稻的抗白叶枯病基因Xa21(Song et al,1995)、Xa1(Yoshimura et al,1998)，抗稻瘟病基因Pi-b(Wang et al,1998)，控制水稻分蘖的基因Moc1(Liet al,2003)，还有小麦的抗线虫基因Cre3(Lagudah et al,2003)、甜菜抗胞囊线虫基因Hs1pro-1(Thurau et al,2003)。相对于拟南芥135Mb、水稻372Mb、大豆975Mb的基因组大小来说，棉花2.5Gb的大小无异是巨人，因棉花为异源四倍体，重复序列高达70％以上，全基因组测序较困难，二倍体雷蒙德氏棉的序列也是近期才公布，而作为锦葵科的棉花与其他已测序作物水稻、大豆、谷子进化关系较远，所以借助其他作物基因组序列信息来图位克隆棉花基因很难实现，故到目前为止并未有任何一个基因在棉花中图位克隆成功。本发明首次通过图位克隆的方法在棉花中获得了到目前发现的唯一一个控制腺体有无的显性单基因，为针对棉花等多倍体材料的图位克隆提供了宝贵的经验。
通过病毒介导的基因沉默技术(Virus interfering gene silencing,VIGS)，证明knock-down陆地棉遗传标准系TM-1中的GhPGF基因的表达将导致腺体不能正常形成。我们的实验结果证实GoPGF是一个控制棉花腺体形成的关键性基因。在遗传分析中Gl2 e有众多的复等位基因，gl2、Gl2 b、gl2 b、gl2 arb、gl2 s等等，本研究对GoPGF基因的克隆成功，其他复等位基因也不难获得，尤其是控制子叶色素腺体延缓发育形成性状的Gl2 b，使种子中的腺体发育停滞在色素腺体原阶段。本基因的克隆为进一步解释腺体发育的过程，从色素腺体原到两种不同形态细胞的分化，再到中央细胞的降解，找到控制相关过程的下游基因提供基础。GoPGF基因的克隆及功能验证一方面有助于我们进一步揭示棉花腺体发育的分子机理，了解腺体发育与棉酚积累的关系，构建腺体发育的基因表达网络。同时该基因的克隆也为研究其他有腺毛植物如青蒿、薄荷等腺体形成、腺体和分泌的次生代谢产物的关系具有借鉴意义。
在棉花低酚棉育种上，该基因的克隆将为通过基因工程方法培育种子无腺体植株有腺体材料的培育提供重要的候选基因。显性无腺体基因应用于生产，有其优越之处：棉酚含量极低；不易受天然杂交的影响，不会因有腺体基因的感染而影响其利用价值；而且显性单基因控制的性状，易于通过回交将它转育到综合性状好的陆地棉(G.hirsutum L.)中，回交时不需自交，可在各世代分离群体中直接鉴别出有、无腺体，从而大大加快了育种进程。因此，本研究将为最终创制棉籽中棉酚含量低而植株其他部位棉酚含量高的新材料奠定基础。
附图说明
图1染色体A12(Chr.12)上Gl2 e基因及其附近分子标记所构建的连锁图谱。A.(N1×TM-1)F2的遗传连锁图；B.(N7×TM-1)F2的遗传连锁图；C.(海1×TM-1)F2的遗传连锁图
图2基因定位及候选区域ORF预测。Gl2 e基因被定位到w5383和w7954之间，约为43kb的范围，包含7个候选基因。
图3候选基因的RT-PCR检测。根据雷蒙德氏棉序列，设计半定量引物，分别在有腺体棉TM-1和海7124与无腺体棉海1、F1(TM-1×海1)中扩增，结果显示ORF2表达量在无腺体棉与有腺体棉中有显著性差异。
图4GoPGF蛋白结构预测。利用植物转录因子数据库(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)预测，ORF2属于bHLH转录因子家族，有两个主要结构域，bHLH-MYC和R2R3-MYB转录因子N端结构域，bHLH结构域。。
图5干扰GhPGF基因表达前后TM-1叶片和茎秆中腺体表型。A：转TRV:CLA植株。B：TM-1植株C：GhPGF基因干扰植株D：转TRV:CLA叶片E：TM-1植株叶片F：GhPGF基因干扰植株叶片。白色方框部分为局部放大图片。
