CN104593383B - 一个具F‑box结构域的基因TaFBK1及其表达载体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，公开了一个具F‑box结构域的基因TaFBK1及其表达载体和应用。具F‑box结构域基因TaFBK1的cDNA序列为SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。该基因来自普通小麦(Triticum asetivum L.)92R137。TaFBK1在抗条锈病小麦品种92R137中受条锈菌诱导表达增强，且表达水平远高于在感病小麦品种扬麦158中的表达水平。将该基因插入pBI220获得过量表达载体，并转化感条锈病小麦品种扬麦158，阳性转化植株的T1代抗条锈病鉴定结果表明TaFBK1的过量表达可以提高感条锈病小麦品种对条锈病的抗性。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，公开了一个具F-box结构域的基因TaFBK1及其表达载体和应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivum L.)是世界上种植面积最大的粮食作物，也是我国重要的粮食作物，小麦的高产稳产关系着我国的粮食安全。小麦条锈病是由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritic)侵染引起的气传性真菌病害，其发生部位主要是叶片，其次为叶鞘和茎，穗部颖壳和芒上亦可发生。小麦条锈病分布非常广泛，世界上主要的产麦国家如美国、中国、印度、俄罗斯、加拿大、巴基斯坦、澳大利亚以及西欧一些国家，小麦条锈病都是重要的病害，可以说有小麦栽培的地方均有小麦条锈病的发生。
在我国，小麦条锈病主要发生在西北、华北和西南各省、自治区。该病害常造成小麦严重减产，甚至颗粒无收。建国以来，我国曾发生16次中等规模、10次较大规模的小麦条锈病流行，尤其是1950、1964、1990和2002年的大流行，分别导致小麦损失产量达60、32、26.5和13亿公斤，2005年更是波及全国14个省区，发生面积达5700多万亩。由于小麦条锈病严重威胁着小麦高产与稳产且具有流行频率高、爆发性强、传播速度快、发生范围广、预防难度大等特点，因此加强小麦条锈病抗病新基因的挖掘利用以及抗病遗传基础的理论研究，选育抗条锈病品种，从而有效防治小麦条锈病大面积流行刻不容缓。
南京农业大学细胞遗传研究所利用四倍体圆锥小麦与二倍体簇毛麦杂交，再与普通小麦回交多代后，选育出了普通小麦-簇毛麦易位系92R137，自1994年进入国内育种利用以来，在四川、云南、陕西等条锈病常发区进行了多年种植，对条锈病表现出了稳定的高度抗性，尤其是对小麦条锈菌优势小种条中29、30、32表现高抗-免疫。遗传分析表明，92R137中的抗性由单基因控制，并呈显性遗传，该基因来自圆锥小麦，被国际小麦基因命名委员会命名为Yr26。
Yr26是一个具有重要应用价值的抗条锈病基因资源，成功克隆该基因或其抗病途径中的某些关键基因，则可以为利用转基因手段培育出抗条锈病转基因小麦新品种奠定坚实基础。本发明利用小麦基因芯片技术从转录组水平上了解小麦与条锈菌互作的基因表达特征，从中筛选了一个含Yr26材料中特异上调表达的基因TaFBK1，将该基因转入感条锈病小麦品种扬麦158中使基因超量表达，可显著提高小麦的条锈病抗性。本发明提供的TaFBK1基因超量表达载体为开展抗条锈病小麦基因工程育种提供基础。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种具F-box结构域的基因TaFBK1的表达载体和应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
具F-box结构域的基因TaFBK1来自普通小麦(Triticum asetivum L.)92R137，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
该具F-box结构域的基因的蛋白质为TaFBK1，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
含有所述的具F-box结构域的基因TaFBK1的重组表达载体。