图6在棉花TM-1植株中，正常叶片和GoPGF基因沉默后GoPGF基因的转录水平的表达情况。CK为未经任何处理的叶片中GoPGF基因的相对表达水平，TRV:GoPGF为VIGS干扰后GoPGF基因的相对表达水平。
图7GhPGF基因沉默后TM-1叶片中没有腺体结构形成。植株石蜡切片观测TM-1叶片经干扰后对照TRV:00叶片(左)中存在正常的腺体结构，而干扰后的植株TRV:GhPGF(右)叶片中不能形成正常的腺体结构。箭头所示为腺体结构。Bar＝10μm
图8A：GhPGF基因沉默后TM-1叶片中半棉酚含量。正常TM-1叶片，TRV:00叶片；B：GbPGF基因沉默后TM-1叶片中棉酚含量。正常TM-1叶片，TRV:00叶片。
具体实施方式
实施例1
本研究采用图位克隆的方法来进行腺体形成基因的克隆。
(一)显性无腺体Gl2 e基因的精细定位
本研究使用了3个显性无腺体材料(海1、N1、N7)和1个有腺体材料(TM-1)配制遗传作图群体。TM-1是陆地棉遗传标准系，来自美国德州农业部南方平原农业研究中心作物种质资源研究室(Kohel et al，1970)。海1为海岛棉无腺体突变品系，1986年由中国农业科学院棉花研究所发放(靖深蓉和占先合，1990)。N1、N7是具有海1遗传背景的显性无腺体棉种。三个F2(海1×TM-1、N1×TM-1、N7×TM-1)作图群体大小分别为1,599、244、354个单株。先后于2009～2012年，调查种植亲本、F1、F2群体单株腺体的表现型。表型性状分为有腺体和无腺体两种类型。性状调查在大田按单株进行，出苗后分三次调查性状。参照董承光等(2009)对Gl2 e的染色体定位结果，用第12染色体上NAU2251和CIR362的SSR标记对三个F2群体进行多态性分析。同时也利用Andy Paterson等(2011)释放的雷蒙德氏棉全基因组测序数据，根据定位区间的标记进行序列锚定，利用所锚定区段的序列信息，开发SSR/SNP引物，加密标记区间，选择在两亲本间表现出多态的标记精细定位。结果发现在三个分离群体中Gl2 e均并位于A12上w5383和w7954之间。Gl2 e与w5383和w7954的距离分别为0.5cM和0.6cM。
(二)候选ORF预测
根据精细定位结果，将Gl2 e两侧标记w5383和w7954锚定到雷蒙德氏棉基因组序列上，我们得到一段43kb的序列(图2)。通过生物信息学软件(Fgenesh：
http://linux1.softberry.com/berry.phtml；Genscan：http://genes.mit.edu/GENSCAN.html；GeneMark：http://exon.gatech.edu/genemark)对候选序列进行预测和分析，共检测到7个ORF，经Blastp进行了初步的功能分析(图2和表2)。主要涉及bHLH类转录因子、α/β-水解酶超家族蛋白、GDSL脂肪酶/乙酰水解酶超家族蛋白、跨膜受体家族蛋白、生长调节因子等。
表2 候选基因功能预测
通过RT-PCR的方法检测7个候选基因在不同腺体表型棉花真叶中的表达情况(图3)。实验表明，在正常生长状态下的各个植株的叶子中，除了ORF3检测不到信号外，其他基因均在叶片中表达。在表达的6个基因中，仅有ORF2在海1与TM-1之间存在表达差异，其它基因或全无差异，或只在(海1×TM-1)F1表达水平上有差异。根据BLAST比对结果，ORF2功能预测为bHLH类转录因子。我们将锁定ORF2为目标基因。命名为腺体形成基因PGF(Gossypium pigment gland formation)。
(三)GoPGF基因全长克隆及基因再定位
跨越整个ORF2序列，设计全长引物(正向引物：5’TCAATAATGTCTTCCTCTTCTTCG3’和反向引物5’CAAGCCCCAATGTTAGTGTT3’)分别在亚洲棉(A基因组)、雷蒙德氏棉(D基因组)、TM-1、海1基因组DNA中进行扩增。扩增得到6条序列，一条来自亚洲棉江陵中棉，一条来自雷蒙德氏棉，2条来自海1，2条来自TM-1。其中四条申请专利，来源于陆地棉遗传标准系TM-1的基因组A亚组中核苷酸序列是SEQ ID NO.1，即棉花腺体形成基因GhPGF_A12。来源于陆地棉遗传标准系TM-1的基因组D亚组中核苷酸序列是SEQ ID NO.2，即棉花腺体形成基因GhPGF_D12。来源于海1基因组A亚组中核苷酸序列是SEQ ID NO.3，即棉花腺体形成基因GbPGF_A12。来源于海1基因组D亚组中核苷酸序列是SEQ ID NO.4，即棉花腺体形成基因GbPGF_D12。6条序列均为1,428bp，编码476个氨基酸，理论等电点和分子量分别为6.35和53.0kDa。序列比较发现，来自A、D组/亚组的两条序列之间存在7个SNP位点。比较TM-1和海1GoPGF基因在A亚组间序列差异，核苷酸水平两条基因序列只有三个碱基差异(128，T/C；771，C/T；1218C/T)，导致一个氨基酸差异，在TM-1中为丙氨酸，海1A基因组中变为缬氨酸。我们根据海1A亚组的序列设计定位引物，共设计6对差异引物，经过在亲本中的筛选，得到有一对表现清晰的多态性引物(正向引物：5’ACTTAGACCATGTTTTAATGATGTATATCAAAGGTC3’和反向引物：5’TTGAACCCATTACCTAGCGATTTACACCAAC3’)用于定位，我们将三个F2定位群体中所有单株上进行多态分析，结果发现与目的基因紧密连锁，无交换单株出现。
表3 GoPGF基因在A亚组和D亚组中的SNP差异位点
我们将PGF全长序列，利用植物转录因子数据库(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)进行预测，该基因属于bHLH转录因子家族。根据NCBI CDS进行保守区预测发现该基因有两个主要结构域，bHLH-MYC和R2R3-MYB转录因子N端结构域，bHLH结构域(图4)。与拟南芥中bHLH的蛋白(登录号：At4g00870.1)相似度为33％。NetPhos2.0预测该蛋白共有35个可能的磷酸化位点，其中丝氨酸位点最多，有24个；苏氨酸位点有8个；络氨酸位点有3个。使用TMHMM软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对蛋白进行跨膜预测。GoPGF蛋白为可溶性蛋白，无跨膜结构。使用SignalP软件2.0版(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/)对PDCD5N端序列进行信号肽分析，该蛋白无信号肽。亚细胞定位：推荐使用PSORT(http://psort.nibb.ac.jp/)II软件对GoPGF蛋白的细胞内定位进行预测。PSORT将该蛋白质定位于叶绿体中。
实施例2GoPGF基因功能验证
1)TRV2::GhPGF_A12干扰表达载体的构建和转化
病毒介导的VIGS载体质粒TRV1、TRV2、TRV:CLA(Gao et al.,2011)。构建TRV2::GhPGF_A12干扰表达载体，选择GhPGF_A12基因3’端作为候选区段，以TM-1叶片的cDNA为模板进行PCR扩增，在该基因904～1428bp处设计特异性引物进行PCR扩增，特异性引物序列为：正向引物：5’AAGGTTACCGAATTCTCTAGATTTGATACACTGGCATGGTGA3’(SEQ ID NO.5)和反向引物：
5’CGTGAGCTCGGTACCGGATCCTTGAAGCAGAAAGGCAACGAC3’(SEQ ID NO.6)。得到的片段与克隆载体pMD19-T Vector连接，筛选获得阳性克隆后，进行DNA测序。测序正确的阳性克隆经酶切与TRV2载体相连，定向克隆在VIGS系统的TRV2载体的BamHI和XbaI多克隆位点，经酶切验证后测序，获得重组病毒载体TRV::GhPGF_A12。进而，利用冻融法将TRV:GhPGF_A12导入农杆菌GV3101。