所述的重组表达载体优选以pBI220为出发载体，将TaFBK1基因插入pBI220的SmaI和KpnI酶切位点间所得。
所述的含具F-box结构域的基因TaFBK1的表达载体在构建抗条锈病小麦品种中的应用。
有益效果
本发明从小麦中克隆得到了一个具F-box结构域的基因TaFBK1及其所编码的蛋白质TaFBK1，该基因在含有抗条锈病基因Yr26的小麦92R137中受条锈菌诱导表达，而在不含有抗条锈病基因Yr26的小麦扬麦158中不受条锈菌诱导表达。将其插入表达载体pBI220，得到的该基因的过量表达载体导入感病小麦品种中，可以提高感条锈病小麦品种对条锈病的抗性。TaFBK1用于基因工程育种，将其导入易感条锈病小麦品种中，能够提高小麦的条锈病抗性。
附图说明
图1利用Q-PCR分析TaFBK1在抗条锈病92R137和感条锈病扬麦158中的表达
横坐标0、6、12、24、48、72表示条锈菌诱导0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时的小麦叶片样品。
图2TaFBK1超量表达载体的构建
A：植物表达载体pBI220；B：pBI220:TaFBK1表达载体
图3pBi220:TaFBK1部分转基因植株T0代PCR分子鉴定
1-12：转基因植株(2，5，9，12为阳性植株，其余为阴性植株)，13：水对照，14：质粒对照，15：扬麦158对照，M：DL2000DNA标准分子量
图4TaFBK1转化扬麦158的T0代阳性植株的条锈病抗性鉴定
A：T1-28株系中分离的部分抗性单株的抗性鉴定
1：抗病对照92R137，2：T1-28-1，3：T1-28-2，4：T1-28-3，5：感病对照扬麦158
B：T1-30株系中分离的部分抗性单株抗性鉴定
1：抗病对照92R137，2：T1-30-1，3：T1-30-2，4：T1-30-3，5：感病对照扬麦158
具体实施方式
实施例1 92R137中受条锈菌诱导表达的具F-box结构域基因TaFBK1的克隆
92R137是南京农业大学用四倍体圆锥小麦(Triticum turgitum)与二倍体簇毛麦(Haynaldiavillosa)杂交后的双二倍体再与六倍体普通小麦多次回交后创造出的易位系(Chen,P.D.,Qi,L.L.,Zhou,B.,S.Z.Zhang,D.J.Liu.1995 Development and molecularcytogenetic analysis of wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation linesspecifying resistance to powdery mildew.TAG,(91):1125-1128.)。92R137的1B染色体上含有抗小麦条锈病基因Yr26，该基因对强毒性小种条中29、31、32等优势小种的抗性达到高抗-免疫水平(Chunmei Wang,Yiping Zhang,Dejun Han,Zhensheng Kang,Guiping Li,Aizhong Cao,Peidu Chen.SSR and STS markers for wheat stripe rust resistancegene Yr26.Euphytica,2008,159:359-366.)。
为了克隆Yr26抗病途径中的抗病相关基因，本实验室在前期研究中，采用基因芯片杂交法筛选抗条锈病小麦92R137与感条锈病小麦扬麦158中的差异表达基因。具体流程如下：将抗条锈病小麦92R137的种子和感条锈病小麦扬麦158的种子播于培养皿中发芽，露白后移栽到盆钵，一叶期把从感条锈病小麦材料上搜集的条锈菌孢子接种到苗上进行诱导，并于接种后12和36小时取样，分别提取RNA(用Invitrogen公司的Trizol试剂提取)，形成两个实验组R12(92R137诱导12小时的样品)、R36(92R137诱导36小时的样品)和两个对照组S12(扬麦158诱导12小时的样品)、S36(扬麦158诱导36小时的样品)。两个实验组和两个对照组的RNA样品分别用SuperscriptTM II反转录成cDNA(试剂盒购自Gibco/BRL,Gaithersburg,MD,USA)，并进一步在体外转录成cRNA。