酶切反应体系如下表所示：
2)侵染及干扰植株腺体表型观察
将构建成功的干扰载体TRV2::GhPGF_A12以及含有质粒TRV1、TRV2、TRV:CLA的农杆菌扩大培养，收集菌体用悬浮液(10mM MgCl2,10mM MES和200μM乙酰丁香酮)重悬并调菌液OD600到1.00静置3小时后，TRV1分别和TRV2、TRV:GhPGF_A12、TRV:CLA按体积比1:1混合，选取子叶刚刚展平的TM-1棉花幼苗(约播种后7-8天)，注射2片厚厚的子叶，并选取5株棉花幼苗作为未注射的阴性对照。将所有棉花幼苗放于光照培养箱，21-25℃培养15天后观察。
注射后15天后观察到沉默TRV:CLA植株的白化表型，植株从生长出第一片真叶就开始失绿，而注射的空载和未注射阴性对照相比无任何差别。TRV::GhPGF沉默植株在侵染15天以后观察腺体表型：侵染植株从开始长出新的叶片开始，腺体变少逐步过渡到没有可以肉眼可见的腺体(图5)，和100％的白化植株相比，所有干扰植株均可观察到腺体变化。腺体从少到无的过程由于病毒注射量、传播效率以及各个植株抗病力稍有不同，但最终从叶子到茎秆均可发展为无腺体植株。通过定量来检测目的基因表达情况(图6)，GhPGF基因在VIGS干扰后表达量显著降低。该实验发现抑制GhPGF基因的表达影响了植株茎秆和叶片上腺体的形成。石蜡切片观察发现(图7)，在海1(无腺体棉)的叶片中则没有色素腺体，也没有色素腺体原等类似的分化细胞，在叶片中仅能看到整齐的栅栏组织、海绵组织等，与其它无腺体作物相似。在TM-1叶片(有腺体棉)的叶片中含有数个色素腺体细胞。观察数个经过VIGS-GhPGF干扰后的TM-1叶片(有腺体棉，经干扰后肉眼看不到腺体存在)多个视野，结果仍然搜寻不到腺体结构。干扰后TM-1叶片与海1(无腺体棉)切片无异，叶片结构整齐，叶脉清晰，也没有类似的可以分化成色素腺体的色素腺体原细胞。而在干扰程度稍小腺体密度分布较小的叶片中观测，腺体结构与TM-1(有腺体棉)一致，发育完善仅仅密度较小较分散。实验证实，我们所克隆的腺体基因为调控腺体发育的关键基因，它的表达量的高低直接影响腺体的有无。在叶片发育早期干扰即可实现整片叶片无腺体(无腺体结构)。
3)腺体和棉酚的关系
由于棉酚和腺体的密切关系，我们测定了TM-1叶片干扰后棉酚的含量。结果TRV:GoPGF沉默植株叶片半棉酚和棉酚含量显著下降(图8)。
HPLC分析使用Agilent 1100系统，Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18analytical column(150mm×4.6mm,5microm)反向C18分析柱。叶片用液氮磨碎后每100mg材料加1ml叶片提取液，浸泡1小时，离心，上清用0.22μm滤头过滤，进行HPLC检测。HPLC检测条件：进样10μl，流动相流速1ml/min，柱温40℃，检测时间40min。叶片提取液：乙腈:水:磷酸＝80:20:0.1。HPLC流动相：乙醇:甲醇:异丙醇:乙腈:水:乙酸乙酯:DMF:磷酸＝16.7:4.6:12.1:20.2:37.4:3.8:5.1:0.1。
腺体结构和次生代谢的化学产物棉酚之间是否是“源”与“库”的关系，至今未有定论。张天真等(2001)对湘X9628种子低酚、植株有酚特性的遗传分析表明：湘X9628植株有腺体、种子低棉酚特性由两对重叠隐性基因控制。等位性测验表明，其中一对基因是gl2的等位基因，另一对是gl3的复等位基因，它对gl3表现为隐性，并定名为gl3 n。gl3 n既是腺体有无gl3的复等位基因也控制棉酚在种子中的含量。Tao等人(2013)通过分析腺体延缓形成澳洲棉的种子萌发过程转录组和差异表达基因也富集到很多合成和调控棉酚等次生代谢产物的基因进一步证明这一结果。本研究克隆到控制腺体发育的上游基因，在VIGS干扰前和干扰后的石蜡切片和棉酚含量的测定表明，腺体基因被干扰表达量降低后影响了棉酚的合成，导致了棉酚含量的减少。