2个实验组和2个对照组的cRNA样品分别与四张小麦表达谱芯片GeneChip(Affymetrix小麦基因表达谱芯片，part number900515)杂交，芯片杂交实验在“上海国家生物芯片工程中心”完成，实验步骤参照Affymetrix公司说明书“Ex pressed Analysis Technical Manual”(http://www.affymetrix.com/support/technical/manual/expressi on_manual.affx)。以芯片上实验组杂交信号与对照组杂交信号的比值大于2为标准，筛选抗条锈病材料92R137中的上调表达基因。其中一个差异表达基因为Ta.14847.1.A1_at，该基因是一个具有F-box结构域的基因，并且在实验组R12与对照组S12的相比以及在实验组R36与对照组S36相比，该基因都存在差异表达，所以初步判断该基因与白粉病抗性具有密切相关性。
以92R137经条锈菌诱导12小时的叶片提取出的RNA反转录成cDNA为模板、以根据芯片探针Ta.14847.1.A1_at设计的引物P1(CGAACCATGGGTCAGCTGAT,SEQ ID NO.3)和P2(ATCGGCGGTGGTTGATCATG,SEQ ID NO.4)为引物进行RT-PCR，获得了Ta.14847.1.A1_at基因的cDNA全长片段。该基因的ORF(开放阅读框)为1062bp的序列，序列如SEQ ID NO.1所示，编码353个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，经SMART软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析，该基因编码了一种具F-box结构域的蛋白，将该基因命名为TaFBK1。
实施例2 TaFBK1基因受条锈菌诱导的表达特征分析
为了研究TaFBK1在抗感条锈病材料中的表达模式，利用抗病材料92R137和感病材料扬麦158经条锈菌诱导0、6、12、24、72小时的RNA反转录cDNA为模板，利用P3(GTTTGCTTGTTGTGCATTGG，SEQ ID NO.5)和P4(CGCTTGCGACATTCAAGATA，SEQ ID NO.6)为引物进行实时荧光定量PCR(Q-PCR)分析。PCR程序为：PCR反应在实时荧光定量PCR仪(MyIQ，Bio-Rad公司，美国)上扩增并检测荧光。20uL PCR反应体系中含2×SYBR Green PCRMaster Mix 10uL，0.5μM引物P3和P4，反转录cDNA模板2uL。扩增参数为：95℃10分钟，然后95℃15秒、60℃30秒，72℃1分钟，共40个循环。反应结束后，进行熔解曲线的测定。检测基因表达水平用MyiQ系统软件进行分析。结果表明，在92R137中，TaFBK1受条锈菌诱导上调表达，12小时上调显著，24h后表达水平最高，48和72小时表达已下降；在扬麦158中，TaFBK1没有受条锈菌诱导表达的特征，各个时间段的表达量均低于在92R137中的表达量(图1)。
实施例3 TaFBK1超表达载体构建及其转化普通小麦扬麦158及抗条锈病鉴定
以来自92R137的cDNA为模板，以TaFBK1的基因全长序列设计横跨ORF的引物P5(ATCCCGGGTATGGTTGAGTGCACAATGG，SEQ ID NO.7)和P6(ATAGGTACCGAGCCTAGATCTTCAGCAGA，SEQ ID NO.8)，且P5带有SmaI的酶切位点，P6带有KpnI的酶切位点。使用引物对P5和P6进行PCR扩增，回收扩增片段。用SmaI和KpnI对扩增产物进行双酶切，将酶切产物插入到SmaI和KpnI双酶切后的载体pBI220(Jefferson RA,Kavanagh TA,Bevan MW.GUS fusions:beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higherplants.EMBO J.1987,6:3901-3907.)中，将TaFBK1置于35S启动子后面的多克隆位点处，替换掉载体本身带有的GUS基因。由此将目标基因TaFBK1克隆到强启动子35S的下游，获得表达载体pBI220:TaFBK1(图2)。
利用基因枪转化方法TaFBK1转入感条锈病受体的转化方法如下：1、挑取预培养7天约2000块扬麦158幼胚愈伤组织，在高渗培养基(MS+ABA0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2，4-D2mg/L+葡萄糖30g/L+0.4mol/L甘露醇，pH5.8)上预处理4–5小时；2、将携有目的基因TaFBK1的过量表达载体pBI220:TaFBK1通过基因枪轰击法转化到扬麦158愈伤组织，轰击后在高渗培养基上继续培养16小时。3、将愈伤组织转移至恢复培养基(1/2MS+水解酪蛋白500mg/L+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8)上暗培养2周；4、将愈伤组织转移至含有除草剂的筛选培养基上(1/2MS+ABA0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2,4-D1mg/L+蔗糖30g/L+4mg/LBialaphos，pH5.8)筛选培养2周；5、将具有除草剂抗性的愈伤组织转移到分化培养基中(1/2MS+L-谷氨酞胺l mmol/L+水解酪蛋白200mg/L+KT 1mg/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8％，pH5.8)进行分化，待分化芽长至2–4cm时将其转移至生根培养基(1/2MS+KT 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8％，pH5.8)中。6、至再生苗长约8cm、根系较健壮时，即可开管炼苗1–2天，最后洗去根系携带的培养基残渣便可移栽入盆钵。获得再生植株共307棵。
提取所有再生植株基因组DNA，对转化植株利用启动子内部引物P7(GATTCCATTGCCCAGCTATCTG，SEQ ID NO.9)和基因内部引物P8(CACACATAGCAGTTCTTCTGTCG，SEQ ID NO.10)进行PCR扩增，以鉴定阳性植株。PCR程序：10-50ng基因组DNA模板，10μM的P5和P6各0.5μl；2.5μl 10×buffer；2.5μl 2.5mM的dNTP；1.5μl 25mM的Mg2+；0.25μl(5U/μl)Taq polymerase(TaKaRa)，加水至25μl。PCR反应条件为：94℃预变性3分钟；94℃45秒，55℃45秒，72℃2分钟，33个循环；72℃延伸10分钟。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测。其中64株可以扩增约600bp的目的条带，鉴定为阳性植株。图3所示为部分阳性植株的筛选，从12株转基因植株中鉴定出4株阳性植株。
TaFBK1转基因T0代阳性植株分单株收货后，将阳性单株的T1代种子种成株行，每个株行20粒种子，每隔10行加1行抗病材料92R137和扬麦158做对照，种于云南昆明，待3-4月份条锈病发病时，参照对照扬麦158对转基因苗进行田间成株期病级调查。结果表明：T1-28，T1-30，T1-34,和T1-35四个株系表现抗病，且每个株系间均出现抗感分离现象。抗病对照植株92R137对条锈菌表现高抗，叶片上产生过敏性坏死斑，无孢子生长；感病对照植株扬麦158对条锈菌表现高感，无过敏性坏死斑，叶片上布满条锈菌孢子；转基因T0代阳性植株与未转化扬麦158相比，条锈菌抗性水平得到显著提高，叶片上只有少量孢子，而且叶片上产生了抗病92R137相似的过敏性坏死斑，这是叶片对病原菌产生抗性的标志(图4)。以上鉴定结果表明：TaFBK1在感病材料中的过量表达可提高感病材料的条锈病抗性，该基因可用于利用基因工程手段培育抗条锈病小麦。
Claims (6)
1.具有F-box结构域的基因TaFBK1，来自普通小麦（Triticum asetivum L.）92R137，其ORF序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的基因TaFBK1编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
3.含有权利要求1所述的基因TaFBK1的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于以pBI220为出发载体，将所述的基因TaFBK1插入pBI220的SmaI和KpnI酶切位点间所得。
5.权利要求1所述的基因TaFBK1在构建抗条锈病扬麦158中的应用。
6.权利要求3所述的重组表达载体在构建抗条锈病扬麦158中的应用。
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