GoPGF基因的克隆及功能验证一方面有助于我们进一步揭示棉花腺体发育的分子机理，了解腺体发育与棉酚积累的关系，构建腺体发育的基因表达网络。同时该基因的克隆为研究其他有腺毛植物如青蒿、薄荷等腺体形成、腺体和分泌的次生代谢产物的关系具有借鉴意义。
在棉花低酚棉育种上，该基因的克隆将为通过基因工程方法培育种子无腺体植株有腺体材料的培育提供重要的候选基因。显性无腺体基因应用于生产，有其优越之处：棉酚含量极低；不易受天然杂交的影响，不会因有腺体基因的感染而影响其利用价值；而且显性单基因控制的性状，易于通过回交将它转育到综合性状好的陆地棉(G.hirsutum L.)中，回交时不需自交，可在各世代分离群体中直接鉴别出有、无腺体，从而大大加快了育种进程。因此，本研究将为最终创制棉籽中棉酚含量低而植株其他部位棉酚含量高的新材料奠定基础。
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Claims (10)
1.一个棉花腺体形成基因GhPGF_A12，在陆地棉遗传标准系TM-1的基因组A亚组中核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一个棉花腺体形成基因GhPGF_D12，在陆地棉遗传标准系TM-1的基因组D亚组中核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一个棉花腺体形成基因GbPGF_A12，在海1基因组A亚组中核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一个棉花腺体形成基因GbPGF_D12，在海1基因组D亚组中核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.权利要求1所述的腺体形成基因GhPGF_A12的VIGS干扰载体。
6.根据权利要求5所述的VIGS干扰载体，其特征在于以陆地棉遗传标准系TM-1的cDNA作为模板，选择GhPGF_A12基因3’端作为候选区段，在该基因904～1428bp处设计特异性引物进行PCR扩增，将扩增产物插入VIGS载体pTRV2的BamHI/Xba I位点间得到腺体形成基因GhPGF_A12的VIGS干扰载体；其中特异性引物为：正向引物：SEQ ID NO.5，反向引物：SEQ ID NO.6。
7.含权利要求1～4中任一项所述的腺体形成基因的植物表达载体。
8.根据权利要求7所述的植物表达载体，其特征在于以陆地棉TM-1或海岛棉海1的cDNA作为模板，在该基因起始位点ATG到终止密码子之前设计特异性引物进行PCR扩增，将扩增产物插入载体PBI121的Xba I/SmaI位点间得到腺体形成基因GoPGF的植物表达载体；其中特异性引物为：正向引物：SEQ ID NO.7，反向引物：SEQ ID NO.8。
9.权利要求1～4中任一项所述的腺体形成基因在控制棉花腺体形成，进行低酚棉、高酚棉创制中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于利用腺体形成基因GoPGF设计分子标记，筛选低酚性状，培育符合需要的低酚棉花新品种；或者利用基因工程手段使棉酚腺体基因在有腺体棉的种子中不表达，在植株其他组织中正常表达或高表达，培育既具有抗性又能作为蛋白质和植物油资源的棉花新品种。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150325 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |